WO2021241283A1 - ターゲット粒子の分離方法およびシステム - Google Patents

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target
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享史 大坂
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東京応化工業株式会社
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology

Definitions

  • the present invention relates to separation methods and systems for separating, capturing, detecting, or isolating target particles such as cells.
  • a device that separates specific particles from particles of mixed sizes in a liquid has been conventionally known.
  • the cell components of blood are mainly erythrocytes, leukocytes, and platelets, among which are present, such as circulating tumor cells / CTC (Circulating Tumor Cell) and maternally derived fetal cells (fNRBC). It is known that cells with extremely low rates are mixed.
  • Label-free separation methods include negative selection using antibodies that bind to cells other than target cells, and methods based on differences in physical properties such as cell size, deformability, and density. Negative selections, for example, label leukocytes with a CD45 antibody bound to magnetic particles to isolate cancer cells in the blood, attract the labeled leukocytes to a magnet in the column, and in the unattracted cell fraction. (Non-Patent Document 1).
  • the concentration method by negative selection has a low recovery rate because the target cells are also involved when a large number of leukocytes are attracted to the magnet.
  • the recovery rate is reported to be 58%.
  • separation by a filter having a hole, a fine comb-shaped structure, or a microchannel chip having a stepped structure is known.
  • filters clogging prevents separation, so the size, shape, and density of the pores must be optimized so that only the target cells can be captured and excess cells removed.
  • the cells concentrated by such a separation method based on physical characteristics are label-free, and in order to visualize and identify the target cells, immunostaining with an antibody specific to the target cells is performed.
  • the separation filter is flexible, the filter bends when the cells are identified by microscopic observation, and it is difficult to focus. Therefore, after the cells captured by the filter are transferred to the tube again, the staining operation is performed in the tube, and the cells are transferred to the slide glass for observation, but there is a risk that the cells will be lost in the process of the staining operation.
  • microchannel chip As separation by size and deformability, there is a microchannel chip having a microfilter shape or a gap shape, which has a shape separation function that has been finely processed. In this case, since the separation and capture processing is performed in the microchannel, the staining can be performed in the chip as it is after the processing, and the rigidity is higher than that of the filter, so that it can be directly used for microscopic observation.
  • the retained cells can be collected in a tube or the like by reversing the flow direction.
  • the cells collected in a tube or the like can be re-rolled on a slide glass, and only specific cells can be isolated. However, if the cells are sprinkled at a high density, the cells overlap each other, which makes observation difficult, and when the cells are collected, there is a risk of collecting cells other than the target.
  • a method of arranging one cell by an array with a filter or a substrate having a partition having a partition wall of one cell size is known.
  • a filter having a microwell with a through hole at the bottom can perform separation by size and deformability and arraying of one cell at the same time, so that the septum is separated from the adjacent cell and one cell is recovered. There is a merit in that it can be analyzed.
  • Non-Patent Document 3 For filters with microwells, when observing or retrieving cells, the retained cells are recovered by disassembling the housing or gasket holding the filter and removing the filter or reversing the flow direction (reversing the flow direction).
  • Non-Patent Document 4 a separation method in which leukocytes are removed by negative selection with a CD45 antibody after size separation with a filter, and cells are captured in microwells with a dielectrophoretic chip.
  • this method requires the transfer of cells to the device step by step, which causes a problem of loss of rare cells.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and by performing filter separation of target particles, removal of non-target cells, and storage of target particles in wells with one device, loss of target particles can be achieved.
  • each aspect of the present invention comprises the following configurations.
  • One aspect of the present invention is a method for separating target particles from a fluid containing target particles and non-target particles.
  • a chamber an inflow path to the chamber, a discharge path from the chamber, a filter provided in the discharge path, which does not allow the target particles to permeate and allows the fluid to permeate, and a target provided in the chamber.
  • the target particle trapping membrane is formed facing the inside of the chamber and has a plurality of wells within which the particles can be accommodated.
  • An introduction step of introducing the fluid containing the target particles and the non-target particles into the chamber from the inflow path.
  • a fluid containing target particles and non-target particles is introduced into the chamber from the inflow path of the particle capture device, and at least a part of the fluid is discharged through the first discharge path.
  • the filter concentrate at least a part of the target particles and the non-target particles.
  • the non-target particles filtered by the filter are separated from the target particles by a suction means that sucks only the non-target particles, and the target particles are stored in the well in the chamber.
  • filter separation of target particles, removal of non-target cells filtered out with target particles, and storage of target particles in wells can be performed with one particle capture device, resulting in loss of target particles. It is possible to suppress.
  • a labeling step of labeling the non-target particles with a magnetic antibody is further provided prior to the introduction step, and in the separation step, the labeled non-target particles are further provided by the magnetic force of the suction means. May be aspirated to separate the labeled non-target particles from the target particles.
  • the non-target particles are labeled with a magnetic antibody prior to the introduction step, and in the separation step, a magnetic force is generated by the suction means, and the labeled non-target particles are attracted by this magnetic force. Since it is separated from the target particles, the attractive force of the non-target particles can be easily controlled by controlling the magnetic force, and it is easy to realize the optimum separation conditions.
  • a negative selection marker that selectively binds to the non-target particles is fixed to the filter, and in the separation step, the negative selection marker fixed to the filter is the non-target.
  • the non-target particles may be separated from the target particles by binding to the particles.
  • a negative selection marker is fixed to the filter, and the negative selection marker separates the non-target particles from the target particles by binding to the non-target particles filtered by the filter, so that high selectivity is obtained. Therefore, it is easy to separate non-target particles.
  • a suction portion to which a negative selection marker that selectively binds to the non-target particles is fixed is provided in the chamber, and is fixed to the suction portion in the separation step.
  • the non-target particles may be separated from the target particles by binding the negative selection marker to the non-target particles.
  • a negative selection marker is fixed at a specific position in the chamber, and the negative selection marker binds to the non-target particles filtered by the filter to separate the non-target particles from the target particles.
  • the negative selection marker With high selectivity, it is easy to separate non-target particles at a position away from the target particles.
  • the non-target particle may be leukocytes
  • the negative selection marker may be at least one of a CD34 antibody and a CD45 antibody.
  • the leukocytes can be separated from the target particles with high selectivity by binding to the leukocytes filtered by the filter at least one of the CD34 antibody and the CD45 antibody.
  • a dyeing step of dyeing the target particles before or after storage in the well may be further provided.
  • the target particles since the target particles are stained by the staining step, the target particles can be easily detected after being captured by the well.
  • a detection step of observing the inside of the well to identify the stained target particles may be further provided.
  • the target particles stained by the dyeing step are detected in the detection step, the target particles captured by the well can be easily inspected and recovered.
  • a recovery step of recovering the specified target particles may be further provided.
  • the target particles are collected after the position is specified, the collection can be easily performed.
  • Another aspect of the present invention is a target particle separation system that separates the target particles from a fluid containing target particles and non-target particles.
  • a chamber an inflow path to the chamber, a discharge path from the chamber, a filter provided in the discharge path, which does not allow the target particles to permeate and allows the fluid to permeate, and a target provided in the chamber.
  • a particle trapping device comprising a particle trapping membrane, wherein the target particle trapping membrane is formed facing the inside of the chamber and has a plurality of wells capable of accommodating the particles therein, and only the non-target particles.
  • a suction means for sucking and separating from the target particles is provided.
  • a fluid containing target particles and non-target particles is introduced into the chamber from the inflow path of the particle capture device and at least a portion of the fluid through the first discharge path.
  • the filter can concentrate at least a portion of the target particles and the non-target particles.
  • the non-target particles filtered by the filter are separated from the target particles by a suction means that sucks only the non-target particles, and the target particles are stored in the well in the chamber.
  • the system allows filter separation of target particles, removal of non-target cells filtered out with target particles, and storage of target particles in wells with a single particle capture device, resulting in target particle loss. It is possible to suppress.
  • the area of the target particle trapping film of the particle trapping device may be smaller than the area of the filter. In this case, since the target particles can be captured in a small area, there is an advantage that the target particles can be easily inspected and recovered.
  • filter separation of the target particle As described above, according to the target particle separation method and system of the present invention, filter separation of the target particle, removal of non-target cells filtered together with the target particle, and storage of the target particle in the well 1 This can be done with one particle capture device and can reduce the loss of target particles.
  • it is a vertical cross-sectional view of a particle capture device showing a step of introducing a fluid containing target particles and non-target particles into a chamber.
  • it is a vertical sectional view of a particle capture device showing a step of concentrating target particles with a filter.
  • it is a vertical sectional view of a particle capture device showing a state in which target particles are concentrated by a filter.
  • it is a vertical sectional view of a particle trapping device which shows the process of storing a target particle in a well.
  • it is a vertical cross-sectional view of a particle capture device showing a step of recovering target particles.
  • It is a perspective enlargement view which shows an example of a target particle trapping film.
  • It is a vertical cross-sectional view of the particle capture device which shows the step of sucking a non-target particle and separating it from a target particle in the 2nd Embodiment of the separation method of the target particle which concerns on this invention.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a first embodiment of the present invention
  • FIGS. 2 to 7 are vertical cross-sectional views of the particle trapping device in each step of the same embodiment. The structure will be explained.
  • the particle capture device 1 has a device body 2 having a container shape with an open upper surface, a target particle capture film 6 is arranged in the device body 2, and a space below the target particle capture film 6 is provided. It is the first discharge channel 8.
  • the shape of the device body 2 is not limited and may be any shape, but a flat bottom having a planar shape such as a rectangular shape, an elliptical shape, or a circular shape and a peripheral wall portion vertically erecting from the bottom portion are formed. The shape to have can be adopted.
  • the target particle trapping film 6 is preferably arranged horizontally and flat in the state of use of the device body 2, but it does not necessarily have to be horizontal and flat, for example, it may be slightly inclined or, if necessary, curved. It may have been done.
