CN113272648A - 粒子捕获系统和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于纯化、提取和任选地分析诸如细胞的磁性靶实体(例如结合到一个或多个磁珠上的细胞)的自动微流体系统和方法。

Description

粒子捕获系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月25日提交的序列号为62/750,620的美国申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本说明书一般涉及微流体系统。

发明背景

当需要将流体样品中的单个颗粒(例如细胞)与样品中包含的大量细胞区分开时，在高通量微流体系统中很难分析这些细胞。此外，最初必须从流体样品中分离单个细胞以根据所进行的测试的类型适当地分析细胞内容物，例如DNA,RNA和/或蛋白质。在一些情况下，还需要以预定义的几何排列来分离单个细胞，以实现自动化处理和分析。常见的分离技术可包括以仅单个细胞与微孔板的单个微孔一致的方式稀释流体样品。然而，这种技术可能缺乏足够的精度和速度，并且主要依赖于统计，从而减少了获得可重复结果的机会。

发明概述

本公开全文描述的创新方面包括用于分离、捕获和提取被引入一次性微流体盒中的流体样品内的靶实体(例如细胞，细胞簇和/或其它类型的颗粒)的装置，系统和方法。该盒可以容纳一个或多个微流控芯片，所述微流控芯片用于在纯化芯片(例如，如本文所述的多孔芯片)中使用基于免疫磁性抗体的表面识别从流体中分离或纯化靶实体，然后从提取芯片(例如，如本文所述的微孔芯片)中的已知位置提取或捕获靶实体。在一些实施方案中，所述系统可以处理流体样品，并在最小的或没有人为干预的情况下对靶实体进行测定，以增强使用的容易性，并与可比较的手动测定技术相比，提高使用所述系统的靶实体纯化和提取的可重复性和准确性。

本文所述的系统和技术可用于疾病状况的科学和临床研究，其中分析个体稀有的靶实体如稀有细胞，例如血液样品中的循环肿瘤细胞或母体血液或母体宫颈粘液样品中的胎儿细胞(例如滋养层或有核红细胞)对于理解和检测例如疾病如癌症或遗传病症如胎儿非整倍体是至关重要的。

所述方法和系统也可用于确定细胞间的变化。例如，所述系统和技术可用于改善对具有肿瘤异质性的癌症的研究，这通常需要鉴定多种肿瘤的存在和性质。作为一个实例，如果多个细胞被组合和裂解，那么它们的遗传内容物将混合，并且与细胞间变异有关的信息将受损和/或丢失。然而，如果可以使用本文所述的系统和技术分别分离，捕获和分析它们，则可以保留与细胞间变化有关的信息用于分析。这适用于从流体(例如血液，尿液和唾液)获得的细胞以及通过研磨(例如化学或机械研磨)实体组织(例如肿瘤)并将细胞分布在液体介质(例如缓冲液)中获得的细胞。

在一个方面，本公开提供了用于分析(例如，纯化，提取和任选地分析)靶实体(例如稀有细胞)的系统，所述靶实体例如稀有细胞是或被制成磁性的，例如使用官能化的磁珠。该系统包括壳体，该壳体包括接收区域，该接收区域被配置为当包含靶实体的样品流体流过一个或多个测试盒装置时接收用于捕获靶实体的一个或多个测试盒装置，其中每个测试盒装置包括一个或多个微流控芯片，该微流控芯片提供净化、分离和/或提取功能；样本流体储存器，其与所述接收区域流体连通并配置为存储所述样本流体；一个或多个试剂储存器，其各自与所述接收区域连通并且被配置为存储一种或多种试剂以用于所述测定；一个或多个磁体组件，所述磁体组件被布置成邻近容纳所述测试盒装置的所述接收区域，并且被配置为产生足以净化磁性靶实体或将磁性靶实体与非磁性实体分离的磁力，并且当样品流体流过所述微流体芯片内的表面时，所述磁体组件将至少一个磁性靶实体保持在所述微流体芯片中的至少一个内的至少一个已知位置；流体控制装置，用于控制所述样品流体和所述一种或多种试剂通过所述流体回路的流动，其中所述流体控制装置使所述样品流体以足以将非磁性实体移出所述一个或多个微流体芯片但不足以将磁性靶实体从所述一个或多个微流体芯片移除的流量通过所述一个或多个微流体芯片；任选地，用于在微流体芯片内的至少一个已知位置处对所述至少一个磁性靶实体进行成像的分析器装置；以及计算装置，其被布置和编程以控制所述分析器装置和所述流体控制装置。

在这些系统中，测试盒装置可以包括纯化或分离芯片，其包括多孔表面和/或提取芯片，其包括微孔表面，所述微孔表面具有布置在微孔表面的一个或多个阵列中的多个微孔，其中多孔表面的孔小于靶实体(例如，所述孔可以具有在0.5μm和20μm之间的尺寸，例如，5至15μm)和微孔大于靶实体，并且其中所述一个或多个磁体组件被布置成在样品流体流过多孔表面时吸引和移动磁性靶实体朝向多孔表面并且将至少一个磁性靶实体保持在多孔表面上，并且在流体流过微孔表面时吸引和保持多个微孔中的至少一个微孔中的至少一个磁性靶实体。

在不同的实施方式中，系统，例如壳体，可以进一步包括选择阀，用于选择将存储在样品流体储存器中的流体样品流入测试盒，或者将存储在一个或多个试剂储存器中的一种或多种试剂流体流入测试盒。

这些系统还可以包括一组被配置成与靶实体特异性结合的磁珠。例如，磁珠可被功能化以特异性结合特定类型的细胞，例如循环肿瘤细胞或胎儿细胞，包括滋养层和有核红细胞。在一些实施方案中，磁珠在其表面上包括一个或多个与靶实体表面上的分子特异性结合的结合部分。

在一些实施例中，磁体组件被配置和控制为相对于微孔表面沿着两个水平轴移动。

在某些实施例中，所述系统还包括靶实体提取模块，所述靶实体提取模块被配置成从至少一个已知位置(例如微孔)提取靶实体。例如，靶实体提取模块可以包括手动或自动微量移液管。

例如，多个微孔中的每个微孔可以具有允许仅一个靶实体进入给定微孔的尺寸，并且多个微孔中的每个微孔具有大致相同的尺寸。在一些实施方式中，微孔表面的一个或多个阵列可以包括布置在微孔表面上的第一位置处的微孔的第一阵列；以及第二和后续阵列(如果存在)，其在第二和后续位置处顺序地布置在微孔表面上，使得当样品流体首先流过微孔的第一阵列，然后顺序地流过微孔的第二和后续阵列时，以及其中第二和后续阵列(如果存在)中的微孔各自在给定阵列内具有比先前相邻阵列中的微孔的尺寸大至少10％的尺寸。

在另一方面，本公开提供了用于使用磁珠从液体样品中纯化和提取靶实体的测试盒装置，所述靶实体是磁性的或被制成磁性的。这些测试盒装置包括具有至少一个主体入口和至少一个主体出口的主体；第一微流体组件，其布置在所述主体内并包括第一腔，所述第一腔具有与所述主体入口流体连通的第一入口和第一出口；以及板，其设置在所述腔室内并将所述腔室分成第一部分和第二部分，其中所述板包括多个孔，每个孔小于靶实体且大于磁珠；第二微流体组件，其布置在所述主体内并且包括具有第二入口和第二出口的第二腔，其中所述第二腔包括微孔表面，所述微孔表面具有布置在所述微孔表面的一个或多个阵列中的多个微孔，其中所述微孔大于所述靶实体；以及阀，其被布置在所述主体内并且被配置为提供与所述第一出口、所述主体出口和所述第二入口的选择性流体连通；其中所述第一和第二微流体组件串联布置并且所述阀布置在所述第一和第二室之间，并且其中所述阀提供从所述第一出口到所述主体出口或所述第二入口的选择性流体连通。

