CN115698254A - 靶标粒子的分离方法及系统 - Google Patents

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Abstract

使用粒子捕捉设备(1)，具备下述工序：导入工序，将包含靶标粒子(CT)及非靶标粒子(CA)～(CC)的流体从流入路(18)导入腔室(20)内；浓缩工序，使流体的至少一部分通过第一排出路(8)而排出，从而由过滤器(12)浓缩靶标粒子(CT)、和非靶标粒子的至少一部分(CA)；分离工序，利用吸引手段(30)将滤出的非靶标粒子(CA)从靶标粒子(CT)分离；和容纳工序，将靶标粒子(CT)容纳于凹坑。

Description

靶标粒子的分离方法及系统
技术领域
本发明涉及用于对细胞等靶标粒子进行分离、捕捉、检测、或单独分离等的分离方法及系统。
本申请基于于2020年5月25日在日本提出申请的特愿2020-090677号主张优先权，并将其内容援用于此。
背景技术
从液体中大小混合存在的粒子中分离出特定的粒子的设备是以往已知的。例如，血液的细胞成分主要为红血球、白血球、血小板，它们中，混合存在有血中循环肿瘤细胞/CTC(Circulating Tumor Cell)、胎儿有核红细胞(fNRBC)那样的存在率极低的细胞是已知的。
为了分离、取得这样的存在比率极低的细胞，有利用了针对靶标细胞的表面标志物的抗体的基于亲和力的分离、浓缩方法，但分离效率依赖于表面标志物的表达量，表达量低的细胞会逃脱。
另外，基于亲和力的分离、浓缩方法的情况下，由于抗体等分子与作为靶标的细胞结合，因此存在细胞内的信号传导系统被激活·抑制，取得后的细胞不反映自然状态的风险。
因此，期望对靶标的细胞没有影响的无标记的分离方法。
作为无标记的分离方法，有使用了与靶标细胞以外的细胞结合的抗体的阴性选择、和基于细胞的大小、变形性(deformability)、密度等物性的差异的方法。
就阴性选择而言，例如，为了分离血液中的癌细胞，通过已结合了磁性粒子的CD45抗体来标记白血球，在柱内将经标记的白血球吸引至磁体上，对未被吸引的细胞级分中的癌细胞进行确定(非专利文献1)。
然而，基于阴性选择的浓缩方法中，大量白血球被吸引至磁体时，靶标细胞也会被卷入，因此回收率低。例如，根据非专利文献2，报道了回收率为58％。
作为基于细胞的大小或变形性等物性的差异的分离方法，利用有孔的过滤器、具有精细的梳型结构或段差结构的微流控芯片进行的分离是已知的。过滤器的情况下，若发生堵塞，则无法进行分离，因此必须以能够仅捕捉靶标的细胞、除去多余的细胞的方式优化孔的大小、形状、密度。
用这样的基于物性的分离方法浓缩的细胞是无标记的，为了将靶标细胞可视化而进行确定，会进行基于对靶标细胞有特异性的抗体的免疫染色。然而，由于分离过滤器是柔软的，用显微镜观察确定细胞时，过滤器发生弯曲而难以聚焦。因此，将过滤器中捕捉的细胞再次转移到管(tube)中之后，在管内进行染色操作，转移至载玻片进行观察，但在染色操作的过程中存在细胞丢失的风险。
作为基于尺寸、变形性的分离，有形成为微过滤器形状、间隙形状的微流控芯片，其进行了精细加工且具有形状分离功能。该情况下，在微通道内进行分离和捕捉的处理，因此处理后能直接在芯片内染色，另外，与过滤器相比刚直性高，能够直接供于显微镜观察。
基于分离过滤器的方法、基于微流控芯片的分离方法中，能够通过颠倒流动的方向将保留的细胞回收至管等中。将被回收至管等中的细胞再次重新铺在载玻片上，能够仅单独分离出特定的细胞。然而，若高密度地铺细胞，则细胞会互相重叠，因此观察变得困难，另外，回收细胞时存在靶标以外的细胞也被回收的风险。
因此，通过具备单细胞尺寸的有分隔壁的分区的过滤器或基板将单细胞阵列化的方法是已知的。例如，具备在底部具有贯通孔的微凹坑的过滤器能够同时地进行基于大小、变形性的分离与单细胞的阵列化，因此可实现与相邻的细胞的分隔壁分离，在能够回收分析单细胞的方面具有优点。
具有微凹坑的过滤器的情况下，观察或回收细胞时，分解保持过滤器的壳体、垫圈，取出过滤器，或者颠倒流动的方向，从而回收所保持的细胞(非专利文献3)。
然而，微凹坑的数目是有限的，若所有的微凹坑被细胞占据，则无法进行进一步的分离与容纳。因此已知有组合有多种分离手法的分离方法。例如已知有在进行基于过滤器的尺寸分离之后，通过基于CD45抗体的阴性选择来除去白血球，通过电泳芯片将细胞捕捉于微凹坑这样的方法(非专利文献4)。然而，该方法中，每1步骤都需要将细胞转移至设备，存在稀少细胞发生损失的问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 21:521-530,2002 521.
