JPH02503865A - ウイルス及びウイルス性抗原の製法及びそのための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス及びウィルス注抗原の製法及びそのための装置 本発明は、培Ｍ懸濁液中の動物細胞上で培養することによりウィルス又はウィル ス注抗原を製造する方法盃びにこの方法を実施するための装置に関する。

ウィルス及びクラミジアの培養に当って、今日ｌで懸濁液培養は回転ビン中か又 は靜ｒＩＬ醗酵槽培地甲でだけ実施することができる。その際、静置醗酵槽中で 細胞培養するｗＡｉｃ、大容菫の培養を達成するｌでに煩雑な予＊ｙ４装を行な わなければならず、かつ更にこの培養は、その都度培養を行なった後で、所絹各 バッチ後毎に系をｆｃｆＪ”Ｌ、、改めて始動させなけ１ばならな匹と＾を欠点 を有する。更に、場合により起る大型醗酵槽の汚染は大型の培地の損失１ＩＣｉ ｌｔする。

従来、動物細胞の連続培養は、遺伝子操作生履物全生成する細胞（インター７二 ロン、モノクロナール抗体）の培養だけｉｃ適用することができた。

ウィルスワクチンｋｍ造するためのウィルス培養の際の他の問題は、細胞残渣を 分離するための常法の濾過では、骨に繰シ返し接種する際１ｃ息いアレルギー性 症状七発現させ得る低分子ｔｇ分が除去さ７″Ｌな＾と１八うことでδる。それ 故、バッチ式操作法の欠点を回避し、かつ低分子量の成分をウィルスから分離で きて、汚染の危険を最少にすることのできる、ウィルスの培養法が切望された。

それ故、本発明の課題は、板抜＾が簡単であ）かつ汚染を実′Ｘ豹に避けること のできる、ウィルス又はウィルス性抗原の培養法ｔ″開示することであった・こ の課題は、培地懸濁液中の動Ｗ細胞上で培養することによタウィルス又はフィル ス性抗原ｔ−製造するに当り、第１バイオリアクターＡ甲で動物細胞を連続的な 培地銚Ｘ下に懸濁培養し、−足の細胞磯度の到達後に１細胞艙濁液を第２バイオ リアクターＢｃｐに連続的に移しかつそこで維持培地の連続的添加下にウィルス 培養用の培地として使用し、−足麓のウィルスの生成後に第１濾過装置中で細胞 及び細砲残厘をウィルス含有培地懸濁液から分離し、残留齋を廃棄し、濾液では 第２ａ４装置中でウィルス又はウィルス注抗原全培地懸濁液から連続的に分離し かつその＃［１ｌｌＩ縮し、かつ使用した培地を廃棄することｔ−特徴とする良 法にょシ解決される。

この方法の優れた実施形は従属項に記載されている。

本発明万εによシ連続的なウィルス培養を実施することができ、その際に細胞培 地を培養し、こＡを培養すべきウィルスの成長ベースとして使用し、２つの濾過 工程を介して初めｉｃＭ＃残ｆｆｔ’ｔ、その後で低分子量成分を分離すること ができる。細胞の成長速度のｉＩＪ御はバイオリアクターＡ中で、即ちｊｉｊｌ ！ｓ培養＃Ｃお込て培地懸濁液の添加を介して行な＾、これはコンピュータｔｆ ｆｉＪ＠Ｌ、て行なうと有利でｂる。この培地懸濁液添加の制御も培ｍ懸濁液中 の動物細胞を第２バイオリアクターＢ４）に移すｆｔ！の制御も、バイオリアク ターＢ中へ移す際の細胞懸濁液のＶ！！尻の九度捌定を介して行なう。

ｍ胞懸濁液が十分な細胞密度に達して＾な込場合には、バイオリアクター人とＢ との間の流速ｔ″叔る。

不発明の優れた実施形では、１ｔｄ当りａ胞少なくとも４Ｘ１０’ＭＳ殊Ｖｃｊ ｌ１８胞２　Ｘ　１　ｏａ　個ｏｒｓａ−ｃｍｍ＊遅続的にバイオリアクターＢ 中に移す。細胞磯度がこの数値を下層る場合には、本発明の優れた実施形ではバ イオリアクター人からバイオリアクターＢへｏｆＬｉを相応して低め、細胞がバ イオリアクターＢ中ＩＣ訛入する前に高い密度に増殖させることができる。