在一些实施方式中，多个微孔中的每个微孔具有允许仅一个靶实体进入微孔的尺寸，并且多个微孔中的每个微孔具有大致相同的尺寸。

在另一方面，本公开提供了捕获靶实体的方法，所述方法包括将包含磁性靶实体的流体样品从样品流体储存器引入到本文所述的测试盒装置中，任选地当容纳在本文所述的系统中时。所述方法包括将一种或多种试剂从试剂储存器引入到测试盒装置中；孵育所述样品流体和引入到所述测试盒装置中的一种或多种试剂；例如使用可调节地布置在微流体测试盒装置下方的磁体组件向测试盒装置施加可变磁力；使所述样品流体以足以使非磁性实体在所述多孔板的表面上移动并离开所述多孔板的表面的流量流过所述测试盒的所述多孔板，但所述流量不足以将磁性靶实体从所述多孔板的所述表面移开，在所述多孔板的所述表面处所述磁性靶实体被所述可变磁力保持；以及调整所述磁体组件相对于所述测试盒装置的位置、场强或两者，使得所施加的磁力将所述磁性靶实体吸引并保持在所述多个微孔中。

在一些实现中，所述方法还包括例如使用检测器组件来分析磁性靶实体的特性。例如，待分析的特性可以是包含在靶实体内的分子、DNA、RNA、蛋白质、小分子和酶，或者包含在靶实体表面上的分子标记，或者从靶实体分泌的分子的数量、大小、序列和/或构象。例如，分析可以包括检测由靶实体发射的荧光。

在某些实施方式中，所述方法可进一步包括在调整磁体组件相对于多个微孔的位置之后，调整测试盒装置的盖；以及从所述多个微孔中的至少一个中提取靶实体。例如，从多个微孔中的至少一个中提取靶实体可以包括将提取的靶实体运输到一次性盒外部的容器。

在一些实施方式中，调整磁体组件的位置包括使磁体组件相对于一次性盒沿两个水平轴移动。在某些实施方式中，当流体样品流入测试盒装置的第一微流体组件时，可变磁力被施加到测试盒装置。

本文所述的系统和技术可提供优于其它现有粒子捕获系统的许多技术优点。例如，用于循环肿瘤细胞(CTCs)的许多检测系统经常存在问题，例如灵敏度，纯度，速度，易用性和效率不足。一些系统可以提供可接受的灵敏度，但是通常需要长的操作时间，例如，大于6小时，并且需要多个大型设备，这可以限制它们在现场护理或其它资源受限场景中的使用。一些系统可能是成本有效的，但是也可能受到缺乏灵敏度的困扰，因此经常不能检测到已经稀有和宝贵的CTC。本文所述的系统和技术通过使用其它已知的微流体装置解决了这些和其它限制，如下所述。

该系统包括测试盒和试剂盒。测试盒可以容纳一个、两个或多个微流体芯片，例如纯化芯片(例如多孔芯片)和/或提取芯片(例如微孔芯片)。多孔芯片包括由多孔表面隔开的两个流体腔。多孔表面包括孔，其尺寸允许磁珠通过多孔表面进入流体样品中，但阻止靶实体进入。微孔芯片包括具有表面的衬底，例如薄板，所述表面具有一个或多个微孔阵列，其中微孔具有被选择为使得单个靶实体或靶实体簇能够进入微孔的尺寸。如本文所述，这些多个芯片被集成到一个一次性盒中，该一次性盒被设计用于本文所述的自动化系统中。

试剂盒，例如一次性试剂盒，包括多个储存器，所述储存器存储用于执行由自动化系统执行的一个或多个测定的试剂。例如，试剂盒可包括磁珠溶液、抗体溶液、洗涤缓冲液等的贮器。在本文所述的新的自动化系统中使用时，测试盒和试剂盒在插入自动化分析系统时流体地和机械地连接，所述自动化分析系统包括流体系统、泵(或其它流体压力或流源，例如真空源)和控制例如将流体样品和其它试剂引入到测试盒中以在包含在测试盒中的流体室内进行分析的流量控制装置。在一些实施例中，一次性测试盒和一次性试剂盒被集成到一个单元中，该单元被设计用于本文所述的系统中。

该系统包括磁体组件，该磁体组件可用于施加与流动无关的可变磁力，以引导和控制磁性的或被制备为有磁性的靶实体的运动。例如，，磁体组件被用于将靶实体吸引并保持在多孔芯片的第一流体腔室内的多孔表面的表面顶部上，而流体样品中的未结合磁珠穿过多孔表面进入第二流体腔，并且非靶实体流过第一流体腔并流出多孔芯片。作为另一个例子，磁体组件用于将靶实体移动到微孔芯片的微孔中和/或将靶实体保持在微孔中，而不需要使用清洗步骤来避免对非靶实体(例如细胞)的错误阳性检测，这经常会导致特定靶实体的不期望的损失。

在不同的实施例中，调整磁力的大小以增加或减小靶实体例如细胞、沉降速率，并且可以调整所施加的磁场的方向以引起磁感生的靶实体沿着微孔芯片的表面的一个或两个维度移动。在这点上，板的微孔布置和可变磁场的施加可以更有效地以更高的精度和一致性捕获磁化的细胞和细胞簇。

如本文所述，当涉及靶实体时，术语“磁性”是指固有磁性，顺磁性或超顺磁性，或者通过施加磁力或电力使其成为磁性，顺磁性或超顺磁性。当涉及靶实体时，术语磁性还指通过附着，即，例如共价或非共价地连接到本身为磁性、顺磁性或超顺磁性的珠或颗粒上而成为或被制成为磁性、顺磁性或超顺磁性的靶实体。

如本文所述，流体样品内的“靶实体”或“目标颗粒”是固有磁性的，顺磁性的或超顺磁性的，或至少暂时地使用不同的技术磁化(例如，制备为磁性的，顺磁性的或超顺磁性的)，例如，结合到如本文所述的磁性颗粒，例如磁珠。靶实体或颗粒可以是细胞(例如人或动物血细胞，哺乳动物细胞(例如人或动物胎儿细胞，例如母体血样中的滋养层或有核红细胞，人或动物肿瘤细胞，例如循环肿瘤细胞(CTC)，上皮细胞，干细胞，B-细胞，T-细胞，嵌合抗原受体T细胞，树突细胞，粒细胞，先天性淋巴细胞，衰老细胞(和与特发性肺纤维化相关的其它细胞)，巨核细胞，单核细胞/巨噬细胞，骨髓来源的抑制细胞，自然杀伤细胞，血小板，红细胞，胸腺细胞和神经细胞)，和细菌细胞(例如肺炎链球菌，大肠杆菌，沙门氏菌，利斯特氏菌，和其它细菌，例如导致脓毒病的细菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))。

靶实体或颗粒还可以是植物细胞(例如花粉粒，叶子，花和蔬菜的细胞，薄壁组织细胞，厚角组织细胞，木质部细胞和植物表皮细胞)或各种生物分子(例如DNA,RNA或肽)，蛋白质(例如抗原和抗体)或颗粒，例如污染物，例如毒性颗粒。在环境流体中(例如，污水或水，例如类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、兰氏贾第虫(Giardia lamblia)和寄生虫类和其它污染生物及其卵或孢囊)。靶实体也可以是颗粒，包括污染的或有毒的颗粒，例如，在水或用于人类或动物消费的流体中。