非专利文献2：Liu,Z.等人，Negative enrichment by immunomagneticnanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells fromperipheral blood of cancer patients.J.Transl.Med.9,70-70(2011).
非专利文献3：S Khetani et adl.Filter-based isolation,enrichment,andcharacterization of circulating tumor cells.Biotechnol Bioeng.2018Oct；115(10):2504-2529.
非专利文献4：Cancer marker-free enrichment and direct mutationdetection in rare cancer cells by combining multi-property isolation andmicrofluidic concentration Lab Chip,2019,19,757-766.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是为了解决前述问题完成的，提供能够通过在1个设备中进行靶标粒子的过滤器分离、非靶标细胞的除去、靶标粒子在凹坑中的容纳从而抑制靶标粒子的损失的、靶标粒子的分离方法及系统。
用于解决课题的手段
为了解决前述课题，本发明的各方式具备以下的构成。
[1]本发明的一个方式为从包含靶标粒子及非靶标粒子的流体中分离出前述靶标粒子的靶标粒子的分离方法，其使用粒子捕捉设备，该粒子捕捉设备具备：
腔室；入前述腔室的流入路；出前述腔室的排出路；设置于前述排出路、且前述靶标粒子不透过而前述流体透过的过滤器；和设置于前述腔室内的靶标粒子捕捉膜，其中，前述靶标粒子捕捉膜具有朝向前述腔室的内侧形成且可在其内部收容前述粒子的多个凹坑，
所述分离方法具备下述工序：
导入工序，将包含前述靶标粒子及前述非靶标粒子的前述流体从前述流入路导入前述腔室内；
浓缩工序，使前述流体的至少一部分通过前述第一排出路而排出，从而由前述过滤器浓缩前述靶标粒子、和前述非靶标粒子的至少一部分；
分离工序，利用仅吸引该非靶标粒子的吸引手段，将由前述过滤器滤出的前述非靶标粒子从前述靶标粒子中分离；和
容纳工序，在前述腔室内将前述靶标粒子容纳于前述凹坑中。
根据前述靶标粒子的分离方法，将包含靶标粒子及非靶标粒子的流体从前述粒子捕捉设备的前述流入路导入前述腔室内，使前述流体的至少一部分通过前述第一排出路而排出，从而由前述过滤器浓缩前述靶标粒子、和前述非靶标粒子的至少一部分。接着，利用仅吸引该非靶标粒子的吸引手段将由前述过滤器滤出的非靶标粒子从靶标粒子中分离，在前述腔室内中将前述靶标粒子容纳于前述凹坑中。
根据该方法，能够在1个粒子捕捉设备中进行靶标粒子的过滤器分离、与靶标粒子一同滤出的非靶标细胞的除去、及靶标粒子在凹坑中的容纳，能够抑制靶标粒子的损失。
[2]也可以是，在前述方式[1]中，其在前述导入工序之前还具备用磁性抗体标记前述非靶标粒子的标记工序，在前述分离工序中，利用前述吸引手段的磁力吸引经标记的前述非靶标粒子，将经标记的前述非靶标粒子从前述靶标粒子中分离。
根据该方法，在导入工序之前事先用磁性抗体标记非靶标粒子，在前述分离工序中，利用前述吸引手段产生磁力，利用该磁力吸引经标记的前述非靶标粒子而将其从前述靶标粒子中分离，因此能够利用磁力的控制而容易地控制非靶标粒子的吸引力，易于实现最优的分离条件。
[3]也可以是，在前述方式[1]中，在前述过滤器中固定有与前述非靶标粒子选择性结合的阴性选择标志物，在前述分离工序中，固定于前述过滤器的前述阴性选择标志物与前述非靶标粒子结合，从而将前述非靶标粒子从前述靶标粒子中分离。
根据该方法，过滤器中固定有阴性选择标志物，该阴性选择标志物与由过滤器滤出的非靶标粒子结合，从而将非靶标粒子从靶标粒子中分离，因此易于以高选择性分离非靶标粒子。
[4]也可以是，在前述方式[1]中，在前述腔室内设置有吸引部，该吸引部固定有与前述非靶标粒子选择性结合的阴性选择标志物，在前述分离工序中，固定于前述吸引部的前述阴性选择标志物与前述非靶标粒子结合，从而将前述非靶标粒子从前述靶标粒子中分离。
根据该方法，在前述腔室内的特定位置固定有阴性选择标志物，该阴性选择标志物与由过滤器滤出的非靶标粒子结合，从而将非靶标粒子从靶标粒子中分离，因此易于以高选择性且在远离靶标粒子的位置分离非靶标粒子。