ウィルスｇａ物ｔ−接種する第２バイオリアクターＢ中で、動物細胞中で増殖し 得るウィルスの培養を行なう。細胞変性効果を及ぼす、この！胸中のウィルスの 増Ｍ後に、細胞を溶解すると、その際に娘ウィルスが遊離する。こｔ′Ｌによシ 測足可能な、細胞密度の低下が起シ、それ故バイオリアクターＢ中でＳ濁液が溌 明になシ、この泄明性を更に同様に細胞−ウィルス−懸濁液がバイオリアクター Ｂから第１ｔＩｉ過装置中ｉｃ流動する際に光度計で細胞変性効果として測定し 、それ故バイオリアクターＢ〃λら第１１１ｉ１過装置中へのｆｉ速も同様に最 適になるように１ＩｔＩ制御することができる。感染して＾ない細胞及び溶解し た細胞の細胞片も含有するウィルス悪濁液も同様に連続的１ｃ第１ｆ１１過装置 中に移す。

本発明の優れた実施形では、ａ過工程七行な＾、Ｒ１］ちバイオリアクターＢ中 で少なくとも８ｏ優の細胞が浴Ｍさルたら直ちに、ｌｓ１＠−ウィルス−懸濁液 をバイオリアクターＢから第１１ｆ１１過装置に移す。

細胞変性効果を示ざないウィルスの培養では、バイオリアクターＢから採取した ？ｓＪ胞を超音波で破壊したつその中に存在するウィルスを遊離する。

このために、）ＡＩＣ醗酵僧Ｂから連続的にウィルス感染した細胞懸濁液が補来 容器中に流動する。予備貢験により決定すべき時間（約１５分間〕の後で、時間 と強さに応じて調整可能ですべてのｍ胞を砕壊する起音波ｍｔ−接硯する。引続 りて、このようにして得られ九懸濁液を第１ｇ過装置中に導きρ為り捕集容器を 空にする。時間制御は９犬のコンピュータにより行なう。

バイオリアクターＢ中での滞留時間は予備実験にょシ決定しなければならなＡ、 バイオリアクター人から連続的に流入する際に、バイオリアクターＢ中の滞留時 間はバイオリアクターＢ中の作業容積の変化にょシ変動させることができる。

ウィルス培養に当り、良好な細胞の成長条件を維持するために、成長条件ｔ−最 適化する維持培地を連α的にバイオリアクターＢ中に添Ｘする。

本発明の優れた実施形では、第１及び／又は第２ｍ過装置の残留９Ｊ全洗浄液で 洗−１この洗浄液は第２濾Ａ装置中のｍ液としてウィルス産吻から除去しかつ廃 棄する。こｎＫよシ、第１ｇ過装置中でウィルスの収率の上昇が達成され、これ に対して第２＋１１過装置中で低分子１物質の分離が最適化される。

本発明の特に−優れた実施形では、バイオリアクター人甲の細胞のｍｘ＆び／又 は細胞変性するウィルスの場合の靜解した細胞のｔμ、バイオリアクターＢＣｐ のなお完全でδる１１ｆＢ胞の一度を介して元度測足によ夕測足し、かつバイオ リアクター人への培地の添加、バイオリアクターＡからバイオリアクターＢへの ｄ勤、バイオリアクターＢへのｍ持培旭の添加、バイオリアクターＢからａ！１ 瀘通Ｉ＆置装の流動及び／又は濾過装置のｆｉ貿物への洗浄液の添加は、光度計 に接続してめるコンピュータを介して制御する。

濾過装置中でフィルターとして中空繊維束を流動法（Ｕｅｂｅｒｓｔｒｏｍｖｓ ｒｆａｈｒｅｎ　）で使用すると優れている〇本発明の他の優れた実施形では、 バイオリアクター人に添加する前の培地、バイオリアクターＢｉＣ添加する前の 維持培地並びに濾過装置の残留物に添Ｗする前の洗浄液を接線方向で中空繊維束 を介して流動させて滅菌Ｉ１１遇する。これによう、培養物の汚染が有効に回避 される。

本発明の他の優れた実流形では、バイオリ７クタ−中の−及び１）０２　ｋ、中 空ｌＲ維離脱通して通気することによ逆制御する。例えば、気泡を含ｌない通気 のだめのこのような中空ｇ、維はＪ、　Ｌｅｈｍａｎｎ及びその他共著、ＢＴＦ −ＢｉＯｔｓ＋Ｃｈ−Ｆ’Ｏｒｕｍ＋　　２　（１９８５）　３から公知でｂる 。