作为细胞的靶实体可以具有在100纳米至1微米之间的最小直径，并且在高达约20,30或40微米或更大的范围内。靶实体的簇在尺寸上可以更大并且在高达100μm或1mm的范围内。尽管参考细胞或细胞簇的捕获来描述本公开，但本文所述的系统和方法也可用于从液体样品中捕获或隔离其它类型的靶实体或颗粒。例如，靶实体可以是大小可以小至30纳米或更小的外来体或其它细胞外囊泡。样品可以是来自人或动物受试者的任何体液，例如血液，例如全血、血浆、血清、尿、唾液、肺灌洗液、脑脊髓液、母乳、羊水、精液、淋巴以及粘液和粘膜分泌物，例如阴道或宫颈分泌物。样品也可以是混合在缓冲液或其它液体中的粪便样品，以及骨髓或其它组织或细胞样品，例如，切割和浸渍在例如水或缓冲液中的实体肿瘤样品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料，方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

在附图和下面的描述中阐述了一个或多个实施例的细节。从说明书，附图和权利要求书中，其它潜在的特征和优点将变得显而易见。

附图的简要说明

图1A是示出可与一次性测试盒一起使用以隔离，捕获和分析靶实体的系统的实例的示意图。

图1B是示出使样品流体流过净化芯片(例如多孔芯片)的流体腔的实例的示意图，所述净化芯片可以被配置为测试盒(例如一次性测试盒)的一部分，以从样品流体中去除未结合的磁珠和非靶实体。

图1C是示出使具有磁性靶实体的样品流体流过流体腔室以将至少一些磁性靶实体沉积到提取芯片中例如在微孔芯片的微孔中的结果的实例的示意图，所述提取芯片例如可以被配置为测试盒(例如一次性盒)的一部分。

图2A-F是可与图1A所示的系统一起使用的微流体装置(例如测试盒)的实例的示意图。图2A描述了完全组装的微流体装置。图2B描绘了图1的微流体装置的多个层的分解图。图2C-F描绘图2A的微流体装置的个别层的俯视图。

图3是包括净化芯片(例如多孔芯片)和提取芯片(例如微孔芯片)的一次性测试盒的实例的示意图。

图4A-B是可以与图1A所示的系统一起使用的试剂盒的实例的示意图。图4A示出了试剂盒的储存器的示例。图4B示出了放置在配合歧管上的试剂盒的实施方案。

图5是可与本文所述的测试盒一起使用的全自动检验系统的实施方案的示例的示意图。

图6是使用本文所述的细胞分析系统捕获细胞的过程的示例的流程图。

图7A是图解说明潜在结果的图，其中本文所述的系统用于从非小细胞肺癌患者(NSCLC)的血液样品中分离、捕获和/或分析循环肿瘤细胞(CTCs)。图7B是具有识别的CTC的患者样品的潜在荧光图像的表示。

在附图中，相同的附图标记在全文表示相应的部件。

发明详述

通常，描述了用于分离、捕获和提取引入到一次性微流体测试盒中的流体样品中的靶实体，例如细胞，细胞簇和/或其它类型的粒子，例如外来体，细菌或其它生物实体的装置，系统和方法。所述盒可容纳一个或多个微流体芯片，例如纯化芯片和提取芯片，所述纯化芯片将磁性或磁化的靶实体与非靶实体和未结合至靶实体的过量磁珠(例如，多孔芯片)分离，所述提取芯片将靶实体定位到可从中提取它们的特定的已知位置(例如，微孔芯片)，它们一起用于使用基于免疫磁性抗体的表面识别和捕获靶实体将靶实体与流体分离，进入到微孔中。

在一个实例中，多孔芯片包括由具有孔的多孔表面隔开的两个流体腔室，所述孔的尺寸允许磁珠通过多孔表面进入流体样品中，但阻止一些比孔大的靶实体(例如细胞)进入，但允许其它较小的靶实体(例如外来体或特定蛋白质，例如抗体)进入，所述其它较小的靶实体是游离的或结合于珠。在一个实例中，微孔芯片包括具有表面的衬底，例如薄板，所述表面具有一个或多个微孔阵列，其中微孔具有选择成使特定尺寸的靶实体能够进入微孔的尺寸。在一些实施方案中，微孔芯片包括两组或多组不同尺寸的微孔，其中一组中的所有微孔具有相同的直径，但不同组中的微孔具有不同的直径。

在一些实施方案中，如本文所述的系统可以处理流体样品并且在最小的或没有人为干预的情况下对靶实体进行测定，以相对于可比较的手动测定技术，增加使用本文所述的方法的靶实体分离的易用性、可重复性和准确性。

该系统还能够施加与流动无关的可变吸引力以引导和控制感兴趣的磁性、顺磁性或超顺磁性靶实体(例如细胞)的运动，而无需使用洗涤步骤来避免对非靶实体的假阳性检测。例如，可以操纵所施加的与流动无关的吸引力的大小以增加或降低细胞沉降速率，并且可以调节所施加的磁场的方向以引起沿着板表面的两个维度的磁诱导的细胞移动。在这一点上，板上的微孔布置和可变磁场的应用可用于以高效率、精确性和一致性捕获细胞和细胞簇。

系统概述

图1A示出了细胞分析系统100的示例。系统100通常包括微流体装置110，例如微流体测试盒，计算装置120，流体控制装置130，分析器装置140，泵150和废物容器160。

通常，系统100可用于将靶实体与流体样品分离，所述流体样品被引入容纳一个或多个微流体芯片的测试盒中。在包括流体室的纯化芯片中使用例如在微流体芯片的一个或多个表面上的基于免疫磁性抗体的表面识别(靶实体表面配体，例如细胞表面受体)技术来分离和捕获靶实体。在一些实施例中，系统100的各方面可以作为人工分析由操作人员操作。例如，一旦靶实体已经被捕获在提取芯片内，操作人员可以使用微量移液管从提取芯片内的特定的已知位置提取捕获的靶实体。在其它实施例中，例如如图5所示，系统100作为半自动或全自动测定操作，该测定由计算设备120以最小或没有人为干预来控制。例如，样品流体最初可以由操作人员引入到样品流体容器中例如，真空容器132，以及该测定的其它方面，例如，通过微流体装置110的流量控制，磁体144的移动，分析器装置140的图像捕获和分析，以及靶实体提取，可以由在计算装置120上运行的软件来控制。

在一些实施方式中，样品流体容器例如储存器132可以在系统的壳体内，或者可以在壳体内或壳体上具有存放样品流体例如血液的试管/小瓶/真空容器的支持器，以及从试管引导到系统中的管或流体导管。在其它实施方式中，壳体内或壳体上的支架容纳两个或多个试管/小瓶。可以将磁珠添加到试管/小瓶中，或者可以将样品流体流入壳体中的一个或多个储存器中，然后将磁珠添加到一个或多个储存器中。或者，可以在添加样品流体(例如血液)之前将磁珠置于试管/小瓶/真空容器内。

系统100被配置成使用微流体测试盒装置110来分离、提取和任选地分析样品流体内的靶实体。使用磁珠(例如使用特异性抗体抗原结合)将靶实体磁化。磁体144，例如永磁体或电磁体，通常位于或邻近接收区域，例如平台142，其与微流体测试盒装置110相对设置，并用于产生吸引力例如磁场以吸引未结合的磁珠穿过多孔表面，并吸引和容纳待捕获在多孔表面表面上的磁性或“磁化的”靶实体，以及将靶实体保持在提取芯片的特定位置中，例如，保持在本文所述的微流控测试盒装置110中的微孔芯片的微孔中。分析器设备140在存在时用于检测与所捕获的靶实体相关联的特性。