[5]也可以是，在前述方式[3]及[4]中，前述非靶标粒子为白血球，前述阴性选择标志物为CD34抗体及CD45抗体中的至少一者。该情况下，CD34抗体及CD45抗体的至少一者与由过滤器滤出的白血球结合，能够以高选择性将白血球从靶标粒子中分离。
[6]也可以是，在前述方式[1]～[5]中，还具备在将前述靶标粒子容纳于前述凹坑中之前或之后对该靶标粒子进行染色的染色工序。该情况下，靶标粒子经染色工序被染色，而后，在由凹坑捕捉后容易地进行靶标粒子的检测。
[7]也可以是，在前述方式[6]中，在前述染色工序之后还具备对前述凹坑内进行观察来确定经染色的前述靶标粒子的检测工序。该情况下，经染色工序被染色的靶标粒子经检测工序被检测，而后，能够容易地进行由凹坑捕捉的靶标粒子的检查、回收。
[8]也可以是，在前述方式[7]中，在前述检测工序之后还具备将所确定的前述靶标粒子回收的回收工序。该情况下，确定靶标粒子的位置之后进行回收，因此回收可容易地进行。
[9]本发明的其他方式为从包含靶标粒子及非靶标粒子的流体中分离出前述靶标粒子的靶标粒子的分离系统，其具备粒子捕捉设备、及用于仅吸引前述非靶标粒子而将其从前述靶标粒子中分离的吸引手段，其中，该粒子捕捉设备具备：
腔室；入前述腔室的流入路；出前述腔室的排出路；设置于前述排出路、且前述靶标粒子不透过而前述流体透过的过滤器；和设置于前述腔室内的靶标粒子捕捉膜，其中，前述靶标粒子捕捉膜具有朝向前述腔室的内侧形成且可在其内部收容前述粒子的多个凹坑。
根据这样的靶标粒子的分离系统，将包含靶标粒子及非靶标粒子的流体从前述粒子捕捉设备的前述流入路导入前述腔室内，使前述流体的至少一部分通过前述第一排出路而排出，从而能够由前述过滤器浓缩前述靶标粒子、和前述非靶标粒子的至少一部分。接着，利用仅吸引该非靶标粒子的吸引手段将由前述过滤器滤出的非靶标粒子从靶标粒子中分离，在前述腔室内中将前述靶标粒子容纳于前述凹坑中。根据该系统，能够在1个粒子捕捉设备中进行靶标粒子的过滤器分离、与靶标粒子一同滤出的非靶标细胞的除去、及靶标粒子在凹坑中的容纳，能够抑制靶标粒子的损失。
[10]也可以是，在前述方式[1]～[9]中，前述粒子捕捉设备的前述靶标粒子捕捉膜的面积小于前述过滤器的面积。该情况下，能够以小面积捕捉靶标粒子，具有靶标粒子的检查、回收易于进行的优点。
发明效果
如以上所说明的，根据本发明的靶标粒子的分离方法及系统，能够在1个粒子捕捉设备中进行靶标粒子的过滤器分离、与靶标粒子一同滤出的非靶标细胞的除去、及靶标粒子在凹坑中的容纳，能够抑制靶标粒子的损失。
附图说明
[图1]为示出本发明的靶标粒子的分离方法的第一实施方式的流程图。
[图2]为示出第一实施方式中将包含靶标粒子及非靶标粒子的流体导入腔室内的工序的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图3]为示出第一实施方式中由过滤器浓缩靶标粒子的工序的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图4]为示出第一实施方式中由过滤器浓缩靶标粒子后的状态的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图5]为示出第一实施方式中吸引非靶标粒子而将其从靶标粒子中分离的工序的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图6]为示出第一实施方式中将靶标粒子容纳于凹坑中的工序的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图7]为示出第一实施方式中将靶标粒子回收的工序的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图8]为示出靶标粒子捕捉膜的一例的立体放大图。
[图9]为示出本发明的靶标粒子的分离方法的第二实施方式中吸引非靶标粒子而将其从靶标粒子中分离的工序的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图10]为示出本发明的靶标粒子的分离方法的第三实施方式中吸引非靶标粒子而将其从靶标粒子中分离的工序的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
[图11]为示出本发明的靶标粒子的分离方法的第七实施方式中所使用的粒子捕捉设备的纵向剖视图。
具体实施方式