  • a discharge port 4 is formed in the device main body 2 at any position, and the fluid in the first discharge path 8 can be discharged through the discharge port 4, and the fluid flows from top to bottom through the target particle trapping film 6 as the discharge occurs.
  • one outlet 4 is formed in the center of the bottom of the device main body 2, but the present invention is not limited to this configuration, and the outlet 4 may be formed on the peripheral wall portion of the device main body 2 or another part. A plurality of them may be formed, or the entire lower end of the device main body 2 may be open as the discharge port 4.
  • a filter holding portion 10 is arranged above the target particle trapping film 6 of the device main body 2 away from the target particle capturing film 6.
  • a filter 12 is arranged at the lower end of the filter holding portion 10, a second discharge passage 14 is formed on the filter 12 inside the filter holding portion 10, and a discharge port 16 leading from the second discharge passage 14 to the outside is formed.
  • the filter 12 in this example is preferably arranged horizontally and flat in the state of use of the device body 2, but it does not necessarily have to be horizontal and flat, for example, it may be slightly inclined or, if necessary, curved. It may be set to.
  • the filter holding portion 10 may be fixed to the device main body 2, but it is more preferable that the filter holding portion 10 is detachable from the device main body 2. In that case, when the filter holding portion 10 is removed from the device main body 2, the target particles are removed.
  • the upper surface of the capture film 6 can be exposed, and as shown in FIG. 7, for example, the target particle CT captured on the upper surface of the target particle capture film 6 can be easily operated directly by an operating means 21 such as a micropipette. Become.
  • the bottom of the filter holding portion 10 is composed of a filter 12, a second discharge passage 14 is formed inside, and a discharge port 16 leading from the second discharge passage 14 to the outside is formed.
  • One discharge port 16 in this example is formed in the center of the top plate portion of the filter holding portion 10, but the present invention is not limited to this configuration, and even if the discharge port 16 is formed on the side surface of the filter holding portion 10.
  • a pair of discharge ports 16 leading to both ends of the second discharge path 14 may be formed.
  • a chamber 20 is formed between the target particle trapping film 6 of the device body 2 and the filter 12 of the filter holding portion 10. Further, an inflow path 18 communicating with the chamber 20 is formed at least in a part between the device main body 2 and the filter holding portion 10. It is also possible to seal the entire upper surface of the device main body 2 with the filter holding portion 10 and form an inflow path 18 on the side surface of the device main body 2.
  • the target particle trapping film 6 of this example has a large number of fine wells 22 having a concave shape toward the upper surface and are regularly formed.
  • each well 22 has a regular hexagonal shape in a plan view, and has a hexagonal well bottom 28 and a regular hexagonal tubular well wall 24 rising from each well bottom 28. 24 has a honeycomb structure as a whole.
  • the shape of the well 22 is not limited to such a hexagonal shape, and may be circular or square.
  • two well discharge ports 26 are formed so as to penetrate vertically for each well 22, and the fluid in the well 22 is directed to the lower surface side of the target particle trapping film 6 through the well discharge port 26. It is discharged.
  • two well discharge ports 26 are formed for each well 22, but the number of well discharge ports 26 for each well 22 may be one or three or more. In the case of two or more, there is an advantage that the well discharge port 26 is not completely closed even when the target particle CT enters the well 22.
  • the size and depth of the well 22 can be selected according to the size of the target particle CT to be captured. Specifically, the dimensions and depth of the well 22 are slightly larger than the target particle CT to be captured, and one target particle CT has a slight gap in the well 22 between the well wall 24 and the well 22. It is set to fit. If necessary, the well 22 may be sized to accommodate a predetermined number, for example, two, three, or more target particle CTs, respectively.
  • the target particle trapping film 6 may be directly attached to the device main body 2, but instead, it may be fixed to a frame body (not shown), and this frame body may be detachably attached to the device main body 2. In that case, by exchanging the target particle trapping film 6 together with the frame, there is an advantage that the size of the well 22 can be selected. It also has the advantage that the device body 2 can be reused even when the target particle trapping film 6 becomes unusable.
  • the filter 12 is a porous membrane having a large number of through holes of a substantially constant size, and the size of the through holes is larger than the size of the non-target particles (CB, CC in FIGS. 2 to 7) to be permeated, and the target. It is smaller than the size of the particle CT and the non-penetrating non-target particles (CA in FIGS. 2-7).
  • the filter holding portion 10 may be individually provided for each eye size of the filter 12, and the size of the through hole may be changed by exchanging the filter holding portion 10.
  • the separation amount L (FIG. 2) between the filter 12 and the target particle capture film 6 is substantially constant over the entire area of the target particle capture film 6.
  • the target particle CT that has fallen from the lower surface of the filter 12 descends while swaying in the fluid and reaches the target particle capture film 6 with substantially the same dispersion area, so that the wells cover the entire area of the target particle capture film 6.
  • the probability that 22 captures the target particle CT can be made approximately equal.
  • the areas of the filter 12 and the target particle trapping film 6 are almost the same, but as in the embodiment shown in FIG. 11 described later, the area of the target particle capturing film 6 is smaller than the area of the filter 12. Therefore, the target particle CT may be concentrated in a small area and descend, facilitating the inspection of the target particle CT and the recovery by the operating means 21. Further, if necessary, the area of the target particle trapping film 6 can be made larger than that of the filter 12.
  • the present invention is not limited to blood samples, and any biological sample or non-biological sample may be used, and any particles contained therein may be used as target particles.
  • the fluid various buffers suitable for storing the target particle CT can be used.
  • step S1 a fluid containing the target particles CT and the non-target particles CA, CB, and CC is introduced into the chamber 20 from the inflow path 18.
  • the number of non-target particles is three, but this is just an example, and the number of non-target particles may be one, two, or four or more.
  • the target particle CT may also contain a plurality of types of particles.
  • step S2 as shown in FIG. 3, the fluid in the second discharge passage 14 is sucked from the discharge port 16 by a suction means (not shown) while appropriately supplying the fluid from the inflow passage 18.
  • a suction means not shown
  • the non-target particles CB and CC having a size transmitted through the filter 12 enter the second discharge path 14 and are discharged from the discharge port 16.
  • the filter 12 can concentrate almost only the target particle CT and the non-target particle CA in the chamber 20.
  • step S3 as shown in FIG. 5, of the target particle CT and the non-target particle CA captured on the lower surface of the filter 12, only the non-target particle CA is dropped from the filter 12 by a suction means (not shown), and the filter 12 is used. Separate from the target particles CT remaining in.
  • the balance between the amount of fluid flowing in and out of the discharge port 4, the amount of fluid flowing in and out of the discharge port 16, and the amount of fluid discharged from the inflow path 18 is used as the suction means. That is, the flow velocity of the fluid flowing through the filter 12 is controlled by controlling three types of flow rates: the amount of fluid flowing in and out of the discharge port 4, the amount of fluid flowing in and out of the discharge port 16, and the amount of fluid discharged from the inflow path 18. Adjusted so that the target particle CT remains on the lower surface of the filter 12, while the non-target particle CA falls off the filter 12, and the non-target particle CA dropped from the filter 12 is discharged from the inflow path 18. do.
  • Such suction means can be used for the difference in specific gravity between the target particle CT and the non-target particle CA, the size difference, and / or the adhesion to the filter 12 (strength of physical adhesion, surface affinity, particle shape difference). Etc.), and there is a difference between remaining on the lower surface of the filter 12 and falling off from the filter 12 depending on the flow velocity of the fluid flowing through the filter 12. If it is not possible to control the residual / dropout due to such a fluid flow velocity, separation by magnetic force, separation by a negative selection marker, separation by electrostatic force, or the like can be adopted as in the second to fourth embodiments described later.
  • step S4 the target particle CT is dropped from the filter 12 in the chamber 20, lowered in the fluid, and stored in the well 22 of the target particle capturing membrane 6.
  • the inflow and outflow of the fluid from the discharge port 4, the discharge port 16, and the inflow path 18 may be stopped.
  • the fluid is supplied from the inflow path 18 into the chamber 20 while discharging the fluid from the discharge port 4 and sucking the target particle CT into the well 22. May be good.
  • step S5 the filter holding portion 10 is removed from the device body 2, and the position of the target particle CT captured by any well 22 of the target particle capturing membrane 6 by a microscope or an inspection device (not shown) is determined.
  • You may specify and collect the target particle CT one by one from the well 22 by an operating means 21 such as a micropipette.
  • various tests may be performed on the specified target particle CT in a state of being captured by the well 22 of the target particle capture film 6 without collecting the target particle CT.
  • the target particle CT may be provided with a dyeing step of dyeing with various dyes in advance.
  • the dyeing step may be performed before step S1, that is, at the time of sample preparation, or the dye may be added to the fluid in any of steps S2 to S4 to stain the target particle CT.
  • the type of dyeing agent is not limited, and any dyeing agent used for the same purpose as before is possible.
  • a detection step of observing the inside of the well to identify the stained target particles observation with a microscope, observation with a fluorescence microscope, or observation using a fluorescence microscope or a computer according to the emission wavelength or the absorption wavelength of the stain agent is performed.
  • image processing used or the like it is possible to specify at which position the well 22 of the target particle capturing film 6 the target particle CT is captured.
  • the target particle CT in the well 22 at that position can be automatically collected or inspected.
  • the separation of the target particle CT by the filter 12, the separation and removal of the non-target cell CA filtered together with the target particle CT, and the storage of the target particle CT in the well 22 are one. This can be done with the particle capture device 1, and it is possible to suppress the loss of the target particle CT.
  • FIG. 9 shows step S3 (step of removing non-target particles) in the second embodiment of the present invention.
  • the other steps S1, S2, S4, and S5 may be the same as those of the first embodiment unless otherwise specified, but in this second embodiment, the non-target that does not pass through the filter 12 prior to step S1 (introduction step).
  • a labeling step of pre-labeling the particle CA with a magnetic antibody is further provided.