本文所述的用于本文所述的系统和方法的“磁珠”可以是磁性、顺磁性或超顺磁性颗粒，其可以具有任何形状，并且不限于球形。这种磁珠是可商购的，或者可以被特别设计用于本文所述的方法和系统。例如，

是磁性的或超顺磁性的并且具有各种直径(1.05μm、2.8μm和4.5μm)。Sigma提供顺磁珠(1μm、3μm、5μm和10μm的平均直径)。Pierce提供超顺磁珠，例如平均直径为1μm。Thermo Scientific

珠是超顺磁性的并且具有各种直径(1μm至4μm)。Bangs Lab销售磁珠和顺磁珠(0.36、0.4、0.78、0.8、0.87、0.88、0.9、2.9、3.28、5.8和7.9μm平均直径)。R&D Systems

Ferrofluid含有超顺磁性纳米颗粒(直径为150纳米)。Bioclone销售磁珠(1μm和5μm平均直径)。此外，PerkinElmer提供(Chemagen)超顺磁珠(0.5-1μm和1-3μm平均直径)。磁珠是平均直径可以在例如10纳米至100微米范围内的颗粒。

如果细胞在基本上水平的流体流和向下的磁力的影响下在微流体装置110的流体室中行进，则其与表面的接触取决于流体阻力和向下的磁力之间的平衡，该平衡取决于磁场以及细胞表面上的珠的性质和数量。流体阻力取决于平均流速，其由以下等式表示：Q＝V*A，其中Q是流量，V是平均流体速度，并且A是流动腔室的横截面积。

在标题为“使用平行流微孔径芯片系统进行循环肿瘤细胞检测”的研究中，研究者证明，当肿瘤细胞结合至来自Sigma的至少7个超顺磁珠(具有1μm的平均直径)时，如果平均流体速度约为4.4mm/s(即，2ml/min流量，横截面积约为7.6mm²)，则细胞具有90％的概率遇到固体表面。参见，Lab Chip,2015,15,1677-1688。在该研究中，所使用的磁体是钕永磁体(K&J Magnetics，N52级)，其在磁体表面附近具有0.4至1.5T的磁通密度和160至320T/m的梯度，该磁体放置在芯片表面以下约650微米。在这些条件下，即使具有单个磁珠的细胞也可以被吸引到芯片表面，尽管具有较低的概率。

在一些实施方案中，可以显著降低流量和速度以最大化捕获细胞的概率。较高的流量(ml/min)可导致较高的速度(mm/s)，这可引入细胞逃逸表面的风险。或者，更高的流量仍可用于更大的横截面积，以防止平均速度增加。在这些实施方案中，“横截面积”是指垂直于流体流测量的流体腔室的面积。或者，也可使用具有较高磁化率(例如，较高的铁氧化物含量)的较强磁体或磁珠。在一些其它变体中，较高亲和力的抗体可以偶联在珠表面上。这将导致结合到细胞表面的更多的珠，并因此导致更大的总磁力。

在一些实施方案中，流体流量和速度也可以增加，而不会使微孔中捕获的细胞从微孔芯片的表面逸出。例如，在一个实施方案中，体积流量、磁场强度和横截面面积被配置为能够实现从0.0001mm/s至500mm/s或从0.01mm/s至50mm/s或从1mm/s至10mm/s范围内的平均流速。在一种实施方式中，在单个磁性粒子上的磁通量密度力可以在1picoNewton至100picoNewton的范围内，但是在一些情况下，可以小至1attoNewton且大至100nanoNewton或microNewton。

大多数磁珠通常在其中心具有带有聚合物壳的铁氧化物芯。珠也可以预涂有易于官能化的表面，例如链霉抗生物素蛋白、生物素、右旋糖酐、羧基、NHS或胺的表面涂层。

在各种实施方案中，磁珠与在靶实体，例如流体样品中的细胞的表面上表达的特异性抗原结合或连接。在这些实施方案中，磁珠以任何一种或多种方式功能化，例如，新的、常规的或市售的方式，包括一种或多种结合部分或一种或多种不同类型的结合部分，例如，合适的单克隆或多克隆抗体，包括但不限于，抗EpCAM、EGFR、Vimentin、HER2、孕酮受体、雌激素受体、PSMA、CEA、PD-L1、HLA-G、CD105、CD141、CD71、叶酸受体的抗体、或具有其它结合部分如适体，或能结合特定靶实体(例如特定细胞，如血样中的CTC，或母体血样中的胎儿细胞)表面的短肽。

除抗体以外的分子也可用作珠子上的捕获物。小分子量配体，或适体，以及抗体可以与具有连接基团的官能团(氨基，N-羟基琥珀酰胺(NHS)，或生物素，这取决于所使用的磁珠上的官能团)结合，所述连接基团例如具有聚乙二醇(PEG)链，位于低分子量配体和官能团之间，以抑制珠与样品中非靶实体的非特异性结合。

在其它情况下，通过将流体样品暴露于磁性颗粒的液滴，磁性颗粒的流体流，或使用向微孔芯片的磁致流动，由靶细胞内化磁性颗粒。例如，靶细胞可以在含有磁性、顺磁性或超顺磁性颗粒的流体中孵育，所述磁性、顺磁性或超顺磁性颗粒通常是尺寸为约1nm至微米的纳米颗粒，在足以使细胞内在化磁性颗粒的条件和时间下孵育。在一个实施例中，磁性颗粒的平均直径是几个微米，只要颗粒足够小于靶细胞的尺寸，使得它们可以被细胞内在化。在一个实施方案中，细胞是血细胞或肿瘤细胞，其大小在5微米至20微米的范围内。

在各种实施方案中，内化磁性颗粒的细胞是白细胞(WBC)，肿瘤细胞，免疫细胞，T细胞，B细胞或干细胞。在该技术的一个实施方案中，细胞在珠粒的内化程度方面彼此分离。例如，内在化更多磁珠的细胞可以变得更“磁性”，并因此更容易在流动下被吸引到芯片表面，而内在化更少磁珠的其它细胞将具有更少的磁性。

如图1A所示，微流体装置110可以包括一个或多个具有形成微流体腔室的表面的芯片，其中流体样品在入口端口和出口端口之间流动。例如，微流体装置110具有净化芯片，例如多孔芯片112A(如图1B所示)，其其包括具有孔118A的多孔表面118以形成流体腔室114。作为另一个实例，微流体装置110包括提取芯片，例如微孔芯片112B(如图1C所示)，具有带微孔122A的表面以形成微流体腔室124。微流体腔室124的底表面包括或包含板，该板包括微孔阵列(在本文中也称为“孔”)，该微孔阵列被设计成捕获悬浮在流体样品中的单个细胞或细胞簇。在一些实施方式中，多孔表面118的孔具有杯状孔开口，所述杯状孔开口能够完全或部分地容纳靶实体，以便更好地将它们定位用于随后的提取。在这种实施方式中，净化芯片和提取芯片被集成到一个芯片中。例如，多孔芯片112A可以用作纯化芯片和提取芯片，而不使用单独的微孔芯片112B。