脣に優れている不発明の実施形では、−及びｐｏｇのｉ；４ＷｉＶｃｉ！２！用 するガスはガス混合容器中でコンピュータ制御して混会し、−緒に中空ＮＬ維系 だけを通して配黛するＯ 本発明方法では細胞及びウィルスの培養を連関させ、その除に培養した細胞は直 ちにウィルスの成長ベースとして使用する。不発Ｆ！Ａ［よ夕＃１８胞及びウィ ルスの全培養は連続的に進行し、これによってバッチ式つィルス培餐の欠点は回 避される。それというのも培養サイクルの終結後に、系ｔ−ｆｒしく負荷しかつ 新しく始動させる必要がないからでｂる。不発８Ａｉｃよるウィルス培養法上開 始したら、中断せずに、数週間にわたって汚染されずに使うことができ、その際 ｉＣ侵れたマスターコンピュータの導入により特別な熟練者を必要とせずに連続 晶施できかつ有効性が保証された均一な生成物が得られる。

本発明の他の目的は、培地懸濁液中の動物細胞上で培養することによシウイルス 又はウィルス性抗原を連続的に培養する方法を実施するための装置でろシ、これ はバイオリアクター人が管を介して培地貯槽と及び、光度計を備えて＾る管を介 してバイオリアクターＢと接続しておジ、バイオリアクターＢが管を介してｍ持 培地８器とＭ分しておシかつ！！に管を介して第１残留＠容器と結合して２９、 この容器から細胞−ウィルス−懸濁液が管’、ｃ　ｊ’ｒ　Ｌ第１濾過装置を介 して導かｔＬｌ　その残留物は管を介して第１残留物谷器中に戻さ庇かつ第１残 Ｗ智容器から管を介して糸から排出され、かつ第１瀘Ａ装置の濾液は管を介して 第２残留物谷器中に案内さ几、この容器は管を介して第２ａ過裂直と結合してお シ、七の残餉物μ管を介して第２残留物容器中ＩＣ戻されかつその濾液は管を介 して排出され、その際に光度計はコンピュータｔ＃御される？ｆｉ１ｍ系と結合 していることｔ特徴とする。

この際、第１の優ｚ”した実施形では、バイオリアクターＢから第１ａ過裂直へ の管も、制御系と結合して偽る光度計ｋ　ｉＪＮえている。これにより、再度細 胞誂度測定を可能にし、この測定ρ為ら、形成されたウィルス量が判明する。

第２の優れた実施形では、バイオリアクターＢと第１濾過装置との間の管は、超 音波ＩＸ’ｉ包含する捕果容器及び場合によジボング全具備する。溶解作用を及 ぼでないウィルスを培養するｉに超音波を適用することによジ細胞を破壊しかつ 培養したウィルスを遊離させる。この捕集ｇ器から懸濁液が有利にはポンプを介 して第１残留物容器中に導かれる。

同様に優れて−る本発明の実施形では、培地貯槽及び維持培地貯槽からの管及び ／又は濾過装置への管は、特に有利にこの場合も同様にコンピュータ制御される 制御系により制御さルるポンプを有する。

本発明の他の優れた実施形ではバイオリアクター人及びＢは中空ｌ１ｊ１．離脱 を備えておシ、この展を介して細胞懸濁液の一値及びｐｏ２含蓋會ガス供給によ り調節することができる。このためにこの裂ｆＲはがス混合容器も備えて＾てよ く、この中でガスがコンピュータ制御されて混合され、その後で中空繊維系を介 して配量される。本発明の範囲では、両刀のバイオリアクター用の２つの別別の 中空ｉＲ維離脱使わずに、両方のり７クター中で結合した中空＃、維換系を使用 することもできる。

本発明の更に優れた実施形では、バイオリアクター人及びＢは電磁攪拌機を備え ておシ、これはこれらのバイオリアクター中のａ応する混合及び攪拌を行なう。

本発明による装置中の汚染を回避するために　ｔｓ？イオリアクタ−ＡとＢとの 間の管、バイオリアクターＢと第１残貿突容器との間の管、第１残留蜜容器と第 ２残留物容器との間の管、残留物の排出用の管、低分子量仄分及び水の排出用の 管及び洗浄液流入管は本発明の優れた実施形では逆灰長トラップ（Ｒｕｓｃｋｖ ｕｃｋｓｆａ且りを備えている。更に、バイオリアクター人及びＢは管を介して 、気気安全容器中に開口している過圧升を１霜えて＾る。これにより、懸濁液の 導通もしくはガス又は培地の導入により発生する圧力差及び過圧ｔ−ｖ４節する ことができる。気気安全容器は気気の浄化に有用でｂシ、それによって危険なウ ィルス粒子を、放出させなり０本発明の優れた実施形では、残留物容器も、この 場合も同様ＶＣＣ気気安全容器開口して＾る圧力調節管を備えている。こ几らの 圧力崗顧管すべてが、場合により存在するウィルス粒子全保持する中空＃＆維フ ィルター七備えてＡると優几て＾る。（洗浄液では鷹だ還ａ洛下してしない）。