  • the magnetic antibody for example, magnetic beads in which an antibody that binds to an antigen existing on the surface of the non-target particle CA that does not pass through the filter 12 is previously bound to the surface can be used.
  • the magnetic beads are, for example, ferrites such as spinel ferrite (AFe 2 O 4 (A is Mn, Co, Ni, Cu, Zn, etc.) and hexagonal ferrite (AFe 12 O 19 (A is Ba, Sr, Pb, etc.))).
  • the core has a core such as, and the surface of the core is coated with a hydrophilic polymer or a lipid to impart a functional group, and the functional group is further imparted with an antibody or protein such as adibin, albumin, protein A, or protein G.
  • an antibody can be used in the same manner as described above using a polymer polymer core in which a magnetizable substance such as ferrite is dispersed therein.
  • the magnetic beads may be micron ( ⁇ m) size or nano (nm) size.
  • micron size the magnetic force per particle is strong, so the complementing effect by magnetism is high, but the small specific surface area reduces the amount of active substances that can be bound per unit mass of beads.
  • nano-sized beads have a large specific surface area, the amount of active substances that can be bound per unit mass of the beads is large, and it is easy to increase the sensitivity for detecting the target particle CT. It can be used properly according to the purpose.
  • step S2 shown in FIG. 3 the fluid in the second discharge passage 14 is sucked from the discharge port 16 by a suction means (not shown) while appropriately supplying the fluid from the inflow passage 18.
  • a suction means not shown
  • the non-target particles CB and CC having a size transmitted through the filter 12 are discharged from the discharge port 16 through the second discharge path 14, while the target particles CT and the non-target particles CA having a size larger than the through holes of the filter 12 are discharged.
  • the magnet 30 is arranged on the side opposite to the particle trapping surface of the filter 12, that is, on the upper side of the filter 12.
  • the non-target particles CA to which the magnetic beads are attached to the surface in advance are attracted by the magnetism generated by the magnet 30 and pressed against the filter 12, so that the state captured by the filter 12 is maintained.
  • the target particle CT does not have magnetic beads attached to it, it is not affected by the magnetic force generated by the magnet 30, so that it easily falls off from the filter 12 and descends in the fluid to capture the target particle. It reaches 6 and is captured by well 22.
  • the magnet 30 may be a permanent magnet or an electromagnet. When an electromagnet is used, it has the advantage that the suction / non-suction of the non-target particle CA can be switched by turning the current ON / OFF, and the magnitude of the suction force can be controlled by adjusting the current.
  • the magnet 30 is arranged on the filter holding portion 10, but the structure is not limited to this, and the magnet 30 can be arranged inside the filter holding portion 10, and a plurality of magnets 30 are arranged. It may be divided into small magnets of the above, and these may be turned on / off the magnetic force all at once, or they may be held by a common support so that they can move up and down at the same time.
  • the magnet 30 is removed together with the filter holding portion 10
  • the non-target particle CA is removed together with the filter 12
  • the target particle capturing film 6 is exposed, and the target particle CT in the well 22 is removed.
  • Collect by inspection or operating means 21 such as a micropipette.
  • the non-target particle CT is labeled with a magnetic antibody prior to step S1, and in step S3, the non-target particle CA labeled by the magnetic force of the magnet 30 is attracted and separated from the target particle CT.
  • the attractive force of the non-target particle CA can be easily controlled, and the optimum separation conditions can be easily realized.
  • FIG. 10 shows step S3 (step of removing non-target particles) in the third embodiment of the present invention.
  • the other steps S1, S2, S4, and S5 may be the same as those of the first embodiment unless otherwise specified, but in this third embodiment as well as the second embodiment, prior to step S1 (introduction step), Further comprising a labeling step of pre-labeling the non-target particle CA that does not pass through the filter 12 with a magnetic antibody.
  • the magnetic antibody may be the same as in the second embodiment.
  • step S2 shown in FIG. 3 the fluid in the second discharge passage 14 is sucked from the discharge port 16 while appropriately supplying the fluid from the inflow passage 18.
  • the non-target particles CB and CC having a size transmitted through the filter 12 are discharged from the discharge port 16 through the second discharge path 14, while the target particles CT and the non-target particles CA having a size larger than the through holes of the filter 12 are discharged.
  • the magnet 32 is inserted into the chamber 20 from the inflow path 18 as shown in FIG.
  • the non-target particles CA to which the magnetic beads are attached to the surface in advance are attracted by the magnetism generated by the magnet 32, separated from the filter 12 and attracted to the magnet 32.
  • the target particle CT since the target particle CT does not have magnetic beads attached, it is not affected by the magnetic force generated by the magnet 32, and when it falls off the filter 12, it descends in the fluid and reaches the target particle trapping film 6. , Captured by well 22.
  • the non-target particle CA is removed together with the magnet 32, the filter holding portion 10 is removed, the target particle capture film 6 is exposed, and the target particle CT in the well 22 is inspected or micron. Collect by operating means 21 such as a pipette.
  • the non-target particle CA labeled with the magnetic antibody can be attracted to the position away from the target particle CT by the magnet 32 placed at a position away from the filter 12, so that the non-target particle CA can be attracted to the position away from the target particle CT. It has the advantage that CA can be easily separated.
  • a fourth embodiment of the present invention is characterized in that a negative selection marker that selectively binds to non-target particle CA that does not pass through the filter 12 is fixed in advance to the filter 12.
  • the negative selection marker for example, an antibody that selectively binds to an antigen existing on the surface of the non-target particle CA that does not pass through the filter 12 can be used.
  • the negative selection marker fixed to the filter 12 binds to the non-target particle CA to keep the non-target particle CA attached to the filter 12.
  • the target particle CT does not bind to the negative selection marker of the filter 12, it falls off from the filter 12, descends in the fluid, reaches the target particle trapping film 6, and is captured by the well 22.
  • a negative selection marker is fixed to the filter 12, and the negative selection marker binds to the labeled non-target particle CA filtered by the filter 12 to cause the non-target particle CA to be targeted particle CT. Since it is separated from the non-target particle CA, the non-target particle CA can be separated with high selectivity.
  • a fifth embodiment of the present invention is characterized in that a negative selection marker that selectively binds to non-target particle CA that does not pass through the filter 12 is fixed at a position other than the filter 12. Specifically, a suction portion to which a negative selection marker that selectively binds to the non-target particle CA is fixed is provided in the chamber 20, and the negative selection marker fixed to the suction portion in the separation step is the non-target particle CA. The non-target particle CA is separated from the target particle CT by binding to. On the other hand, since the target particle CT does not bind to the negative selection marker of the filter 12, it falls off from the filter 12, descends in the fluid, reaches the target particle trapping film 6, and is captured by the well 22.
  • the position of the suction portion is not limited as long as it is inside the chamber 20, but for example, a negative selection marker may be fixed to the inner wall surface of the chamber 20 of the device main body 2, or the inflow path 18 or specially provided.
  • a member having a suction portion may be inserted into the chamber 20 through the wall surface of the device main body 2 from the insertion port.
  • a member 32 provided with an attractive portion may be inserted into the chamber 20.
  • a negative selection marker is fixed at a specific position in the chamber 20, and the negative selection marker is combined with the non-target particle CA filtered by the filter 12 to cause the non-target particle CA to be targeted particle CT. Since it is separated from the target particle CA, it is easy to separate the non-target particle CA at a position away from the target particle CT with high selectivity.
  • the non-target particle CA that does not pass through the filter 12 is a leukocyte
  • the negative selection marker is at least one of a CD34 antibody and a CD45 antibody.
  • the target particle CT is not limited, but may be, for example, a circulating tumor cell / CTC (Circulating Tumor Cell) or a maternally-derived fetal cell (fNRBC).
  • the CD34 antibody selectively binds to the CD34 antigen present on the surface of hematopoietic stem cells that produce leukocytes in the blood.
  • the CD45 antibody selectively binds to the CD45 antigen, which is a leukocyte common antigen.
  • leukocyte CA which is a non-target particle, is bound to the CD34 antibody and the CD45 antibody.
  • Leukocyte CA is separated from the target particle CT.
  • the target particle CT does not bind to the CD34 antibody and the CD45 antibody, it falls off from the filter 12 and descends in the fluid, reaches the target particle trapping membrane 6, and is captured by the well 22.
  • leukocyte CA which is difficult to separate from the target particle CT, can be removed from the target particle CT with high selectivity.
  • FIG. 11 is a vertical sectional view showing a seventh embodiment of the particle trapping device 1 that can be used in the present invention.
  • the device body 2 has a bottom portion 2A, a tapered portion 2B, and an enlarged portion 2C.
  • the bottom portion 2A has a bottom plate and a peripheral wall that rises from the periphery thereof, and in this example, a discharge port 4 is formed in the center of the bottom plate of the bottom portion 2A. However, the discharge port 4 does not have to be at this position.
  • the tapered portion 2B is formed diagonally upward from the upper end of the peripheral wall of the bottom portion 2A, and expands in the horizontal direction toward the upward side to form a tapered shape.
  • the target particle trapping film 6 is arranged horizontally in the usage mode along the boundary between the bottom portion 2A and the tapered portion 2B, and the frame body 7 supporting the target particle capturing film 6 is detachably arranged along the inside of the peripheral wall of the bottom portion 2A.
  • the planar shape of the device main body 2 is not limited, and may be a rectangular shape, a circular shape, an elliptical shape, a shape having semicircular portions on both sides of the rectangular shape, or the like.
  • a cylindrical enlarged portion 2C is formed from the upper end of the tapered portion 2B upward, and a filter holding portion 10 is detachably attached to the inside of the enlarged portion 2C and horizontally and detachably attached in a usage pattern. If the center position of the filter 12 of the filter holding portion 10 and the center position of the target particle capture film 6 are arranged so as to be substantially the same, the descent density of the target particle CT to the target particle capture film 6 is made uniform. However, the two do not necessarily have to match.
