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Verfahren zur Herstellung von Bakteriophagenpräparaten Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung verläßlicher und wirksamer präparate für
die Therapie und Prophylaxis infektiöser Erkrankungen, die von verschiedenen Arten
der pathogenen Mikroorganismen, z. B. alle Arten der Dysenterie-, Typhus-, Paratyphus-Mikroorganismen
und anderer Salmonelle-Arten, Vibrio cholerae, E. coli und coli 111 B 4 55 B 5 und
26 B 6, Staphylokokken, Proteus u. dgl., hervorgerufen werden.
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Der Kampf gegen diese Mikroorganismen wurde bisher durch Anwendung
von Chemotherapentika und Antibiotika geführt. Diese müssen aber jetzt, hauptsächlich
in den chronischen Fällen oder bei Bazillenträgern, als nicht genügend wirksam betrachtet
werden.
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Die Phagotherapie zeigt sich demgegenüber als besonders geeigneter
Weg für diese Fälle.
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Die Herstellung der therapeutischen Bakteriophagenpräparate wird
bisher im ruhenden flüssigen Nährmedium durchgeführt, die Arzneiform ist ein flüssiger
nativer 13akteriopllag. Dieses Herstellungsverfahren entspricht aber den therapeutischen
Zwecken aus folgenden @ Gründen nicht: 1. schwierige Herstellung einer größeren
Menge in kurzer Zeit, 2. niedriger Titer der Bakteriophagen und die kleine Wirksamkeit
im Organismus, 3. nicht geeignete Arzneiform des flüssigen Präparates, 4. leichte
Entwertung durch Verunreinigung mittels fremder mikrobieller Flora, 5. Unstabilität
des Präparates und zeitliche Begrenzung der Wirkung, 6. schwierige Dosierung des
Präparates.
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Die Erfindung bezweck, diese Mängel durch Herstellen eines getrockneten
und gereinigten therapeutischen Bakteriophagenpräparates mittels der Tiefkultivierung
in geeigneter Arzneiform zu beseitigen. Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht
darin, daß man pathogene Mikroorganismen in einem Nährmedium submers vermehrt, dann
mit dem entsprechenden, spezifischen Bakteriophagen beimpft und unter gleichen Bedingungen
weiterbehandelt, schließlich die phagolisierte Kultur durch Erwärmen und Filtrieren
durch einen bakteriologischen Filter inaktiviert, die Phagen mittels üblicher Eiweißfällungsmittel
aus dem Filtrat ausfällt und dann in Trocken form überführt.
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Dieses Herstellungsverfahren ermöglicht bedeutende wirtschaftliche
Ersparnisse an Material, Zeit und Arbeit.
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Die Präparate weisen eine hohe Wirksamkeit, bis dreifache Titer und
Stabilität auf. Durch die Anwendung der Präparate wird die Dauer der Krankheit und
der Rekonvaleszenz ungefähr um 75% erniedrigt. Die Präparate übertreffen in ihrem
therapeutischen Effekt die Antibiotika und Chemotherapeutika, wobei sie die Nachteile
dieser Arzneimittel nicht aufweisen. Das Herstellungsverfahren erfüllt im Sinne
der bisherigen epidemiologischen Erfahrungen alle Voraussetzungen für eine wirksame
Phagotherapie der epidemischen Krankheiten des Menschen.
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Es ist bekannt, Stämme von zur Herstellung von Streptomycin dienenden
Actinomyces griseus in Gegenwart von Actinophage zu züchten. Dabei wurde lediglich
der Zweck verfolgt, gegen Actinophagen, welche den Fermentationsvorgang bei der
Herstellung von Streptomycin beeinträchtigen, widerstandsfähige Zellen von Actinomyces
griseus zu erhalten, die sofort auf ein frisches Nährmedium übertragen und von diesem
weiter gezüchtet wurden, bis die Actinophage eliminiert ist.
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Das Verfahren dient lediglich zur Vesbesserung des Herstellungsverfahrens
von Streptomycin und nicht zur Gewinnung von Phagen. Der Zweck dieses bekannten
Verfahrens ist also ein ganz anderer als beim Verfahren gemäß der Erfindung. Außerdem
sind die Wesen, die bei diesem bekannten Verfahren gemeinsam gezüchtet werden, vollkommen
verschieden von denjenigen beim erfindungsgemäßen Verfahren.
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Ein Beispiel einer Dysenterie-Epidemie, Typus Sonne:
| Therapie lurcll |
| Bakteriophag Chloramphentcol Chemotherapeut. |
| Zahl der Behandelten ............... 27 24 16 |
| Negativ in 24 Stunden .............. 21 19 - |
| Negativ in 48 Stunden .............. 6 - |
| Bis zu Ende behandelt mit |
| Bakteriophagen |
Die Tiefkultivierung der ausgewählten bakteriellen Stämme wird in flüssigen Hydrolysat-Nährmedien,
z. B.
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Fleischhydrolysat, Typ Hottinger, oder einem Hydrolysat anderer Eiweiß
enthaltender Stoffe in Kultivierungstanks durchgeführt, wobei mit Sauerstoff, einem
Gemisch von Sauerstoff mit Luft oder mittels Luft belüftet und unter strengen sterilen
Bedingungen gerührt wird. Die Submerskulturen der bakteriellen Stämme in dem flüssigen,
auf eine geeignete Art hergestellten Nährmedium, werden in die Kultivierungstanks
übertragen, wo die Vermehrung der Bakterien in der Suspension stattfindet. Die Z@@tdau@r
dieser Vermehrung ist für jede Bakterienart spezifisch und kann den technologischen
Bedingungen angepaßt werden. In der vermehrten bakteriellen Suspension wird der
spezifische Bakteriophag in einer seinem Titer entsprechenden Menge beigemengt.