本発明の他の実施形では、残留物容器は、ポンプ′ｆｃ備えたそれぞれ１１−の 管を介して洗浄容器とＭ会しており、この容器を介して批苧液を残留物容器中に 成人させることがでさる。Ｃのために設けた管は優れた実施形では同様に逆戊長 トラップを備えてｈる。

バイオリアクター人及びＢ中ｉＣＡ気するための中空繊維展系も同様にＷを介し てかつ有利には場合によル存在するウィルス七分屋するための中空繊維フィルタ ー、気気安全容器と結合して＾てもよい。

本発明方法及びこの方法１ｃ適用可能な本発明による装置によシ、ワクチン接種 に好適でらるウィルス又はウィルス性抗原を簡単に連続培養することができ、そ の際にこの方法は未熟練者も実施することができかつ数週間にわたって均一な生 ｇ物をもたらす。本発明による方法及び装置は小型装置故に、大型実験富とそれ に伴な５社会設備の建設を節約することができる。この系は、予め製造した実験 室コンテナー中に取付けるのに好適で６勺、このコンテナー′ｆｃ最終的に仕上 げて例えば熱帯地域に設置して、その処置の後で直ちに生産を開始することがで きる。このよ５ｉＣｔ、て、特ニ問題の多い地域でも流行病が発生したときＩｃ 場合により−Ｃは地域ｉｃ脣異的な菌株からワクチン全生成することができる。

この利点は、多数の熱帯ａ流行病のｇ４匁両全工業国にもち込んではならず、そ れ故世界的な必要のための主要なワクチン製造が工業国では不可症でわる場合に １要である〔子役、７７９カ豚ペースト、ブルー−タンク曽ウィルス（Ｂｌｕｅ 　Ｔｏｎｇｎｅ　Ｖｉｒｕｓ　）等〕０本発８Ａにより得られた生ｆｙ、物に系 に由来して高−品質及び抗原性で６タ、有害な副産物（低分子ｆ物質又は細胞残 渣）金言１ず、かつ低コストで製造することができる。

図面はバイオリアクターＡ２ｔ−備えた本発明による優れた装置ｌ　ｋ示してお シ、このバイオリアクターＡ２中ＩＣ制御されながら培地貯槽４から、ポンプ８ を備えた管６七介して培地が導入される。

この際更に、バイオリアクター人２は中空繊維膜５８を備えており、このＭｔ− 介して一文はＰＯ＋全調節するためにガスを導入することができる。更に、バイ オリアクター人２は電磁攪拌機６２、及び過圧弁を有する管６６を介して脚気安 全容器１０と結合しておシ、その際に管は場合によ少存在するウィルスを保持す るために中空繊維フィルター８２に有する。／マイオリアクター人２は、光度計 １２及び逆成長トラップを備えた管１０を介してバイオリアクターＢ１４（！： 連結しておシ、このリアクターＢ１４中に、ポンプ２０及び逆成長トラップ′ｔ −備えた管１８を介して維持培地容器１６から培地が供給される。更に、バイオ リアクターＢ１４は、通気及び−とＰＯ２の、）４ｙＲｊのために使われる中空 部ｊ４［６０に備えて＾る。付加的に、バイオリフ、フタ−Ｂ１４は内容物を混 合するために電憾攪拝機６４全有する。過圧弁を備えた１ｔ６８は圧力ｖ４節に 有用でわｐｌかつ場合により存在するウィルスを保持する中空繊維フィルター８ ４を介して気気安全各５１０中に案内する。バイオリアクタ−８１４Ｆｉ第１ｍ 過装置の第１残留物谷器２６と、光度計２４及び逆成長トラップ′ｔ−備えた管 ２２を介して連結しており、第１残留物答器２６も筐た、中空繊維フィルター８ ６を有する管７８に介して脚気安全容器ｌＯと連結して、圧力調節する。第１残 留物容器２６からの残Ｗ物は逆成長トラップｔ−備えた管３６′に介して排出さ せる。第１残留物容器２６から、光度計３０を備えた管２８を介して、懸濁液が 第１フイルター３２中に導入され、かつここから残留物は管３４を介して第１残 留物容器２６中に返流されかつ濾液は逆成長トラップ全備えた管３８を介し６て 、圧力調節管８０を備えた第２残留物谷器４０中に導かれ、この管は中空ｍ維フ ィルター８６を介して脚気安全容器７０ｃＰ［開口してｂ７）、更に、第２残留 物容器４０はＷ５０ｔ−備えておｐｌこの管は逆成長トラップ全具備しかつこの 管？介してウィルス磯繍智が排出される。第２残留物容器４０から、ポンプ４４ を備えた管４２（！−介して懸濁液は濾過装置４６中に案内され、ａ過装置［４ ６の残留９！Ｊは管４８を介して第２残留物容器４０中に返流さ几、かつｌＩｌ 液は還流トラップを備えた管５４を介して排出される。洗浄液容器１６から、同 様にコンピュータｆ＃ｌ１ｉｌ、て、ｊｌ光ト　Ｐラップ及びポンプ７４に備え た管７２ｔ″介して洗浄液全残留物容器２６．４０中に供給する。