  • An opening 19 is formed in a part of the peripheral wall of the tapered portion 2B and is connected to the inflow path 18. It is also possible to insert the magnet 30 along the inflow path 18 as in the embodiment of FIG. 10, or to arrange the magnet 30 above the filter holding portion 10 as in the embodiment of FIG. Since other configurations may be the same as those of the other embodiments described so far, the description thereof will be omitted.
  • the device body 2 has a shape that expands upward, and the area of the target particle trapping film 6 is smaller than the area of the filter 12, so that the area is small.
  • the target particle CT will be captured, and there is an advantage that the target particle CT can be easily inspected and recovered after the filter holding portion 10 is removed.
  • the angle of inclination of the tapered portion 2B with respect to the vertical line is selected so that the target particle CT does not adhere to the inner wall surface of the tapered portion 2B and stop. In order to set this angle as close to horizontal as possible, a vibration device may be provided in the device body 2 and the device body 2 may be slightly vibrated to promote the drop of the target particle CT onto the target particle capture film 6.
  • filter separation of the target particle, removal of non-target cells filtered together with the target particle, and storage of the target particle in the well are performed by one particle capture device. Since it is possible to suppress the loss of target particles, it can be used industrially.

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Abstract

粒子捕捉デバイス（１）を用い、ターゲット粒子（ＣＴ）および非ターゲット粒子（ＣＡ）～（ＣＣ）を含む流体を流入路（１８）からチャンバー（２０）内に導入する導入工程と、第1排出路（８）を通じて流体の少なくとも一部を排出させることにより、フィルタ（１２）でターゲット粒子（ＣＴ）と非ターゲット粒子の少なくとも一部（ＣＡ）とを濃縮する濃縮工程と、濾別された非ターゲット粒子（ＣＡ）を吸引手段（３０）によりターゲット粒子（ＣＴ）から分離する分離工程と、ターゲット粒子（ＣＴ）をウェルに格納する格納工程とを具備する。

Description

ターゲット粒子の分離方法およびシステム
　本発明は、細胞等のターゲット粒子を分離、捕捉、検出、または単離などするための分離方法およびシステムに関する。
　本願は、２０２０年５月２５日に日本に出願された、特願２０２０－０９０６７７号に基づき優先権主張し、その内容をここに援用する。
　液体中の大きさの混在する粒子から特定の粒子を分離するデバイスが従来から知られている。例えば、血液の細胞成分は、主に赤血球、白血球、血小板であるが、それらの中には、血中循環腫瘍細胞／ＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）や母体由来胎児細胞（ｆＮＲＢＣ）のように、存在率が極めて低い細胞が混在していることが知られている。
　このような存在比率の極めて低い細胞を分離、取得するため、ターゲットの細胞の表面マーカーに対する抗体を利用したアフィニティーによる分離、濃縮方法があるが、分離効率は表面マーカーの発現量に依存しており、発現量の低い細胞は取り逃してしまう。
　また、アフィニティーによる分離、濃縮方法の場合、ターゲットとなる細胞に抗体などの分子が結合してしまうため、細胞内のシグナル伝達系が活性化・抑制化され、取得後の細胞が自然な状態を反映しないリスクがある。
　したがって、ターゲットの細胞には影響を与えないラベルフリーの分離方法が望ましい。
　ラベルフリーの分離方法としては、ターゲット細胞以外の細胞に結合する抗体を用いたネガティブセレクションと、細胞の大きさ、変形能（Deformability）、密度などの物性の違いによる方法がある。
　ネガティブセレクションは、たとえば、血液中のガン細胞を分離するために、磁性粒子を結合したＣＤ４５抗体によって白血球をラベルし、ラベル化された白血球をカラム内で磁石に引き付け、引き付けられなかった細胞フラクション中のガン細胞を特定する（非特許文献１）。
　しかし、ネガティブセレクションによる濃縮方法は、多数の白血球が磁石に引き寄せられる際に、ターゲットの細胞も巻き込まれてしまうため、回収率が低い。たとえば、非特許文献２によれば、回収率は５８％と報告されている。
　細胞の大きさあるいは変形能などの物性の違いによる分離方法としては、孔のあるフィルタ、微細な櫛型構造、または段差構造を有するマイクロ流路チップによる分離が知られている。フィルタの場合、目詰まりを起こすと分離ができなくなるため、ターゲットの細胞だけを補足し、余分な細胞を除去できるように、孔の大きさ、形状、密度を最適化しなければならない。
　このような物性による分離方法で濃縮された細胞はラベルフリーであり、ターゲットの細胞を可視化して特定するため、ターゲット細胞に特異的な抗体による免疫染色が行われる。しかし、分離フィルタは柔軟であるため、顕微鏡観察での細胞特定の際にフィルタにたわみが発生し焦点が合いにくい。このため、フィルタに捕捉された細胞を再度チューブに移したのち、チューブ内で染色操作を行い、スライドガラスに移して観察が行われるが、染色操作の過程で細胞が失われるリスクがある。
　サイズや変形能による分離としては、微細な加工が行われた形状分離機能を有する、マイクロフィルタ形状やギャップ形状が形成されたマイクロ流路チップがある。この場合、マイクロ流路内で分離と捕捉の処理を行うから、処理後にそのままチップ内での染色が可能であり、またフィルタに比べて剛直性が高く、そのまま顕微鏡観察に供することができる。
　分離フィルタによる方法や、マイクロ流路チップによる分離方法では、フローの方向を逆にすることにより、保持された細胞をチューブ等に回収することができる。チューブ等に回収された細胞を再度スライドガラスにまき直し、特定の細胞だけを単離することができる。しかし、高密度に細胞を撒くと、細胞が重なり合うため、観察が困難となり、また細胞を回収する場合にターゲット以外の細胞も回収リスクがある。
　そのため、１細胞サイズの隔壁のある区画を有するフィルタあるいは基板によって、１細胞をアレイ化する方法が知られている。たとえば、底部に貫通孔を有するマイクロウェルを有するフィルタは、大きさ、変形能による分離と1細胞のアレイ化を同時に行うことができるため、隣の細胞との隔壁分離がなされ、１細胞を回収分析できる点ではメリットがある。
　マイクロウェルを有するフィルタの場合、細胞を観察または回収する時には、フィルタを保持するハウジングやガスケットを分解し、フィルタを取り出すか、フローの方向を逆にすることにより、保持された細胞を回収する（非特許文献３）。
　しかし、マイクロウェルの数は有限であり、全てのマイクロウェルが細胞に占有されるとそれ以上の分離と格納ができない。そこで、複数の分離手法を組み合わせた分離方法が知られている。例えば、フィルタによるサイズ分離を行った後、ＣＤ４５抗体によるネガティブセレクションによって白血球を除去し、誘電泳動チップによってマイクロウェルに細胞を補足する、という方法が知られている（非特許文献４）。しかし、この方法では、１ステップごとにデバイスへの細胞の移し替えが必要であり、希少な細胞のロスが発生する問題があった。
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 21: 521-530, 2002 521. Liu, Z. et al. Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients. J. Transl. Med. 9, 70-70 (2011). S Khetani et adl. Filter‐based isolation, enrichment, and characterization of circulating tumor cells. Biotechnol Bioeng. 2018 Oct; 115(10):2504-2529. Cancer marker-free enrichment and direct mutation detection in rare cancer cells by combining multi-property isolation and microfluidic concentration Lab Chip, 2019,19, 757-766.