以下，使用附图对本发明的靶标粒子的分离方法及系统的实施方式详细地进行说明。图1为示出本发明的第一实施方式的流程图，图2～图7为示出第一实施方式的各工序中的粒子捕捉设备的纵向剖视图，首先使用图2对前述粒子捕捉设备1的结构进行说明。
粒子捕捉设备1具有呈上表面开放的容器形状的设备主体2，设备主体2之中配置有靶标粒子捕捉膜6，较之靶标粒子捕捉膜6靠下侧的空间为第一排出路8。设备主体2的形状没有限定，可以为任意形状，例如能够采用具有矩形状、椭圆状或圆状等平面形状的平坦的底部、和具有自该底部垂直地立起的周壁部的形状等。靶标粒子捕捉膜6在设备主体2的使用状态下优选水平且平坦地配置，但并非必须是水平且平坦的，例如也可以稍稍倾斜、或者根据需要而使其呈曲面状。
设备主体2在任意位置形成有排出口4，能够通过排出口4使第一排出路8内的流体排出，流体随着排出而通过靶标粒子捕捉膜6并从上往下流动。在图示的例子中，在设备主体2的底部的中央形成有一个排出口4，但并不限于该构成，可以形成在设备主体2的周壁部、其他部分，也可以形成多个，也可以是设备主体2的整个下端开放而作为排出口4。
在设备主体2的较之靶标粒子捕捉膜6靠上侧远离靶标粒子捕捉膜6地配置有过滤器保持部10。在过滤器保持部10的下端配置有过滤器12，在过滤器保持部10的内部，在过滤器12之上形成有第二排出路14，形成有从第二排出路14通向外部的排出口16。该例子的过滤器12在设备主体2的使用状态下优选水平且平坦地配置，但并非必然是水平且平坦的，例如也可以稍稍倾斜、或者根据需要而使其呈曲面状。
过滤器保持部10可以固定于设备主体2，但更优选能从设备主体2装卸，该情况下，若从设备主体2取下过滤器保持部10，则能够使靶标粒子捕捉膜6的上表面露出，例如如图7所示，利用微量移液器等操作手段21直接对靶标粒子捕捉膜6的上表面所捕捉的靶标粒子CT进行操作变得容易。
就过滤器保持部10而言，底部由过滤器12构成，在内部形成有第二排出路14，形成有从第二排出路14通向外部的排出口16。该例子在过滤器保持部10的顶板部的中央形成有一个排出口16，但不限于该构成，也可以在过滤器保持部10的侧面形成排出口16，也可以形成与第二排出路14的两端相通的一对排出口16。
在设备主体2的靶标粒子捕捉膜6与过滤器保持部10的过滤器12之间形成有腔室20。另外，在设备主体2与过滤器保持部10之间在至少一部分形成有与腔室20连通的流入路18。也可为由过滤器保持部10将设备主体2的整个上表面封固、在设备主体2的侧面形成流入路18的构成。
如图8所示，该例子的靶标粒子捕捉膜6规则地形成有大量朝向上表面呈凹形状的精细的凹坑22。该例子中，各凹坑22在俯视下呈正六边形状，具有六边形状的凹坑底部28、和自各凹坑底部28立起的呈正六边形筒状的凹坑壁部24，凹坑壁部24作为整体具有蜂巢结构。凹坑22的形状不限于这样的六边形状，可以为圆形，也可以为四边形状。
每一个凹坑22在凹坑底部28的中央处上下贯通地形成有二个凹坑排出口26，凹坑22内的流体通过凹坑排出口26向靶标粒子捕捉膜6的下表面侧排出。该例子中，每一个凹坑22形成有二个凹坑排出口26，但每个凹坑22的凹坑排出口26的个数可以是1个，也可以是3个以上。2个以上的情况下，具有即使靶标粒子CT进入凹坑22内的情况下凹坑排出口26也不易被完全堵塞的优点。
凹坑22的尺寸及深度能够根据应捕捉的靶标粒子CT的尺寸而选择。具体而言，凹坑22的尺寸及深度设定为略微大于应捕捉的靶标粒子CT，一个靶标粒子CT与凹坑壁部24之间空开些许间隙的方式收纳于凹坑22内。根据需要，可以设为凹坑22内可分别容纳规定个数、例如2个、3个或其以上的个数的靶标粒子CT的大小。
靶标粒子捕捉膜6可以直接安装于设备主体2，作为代替，也可以固定于未图示的框体，该框体以可装卸的方式安装于设备主体2。该情况下，具有通过连同筐体更换靶标粒子捕捉膜6而使凹坑22的尺寸变得能够选择的优点。具有即使在靶标粒子捕捉膜6变得无法使用的情况下也能够再利用设备主体2的优点。
过滤器12为具有大量几乎恒定的尺寸的通孔的多孔质膜，通孔的尺寸大于应透过的非靶标粒子(图2～图7中为CB、CC)的尺寸，小于靶标粒子CT及不使其透过的非靶标粒子(图2～图7中为CA)的尺寸。由此，非靶标粒子CB、CC通过过滤器12，靶标粒子CT及非靶标粒子CA无法通过过滤器12。按过滤器12的每个网眼的尺寸单独设置过滤器保持部10，更换过滤器保持部10，从而能够变更通孔的尺寸。
过滤器12与靶标粒子捕捉膜6的间隔量L(图2)优选在靶标粒子捕捉膜6的整个范围内几乎恒定。该情况下，从过滤器12的下表面落下的靶标粒子CT一边在流体中晃动一边降落，以几乎相同的分散面积到达靶标粒子捕捉膜6上，因此能够使得靶标粒子捕捉膜6的整个范围内凹坑22捕捉靶标粒子CT的概率几乎相等。