装置の各部材への流入及び各部材からの流出のＹｆＩＪ御バクロセス！ＩＩＪ（ ｉｉｌ用コンピュータ５６［よシ行なう。

次の実施例によρ本発明を更に詳説する。

例　　１ ＢＨＫ　２１クローン１３細胞を連続的な懸濁培養法で製造 細胞Ｂ肛２１クローン１３１：　ＫＣＡＣＣム８４１００５０１（Ｆｌｏｗ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒ１＊ｓ　Ｍｅｃｋｅｎｈｅｉｍ　’ｉ；通して入手）の培養は 単層ビンでも回転ビンでも行なうことができる。

接種するため［は、醗酵槽中に少なくとも細胞８ｘ１０４個／ｄが存在すべきで ろシ、これにより培養物の迅速な成長が保証される。ＢＨＫ　２１クローン１３ Ｊａ胞の倍加時間は２４時間でｂりた。、５日後に、１１ｆ８胞数が少なくとも ４　Ｘ　１０Ｉｈ／ＪＩＺ！ｉｃなったら連続的な細胞の取得を開始することが できた。培地の添加（ＭＥＭ（最少必須培地）９．５３８Ｊｊ＃’ｔ−アールの ７ユピンナー塩（ＩＣａｒｌ’ｓ　Ｓｐｉｎｎｅｒｓａｌｇｅ　）　、　　Ｎａ ＨＣＯ３２，２１１／　ｌ。

辺Ｍ−ビタミン溶液１０．υＩｌｌ／ｌ　、必須ではなＡ７ミノａｌ１１０．０ ＩＬｔ／Ｊ、胎生牛血清１０．Ｕチ／ｊと一緒に、直接バイオリアクターに接続 している中空繊維束を介して滅菌ｄｌＪする〕は、醗酵開始のため［２４［ＪＮ ／日（＝稀釈率１：１２．５）でｂ夛かつ成長に比例して１５！ＪＯＩＬｔ／日 ｌで高めることができた（１：２）。

調節は取ｐ付けた光度計を介（−で行なった。′ｉａ胞はミクロキャリア（Ｍｉ ｋｒｏｃａｒｒｉｅｒ　）なしで成長じた。バイオリアクター人の反応容積は４ ｇ、液体容重は３１でｂった。反応温度は６７℃、攪拌速度は１５０　ｒｐｍ。