　本発明は、前記問題を解決するためになされたものであり、ターゲット粒子のフィルタ分離、非ターゲット細胞の除去、ターゲット粒子のウェルへの格納を１つのデバイスで行うことにより、ターゲット粒子のロスを抑制することができる、ターゲット粒子の分離方法およびシステムを提供する。
　前記課題を解決するために、本発明の各態様は以下の構成を具備する。
［１］本発明の一態様は、ターゲット粒子および非ターゲット粒子を含む流体から前記ターゲット粒子を分離するターゲット粒子の分離方法であり、
　チャンバーと、前記チャンバーへの流入路と、前記チャンバーからの排出路と、前記排出路に設けられ、前記ターゲット粒子は透過せず、前記流体は透過させるフィルタと、　前記チャンバー内に設けられたターゲット粒子捕捉膜とを具備し、前記ターゲット粒子捕捉膜は、前記チャンバーの内側を向いて形成されその内部に前記粒子を収容しえる複数のウェルを有する、粒子捕捉デバイスを用い、
　前記ターゲット粒子および前記非ターゲット粒子を含む前記流体を前記流入路から前記チャンバー内に導入する導入工程と、
　前記第1排出路を通じて前記流体の少なくとも一部を排出させることにより、前記フィルタで、前記ターゲット粒子と、前記非ターゲット粒子の少なくとも一部とを濃縮する濃縮工程と、
　前記フィルタで濾別された前記非ターゲット粒子を、この非ターゲット粒子のみを吸引する吸引手段により前記ターゲット粒子から分離する分離工程と、
　前記チャンバー内において前記ターゲット粒子を前記ウェルに格納する格納工程とを具備する。
　前記ターゲット粒子の分離方法によれば、ターゲット粒子および非ターゲット粒子を含む流体を前記粒子捕捉デバイスの前記流入路から前記チャンバー内に導入し、前記第1排出路を通じて前記流体の少なくとも一部を排出させることにより、前記フィルタで前記ターゲット粒子と前記非ターゲット粒子の少なくとも一部とを濃縮する。次に、前記フィルタで濾別された非ターゲット粒子を、この非ターゲット粒子のみを吸引する吸引手段によりターゲット粒子から分離し、前記チャンバー内において前記ターゲット粒子を前記ウェルに格納する。
　この方法によれば、ターゲット粒子のフィルタ分離、ターゲット粒子とともに濾別された非ターゲット細胞の除去、および、ターゲット粒子のウェルへの格納を１つの粒子捕捉デバイスで行うことができ、ターゲット粒子のロスを抑制することが可能である。
［２］　前記態様［１］において、前記導入工程に先だって前記非ターゲット粒子を磁性抗体でラベルするラベル工程をさらに具備し、前記分離工程では、前記吸引手段の磁力により前記ラベルされた非ターゲット粒子を吸引し、前記ラベルされた非ターゲット粒子を前記ターゲット粒子から分離してもよい。
　この方法によれば、導入工程に先だって非ターゲット粒子を磁性抗体でラベルしておき、前記分離工程では、前記吸引手段により磁力を発生し、この磁力により前記ラベルされた非ターゲット粒子を吸引し、前記ターゲット粒子から分離するから、磁力のコントロールにより非ターゲット粒子の吸引力を容易にコントロールでき、最適な分離条件を実現しやすい。
［３］　前記態様［１］において、前記フィルタには前記非ターゲット粒子と選択的に結合するネガティブセレクションマーカーが固定され、前記分離工程では、前記フィルタに固定された前記ネガティブセレクションマーカーが前記非ターゲット粒子と結合することにより、前記非ターゲット粒子を前記ターゲット粒子から分離してもよい。
　この方法によれば、フィルタにネガティブセレクションマーカーが固定され、このネガティブセレクションマーカーが、フィルタで濾別された非ターゲット粒子と結合することにより、非ターゲット粒子をターゲット粒子から分離するから、高い選択性を以て非ターゲット粒子を分離しやすい。
［４］　前記態様［１］において、前記チャンバー内には、前記非ターゲット粒子と選択的に結合するネガティブセレクションマーカーが固定された吸引部が設けられ、前記分離工程では、前記吸引部に固定された前記ネガティブセレクションマーカーが前記非ターゲット粒子と結合することにより、前記非ターゲット粒子を前記ターゲット粒子から分離してもよい。
　この方法によれば、前記チャンバー内の特定位置にネガティブセレクションマーカーが固定され、このネガティブセレクションマーカーがフィルタで濾別された非ターゲット粒子と結合することにより、非ターゲット粒子をターゲット粒子から分離するから、高い選択性を以て、かつ、ターゲット粒子から離れた位置に非ターゲット粒子を分離しやすい。
［５］　前記態様［３］および［４］において、前記非ターゲット粒子は白血球であり、前記ネガティブセレクションマーカーは、ＣＤ３４抗体およびＣＤ４５抗体の少なくとも一方であってもよい。この場合、ＣＤ３４抗体およびＣＤ４５抗体の少なくとも一方がフィルタで濾別された白血球と結合することにより、高い選択性を以て白血球をターゲット粒子から分離できる。
［６］　前記態様［１］～［５］において、前記ターゲット粒子を前記ウェルへの格納の前または後に染色する染色工程をさらに具備していてもよい。この場合、染色工程によりターゲット粒子が染色されるから、ウェルで捕捉した後にターゲット粒子の検出が容易に行える。
［７］　前記態様［６］において、前記染色工程の後に、前記ウェル内を観察して、染色された前記ターゲット粒子を特定する検出工程をさらに具備していてもよい。この場合、染色工程により染色されたターゲット粒子が検出工程で検出されるから、ウェルで捕捉したターゲット粒子の検査や回収が容易に行える。
［８］　前記態様［７］において、前記検出工程の後に、特定された前記ターゲット粒子を回収する回収工程をさらに具備していてもよい。この場合、ターゲット粒子の位置を特定してから回収するため、回収が容易に行える。
［９］　本発明の他の態様は、ターゲット粒子および非ターゲット粒子を含む流体から前記ターゲット粒子を分離するターゲット粒子の分離システムであり、
　チャンバーと、前記チャンバーへの流入路と、前記チャンバーからの排出路と、前記排出路に設けられ、前記ターゲット粒子は透過せず、前記流体は透過させるフィルタと、　前記チャンバー内に設けられたターゲット粒子捕捉膜とを具備し、前記ターゲット粒子捕捉膜は、前記チャンバーの内側を向いて形成されその内部に前記粒子を収容しえる複数のウェルを有する、粒子捕捉デバイス、および
　前記非ターゲット粒子のみを吸引して前記ターゲット粒子から分離するための吸引手段を具備する。
　このようなターゲット粒子の分離システムによれば、ターゲット粒子および非ターゲット粒子を含む流体を前記粒子捕捉デバイスの前記流入路から前記チャンバー内に導入し、前記第1排出路を通じて前記流体の少なくとも一部を排出させることにより、前記フィルタで前記ターゲット粒子と前記非ターゲット粒子の少なくとも一部とを濃縮できる。次に、前記フィルタで濾別された非ターゲット粒子を、この非ターゲット粒子のみを吸引する吸引手段によりターゲット粒子から分離し、前記チャンバー内において前記ターゲット粒子を前記ウェルに格納する。このシステムによれば、ターゲット粒子のフィルタ分離、ターゲット粒子とともに濾別された非ターゲット細胞の除去、および、ターゲット粒子のウェルへの格納を１つの粒子捕捉デバイスで行うことができ、ターゲット粒子のロスを抑制することが可能である。
［１０］　前記態様［１］～［９］において、前記粒子捕捉デバイスの前記ターゲット粒子捕捉膜の面積は、前記フィルタの面積よりも小さくてもよい。この場合、小面積でターゲット粒子を捕捉できるので、ターゲット粒子の検査や回収が行いやすいメリットを有する。
　以上説明したように、本発明のターゲット粒子の分離方法およびシステムによれば、ターゲット粒子のフィルタ分離、ターゲット粒子とともに濾別された非ターゲット細胞の除去、および、ターゲット粒子のウェルへの格納を１つの粒子捕捉デバイスで行うことができ、ターゲット粒子のロスを抑制できる。
本発明に係るターゲット粒子の分離方法の第１実施形態を示すフローチャートである。 同実施形態において、ターゲット粒子および非ターゲット粒子を含む流体をチャンバー内に導入する工程を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 同実施形態において、フィルタでターゲット粒子を濃縮する工程を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 同実施形態において、フィルタでターゲット粒子を濃縮した状態を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 同実施形態において、非ターゲット粒子を吸引してターゲット粒子から分離する工程を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 同実施形態において、ターゲット粒子をウェルに格納する工程を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 同実施形態において、ターゲット粒子を回収する工程を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 ターゲット粒子捕捉膜の一例を示す斜視拡大図である。 本発明に係るターゲット粒子の分離方法の第２実施形態において、非ターゲット粒子を吸引してターゲット粒子から分離する工程を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 本発明に係るターゲット粒子の分離方法の第３実施形態において、非ターゲット粒子を吸引してターゲット粒子から分離する工程を示す粒子捕捉デバイスの縦断面図である。 本発明に係るターゲット粒子の分離方法の第７実施形態において使用される粒子捕捉デバイスを示す縦断面図である。
　以下、本発明に係るターゲット粒子の分離方法およびシステムの実施形態を図面を用いて詳細に説明する。図１は本発明の第１実施形態を示すフローチャート、図２～図７は同実施形態の各工程における粒子捕捉デバイスの縦断面図であり、先に図２を用いて前記粒子捕捉デバイス１の構造を説明する。