微孔的尺寸(例如，直径，深度，形状等)和微孔阵列模式可基于使用微流体装置110捕获的靶实体(例如，目标细胞)而变化。例如，微孔的深度可以在靶细胞的标称直径与靶细胞的标称直径的2倍以下之间。作为实例，循环肿瘤细胞的直径为约15微米。微孔的深度可以在15和30微米之间。作为另一个实例，细菌的大小为约1微米，微孔的深度可以在1和10微米之间。在另一个实施例中，微孔的深度可以等于或甚至比细胞的标称直径小5,10,20或50％，假定一旦单元在微孔内并且在向下的磁力的影响下，其厚度可以减小，而其宽度可以增大。在一个实施方案中，目标细菌可以是长度在1和7微米之间变化的棒状。

如图1A-C所示中，微流体装置110通常可包括一个或多个流体腔室，并容纳多孔芯片112A，微孔芯片112B或两者。首先参考图1B，多孔芯片112A包括多孔表面118，其包括孔118A，孔118A的尺寸小于靶实体102，但大于未结合的磁珠106。多孔芯片112A用于清除任何非靶实体104，例如全血样品中的白细胞，以及任何未结合的磁珠106，其小于靶实体102并因此能够穿过孔118A。磁体144用于施加吸引力，当流体沿着多孔芯片112A的顶部流动时，该吸引力使得磁化的靶实体102保持被吸引到多孔芯片112A的表面，未结合的磁珠106穿过孔，从而从流过多孔芯片的样品中去除未结合的磁珠。

通常，可以使用各种技术，包括激光钻孔、铣削、各向异性蚀刻和化学蚀刻，由具有足够刚性的各种材料制造多孔芯片。多孔芯片的一个实例描绘于图1B中，并在本文中描述。在标题为“MICRO-FLUIDIC SYSTEM USING MICRO-APERTURE FOR HIGH THROUGHPUTDETECTION OF CELLS”的美国专利9,500,625中公开了多孔芯片的其它实例，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，穿过孔的一些磁珠与其他的次要靶实体结合，例如，分子或外来体(exosome)，其足够小以自身穿过孔或当附着到珠上时穿过孔。在这样的实施方案中，主要靶实体被捕获在多孔芯片的表面上，并且次要靶实体被捕获在多孔芯片下方的腔室中。该实施方案例如可用于使用一种装置收集CTCs，例如前列腺癌CTCs，其会被捕获在多孔板的表面上；以及相关的或相应的分子，例如前列腺特异性抗原(PSA)，其适合通过孔并且将被捕获在多孔板下方的室中。可以使用不同的磁珠连接到CTC和PSA，因此两者都是磁性的。

现在参考图1C，微孔芯片112B可以包括具有多个微孔122A阵列的布置，所述多个微孔122A阵列用于捕获通过磁体144施加的吸引力吸引到微孔底部的靶实体。在标题为“HIGH-THROUGHPUT PARTICLE CAPTURE AND Analysis”的PCT/US2017/029202中公开了微孔芯片的其它例子，其全部内容在此通过引用并入本文。

在一些实施方案中，例如图1A中所示的示例，微流体装置110具有容纳多孔芯片112A和微孔芯片112B两者的单个壳体。在这样的实施方案中，微流体装置110的壳体包括流体回路，该流体回路连接壳体内的多孔芯片和微孔芯片，使得多孔芯片被放置在流体回路中的微孔芯片的上游。在图1A所示的示例中，微流体装置110包括两个输入端。顶部入口端口101A接收来自样品管132的样品流体，而底部入口端口101B接收来自试剂储存器134的试剂。微流体装置110还包括两个出口。顶部出口103A用于从微孔芯片去除废物，例如流过微孔芯片的流体腔室并且不包括捕获的靶实体的过量流体。底部出口103B用于从多孔芯片去除废物，例如流过多孔芯片112A的流体腔室114的流体，该流体腔114包括未结合的磁珠106和非靶实体104(如图1B所示)。尽管这是微流体装置110内的流体回路的布置的一个实例，但是在本公开内容内也考虑了其它布置，如本文所述。

在一些其它实施方案中，微流体装置110容纳单个微孔芯片或单个多孔芯片。在这样的实施方案中，容纳微孔芯片的微流体装置110可以类似地构造为容纳多孔芯片的微流体装置110。例如，如图2B所示，每个微流体装置110可以具有形成微孔芯片板或多孔板或两者的类似外层和不同内层和/或腔室。在微流体装置仅容纳一个内部芯片的实施方案中，容纳多孔芯片的微流体装置可以与容纳流体回路中的微孔芯片的另一微流体装置串联连接。例如，容纳多孔芯片的微流体装置可以被放置在流体回路的上游，使得包含非靶实体和未结合磁珠的样品流体的体积流到废物容器160。然后，可以将另一体积的包含靶实体的样品流体引入容纳微孔的微流体装置中以捕获靶实体。这种类型的布置可用于通过增加引入到包含微孔的流体室中的流体内的靶实体的浓度来改进靶实体捕获。

如图1A所示，计算装置120可用作控制器，以针对本文所述的方法的各个步骤(例如，样品流体注射，细胞捕获，所捕获细胞的提取和/或所捕获细胞的分析)，使在微流体装置110上执行的动作自动化。计算设备120可以是具有用计算机程序指令编码的一个或多个微处理器和计算机可读存储介质的任何类型的计算设备，所述计算机程序指令使得计算设备120执行与捕获、隔离和/或分析靶实体有关的操作。作为示例，计算设备120可以是台式计算设备，笔记本电脑计算设备，平板计算设备，智能电话或能够运行可执行代码的任何其它设备。

计算设备120可以运行使得计算设备120能够作为系统100的控制器操作的软件。计算装置120可针对本文所述的方法的各个步骤而使在微流体装置110上执行的动作自动化，例如样品流体引入，细胞捕获，所捕获细胞的提取和/或所捕获细胞的分析。在一个实例中，计算装置120可用于调节接收区域(例如，平台142)的位置，所述接收区域调节微流体装置110相对于分析器装置140的视场的位置以记录每个微孔的内容物的图像，或相对于用于提取捕获的细胞的微量移液管的位置。在另一实例中，计算装置120能够产生计算机实施的指令，所述指令调节磁体144的位置和所产生的吸引力的大小，以针对特定类型的样品流体、靶实体、磁珠和/或盒定制细胞捕获技术

计算设备120可以包括一个或多个微处理器，其被配置为控制流体控制设备130以执行用于特定靶实体、磁珠、识别元件、样品流体和/或样本大小的受控流协议。不同的流动协议可用于对待分析的不同靶实体、待处理的不同类型的流体样品、或相同样品流体的不同体积进行分析。计算设备120可以包括读取器以读取与一个或多个特定样品相关联的标记，并且自动上载并执行与该特定样品相关联的预定流协议。计算设备120还可以在检测周期期间调制磁场，以便于捕获靶实体，并将未结合的磁珠拉过多孔芯片，并将靶实体保持在多孔芯片的表面上，然后进入微孔阵列。

计算设备120还可以被配置为允许用户控制的操作。例如，可以通过增加结合的靶细胞样品的流速直到不再可能将靶实体吸引到微流体装置110的表面来确定特定靶细胞-磁珠组合的流速。系统100的连续操作可以通过可视化窗口(例如，置于微流体装置110上方的窗口)直接观察，以确定是否需要额外的样品处理或检测过程是否完成。计算装置120还可以使微流体装置110移动，以使分析器装置140能够扫描和获得微流体装置110的各个部分上的图像。然后，这些图像可用于重建微流体装置110的整个或部分表面的图像。