该实施方式中，过滤器12与靶标粒子捕捉膜6的面积几乎相同，但也可以如后述图11所示的实施方式那样，使靶标粒子捕捉膜6的面积小于过滤器12的面积，靶标粒子CT集中降落在小面积，从而使靶标粒子CT的检查、基于操作手段21的回收变得容易。另外，也能够根据某种需要，使靶标粒子捕捉膜6的面积大于过滤器12。
接着，按照图1的流程图，对第一实施方式的靶标粒子的分离方法进行说明。以下的说明相当于例如使用人或动物的血液、或者血液的稀释液或成分提取液作为样品，从血液中所存在的多种细胞之中捕捉特定的靶标细胞的情况等，但本发明并不限于血液样品，可以使用任意生物体样品或非生物体样品，也可以将它们中所包含的任意粒子作为靶标粒子。作为流体，能够使用适合保存靶标粒子CT的各种缓冲液。
步骤S1中，如图2所示，将包含靶标粒子CT及非靶标粒子CA、CB、CC的流体从流入路18导入腔室20内。该图的例子中，非靶标粒子设为了三种，但这仅是一例，非靶标粒子可以是1种或2种，也可以是4种以上。靶标粒子CT也可以包含多种粒子。
步骤S2中，如图3所示，在从流入路18适当供给流体的同时，利用未图示的吸引手段从排出口16吸引第二排出路14内的流体。由此，透过过滤器12的尺寸的非靶标粒子CB、CC进入第二排出路14内，从排出口16被排出去。最终如图4所示，能够利用过滤器12几乎仅将靶标粒子CT与非靶标粒子CA浓缩在腔室20内。
步骤S3中，如图5所示，利用未图示的吸引手段使过滤器12的下表面所捕捉的靶标粒子CT及非靶标粒子CA之中的仅非靶标粒子CA从过滤器12脱落，将其从过滤器12中剩余的靶标粒子CT中分离。
该第一实施方式中，作为吸引手段，利用来自排出口4的流体的进出量、来自排出口16的流体的进出量、来自流入路18的流体的排出量的平衡。即，通过控制来自排出口4的流体的进出量、来自排出口16的流体的进出量、来自流入路18的流体的排出量这3种流量，调节通过过滤器12流动的流体的流速，靶标粒子CT残留在过滤器12的下表面，而另一方面非靶标粒子CA从过滤器12脱落，并且从过滤器12脱落的非靶标粒子CA从流入路18被排出。
之所以能够利用这样的吸引手段，是因为存在靶标粒子CT与非靶标粒子CA的比重差、尺寸差、及/或对过滤器12的附着性(物理附着性的强弱、表面亲和性、粒子形状差等)的差，利用通过过滤器12流动的流体的流速而产生残留在过滤器12的下表面、或者从过滤器12脱落的差的情况。假设这样的基于流体流速的残存/脱落的控制无法进行的情况下，能够采用后述的第二实施方式～第四实施方式那样基于磁力的分离、基于阴性选择标志物的分离、或基于静电力的分离等。
步骤S4中，如图6所示，在腔室20内使靶标粒子CT从过滤器12脱落，从流体中降落，容纳于靶标粒子捕捉膜6的凹坑22中。此时，也可以停止从排出口4、排出口16及流入路18的流体的进出。或者为了促进靶标粒子CT的捕捉，也可以根据需要从排出口4排出流体，将靶标粒子CT吸入凹坑22内、且从流入路18将流体供给至腔室20内。
步骤S5中，如图7所示，可以从设备主体2取下过滤器保持部10，利用未图示的显微镜、检查装置，对靶标粒子捕捉膜6的任意的凹坑22捕捉到的靶标粒子CT的位置进行确定，利用微量移液器等操作手段21从凹坑22逐个回收靶标粒子CT。或者，也可以不回收靶标粒子CT，以被捕捉于靶标粒子捕捉膜6的凹坑22中的状态对所确定的靶标粒子CT进行各种检查。
为了使确定靶标粒子CT变得容易，也可以设置预先用各种染色剂对靶标粒子CT进行染色的染色工序。染色工序可以在步骤S1之前、即制备样品的时刻进行，或者也可以在步骤S2～S4中的任一工序中向流体中添加染料来对靶标粒子CT进行染色。染色剂的种类没有限定，可以为任意以往用于同样目的的染色剂。
作为对凹坑内进行观察来确定经染色的靶标粒子的检测工序，根据染色剂的发光波长或吸光波长，利用基于显微镜的观察、使用了荧光显微镜的观察、或者这些与使用了计算机的图像处理等，能够确定靶标粒子捕捉膜6的哪个位置的凹坑22捕捉到了靶标粒子CT。利用计算机确定了坐标的情况下，能够自动地对该位置的凹坑22内的靶标粒子CT进行回收或检查。
根据以上的第一实施方式，能够在1个粒子捕捉设备1中进行靶标粒子CT的基于过滤器12的分离、与靶标粒子CT一同滤出的非靶标细胞CA的分离与除去、及靶标粒子CT在凹坑22中的容纳，能够抑制靶标粒子CT的损失。
[使用了磁力的第二实施方式]