　粒子捕捉デバイス１は、上面が解放された容器形状をなすデバイス本体２を有し、デバイス本体２の中にはターゲット粒子捕捉膜６が配置され、ターゲット粒子捕捉膜６よりも下側の空間が第１排出路８とされている。デバイス本体２の形状は限定されず、いかなる形状であってもよいが、例えば矩形状、楕円状、または円状等の平面形状を有する平坦な底部と、この底部から垂直に起立する周壁部を有する形状などが採用できる。ターゲット粒子捕捉膜６は、デバイス本体２の使用状態において水平かつ平坦に配置されることが好ましいが、必ずしも水平かつ平坦でなくてもよく、例えば若干傾斜したり、必要に応じては曲面状にされていてもよい。
　デバイス本体２には、いずれかの位置に排出口４が形成され、排出口４を通じて第１排出路８内の流体を排出でき、排出につれてターゲット粒子捕捉膜６を通じて上から下へ流体が流れる。図示の例では、排出口４がデバイス本体２の底部の中央に一つ形成されているが、この構成に限定されず、デバイス本体２の周壁部や他の部分に形成してもよいし、複数形成してもよいし、排出口４としてデバイス本体２の下端全域が解放されていてもよい。
　デバイス本体２のターゲット粒子捕捉膜６よりも上側には、ターゲット粒子捕捉膜６から離れてフィルタ保持部１０が配置されている。フィルタ保持部１０の下端にはフィルタ１２が配置され、フィルタ保持部１０の内部にはフィルタ１２の上に第２排出路１４が形成され、第２排出路１４から外部へ通じる排出口１６が形成されている。この例のフィルタ１２は、デバイス本体２の使用状態において、水平かつ平坦に配置されることが好ましいが、必ずしも水平かつ平坦でなくてもよく、例えば若干傾斜したり、必要に応じては曲面状にされていてもよい。
　フィルタ保持部１０は、デバイス本体２に固定されていてもよいが、デバイス本体２から着脱可能であることがより好ましく、その場合には、フィルタ保持部１０をデバイス本体２から取り外すと、ターゲット粒子捕捉膜６の上面を露出させることができ、例えば図７に示すように、ターゲット粒子捕捉膜６の上面に捕捉されたターゲット粒子ＣＴをマイクロピペットなどの操作手段２１により直接操作することが容易になる。
　フィルタ保持部１０は、底部がフィルタ１２で構成され、内部に第２排出路１４が形成され、第２排出路１４から外部へ通じる排出口１６が形成されている。この例の排出口１６は、フィルタ保持部１０の天板部の中央に一つ形成されているが、この構成に限定されず、フィルタ保持部１０の側面に排出口１６が形成されていてもよいし、第２排出路１４の両端に通じる一対の排出口１６が形成されていてもよい。
　デバイス本体２のターゲット粒子捕捉膜６と、フィルタ保持部１０のフィルタ１２との間にはチャンバー２０が形成されている。また、デバイス本体２とフィルタ保持部１０との間には、少なくとも一部に、チャンバー２０へ連通する流入路１８が形成されている。フィルタ保持部１０でデバイス本体２の上面全体を封止し、デバイス本体２の側面に流入路１８を形成する構成も可能である。
　この例のターゲット粒子捕捉膜６は、図８に示すように、上面に向けて凹形状をなす微細なウェル２２が多数規則的に形成されたものである。この例では、各ウェル２２は平面視して正六角形状をなし、六角形状のウェル底部２８と、各ウェル底部２８から起立する正六角形筒状をなすウェル壁部２４を有し、ウェル壁部２４は全体としてハニカム構造を有している。ウェル２２の形状はこのような六角形状に限らず、円形であっても、四角形状であってもよい。
　ウェル底部２８の中央には、一つのウェル２２ごとに、二つのウェル排出口２６が上下に貫通して形成され、ウェル排出口２６を通じてウェル２２内の流体がターゲット粒子捕捉膜６の下面側へ排出される。この例では一つのウェル２２ごとに、二つのウェル排出口２６が形成されているが、ウェル２２毎のウェル排出口２６の個数は１個であっても、３個以上であってもよい。２個以上の場合には、ウェル２２内にターゲット粒子ＣＴが入り込んだ場合にも、ウェル排出口２６が完全に塞がりにくい利点を有する。
　ウェル２２の寸法および深さは、捕捉すべきターゲット粒子ＣＴの寸法に応じて選択できる。具体的には、ウェル２２の寸法および深さは、捕捉すべきターゲット粒子ＣＴよりも僅かに大きく、一つのターゲット粒子ＣＴがウェル２２内にウェル壁部２４との間に若干の隙間を空けて収まるように設定されている。必要に応じては、ウェル２２内に所定の個数、例えば２個、３個、またはそれ以上の個数のターゲット粒子ＣＴがそれぞれ格納される大きさにされてもよい。
　ターゲット粒子捕捉膜６は、デバイス本体２に直接取り付けられていてもよいが、その代わりに図示しない枠体に固定され、この枠体がデバイス本体２に着脱可能に取り付けられていてもよい。その場合、ターゲット粒子捕捉膜６を枠体ごと交換することにより、ウェル２２のサイズが選択可能となる利点を有する。ターゲット粒子捕捉膜６が使用不能になった場合にも、デバイス本体２を再利用できる利点も有する。
　フィルタ１２は、ほぼ一定のサイズの透孔を多数有する多孔質膜であり、透孔のサイズは、透過させるべき非ターゲット粒子（図２～図７ではＣＢ、ＣＣ）のサイズよりも大きく、ターゲット粒子ＣＴおよび透過させない非ターゲット粒子（図２～図７ではＣＡ）のサイズよりも小さくされている。これにより、非ターゲット粒子ＣＢ、ＣＣはフィルタ１２を通過し、ターゲット粒子ＣＴおよび非ターゲット粒子ＣＡはフィルタ１２を通過できない。フィルタ１２の目のサイズ毎にフィルタ保持部１０が個別に設けられ、フィルタ保持部１０を交換することにより透孔のサイズを変更できるようにされていてもよい。
　フィルタ１２とターゲット粒子捕捉膜６の離間量Ｌ（図２）は、ターゲット粒子捕捉膜６の全域に亘ってほぼ一定であることが好ましい。この場合、フィルタ１２の下面から落下したターゲット粒子ＣＴが流体中を揺れながら降下し、ほぼ同一の分散面積でターゲット粒子捕捉膜６上に到達するため、ターゲット粒子捕捉膜６の全域に亘ってウェル２２がターゲット粒子ＣＴを捕捉する確率をほぼ等しくすることができる。
　この実施形態では、フィルタ１２とターゲット粒子捕捉膜６の面積はほぼ同じであるが、後述する図１１に示す実施形態のように、フィルタ１２の面積よりもターゲット粒子捕捉膜６の面積を小さくして、ターゲット粒子ＣＴが小さい面積に集中して降下するようにし、ターゲット粒子ＣＴの検査や操作手段２１による回収を容易にしてもよい。また、何らかの必要に応じては、フィルタ１２よりもターゲット粒子捕捉膜６の面積を大きくすることも可能である。
　次に、図１のフローチャートに沿って、第１実施形態のターゲット粒子の分離方法を説明する。以下の説明は例えば、人または動物の血液、もしくは血液の希釈液または成分抽出液をサンプルとして用い、血液中に存在する複数種の細胞の中から特定のターゲット細胞を捕捉する場合などに相当するが、本発明は血液サンプルに限らず、いかなる生体サンプルまたは非生体サンプルを使用してもよいし、それらに含まれるいかなる粒子をターゲット粒子としてもよい。流体としては、ターゲット粒子ＣＴの保存に適した各種のバッファーが使用可能である。
　ステップＳ１において、図２に示すように、ターゲット粒子ＣＴおよび非ターゲット粒子ＣＡ、ＣＢ、ＣＣを含む流体を、流入路１８からチャンバー２０内に導入する。図の例では非ターゲット粒子が三種類としたが、これは単なる一例であり、非ターゲット粒子は１種または２種でも、４種類以上であってもよい。ターゲット粒子ＣＴも複数種の粒子を含んでいてもよい。
　ステップＳ２において、図３に示すように、流入路１８からは流体を適宜供給しつつ、図示しない吸引手段により排出口１６から第２排出路１４内の流体を吸引する。これにより、フィルタ１２を透過するサイズの非ターゲット粒子ＣＢ、ＣＣは第２排出路１４内へ入り、排出口１６から排出されていく。やがて、図４に示すように、フィルタ１２によりほぼターゲット粒子ＣＴと非ターゲット粒子ＣＡのみをチャンバー２０内で濃縮することができる。
　ステップＳ３において、図５に示すように、フィルタ１２の下面に捕捉されたターゲット粒子ＣＴおよび非ターゲット粒子ＣＡのうち、非ターゲット粒子ＣＡのみを、図示しない吸引手段によりフィルタ１２から脱落させ、フィルタ１２に残るターゲット粒子ＣＴから分離する。
　この第１実施形態では、吸引手段として、排出口４からの流体の出入量、排出口１６からの流体の出入量、流入路１８からの流体の排出量のバランスを利用する。すなわち、排出口４からの流体の出入量、排出口１６からの流体の出入量、流入路１８からの流体の排出量の３種の流量をコントロールすることにより、フィルタ１２を通して流れる流体の流速を調整し、ターゲット粒子ＣＴはフィルタ１２の下面に残存する一方、非ターゲット粒子ＣＡはフィルタ１２から脱落するようにし、かつ、フィルタ１２から脱落した非ターゲット粒子ＣＡは流入路１８から排出されるようにする。
　このような吸引手段が利用できるのは、ターゲット粒子ＣＴと非ターゲット粒子ＣＡの比重差、サイズ差、および／またはフィルタ１２への付着性（物理的付着性の強弱、表面親和性、粒子形状差など）の差が存在し、フィルタ１２を通して流れる流体の流速によってフィルタ１２の下面に残存するか、あるいは、フィルタ１２から脱落するかの差が生じる場合である。もしもそのような流体流速による残存／脱落のコントロールが行えない場合は、後述する第２～第４実施形態のように磁力による分離、ネガティブセレクションマーカーによる分離、または静電気力による分離などが採用できる。
　ステップＳ４において、図６に示すように、チャンバー２０内においてターゲット粒子ＣＴをフィルタ１２から脱落させ、流体中を降下させ、ターゲット粒子捕捉膜６のウェル２２に格納する。その際、排出口４、排出口１６、および流入路１８からの流体の出入りは止めてもよい。あるいは、ターゲット粒子ＣＴの捕捉を促進するために必要であれば、排出口４から流体を排出してウェル２２内にターゲット粒子ＣＴを吸い込みつつ、流入路１８から流体をチャンバー２０内に供給してもよい。