−値は７．［Ｊ及びＰＣｌｇは空気検定した溶液の０２４５優Ｖｃり４ＷＪした 。この場合ガス流は４．５　Ｊ　／分でめった。

前圧としてはＮ２４０ミリバール、０２２０ミリバール及びＣＯ２３０ミリバー ル並びＶｒ−調節しなかった空気を使用した。本例では装置として次のもの？使 用した二央造者 培地のｆＡ２［Ｉ：ポンプＮＢＣＣ（Ｂｙ−ｐδｓａ）ポンプｌ［ＢＣＣ 温度調節：　モデルＴ腹　　　　　ＢＣＣ温夏センサー：　ｐ’ｒｉ　００　　 　　　　　　　　Ｌｅｍｏ　ＦＧＧ、　　より外部加熱機：冷却−循環一浴−Ｈ ａａｋｅサーモスタット （Ｋａｓ　ｌｔｅ−Ｏｍｗａｓｌｇ− ＢａｃＬ−Ｔｈｅｒｍｏｓ　ｔａｔ　）ＫＴ２内部２［１熱機ニ調温処理カゴ　 　　　ＢＣＣ／よりＴ（Ｔｓｍｐｅｒｉａｒｋｏｒｂ） 独自の開発 攪拌：　モデル５ＰＪＣＢＣＣ 内部駆動：容器の蓋に固定した 攪拌ＸｋＱＣ付けた 電出′ｆｊｔ伴捧 外部駆動：供給ケーシングＩｃ固く 取シ付けた電ａ攪拌機 声調節：モデル−ＢＣＣ 電極：　−電極　　　　　　　　　工ｎｇｏｌとオートクレーブ処理可能 一範囲０〜１２ 屋４６５−３６−９０−に９ ＰＯ２調節：モデルＰＯ２ＢＣＣ 電極：　　ｐ０２電極　　　　　　　　Ｉｎｇｏｌｄオートクレーブ処理可能 屋７４５５１５２２７５６７０２ ガス供給： 型１ニー流を調彫升 ＃Ｊ足管ＩＦＤ−工／８−［Ｊ８− Ｇ　−５／　Ｉｌｌ　　　　　　ＥＦｉｓｃｈｅｒ＆　ＰｏｒＣａｒ−電磁弁　 　　　　　　ＢＣＣ オリ−ベン（Ｏｌｉｖｅｎ） ５ｘｘφ 一ガス混合容器　　　　ＢＣＣ 型２　：　−ｆｉｊｌｉａ４ｍ５磯　　　　　ＭＫＳ−ガス混合容器　　　　Ｂ ＣＣ 減圧機：　型４　Ｄ　１４２／　０３　　　　　Ｄｒａｅｇｅｒ圧縮空気二遅続 的な空気流 通気用中空ＷＲ維：　Ａｃｃｕｒｅｌ’ＰＰ　　　　Ｅｎｋａ−Ｍｅｍｂｒａｎ ａ型Ｓ６／２疎水性　Ａｋｔｓ。

口径二　最大重５４μｍ 舎き：　液面に対して垂直 必要長さ：３馬／ＩｃＲ坏〕 レベル調節：モデルＮＩＶ　　　　　　ＢＣＣｔ極：　オートクレーブ処理可能 　ＢＣＣテフロン膜 細胞−懸濁液の密度測定：ｊｊ流光夏計ＢＣ’Ｃ例　　２ ＢＨＫ　２１細胞上でＮＤにニーキャッスル病）ワクチンの連続製造 細胞維持培地として仄の培地を使用した：辺反（最少必須培地）を アールのシュピンナー塩　　　　　　　９．５４１／ｌ！ＮａＨＣＯ３２−２Ｊ ｉ’　／　１ 辺瀉−ビタミン溶液　　　　　　　　　ｉｏ、ｏｇ／ｚ胎生牛血清　　　　　　 　　　　　　　２．０優／ｌと一緒に。

培地の滅菌は、直接バイオリアクターに接続してｈる中空繊維束を介して濾過す ることによシ行なう。

バイオリアクターＢのウィルス接種 ＢＨＫ単一層上で培養した、１ＱＱｄ中によりウィルス７．Ｉ　Ｘ　１０？個を 含有する培養物をフィルス醗酵槽に接極した。単層培養物の感染は、バイオリア クター中に新鮮細胞を最初に添加する２日前に行なった。単層培養物のＭｊｌ芝 は、ウィルス醗＃檜に接種するこの時Ａｌ″ｔ’ｌ１ｉ１１胞溶解を胃してＡで はならなかった。ウィルスの固有の遊ａは醗＃槽中で、しかも細胞リアクター（ リアクター人）からのｍ胞添加の時点で行なわれるべきでａつ几。

バイオリアクター人からの接種のために、細胞６Ｘ１０’ｍ／ＪＬｊｋバイオリ アクター人からバイオリアクターＢへの流室５０〜１［ＪＯｊｌｊ／時間で細胞 ６．０×１０ｅ〜６．ＯＸ　１０”個／時閾でバイオリアクターＢ中に添加した 。バイオリアクターＢの容積も４ｉ　′Ｒ体容量は６１″Ｔ″６タ、温度３７° Ｃ０攪拌速度１５０　ｒｐｍで６Ｃ１−値は７．０に、ｐｏｚＩＣＩ′ｉ空Ｎ　 ’ＰＩＥ　５ｆｔ　Ｆｌ　？’ｌｌ　中テ０２４０ｔｓＫ調節した。ガスペース 流は４．ＯＪ　／分で６夛、前圧としてＮ２４０ミリバール、０２２０ミリバー ル。