图9示出了本发明的第二实施方式中的步骤S3(非靶标粒子的除去工序)。除非特别说明，其他步骤S1、S2、S4、S5与第一实施方式同样即可，但该第二实施方式中，在步骤S1(导入工序)之前，还具备预先用磁性抗体标记不通过过滤器12的非靶标粒子CA的标记工序。作为磁性抗体，例如能够使用表面预先结合有抗体的磁性珠等，该抗体会与不通过过滤器12的非靶标粒子CA的表面存在的抗原结合。
磁性珠例如能够使用下述物质：有尖晶石铁氧体(AFe2O4(A为Mn、Co、Ni、Cu、Zn等)、六方晶铁氧体(AFe12O19(A为Ba、Sr、Pb等))等铁氧体等的芯，对芯的表面用亲水性聚合物或脂质等进行被覆以赋予官能团，进一步对前述官能团赋予抗生物素蛋白(日文：アジビン)、白蛋白、蛋白A、蛋白G等的抗体、蛋白质而成的物质；或者，使用内部分散有前述铁氧体等可磁化物质的高分子聚合物的芯与前述同样地赋予抗体而得的物质；等等。
磁性珠可以为微米(μm)尺寸，也可以是纳米(nm)尺寸。微米尺寸的情况下，每一粒子的磁力强，因此磁性带来的捕获效果高，而珠的每单位质量能够结合的活性物质的量相应于比表面积减小的量而减小。另一方面，纳米尺寸的珠的比表面积大，因此珠的每单位质量能够结合的活性物质的量多，易于提高检测靶标粒子CT的灵敏度。能够根据目的区别使用。
该第二实施方式的方法中，图3所示的步骤S2中，在从流入路18适当供给流体的同时，利用未图示的吸引手段从排出口16吸引第二排出路14内的流体。由此，透过过滤器12的尺寸的非靶标粒子CB、CC通过第二排出路14从排出口16被排出，而另一方面，尺寸大于过滤器12的通孔的靶标粒子CT和非靶标粒子CA未能通过过滤器12而残留于腔室20内。
此时、或自如图3所示的步骤S2的过滤的开始时起，如图9所示，在过滤器12的与粒子捕捉面相反的一侧、即过滤器12的上侧事先配置磁体30。由此，表面预先附着有磁性珠的非靶标粒子CA被磁体30所产生的的磁性吸引而抵靠于过滤器12，因此维持被过滤器12捕捉的状态。与此相对，靶标粒子CT未附着有磁性珠，因此不会受到磁体30所产生的磁力的影响，故而容易从过滤器12脱落，在流体内降落，到达靶标粒子捕捉膜6而被捕捉于凹坑22。
磁体30可以是永磁体，也可以是电磁体。使用电磁体的情况下，具有能够利用电流的ON/OFF切换非靶标粒子CA的吸引/非吸引，以及能够利用电流的调节来控制吸引力的大小的优点。图示的例子中，磁体30配置于过滤器保持部10之上，但不限于该结构，也能够在过滤器保持部10的内部配置磁体30，将磁体30分割成多个小型的磁体使它们一起ON/OFF磁力；或者，也可以为构成为保持于共同的支承体而能够同时上下移动。
靶标粒子CT被捕捉于凹坑22之后，将磁体30与过滤器保持部10一同除去，将非靶标粒子CA与过滤器12一同除去，使靶标粒子捕捉膜6露出，对凹坑22内的靶标粒子CT进行检查或利用微量移液器等操作手段21进行回收。
根据该方法，在步骤S1之前，事先用磁性抗体标记非靶标粒子CT，步骤S3中，利用磁体30的磁力吸引经标记的非靶标粒子CA将其从靶标粒子CT中分离，因此能够通过磁力的控制来容易地控制非靶标粒子CA的吸引力，易于实现最优的分离条件。
[第三实施方式]
图10示出本发明的第三实施方式中的步骤S3(非靶标粒子的除去工序)。除非特别说明，其他步骤S1、S2、S4、S5与第一实施方式同样即可，但该第三实施方式也与第二实施方式同样地在步骤S1(导入工序)之前还具备预先用磁性抗体标记不通过过滤器12的非靶标粒子CA的标记工序。磁性抗体可以与第二实施方式同样。
该第三实施方式的方法中，在图3所示的步骤S2中，从流入路18适当供给流体，且同时从排出口16吸引第二排出路14内的流体。由此，透过过滤器12的尺寸的非靶标粒子CB、CC通过第二排出路14从排出口16被排出，而另一方面，尺寸大于过滤器12的通孔的靶标粒子CT和非靶标粒子CA未能通过过滤器12而残留于腔室20内。
过滤结束之后，如图10所示，将磁体32从流入路18插入腔室20内。由此，表面预先附着有磁性珠的非靶标粒子CA被磁体32所产生的磁性吸引，远离过滤器12并被吸附于磁体32。与此相对，靶标粒子CT未附着有磁性珠，因此不会受到磁体32所产生的磁力的影响，一旦从过滤器12脱落，则在流体内降落而到达靶标粒子捕捉膜6，被捕捉于凹坑22。
靶标粒子CT被捕捉于凹坑22之后，将非靶标粒子CA与磁体32一同除去，除去过滤器保持部10，使靶标粒子捕捉膜6露出，对凹坑22内的靶标粒子CT进行检查或利用微量移液器等操作手段21进行回收。