　ステップＳ５において、図７に示すように、デバイス本体２からフィルタ保持部１０を取り外し、図示しない顕微鏡や検査装置によりターゲット粒子捕捉膜６のいずれかのウェル２２で捕捉されたターゲット粒子ＣＴの位置を特定して、マイクロピペットなどの操作手段２１によってウェル２２から一つずつターゲット粒子ＣＴを回収してもよい。あるいは、ターゲット粒子ＣＴを回収せずに、ターゲット粒子捕捉膜６のウェル２２に捕捉された状態で、特定されたターゲット粒子ＣＴに対して各種検査を行ってもよい。
　ターゲット粒子ＣＴの特定を容易にするために、ターゲット粒子ＣＴに予め各種染色剤で染色を行う染色工程を設けてもよい。染色工程は、ステップＳ１の前、すなわちサンプル調製の時点で行ってもよいし、あるいは、ステップＳ２～Ｓ４のいずれかの工程において染料を流体に添加してターゲット粒子ＣＴを染色してもよい。染色剤の種類は限定されず、従来同様の目的に使用されている染色剤はいずれも可能である。
　ウェル内を観察して、染色されたターゲット粒子を特定する検出工程としては、染色剤の発光する波長または吸光する波長に合わせて、顕微鏡による観察、蛍光顕微鏡を用いた観察、もしくはそれらとコンピューターを用いた画像処理などにより、ターゲット粒子捕捉膜６のどの位置のウェル２２にターゲット粒子ＣＴが捕捉されているか特定を行うことが可能である。コンピューターにより座標特定した場合、自動的にその位置のウェル２２内のターゲット粒子ＣＴに対し、回収または検査を行うことが可能となる。
　以上の第１実施形態によれば、ターゲット粒子ＣＴのフィルタ１２による分離、ターゲット粒子ＣＴとともに濾別された非ターゲット細胞ＣＡの分離と除去、および、ターゲット粒子ＣＴのウェル２２への格納を１つの粒子捕捉デバイス１で行うことができ、ターゲット粒子ＣＴのロスを抑制することが可能である。
［磁力を用いた第２実施形態］
　図９は、本発明の第２実施形態におけるステップＳ３（非ターゲット粒子の除去工程）を示している。他のステップＳ１，Ｓ２，Ｓ４，Ｓ５は特に説明しない限り第１実施形態と同様でよいが、この第２実施形態では予め、ステップＳ１（導入工程）に先立って、フィルタ１２を通過しない非ターゲット粒子ＣＡを予め磁性抗体でラベルするラベル工程をさらに具備する。磁性抗体としては、例えば、フィルタ１２を通過しない非ターゲット粒子ＣＡの表面に存在する抗原と結合する抗体を表面に予め結合させた磁性ビーズなどが使用可能である。
　磁性ビーズは、例えば、スピネルフェライト（ＡＦｅ２Ｏ４（ＡはＭｎ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｃｕ，Ｚｎ等）や六方晶フェライト（ＡＦｅ１２Ｏ１９（ＡはＢａ，Ｓｒ，Ｐｂ等））等のフェライトなどのコアを有し、コアの表面を親水性ポリマーまたは脂質などで被覆して官能基を付与し、さらに前記官能基にアジビン、アルブミン、プロテインＡ、プロテインＧなどの抗体やタンパク質を付与したもの、または、前記フェライト等の可磁化物質を内部に分散させた高分子ポリマーのコアを用いて前記同様に抗体を付与したものなどが使用可能である。
　磁性ビーズは、ミクロン（μｍ）サイズであっても、ナノ（ｎｍ）サイズであってもよい。ミクロンサイズの場合には一粒子あたりでの磁力が強いため、磁気による補集効果が高いが、比表面積が小さい分、ビーズの単位質量当たりで結合できる活性物質の量が減る。一方、ナノサイズのビーズは比表面積が大きいため、ビーズの単位質量当たりで結合できる活性物質の量が多く、ターゲット粒子ＣＴを検出する感度を高めやすい。目的に応じて使い分けが可能である。
　この第２実施形態の方法では、図３に示すステップＳ２において、流入路１８からは流体を適宜供給しつつ、図示しない吸引手段により排出口１６から第２排出路１４内の流体を吸引する。これにより、フィルタ１２を透過するサイズの非ターゲット粒子ＣＢ、ＣＣは第２排出路１４を通じて排出口１６から排出される一方、フィルタ１２の透孔よりもサイズが大きいターゲット粒子ＣＴと非ターゲット粒子ＣＡはフィルタ１２を通過できず、チャンバー２０内に残留する。
　この時、または図３に示すステップＳ２のフィルタリングの開始時から、図９に示すように、フィルタ１２の粒子捕捉面とは反対側、すなわちフィルタ１２の上側に磁石３０を配置しておく。これにより、表面に予め磁性ビーズが付着している非ターゲット粒子ＣＡは、磁石３０が発生する磁気に吸引され、フィルタ１２に押しつけられるため、フィルタ１２で捕捉された状態が維持される。これに対し、ターゲット粒子ＣＴは磁性ビーズが付着していないため、磁石３０が発生する磁力の影響を受けることがないから、容易にフィルタ１２から脱落し、流体内を下降してターゲット粒子捕捉膜６へ達し、ウェル２２に捕捉される。
　磁石３０は、永久磁石であっても電磁石であってもよい。電磁石を使用した場合は電流のＯＮ／ＯＦＦにより非ターゲット粒子ＣＡの吸引／非吸引を切り替えることができ、さらに電流の調整により吸引力の大小をコントロールできる利点を有する。図示の例では、磁石３０はフィルタ保持部１０の上に配置されているが、この構造に限らず、フィルタ保持部１０の内部に磁石３０を配置することも可能であるし、磁石３０を複数の小型の磁石に分割してこれらが一斉に磁力をＯＮ／ＯＦＦするか、もしくは、共通の支持体に保持されて同時に上下移動できるようにしてもよい。
　ターゲット粒子ＣＴがウェル２２に捕捉されたら、フィルタ保持部１０とともに磁石３０も取り除き、フィルタ１２とともに非ターゲット粒子ＣＡを除去して、ターゲット粒子捕捉膜６を露出させ、ウェル２２内のターゲット粒子ＣＴを検査またはマイクロピペットなどの操作手段２１により回収する。
　この方法によれば、ステップＳ１に先だって非ターゲット粒子ＣＴを磁性抗体でラベルしておき、ステップＳ３では、磁石３０の磁力によりラベルされた非ターゲット粒子ＣＡを吸引し、ターゲット粒子ＣＴから分離するから、磁力のコントロールにより非ターゲット粒子ＣＡの吸引力を容易にコントロールでき、最適な分離条件を実現しやすい。
［第３実施形態］
　図１０は、本発明の第３実施形態におけるステップＳ３（非ターゲット粒子の除去工程）を示している。他のステップＳ１，Ｓ２，Ｓ４，Ｓ５は特に説明しない限り第１実施形態と同様でよいが、この第３実施形態でも第２実施形態と同様に、予めステップＳ１（導入工程）に先立って、フィルタ１２を通過しない非ターゲット粒子ＣＡを予め磁性抗体でラベルするラベル工程をさらに具備する。磁性抗体は第２実施形態と同様でよい。
　この第３実施形態の方法では、図３に示すステップＳ２において、流入路１８からは流体を適宜供給しつつ、排出口１６から第２排出路１４内の流体を吸引する。これにより、フィルタ１２を透過するサイズの非ターゲット粒子ＣＢ、ＣＣは第２排出路１４を通じて排出口１６から排出される一方、フィルタ１２の透孔よりもサイズが大きいターゲット粒子ＣＴと非ターゲット粒子ＣＡはフィルタ１２を通過できず、チャンバー２０内に残留する。
　フィルタリングが完了したら、図１０に示すように、流入路１８から磁石３２をチャンバー２０内に挿入する。これにより、表面に予め磁性ビーズが付着している非ターゲット粒子ＣＡは、磁石３２が発生する磁気に吸引され、フィルタ１２から離れて磁石３２に吸着される。これに対し、ターゲット粒子ＣＴは磁性ビーズが付着していないため、磁石３２が発生する磁力の影響を受けることがなく、フィルタ１２から脱落すると、流体内を下降してターゲット粒子捕捉膜６へ達し、ウェル２２に捕捉される。
　ターゲット粒子ＣＴがウェル２２に捕捉されたら、磁石３２とともに非ターゲット粒子ＣＡを除去して、フィルタ保持部１０を取り除き、ターゲット粒子捕捉膜６を露出させ、ウェル２２内のターゲット粒子ＣＴを検査またはマイクロピペットなどの操作手段２１により回収する。
　この方法によれば、フィルタ１２から離れた位置に置かれた磁石３２により、磁性抗体でラベルされた非ターゲット粒子ＣＡを、ターゲット粒子ＣＴから離れた位置に吸い寄せることができるため、非ターゲット粒子ＣＡを分離しやすい利点を有する。
［第４実施形態］
　本発明の第４実施形態では、フィルタ１２に、フィルタ１２を通過しない非ターゲット粒子ＣＡと選択的に結合するネガティブセレクションマーカーを予め固定しておくことを特徴とする。
　ネガティブセレクションマーカーは、例えば、フィルタ１２を通過しない非ターゲット粒子ＣＡの表面に存在する抗原と選択的に結合する抗体などが使用可能である。これにより、図３に示すステップＳ３において、フィルタ１２に固定されたネガティブセレクションマーカーが非ターゲット粒子ＣＡと結合することにより、非ターゲット粒子ＣＡをフィルタ１２に付着したままに維持する。一方、ターゲット粒子ＣＴは、フィルタ１２のネガティブセレクションマーカーに結合することがないから、フィルタ１２から脱落して流体内を下降し、ターゲット粒子捕捉膜６へ達してウェル２２に捕捉される。
　この方法によれば、フィルタ１２にネガティブセレクションマーカーが固定され、このネガティブセレクションマーカーが、フィルタ１２で濾別されたラベル付きの非ターゲット粒子ＣＡと結合することにより、非ターゲット粒子ＣＡをターゲット粒子ＣＴから分離するから、高い選択性を以て非ターゲット粒子ＣＡを分離できる。
［第５実施形態］
　本発明の第５実施形態では、フィルタ１２を通過しない非ターゲット粒子ＣＡと選択的に結合するネガティブセレクションマーカーを、フィルタ１２以外の箇所に固定しておくことを特徴とする。具体的には、チャンバー２０内に、非ターゲット粒子ＣＡと選択的に結合するネガティブセレクションマーカーが固定された吸引部を設け、分離工程で前記吸引部に固定されたネガティブセレクションマーカーが非ターゲット粒子ＣＡと結合することにより、非ターゲット粒子ＣＡをターゲット粒子ＣＴから分離する。一方、ターゲット粒子ＣＴは、フィルタ１２のネガティブセレクションマーカーに結合することがないから、フィルタ１２から脱落して流体内を下降し、ターゲット粒子捕捉膜６へ達してウェル２２に捕捉される。