流体控制装置130可以是用于将样品流体引入流体回路并使样品以一个或多个选定流速流过流体回路的任何类型的流体输送装置。例如，流体控制装置130可以是蠕动泵、注射泵、具有流量计的压力控制器或具有矩阵阀的压力控制器。流体控制装置130可以连接到管道，该管道连接到微流体装置110的入口端口101A和101B，以将样品流体和/或试剂流体引入到微流体装置110的流体腔室中。在一些情况下，流体控制装置130还能够根据预定程序调节引入流体腔室的样品流体的流速。该预定的程序可以基于特定的顺序，该顺序包括使含有细胞的样品流体以一定的速度流动一定的时间，然后引入一定的染料来染色细胞，并引入一定的分子和酶来结合细胞或与细胞相互作用。

流体控制装置130可以放置在与微流体装置110相关联的流体回路的不同位置。在一些实施方案中，流体控制装置130位于微流体装置110的上游(例如，在流体回路内的微流体装置110的入口端口之前)。在这样的实施方案中，流体控制装置130可用于施加将一定体积的流体从样品室(例如，比色皿，试管或血瓶)“推”到包含微流体装置110的腔室中的力。在其它实施方案中，流体控制装置130可以位于微流体装置110的下游，例如，在流体回路内的微流体装置110的出口端口之后的泵150。在这样的实施方案中，流体控制装置130可以替代地被用于施加力，例如将流体从样品容器“拉”到包含微流体装置110的腔室中的吸力或真空力。由流体控制装置130在下游或上游构造中施加的流速可以在例如0.1-100mL/分钟，例如0.1-3mL/分钟或0.1-10mL/分钟的范围内。

如图1A所示，流体控制装置130连接到样品管132和试剂盒134。流体控制装置130，当连接到试剂盒时，是阀矩阵，其控制哪个试剂将被引入到流体装置中，并且可以将所选择的试剂引入到流体装置的顶部或底部入口中。样品管132包含由流体控制装置130引入微流体装置110的流体回路中的一定体积的样品流体。试剂盒134包含隔室(或“储存器”)，每个隔室存储不同的试剂，这些试剂在免疫测定中用来捕获、隔离和/或分析微流体装置110内的靶实体。试剂盒134的一个实例在图4A中示出，并在本文进行描述。

在一些实施方案中，流体控制装置130可配置为将来自样品管132和试剂盒134的样品流体和测定试剂分别引入到微流体测试盒装置110中，同时最少或没有人为干预。例如，流体控制装置130可以是软件控制的阀矩阵，其自动地从样品管132和试剂盒134中提取样品流体的体积和测定试剂。在该示例中，样品管132是具有塞子的真空容器，该塞子在管内形成真空密封，以便于流体控制装置130抽吸预定体积的液体。试剂储存器134包括允许将一定体积的试剂引入微流体测试盒装置110的气动阀。在这样的实施方案中，流体控制装置130作为多通道泵运行，该多通道泵基于从计算装置120接收到的控制信号执行分析步骤，而不需要操作人员执行这些步骤。

在一些实施方案中，样品管132是市售的血液采集管。在这样的实施方案中，流体样品是血液溶液，例如与化学物质，例如抗凝血剂、固定剂和缓冲液混合。例如，样品管132可以是Streck,NorGen或LBGard(Biomatrica)制造的血液收集管。血液收集管可以根据它们用于保存细胞的时间和它们保存细胞的良好程度而变化。样品管132可在室温或接近4℃下储存以确保靶实体的最大回收率。

磁体144通常位于与微流体装置110相对的位置，例如在一些实施方案中位于微流体装置110的下方，并且被布置成吸引磁珠朝向并通过多孔芯片的孔。相对于连接到每个靶实体的磁珠的平均数量来校准磁体，以施加足以将靶实体拉向微流体装置110的表面的磁力。在一些实施方案中，磁体可以位于微流体装置的一侧或顶部，调整磁力以适应重力。通常，磁体位于与流动室相对的一侧，多孔芯片布置在流动腔室和磁体之间。

磁力将靶实体保持在多孔芯片112A的孔处，然后在靶实体已经通过微孔的入口时保持在微孔芯片112B的微孔内。磁力也足够强以将靶实体从通过微流体腔室114和124的流体流中拉出，其倾向于在平行于微流体装置110中的多孔芯片112A的表面的流动路径中拉出靶实体。作为例子，磁体144可以是NdFeB立方磁体(大约5×5×5mm)，其具有分别为0.4T至2T和100至400T/m(取决于测量的确切位置)的测量的表面通量密度和计算的梯度。在其它例子中，也可以使用其它磁体，包括但不限于，由各种材料制成的较大或较小的永磁体，以及市场上可买到的或使用标准或精密加工过程制造的并且能够产生随时间变化的磁场的电磁体。磁通密度可以在0.01T到50T的范围，或者更窄地在0.1到5T的范围内。磁通量密度梯度可以分别在0.01至1000T/m，例如0.1至1000T/m,10至750T/m,100至500T/m以及200至300T/m的范围。

磁体144可以具有基于特定应用的不同形状和尺寸。例如，磁体144的形状可以是，但不限于，立方体形状，矩形棱柱形状，环形形状，圆形或椭圆形形状，或它们的组合。此外，可以使用多个磁体。磁体144的尺寸可以变化，使得其最小尺寸可以在0.1-30cm之间。在一些实施方案中，磁体144是环形磁体，其用于引起和/或有助于磁性粒子或磁化靶实体的聚集体的分散。例如，环形磁体可以围绕靶实体的集合放置，以帮助朝向磁体144的周边分散单独的靶实体。

磁体144可以容纳在形成于包括微流体装置110的壳体的下半部中的空腔内，或者可以在不需要空腔的情况下附接到壳体的外表面。磁体144可相对于微流体装置110的外部固定或支撑，只要其以朝向微流体装置110的表面吸引靶实体的方式定向或定位，并以受控的方式调节腔室表面上的细胞的运动。例如，磁体144可用于沿着由微流体装置110下方的磁体144的运动所限定的路径引导表面上的细胞。在其它实施方案中，一个或多个磁体可以固定在系统中的接收腔室内，如本文所述的微流体装置(例如，呈盒或透明小容器的形式)可以插入该接收腔室中。这样的系统还可以包括所需的泵、控制器(例如，计算机或微处理器)、流体导管、用于要通过微流体装置的流体的储存器，以及如本文所述的分析系统和设备。

磁体144的移动可以手动地，通过马达完成，和/或可以提供有允许为磁体选择特定扫描模式的控制器。磁体144可以是可以根据需要被激活或去激活的电磁体。此外，作为用于控制磁珠和配体结合实体的运动的技术的一部分，电磁铁可以被配置成反向极性。此外，可以选择性地改变磁体144的取向，以控制所施加的吸引力的大小和方向。

在一些实施方案中，可以例如以串联或顺序使用和控制多个磁体例如电磁铁，以产生随时间和空间变化的磁场。例如，可以控制位于微流体装置110附近(例如下方)的两个或更多个电磁体以产生用于沿微流体装置110的表面移动磁性实体的移动磁力。磁场的磁体运动和力由计算设备120控制。

由磁体144施加的吸引力的大小基于附着到靶实体(例如，细胞)的颗粒的磁性特性、磁体144的强度和/或磁体144相对于微流体装置110的位置来调节。例如，磁体144可以与外部主体相关联，从而磁体与微流体装置110的距离可以变化，从而改变施加到微流体腔室中的靶实体的磁力。然后可以将所施加的磁力校准到所使用的特定类型的靶实体或特定类型的功能化磁珠。此外，磁体144可以移动以根据系统100的协议完全去除磁力。磁力的去除可以用于促进从多孔芯片的表面和/或从微孔中去除捕获的靶实体，从而靶实体然后可以被运输或冲洗到单独的收集容器。在一个实施方案中，磁体144或另一磁体可以放置在芯片的顶部以帮助从微孔中提取细胞。放置在顶部上的磁体144然后可以侧向移动，以便顺序地提取微孔阵列中的细胞。