根据该方法，能够利用被置于远离过滤器12的位置的磁体32将用磁性抗体进行了标记的非靶标粒子CA吸引至远离靶标粒子CT的位置，因此具有易于分离非靶标粒子CA的优点。
[第四实施方式]
本发明的第四实施方式的特征在于，事先在过滤器12中固定与不通过过滤器12的非靶标粒子CA选择性结合的阴性选择标志物。
阴性选择标志物例如能够使用与不通过过滤器12的非靶标粒子CA的表面存在的抗原选择性结合的抗体等。由此，图3所示步骤S3中，过滤器12中固定的阴性选择标志物与非靶标粒子CA结合，由此维持使非靶标粒子CA附着于过滤器12的状态。另一方面，靶标粒子CT没有与过滤器12的阴性选择标志物结合，因此从过滤器12脱落在流体内降落，到达靶标粒子捕捉膜6而被捕捉于凹坑22。
根据该方法，过滤器12固定有阴性选择标志物，该阴性选择标志物与由过滤器12滤出的带标记的非靶标粒子CA结合，由此将非靶标粒子CA从靶标粒子CT中分离，因此能够以高选择性分离非靶标粒子CA。
[第五实施方式]
本发明的第五实施方式的特征在于，事先将与不通过过滤器12的非靶标粒子CA选择性结合的阴性选择标志物固定于除过滤器12以外的部位。具体而言，在腔室20内设置吸引部，该吸引部固定有与非靶标粒子CA选择性结合的阴性选择标志物，在分离工序中固定于前述吸引部的阴性选择标志物与非靶标粒子CA结合，从而将非靶标粒子CA从靶标粒子CT中分离。另一方面，靶标粒子CT不会与过滤器12的阴性选择标志物结合，因此从过滤器12脱落并在流体内降落，到达靶标粒子捕捉膜6而被捕捉于凹坑22。
前述吸引部的位置只要在腔室20内则没有限定，例如，可以事先将阴性选择标志物固定于设备主体2的腔室20的内壁面，也可以从流入路18、特别设置的插入口贯通设备主体2的壁面，将具有吸引部的构件插入腔室20内部。也可以设为将设置有吸引部的构件32插入腔室20的构造来代替图10的磁体32。
根据该方法，在腔室20内的特定位置固定有阴性选择标志物，该阴性选择标志物与由过滤器12滤出的非靶标粒子CA结合，从而将非靶标粒子CA从靶标粒子CT中分离，因此易于以高选择性并且在远离靶标粒子CT的位置分离非靶标粒子CA。
[第六实施方式]
本发明的第六实施方式的特征在于，不通过过滤器12的非靶标粒子CA为白血球，前述阴性选择标志物为CD34抗体及CD45抗体中的至少一者。该情况下，靶标粒子CT没有限定，例如也可以为血中循环肿瘤细胞/CTC(Circulating Tumor Cell)、胎儿有核红血球(fNRBC)等。
CD34抗体与产生血液中的白血球的造血干细胞的表面存在的CD34抗原选择性结合。CD45抗体与作为白血球共同抗原的CD45抗原选择性结合。使用这些CD34抗体及CD45抗体中的至少一者作为第四实施方式或第五实施方式的方法中的阴性选择标志物，从而使作为非靶标粒子的白血球CA与CD34抗体及CD45抗体结合，将白血球CA从靶标粒子CT中分离。另一方面，靶标粒子CT不会与CD34抗体及CD45抗体结合，因此从过滤器12脱落在流体内降落，到达靶标粒子捕捉膜6而被捕捉于凹坑22。
根据该方法，具有能够以高选择性将不易与靶标粒子CT区分的白血球CA从靶标粒子CT中除去的优点。
[第七实施方式]
图11为示出本发明中可使用的粒子捕捉设备1的第七实施方式的纵向剖视图。该第七实施方式中，设备主体2具有底部2A、锥部2B及扩大部2C。底部2A具有底板和自其周围立起的周壁，该例子中，底部2A的底板的中央形成有排出口4。其中，排出口4也可以不在该位置。自底部2A的周壁的上端起朝向斜上方形成锥部2B，越往上方行进越在水平方向上扩大而呈锥状。靶标粒子捕捉膜6在使用形态下沿着底部2A与锥部2B的边界水平地配置，支撑靶标粒子捕捉膜6的框体7以能沿着底部2A的周壁的内侧取下的方式配置。设备主体2的平面形状没有限定，也可以为矩形状、圆形、椭圆形、在矩形状的两侧设置有半圆部的形状，等等。
自锥部2B的上端起朝向上方形成筒状的扩大部2C，过滤器保持部10以可装卸且在使用形态下水平且可装卸地安装于该扩大部2C的内侧。在使向靶标粒子捕捉膜6的靶标粒子CT的降落密度均一化这一点上，优选以过滤器保持部10的过滤器12的中心位置与靶标粒子捕捉膜6的中心位置大致一致的方式进行配置，但两者并非必须一致。
在锥部2B的周壁的一部分形成有开口部19并与流入路18相连。也能够沿着流入路18如图10的实施方式那样插入磁体30；或者向过滤器保持部10的上方如图9的实施方式那样配置磁体30。其他构成可以与之前已说明的其他实施方式同样，故而省略说明。