　前記吸引部の位置は、チャンバー２０内であれば限定されないが、例えば、デバイス本体２のチャンバー２０の内壁面にネガティブセレクションマーカーを固定しておいてもよいし、流入路１８や特別に設けた挿入口からデバイス本体２の壁面を貫通して、チャンバー２０内部に吸引部を有する部材を挿入してもよい。図１０の磁石３２の代わりに、吸引部を設けた部材３２をチャンバー２０へ挿入する構造としてもよい。
　この方法によれば、チャンバー２０内の特定位置にネガティブセレクションマーカーが固定され、このネガティブセレクションマーカーがフィルタ１２で濾別された非ターゲット粒子ＣＡと結合することにより、非ターゲット粒子ＣＡをターゲット粒子ＣＴから分離するから、高い選択性を以て、かつ、ターゲット粒子ＣＴから離れた位置に非ターゲット粒子ＣＡを分離しやすい。
［第６実施形態］
　本発明の第６実施形態では、フィルタ１２を通過しない非ターゲット粒子ＣＡが白血球であり、前記ネガティブセレクションマーカーが、ＣＤ３４抗体およびＣＤ４５抗体の少なくとも一方であることを特徴とする。この場合、ターゲット粒子ＣＴは限定されないが、例えば、血中循環腫瘍細胞／ＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）や母体由来胎児細胞（ｆＮＲＢＣ）などであってもよい。
　ＣＤ３４抗体は、血液中の白血球を作り出す造血幹細胞の表面に存在するＣＤ３４抗原と選択的に結合する。ＣＤ４５抗体は、白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原と選択的に結合する。これらのＣＤ３４抗体およびＣＤ４５抗体の少なくとも一方を、第４実施形態または第５実施形態の方法におけるネガティブセレクションマーカーとして使用することにより、非ターゲット粒子である白血球ＣＡをＣＤ３４抗体およびＣＤ４５抗体と結合させ、白血球ＣＡをターゲット粒子ＣＴから分離する。一方、ターゲット粒子ＣＴは、ＣＤ３４抗体およびＣＤ４５抗体に結合することがないから、フィルタ１２から脱落して流体内を下降し、ターゲット粒子捕捉膜６へ達してウェル２２に捕捉される。
　この方法によれば、ターゲット粒子ＣＴから分別しにくい白血球ＣＡを高い選択性を以てターゲット粒子ＣＴから除去することができる利点を有する。
［第７実施形態］
　図１１は、本発明に使用可能な粒子捕捉デバイス１の第7実施形態を示す縦断面図である。この第７実施形態では、デバイス本体２が底部２Ａ、テーパ部２Ｂ、および拡大部２Ｃを有する。底部２Ａは底板とその周囲から起立する周壁を有し、この例では底部２Ａの底板の中央に排出口４が形成されている。ただし排出口４はこの位置でなくてもよい。底部２Ａの周壁の上端からテーパ部２Ｂが斜め上方へ向けて形成され、上方へいくほど水平方向に拡大してテーパ状をなしている。底部２Ａとテーパ部２Ｂの境界に沿ってターゲット粒子捕捉膜６が使用形態において水平に配置され、ターゲット粒子捕捉膜６を支える枠体７が底部２Ａの周壁の内側に沿って取り外し可能に配置されている。デバイス本体２の平面形状は限定されず、矩形状、円形、楕円形、矩形状の両側にそれぞれ半円部を設けた形状などであってもよい。
　テーパ部２Ｂの上端から上方へ向けて筒状の拡大部２Ｃが形成され、この拡大部２Ｃの内側に、フィルタ保持部１０が着脱可能かつ使用形態において水平かつ着脱可能に取り付けられている。フィルタ保持部１０のフィルタ１２の中心位置と、ターゲット粒子捕捉膜６の中心位置がほぼ一致するように配置されているほうが、ターゲット粒子捕捉膜６へのターゲット粒子ＣＴの降下密度を均一化する上で好ましいが、両者は必ずしも一致していなくてもよい。
　テーパ部２Ｂの周壁の一部には開口部１９が形成され、流入路１８に繋がっている。流入路１８に沿って図１０の実施形態のように磁石３０を挿入するか、あるいは、フィルタ保持部１０の上方へ図９の実施形態のように磁石３０を配置することも可能である。他の構成は、これまで説明した他の実施形態と同様でよいので説明は省略する。
　図１１の第7実施形態によれば、デバイス本体２が上に向けて拡大する形状をなし、フィルタ１２の面積よりも、ターゲット粒子捕捉膜６の面積が小さくされているので、この小さい面積にターゲット粒子ＣＴが捕捉されることになり、フィルタ保持部１０を取り外した後に、ターゲット粒子ＣＴの検査や回収が容易に行える利点を有する。テーパ部２Ｂの鉛直線に対する傾斜角度は、ターゲット粒子ＣＴがテーパ部２Ｂの内壁面に付着して停止しない程度の角度が選択される。この角度をできるだけ水平に近く設定するために、デバイス本体２に振動装置を設け、デバイス本体２を微小振動させてターゲット粒子ＣＴのターゲット粒子捕捉膜６への落下を促進してもよい。
　以上、本発明の様々な実施形態を説明したが、本発明は前記実施形態のみに限定されるものではなく、請求の範囲に基づいて広く解釈されるべきであり、前記実施形態の各構成を周知の他の構成に変更してもよいし、一部の構成を省略してもよいし、実施形態相互に構成を適宜組み替えてもよい。
　本発明のターゲット粒子の分離方法およびシステムによれば、ターゲット粒子のフィルタ分離、ターゲット粒子とともに濾別された非ターゲット細胞の除去、および、ターゲット粒子のウェルへの格納を１つの粒子捕捉デバイスで行うことができ、ターゲット粒子のロスを抑制することが可能であるから、産業上の利用が可能である。
１：粒子捕捉デバイス、　２：デバイス本体、　２Ａ：底部、　２Ｂ：テーパ部、　
２Ｃ：拡大部、　４：排出口、　６：ターゲット粒子捕捉膜、　７：枠体、
８：第１排出路、　１０：フィルタ保持部、　１２：フィルタ、　１４：第２排出路、　１６：排出口、　１８：流入路、　１９：開口部、　２０：チャンバー、　
２１：操作手段、　２２：ウェル、　２４：ウェル壁部、　２６：ウェル排出口、　
２８：ウェル底部、　３０：磁石、　３２：磁石、　
ＣＡ～ＣＣ：非ターゲット粒子、　ＣＴ：ターゲット粒子。

Claims (10)

  1. 　ターゲット粒子および非ターゲット粒子を含む流体から前記ターゲット粒子を分離するターゲット粒子の分離方法であり、
    　チャンバーと、
    　前記チャンバーへの流入路と、
    　前記チャンバーからの排出路と、
    　前記排出路に設けられ、前記ターゲット粒子は透過せず、前記流体は透過させるフィルタと、
    　前記チャンバー内に設けられたターゲット粒子捕捉膜とを具備し、
    　前記ターゲット粒子捕捉膜は、前記チャンバーの内側を向いて形成されその内部に前記粒子を収容しえる複数のウェルを有する、粒子捕捉デバイスを用い、
    　前記ターゲット粒子および前記非ターゲット粒子を含む前記流体を前記流入路から前記チャンバー内に導入する導入工程と、
    　前記第1排出路を通じて前記流体の少なくとも一部を排出させることにより、前記フィルタで、前記ターゲット粒子と、前記非ターゲット粒子の少なくとも一部とを濃縮する濃縮工程と、
    　前記フィルタで濾別された前記非ターゲット粒子を、前記非ターゲット粒子のみを吸引する吸引手段により前記ターゲット粒子から分離する分離工程と、
    　前記チャンバー内において前記ターゲット粒子を前記ウェルに格納する格納工程とを具備することを特徴とする、ターゲット粒子の分離方法。
  2. 　前記導入工程に先だって、前記非ターゲット粒子を、予め磁性抗体でラベルするラベル工程をさらに具備し、
    　前記分離工程では、前記吸引手段の磁力により前記ラベルされた非ターゲット粒子を吸引し、前記ラベルされた非ターゲット粒子を前記ターゲット粒子から分離する、請求項１に記載のターゲット粒子の分離方法。
  3. 　前記フィルタには、前記非ターゲット粒子と選択的に結合するネガティブセレクションマーカーが固定され、
    　前記分離工程では、前記フィルタに固定された前記ネガティブセレクションマーカーが前記非ターゲット粒子と結合することにより、前記非ターゲット粒子を前記ターゲット粒子から分離する、請求項１に記載のターゲット粒子の分離方法。
  4. 　前記チャンバー内には、前記非ターゲット粒子と選択的に結合するネガティブセレクションマーカーが固定された吸引部が設けられ、
    　前記分離工程では、前記吸引部に固定された前記ネガティブセレクションマーカーが前記非ターゲット粒子と結合することにより、前記非ターゲット粒子を前記ターゲット粒子から分離する、請求項１に記載のターゲット粒子の分離方法。
  5. 　前記非ターゲット粒子は白血球であり、前記ネガティブセレクションマーカーは、ＣＤ３４およびＣＤ４５の少なくとも一方である、請求項３または４に記載のターゲット粒子の分離方法。
  6. 　前記ターゲット粒子を前記ウェルへの格納の前または後に染色する染色工程をさらに具備する、請求項１～５のいずれか1項に記載のターゲット粒子の分離方法。
  7. 　前記染色工程の後に、前記ウェル内を観察して、染色された前記ターゲット粒子を特定する検出工程をさらに具備する、請求項６に記載のターゲット粒子の分離方法。
  8. 　前記検出工程の後に、特定された前記ターゲット粒子を回収する回収工程をさらに具備する、請求項７に記載のターゲット粒子の分離方法。
  9. 　ターゲット粒子および非ターゲット粒子を含む流体から前記ターゲット粒子を分離するターゲット粒子の分離システムであり、
    　チャンバーと、
    　前記チャンバーへの流入路と、
    　前記チャンバーからの排出路と、
    　前記排出路に設けられ、前記ターゲット粒子は透過せず、前記流体は透過させるフィルタと、
    　前記チャンバー内に設けられたターゲット粒子捕捉膜とを具備し、
    　前記ターゲット粒子捕捉膜は、前記チャンバーの内側を向いて形成されその内部に前記粒子を収容しえる複数のウェルを有する、粒子捕捉デバイス、および
    　前記非ターゲット粒子のみを吸引して前記ターゲット粒子から分離するための吸引手段を具備することを特徴とする、ターゲット粒子の分離システム。
  10. 　前記粒子捕捉デバイスの前記ターゲット粒子捕捉膜の面積は、前記フィルタの面積よりも小さいことを特徴とする請求項９に記載のターゲット粒子の分離システム。
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