ｃｏ２３０ミリバール及び空気を前圧の調節なしに適用した。培地の添加は２１ ７日及び細胞の添加は平均して細胞１．２　Ｘ　１０１０個／日でｂりた。ウィ ルスの収穫はＩＤ１．０Ｘ１０γ／ｘｔ＝Ｘ　Ｄ　　２．ＯＸ　１０”／Ｅｌ’ ｔ’ろｐ、この際細胞の８０９６が破壊されたと１！！に収穫を行なった。バイ オリアクター２の装置の設備はバイオリアクターＨに相当するが、次の点で異な ってｈた：リアクターＩ中に取り付けたレベル調！！ｔｉ部は時間差をつけて２ つの電磁弁ｔ−開ｌた： 電磁弁１：す７クター五へ細胞を流動させた；電ｍｆｆ　２　：　′ｆＩＬａｆ ｆｌ　Ｒ閉ｅり；細胞の流入Ｗを遊離洗浄するためにり７クターＨの培地流入部 を開放した： 開放時間５〜１０秒間 脚気： 会社 ７リツト：ロ径肌４ρ！ＥＩ　　　　　　　　　　ＢＣＣＮａＯＨ浴　＝２％− 力セイ浴 フィルター：浮遊物質級８　　　　　　　ＪＩＣｎｋａ　Ａｋｚ。

口径０．０５μｍ 疎水性 ウィルス力価を確定するための 刑胞変性効果の測定二Ｘ流元夏計　　　　ＢＣＣ細胞残渣の分離は濾過装Ｒ１中 の口径０−４５　ｎｕ　ｔ−有する１ｍ　Ｍ　；ｙイルター（Ａｋｚｏ　ＭＤ　 ０２０　Ｐ２Ｎ　）　ｋ介して及びｍ過！！Ｒ２中のウィルスフィルター５００ ０ＯＮＭＧＧ　（Ａｋｚｏ　Ｖ’ｌ［ｌ［ＺＩ　）　ｋ介Ｌ−’Ｃ行ｅツ７’ｃ 、　ｑ７ｆ：７グ、レベル調節部及び電磁弁にＢＣＣ社製のものであった。バイ オリアクターとフィルターの上位の詞！＆部としてはミュンツ７・ラント・ディ ール（Ｍｕｅｎｚθｒ　ｕｎＬＩＬＤｉｅｈｌ　）社の過仕させたン７トウエア の産業用マスターコンピュータＦＬＳ１？！：′使用した。マスターコンピュー タシステムは留置測定によりバイオリアクター人中の細胞成長及びバイオリアク ターＢ中の細胞変性（溶解）効果を介してウィルス増殖を制御し、かつバイオリ アクター人中への培地の流量及びバイオリアクターＢからの細胞流出を制御して 最適化する。ａ遇系の変動回転ボンダは〜丁べての生Ｊ！ｉ、物が直ちに後処理 さルるよりにコンピュータを介して調節した・≠ 国際調査報告 ５人　　　２７２０３