根据图11的第七实施方式，设备主体2呈朝上扩大的形状，靶标粒子捕捉膜6的面积小于过滤器12的面积，在该小面积中捕捉靶标粒子CT，具有取下过滤器保持部10之后可容易地进行靶标粒子CT的检查、回收的优点。对于锥部2B的相对于铅垂线的倾斜角度，选择靶标粒子CT不会附着于锥部2B的内壁面而停止的程度的角度。为了将该角度尽可能设定地接近水平，也可以在设备主体2中设置振动装置，使设备主体2轻微振动而促进靶标粒子CT落向靶标粒子捕捉膜6。
以上对本发明的各种实施方式进行了说明，但本发明并不仅限于前述实施方式，可根据权利要求书的范围进行广义的解释，可以将前述实施方式的各构成变更为已知的其他构成，也可以省略一部分的构成，还可以在实施方式彼此间适当重组。
产业上的可利用性
根据本发明的靶标粒子的分离方法及系统，能够在1个粒子捕捉设备中进行靶标粒子的过滤器分离、与靶标粒子一同滤出的非靶标细胞的除去、及靶标粒子在凹坑中的容纳，能够抑制靶标粒子的损失。因此能够在产生上利用。
附图标记说明
1：粒子捕捉设备、2：设备主体、2A：底部、2B：锥部、2C：扩大部、4：排出口、6：靶标粒子捕捉膜、7：框体、
8：第一排出路、10：过滤器保持部、12：过滤器、14：第二排出路、16：排出口、18：流入路、19：开口部、20：腔室、
21：操作手段、22：凹坑、24：凹坑壁部、26：凹坑排出口、
28：凹坑底部、30：磁体、32：磁体、
CA～CC：非靶标粒子、CT：靶标粒子。

Claims (10)

1.靶标粒子的分离方法，其为从包含靶标粒子及非靶标粒子的流体中分离出所述靶标粒子的靶标粒子的分离方法，其特征在于，
使用粒子捕捉设备，该粒子捕捉设备具备：
腔室；
入所述腔室的流入路；
出所述腔室的排出路；
设置于所述排出路、且所述靶标粒子不透过而所述流体透过的过滤器；和
靶标粒子捕捉膜，其设置于所述腔室内，
其中，所述靶标粒子捕捉膜具有朝向所述腔室的内侧形成且可在其内部收容所述粒子的多个凹坑，
所述分离方法具备下述工序：
导入工序，将包含所述靶标粒子及所述非靶标粒子的所述流体从所述流入路导入所述腔室内；
浓缩工序，使所述流体的至少一部分通过所述第一排出路而排出，从而由所述过滤器浓缩所述靶标粒子、和所述非靶标粒子的至少一部分；
分离工序，利用仅吸引所述非靶标粒子的吸引手段将由所述过滤器滤出的所述非靶标粒子从所述靶标粒子分离；和
容纳工序，在所述腔室内将所述靶标粒子容纳于所述凹坑。
2.如权利要求1所述的靶标粒子的分离方法，其在所述导入工序之前还具备预先用磁性抗体标记所述非靶标粒子的标记工序，
在所述分离工序中，利用所述吸引手段的磁力吸引经标记的所述非靶标粒子，将经标记的所述非靶标粒子从所述靶标粒子中分离。
3.如权利要求1所述的靶标粒子的分离方法，其中，
在所述过滤器中固定有与所述非靶标粒子选择性结合的阴性选择标志物，
在所述分离工序中，固定于所述过滤器的所述阴性选择标志物与所述非靶标粒子结合，从而将所述非靶标粒子从所述靶标粒子分离。
4.如权利要求1所述的靶标粒子的分离方法，其中，
在所述腔室内设置有吸引部，该吸引部固定有与所述非靶标粒子选择性结合的阴性选择标志物，
在所述分离工序中，固定于所述吸引部的所述阴性选择标志物与所述非靶标粒子结合，从而将所述非靶标粒子从所述靶标粒子分离。
5.如权利要求3或4所述的靶标粒子的分离方法，其中，
所述非靶标粒子为白血球，所述阴性选择标志物为CD34及CD45中的至少一者。
6.如权利要求1～5中任一项所述的靶标粒子的分离方法，其还具备在将所述靶标粒子容纳于所述凹坑之前或之后对该靶标粒子进行染色的染色工序。
7.如权利要求6所述的靶标粒子的分离方法，其在所述染色工序之后还具备对所述凹坑内进行观察来确定经染色的所述靶标粒子的检测工序。
8.如权利要求7所述的靶标粒子的分离方法，其在所述检测工序之后还具备将所确定的所述靶标粒子回收的回收工序。
9.靶标粒子的分离系统，其为从包含靶标粒子及非靶标粒子的流体中分离出所述靶标粒子的靶标粒子的分离系统，其特征在于，具备粒子捕捉设备、及用于仅吸引所述非靶标粒子而将其从所述靶标粒子分离的吸引手段，
所述粒子捕捉设备具备：
腔室；
入所述腔室的流入路；
出所述腔室的排出路；
设置于所述排出路、且所述靶标粒子不透过而所述流体透过的过滤器；和
靶标粒子捕捉膜，其设置于所述腔室内，
所述靶标粒子捕捉膜具有朝向所述腔室的内侧形成且可在其内部收容所述粒子的多个凹坑。
10.如权利要求9所述的靶标粒子的分离系统，其特征在于，
所述粒子捕捉设备的所述靶标粒子捕捉膜的面积小于所述过滤器的面积。
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