在一些实施例中，磁体144包括以覆盖微流体装置110的一部分的方式放置在微流体装置110下方的电磁体阵列。阵列内的一个或多个电磁体然后可以以特定的顺序选择性地被供电，以施加吸引力，从而引起细胞沿着微流体装置110的表面沿着特定的路径运动。

在一些实施例中，由磁体144施加的吸引力可以用于引导感兴趣的磁、顺磁或超顺磁细胞的运动，而不需要使用洗涤步骤来避免对非特异性细胞的假阳性检测。例如，可以操纵所施加的吸引力的大小以增加或降低细胞沉降速率，并且可以调节所施加的磁场的方向以引起沿着板表面的两个维度的磁感应细胞移动。在这一点上，板上的微孔布置和可变磁场的应用可以被用于以高精度和一致性有效地捕获细胞和细胞簇。

分析器装置140存在时可以被配置成使用光学技术来分析在微流体测试盒装置110内捕获的细胞。例如，分析器装置140可以被配置为使用基于荧光、明场、暗场、Nomarski、质谱、拉曼光谱、表面等离子体共振以及其他已知技术的各种显微技术。

分析器装置140可以包括CCD照相机和计算机化的图像获取和分析系统。CCD照相机可以足够大以覆盖微流体装置110的整个区域的尺寸，从而获取来自多孔芯片112A的所有孔和/或微流体装置110中的所有微孔的图像。或者，CCD照相机可以分析较小的视场，该视场仅包含捕获在孔和/或一个微孔或一组微孔中的一个靶实体。在这样的实施方案中，CCD照相机或微流体装置110可以手动移动或使用台142或其它计算机控制的方式来顺序地将CCD照相机与其它孔和/或微孔对准并采集它们的图像。

分析器装置140可用于分析使用微流体装置110的细胞捕获过程的多个方面。例如，分析装置140可用于分析从微流体装置110的微孔中提取的细胞。或者，分析装置140可另外地或替代地用于在细胞提取之前在多孔芯片112A的孔和/或微流体装置110的微孔内可视化和/或确认细胞捕获。

收集装置146可用于使用本文所述的技术提取已经被捕获在微流体装置110的提取芯片中的靶实体。例如，收集装置146可以是一个或多个微移液管，其能够提取位于提取芯片中特定的已知位置处的靶实体，例如，位于多孔芯片的良好成形的孔内或微孔芯片表面上的微孔内。在一些情况下，操作人员操作微量移液管以提取捕获的靶实体。在其它情况下，系统100包括微操作器，其与一个或多个微移液管物理地相互作用，以允许微移液管的精确移动，用于提取在微流体装置110中捕获的靶实体。例如，微操作器可以是垂直微型线性致动器，其允许微移液管降低到微流体装置110上方的精确高度，用于靶实体提取。微移液管还可以连接到活塞泵以提供在提取期间推动和拉动靶实体穿过微移液管的尖端的能力。

样品处理技术

如本文所述，系统100可作为部分手动、半自动或全自动化验系统操作，以从流体样品中分离、捕获、分析和/或提取靶实体。在一个实例中，系统100可用于处理罕见细胞，例如母体血液或宫颈粘液中的胎儿细胞，或来自哺乳动物或人的血液样品的循环肿瘤细胞(CTC)，例如诊断患有癌症或处于患癌症的潜在风险的人，例如癌症患者，例如肺癌患者，用于下游遗传分析。使用本公开中描述的技术使用微流体装置进行样品处理。

在典型的操作中，使用例如对靶实体的表面抗原的免疫磁性识别，用磁珠对靶实体进行功能化。然后，通过最初使一定体积的样品流体流过净化芯片(例如多孔芯片)来处理具有磁化的靶实体的样品，以去除未结合的磁珠和非靶实体(如图1B所示)。然后将离开纯化芯片并包括功能化的靶实体的一定体积的样品流体引入到提取芯片(例如微孔芯片)中，用于在特定的已知位置(例如微孔芯片的微孔)中隔离和捕获靶实体(如图1C所示)。

首先参考图1B，示出了使样品流体流过多孔芯片112A的实例的示意图。多孔芯片112A包括由多孔表面118分开的流体腔114和116。多孔表面118包括直径小于靶实体102和可能的一些非靶实体104但大于磁珠和某些非靶实体的孔118A。这允许流过流体腔室114的流体中的未结合磁珠穿过孔118A并进入流体腔室116，同时防止靶实体102和非靶实体104进入。

磁体144位于多孔芯片112A附近，例如布置在其上布置有多孔芯片112A的载物台下方。磁体144用于施加吸引力，当流体样品流过多孔芯片112A上方的流体腔室114时，该吸引力使得流体样品中的未结合磁珠进入孔118A。这种吸引力还使得靶实体102暂时地结合到多孔表面118的表面，而非靶实体104(其不结合到任何磁珠或者结合到太少的磁珠)不会受到吸引力的影响，跟随流体流过流体腔室114。在这一方面，使流体样品流过多孔芯片可用于去除未结合的磁珠和非靶实体，从而改进随后使用微孔芯片的靶实体分离和捕获。

一旦非靶实体和未结合的磁珠从流体腔室114洗出，由磁体144施加的吸引力可以减小或停止，以允许主要包括靶实体的样品流体的体积离开流体腔室114。可以将该体积引入微孔芯片以分离和捕获靶实体。引入微孔芯片的体积排除了废物，即具有非靶实体和未结合磁珠的流体，并且可以使用缓冲流暴露于微孔芯片。

在某些实施方案中，靶实体是在8mL血液样品中具有约7-20μm的直径的细胞。在这样的实施方案中，磁珠可以具有大约1微米的直径。孔118A的尺寸可以被设定为具有大约5μm的直径，这允许未结合的磁珠通过孔118A进入，但是防止靶实体进入。这允许多孔芯片112A用于从血样中清除未结合的磁珠，而不区分不同类型的细胞，例如靶细胞和非靶细胞。血液样品可以以0.1-10mL/min，例如1-5mL/min,2-4mL/min的足够高的流速流过流体腔室114，以允许未结合到任何磁珠上的非靶实体，例如白细胞被洗出流体腔室114。流体腔室114可以具有5-100mm，例如0.1-5mm的高度和5-100mm，例如5-50mm的长度的相对较大的尺寸，以在不增加线速度的情况下维持这样的流量，这防止可能否则就会损坏细胞或腔室的完整性的过度剪切或压力的累积。由于孔118A的尺寸，血液样品仅流过流体腔室114。然而，流体腔室116也可以流体地和独立地接近，例如，为了用缓冲液无气泡地灌注。

现在参考图1C，示出了微孔芯片112B的微孔122A内的磁化靶实体104A的捕获的示意图。微孔芯片112B包括衬底122，例如薄板，其具有带一个或多个微孔122A阵列的表面。每个微孔的尺寸被选择成使特定尺寸的靶实体能够进入微孔。在图1所示的一个实施方案中，所有微孔都在一个阵列中，并且都具有大致相同的尺寸，例如在选定尺寸的±5％之内。