Der danach folgende lytische Prozeß erfolgt unter ähnlichen Bedingungen wie die
vorangegangene Vermehrung der Mikroorganismen.
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Das Ende des lytischen Prozesses ist durch eine Erniedrigung der Mikrobenzahl
und durch Klärung des Kulturmediums begleitet, welches nach dem Inaktivieren und
Filtrieren erst mittels eines geeigneten anorganischen Salzes, z. B. Ammoniumsulfat,
konzentriert wird. Dieses Konzentrat wird dann im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Das getrocknete Gemisch wird in die geeignete Arzneiform übergeführt, z. B. wird
mit Zusatz von Füllmitteln tablettiert. Die Tabletten werden mit einer säurefesten
Schicht überzogen, oder das getrocknete Gemisch wird in säurefesten Kapseln eingefüllt.
Für eine parenterale Anwendung wird das Konzentrat durch Dialvse ausgesalzt und
lyophilisiert.
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Die im Sinne der Erfindung hergestellten Bakteriophagenpräparate
in der trockenen, f@sten Form sind durch eine hohe, spezifische und prompte Wirkung
im Organismus ausgezeichnet. Sie rufen keine unerwünschten klinischen Nebenwirkungen
hervor, vernichten die nützliche Darmflora nicht und verursachen auch keine Entwicklung
von resistenten Stämmen. Die Präparate bewahren eine lange Zeit ihre biologische
Aktivität.
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Einen großen Vorteil für die behandelten Kranken stellt die mühelose
und bequeme Eingabeart und Dosierung, ohne Notwendigkeit einer strengen ärztlichen
Kontrolle, dar.
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Die getrockneten Bakteriophagenpraparate können jederzeit zur weiteren
Züchtung benutzt werden.
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D u r c h f ü h r u n g s b e i s p i e l Die Herstellung des dysentrischen
Bakteriophagen.
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Stamm Sonne In dem Kultivierungstank werden zu 8000 ml der sterilen
Nährflüssigkeit (pH 7,6) 350 bis 400 ml einer Suspension des dysentrischen Stammes
Sonne beigemengt, der zuvor in einem flüssigen Nährmedium während 5 Stunden bei
37°C vermehrt wurde. Es wird bei 37°C unter Rühren und Belüften kultiviert. Die
Kontrollmuster werden 90 bis 120 Minuten nach dem Impfen abgenommen. Bei den Mustern
wird der pH-Wert gemessen und gegebenenfalls auf 7,6 eingestellt. Nach
3 Stunden
Kultivierung, bei einer Mikrobenzahl von ungefähr 2,5 Milliarden 1 ml, werden 400
bis 500 ml des spezifischen Dysenteriephages Typus Sonne zugegeben, der durch Oberflächen-
oder submerse Phagolyse des Stammes Sonne auf oder in dem flüssigen Medium hergestellt
wurde. Die Phagolyse wird in zweistündigen Intervallen bewertet. Das Ende der Phagolyse
wird entweder visnell durch Klärung des Kulturmediums oder durch Erniedrigung der
Mikrobenzahl in 1 ml oder durch biochemische Bestimmung des Stickstoffgehaltes in
1 ml bestimmt. Dann wird die Bakteriophagenkultur unter aseptischen Bedingungen
aus dem Tank ausgelassen, im Wasserbade bei 56°C inaktiviert und mittels Seitzfilters
filtriert. Der Wirkungstest des nativen Bakteriophagen kann dann durchgeführt werden.
Das Kulturmedium wird konzentriert und gereinigt, auf 0°C abgekühlt und mit Hilfe
von festem Ammoniumsulfat bis zur vollkommenen Sättigung ein Niederschlag erzeugt.
Der pH-Wert wird durch Salzsäure auf 6,9 @ingestellt und das Ganze im Kühlraum über
Nacht bei 4°C stehengelassen.
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Der entstandene Niederschlag wird bei niedriger Temperatur abgeschleudert
oder abfiltriert. Zu dem Niederschlag werden 10% des feuchten Gewichtes Calciumglukonat
zugegeben und das Gemisch im Vaknum bei Raumtemperatur getrocknet. Die trockene
Masse wird mit Füllmitteln tablettiert und mit einer säurefesten Schicht überzogen,
oder man füllt dieselbe in säurefeste Kapseln ein. Die optimale Menge der Bakteriophagen,
die in einer Tablette enthalten sind, wird für jede einzelne Charge durch Titration
bestimmt. Je nach der Menge in der Tablette ist es möglich, die Anwendungsdosis
zu regeln.
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Ganz analog kann man die spezifischen Bakteriophagen auch anderer
Mikrobenarten, wie z. B. der Dysenterie, Typhus, Paratyphus- und der übrigen Salmonella,
Vibrio cholerae, E. coli und coli 111 B 4, 55 B 5 und 26 B 6, Staphylokokken. Protens
und dgl., kultivieren und verarbeiten.