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．培地懸濁液中の動物細胞上で培養することによりウイルス又はウイルス性抗 原を製造するに当り、第１バイオリアクターＡ中で動物細胞を培地連続添加下に 懸濁培養し、一定の細胞濃度の達成後に細胞懸濁液を第２バイオリァクターＢ中 に連続的に移しかつそこでウイルス培養用培地として、維持培地の連続添加下に 使用し、一定量のウイルスの生成後第１濾過装置中で細胞及び細胞残渣をウイル ス含有培地懸濁液から分離し、残留物を廃棄し、濾液では第２濾過装置中でウイ ルス又はウイルス性抗原を培地懸濁液から連続的に分離しかつその際に濃縮し、 かつ培地を廃棄することを特徴とする方法。
2. ２．細胞少な（とも４×１０５個／ｍｌの濃度の達成後に細胞をバイオリアクタ ー中に連続的に移すことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．バイオリアクター中で少なくとも８０％の細胞が溶解したときん直ちん濾過 工程を連続的に行なうことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
4. ４．細胞包変性效果を及ぼさないウイルスを培養する場合、所定時間後に細胞を 超音波処理により破壊し、かつその後で懸濁液を第１濾過装置中に移すことを特 徴とする請求項１又は２記載の方法。
5. ５．第１濾過装置及び／又は第２濾過装置の残留物を洗浄液で洗浄し、これを第 ２濾過装置中で濾液としてウイルス産物から分離し、かつ廃棄することを特徴と する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. ６．細胞の濃度を光度測定により測定し、かつバイオリアクターＡからバイオリ アクターＢへの流動，バイオリアクターＢから第１濾過装置中への流動並びに第 １及び第２濾過装置の残留物への洗浄液の添加をコンビェータにより制御するこ とを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. ７．濾過装置中で中空繊維束をフィルターとして流動法で使用することを特徴と する請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. ８．ハイオリアクターＡに添加する前の培地，バイオリアクターＢに添加する前 の維持培地並びに濾過装置の残留物に添加する前の洗浄液を接線方向で中空繊維 束を介して流動させて滅菌濾過することを特徴とする請求項１から７までのいず けか１項記載の方法。
9. ９．バイオリアクター中のＰＨ及びＰＯ２は中空繊維膜を介して通気することに より制御することを特徴とする請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
10. １０．ＰＨ−及びＰＯ２調節に使用するガスをガス混合容器中でコンピュータ制 御により混合しかつ一緒に中空繊維系を通して導入することを特徴とする請求項 ９記載の方法。
11. １１．ばイオリアクターＡ（２）が管（６）を介して培地貯槽（４）と及び、光 度計（１２）を備えている管（１０）を介してバイオリアクターＢ（１４）と接 続しており、バイオリアクターＢもまたし管（１８）を介して維持培地（１６） と結合しておりかつ更に管（２２）を介して第１残留物客器（２６）と結合して おり、この容器から細胞−ウイルスー懸濁液が管（２８）を介し第１濾過装置（ ３２）を介して導かれ、その残留物は管（３４）を介して第１残留物容器（２６ ）中に戻されかつ第１残留物容器（２６）から管（３６）を介して系から排出さ れ、かつ第１濾過装置（３２）の濾液は管（３８）を介して第２残留物容器（４ ０）中に案内され、この容器は管（４２）を介して第２濾過装置（４６）と結合 しており、その残留物は管（４８）を介して第２残留物容器（４０）中に戻され かつその濾液は管（５０）を介して排出され、その際に光度計（１２）はコンピ ュータ制御される制御系（５６）と結合していることを特徴とする請求項１から ９までのいずれか１項記載の方法を実施するための装置。
12. １２．管（２２）も、制御系（５６）と結合している光度計（２４）を備えてい ることを特徴とする請求項１１記載の装置。
13. １３．管（２２）は、超音波源を包含する捕集容器及びその後方にボンブを具備 することを特徴とする請求項１１記載の装置。
14. １４．管（６，１８，２８，４２）はポンプ（８，２０，３０，４４）を備えて いることを特徴とする請求項１１から１３までのいずれか１項記載の装置。
15. １５．バイオリアクターＡ及びＢ（２，１４）Ｆ中空繊維腕（５８，６０）を備 えており、この膜を介して細胞懸濁液のＰＨ値及びＰＯ２含量をガス供給により 調節することを特徴とする請求項１１から１４までのいずれか１項記載の装置。
16. １６．バイオリアクターＡ及びＢ（２，１４）は電磁撹拌機（６２，６４）を備 えていることを特徴とする請求項１１から１５までのいずれか１項記載の装置。
17. １７．管（６，１０，１８，２２，３６，３８，５０及び５４）に逆成長トラッ ブ（Ｒｕｅｃｋｗｕｃｋｓｆａｌｌｅ）を備えていることを特徴とする請求項１ １から１６までのいずれか１項記載の装置。
18. １８．バイオリアクターＡ及びＢ（２，１４）は、廃気安全容器（７０）中に開 口している過圧弁を備えている管（６６，６８）を備えていることを特徴とする 請求項１１から１７までのいずれか１項記載の装置。
19. １９．第１残留物容器（２６）及び第２残留物容器（４０）中に洗浄液を洗浄液 容器（７６）から導入させることのできるポンプ（７４）を有する管（７２）が 存在する請求項１１から１８までのいずれか１項記載の装置。
20. ２０．残留物容器（２６，４０）に、廃気安全容器（７０）中に開口している圧 力調節管（７８，８０）が連結していることを特徴とする請求項１１から１９ま でのいずれか１項記載の装置。
21. ２１．廃気安全容器への管（６６，６８，７８，８０）は中空繊維フィルター（ ８２，８４，８６）を備えていることを特徴とする請求項１１から２０までのい ずれか１項記載の装置。