在一些其它实施方案中，微孔芯片可具有两个或更多个微孔阵列，其中给定阵列中的微孔均具有大致相同的尺寸，但一个阵列中的微孔具有与另一阵列中的微孔不同的尺寸。例如，微孔芯片112B可以具有两个微孔阵列，其中较小微孔的第一阵列位于衬底的表面上靠近表面的第一端，例如靠近微流体腔室的入口，以捕获单个细胞；以及包括相对较大微孔的第二阵列位于表面上靠近第二端的表面上，例如第一阵列的“下游”并且靠近微流体腔室的出口，以捕获不适合上游较小微孔的较大细胞或细胞簇。

在一些实施方案中，衬底122可以是游离表面或被非污垢剂如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、两性离子材料或其它阻断非特异性结合的材料阻断的表面。在这种实施方式中，磁体144可在衬底122下方施加吸引力以抑制细胞移动。

磁体144位于微孔芯片112B附近，例如放置在其上放置微孔芯片112B的平台(或其中插入盒的腔室，例如通过滑入位置)下方。磁体144用于施加与流动无关的可变磁力，以引导和控制流体腔室内的靶实体在微孔122A上方的运动。例如，磁体144用于移动靶实体102和/或将捕获的靶实体102A保持在微孔122A中，而不需要使用清洗步骤来避免经常导致靶实体的非靶实体的非预期损失的假阳性检测。

在某些实施方案中，磁体144在平行于微孔芯片表面的方向上横向移动，例如从入口端口到出口端口，以允许靶实体102被捕获在微孔122A中。例如，磁力使得靶实体102向微孔芯片112B的表面移动，并沿着微孔芯片112B的表面水平地拖动靶实体，直到它们“点击落(click-fall”)”到单独的微孔122A中。这种“磁拖曳(magnetic dragging)”技术可用于允许靶实体捕获，而不需要显微观察。一旦被捕获，被捕获的靶实体就可以被接近用于提取或分析，以便使用分析器装置进行成像和表征。在一些实施方案中，沿着微孔芯片112B的表面的各微孔122A的坐标是已知的，以便能够从微孔中可重复但自动地提取所捕获的靶实体102A。

用于靶实体纯化和提取的微流控测试盒装置

附图2A-B是可与图1A所示的系统一起使用的微流体测试盒装置200的实例的示意图。首先参考图2A，描述了可用于靶实体纯化的微流体装置200。在该实施方案中，微流体装置200容纳多孔芯片，但是它也可以容纳净化芯片和提取芯片中的一个或两个，如本文参考图1B和1C以及图3所述。在各种实施方案中，微流体装置可以容纳多孔芯片和微孔芯片中的每一个中的一个或多个，或者每一个或两个的多个，例如串联或并联。例如，与微孔芯片串联的多孔芯片可以与一对或多对多孔和微孔芯片并联布置。或者，可以串联设置两个或多个多孔芯片，然后串联或并联设置两个或多个微孔芯片，这取决于要捕获哪些细胞以及如何分析它们。

微流体装置200包括入口端口202A和202B，流体通过入口端口202A和202B被引入到微流体装置200的壳体内的流体回路中。流体通过出口端口204A和204B离开微流体装置200。微流体装置200还包括凹槽206，在凹槽206中可放置磁体以施加用于分离和捕获磁化靶实体的吸引力，如本文所述。

图2B示意性地描绘了微流体装置200的各个层。图2B-1包括微流体装置200的各个层的一侧的透视图以及图2B-2包括微流体装置200的各层的另一侧的透视图。微流体装置200包括顶盖210、底盖260以及中间层220,230,240和250。中间层230包括多孔表面230A，其包括尺寸小于样品流体内的靶实体但大于样品流体内的未结合磁珠的孔。例如，多孔表面230A可以具有与上述多孔表面118的孔排列相似的孔排列，并在图1B中描述。注意，并非所有的螺钉孔都显示在不同的层中。

在某些实施方案中，顶盖210和底盖由铝制成，并且中间层220,230,240和250由硅树脂、聚碳酸酯或类似的透明的耐化学性塑料层制成，尽管也可以使用其它合适的材料。或者，底盖和/或顶盖可以由透明材料制成，例如玻璃或塑料，以便能够观察装置内的靶实体。

在一些实施方案中，层220和240由软弹性体制成，例如作为硅酮或氟硅酮，它们一起用作密封多孔芯片112A和/或微孔芯片112B的中间的垫圈。在这种实施方案中，层220和240形成顶部和底部流动腔室的侧壁，以及层210和250上的流体通道之间的任何通孔连接。图2C是微流体装置200的顶盖210的侧视图。顶盖210的表面如图2C所示，包括通道210A和210B，所述通道210A和210B分别接收通过入口端口202A和入口端口202B引入到微流体装置200中的流体(例如，样品流体)(如图2A所示)。顶盖210的表面还包括通道210C和210D，所述通道210C和210D接收从由中间层220,240和250形成并由多孔表面230隔开的流体腔室排出的流体(如图2B-1所示)。流体分别通过出口204A和204B离开通道210C和210D。

图2D是微流体装置200的中间层220的侧视图。中间层220的表面如图2D所示，包括腔室220A，其接收流过微流体装置200的流体回路并离开通道210A的流体。中间层220的表面还包括凹槽220B和凹槽220C，凹槽220B接收离开通道210B的流体，凹槽220C例如在离开微流体装置200的腔室之后将流体引导到通道210D中。

图2E是微流体装置200的中间层250的侧视图。中间层250的表面如图2E所示，包括通道250A，其接收流过凹槽220B的流体。中间层250的表面还包括将流体引导到凹槽220C的通道250B。图2F是微流体装置200的底盖260的侧视图。

如图2B-1所示，当微流体装置200被完全组装时，中间层220被放置在微流体装置200的层布置内的中间层230之上，使得由室220A限定的空间形成由多孔表面230A分开的流体腔室的顶部。由腔室220A限定的间隔可以是微流体装置200的流体回路的区域，在该区域中处理样品流体，使得未结合的磁珠和非靶实体通过多孔表面230A从微流体装置中去除，如以上参考图1B所讨论的。

两种芯片都可以由微机械加工的硅制成，并容纳在由铝和塑料机械加工的流体腔室中，并使用硅树脂密封。在一些实施方案中，这些室中的两个用于测定：一个用于多孔芯片，另一个用于微孔芯片。在后者的情况下，打开顶盖(图片中的底部)，用微量移液管提取细胞。由于细胞通过磁力保持在微孔中，这种操作容易实现，而不会破坏细胞的位置。

集成微流体测试盒装置

图3是具有多孔芯片310A和微孔芯片310B的一次性集成测试盒300的示例的示意图。盒300包括模制在塑料部件上的集成流体回路。多孔芯片310A被放置在流体回路内的微孔芯片310B的上游，使得引入到盒300中的样品流体最初流过多孔芯片310A的流体腔室，然后流过本文所述的微孔芯片310B的流体腔室。

盒300包括多个入口302A,302B和302C。每个入口被用于将不同类型的流体引入到盒300的流体回路中，以进行如本文所述的测定。例如，入口302A用于引入样品流体，例如全血，入口302B用于引入磁珠溶液，而入口302C用于引入测定试剂溶液，例如PBS，荧光染料等。

盒300还包括多个出口端口304A,304B和304C。每个出口用于去除离开盒300的流体回路的不同类型的流体。例如，出口端口304A被用于去除从微孔芯片310B排出的废物，出口端口304B被用于去除从多孔芯片310A的顶部腔室(例如图1B所示的流体腔室114)排出的废物，以及出口端口304C用于去除从多孔芯片310A的底部腔室(例如，图1B所示的腔室116)排出的废物。

盒300的入口端口和出口端口分别被盖件302和304覆盖，以提供与分析系统的其它组件的接口，所述其它组件例如是连接到样品室、试剂储存器和废物容器的管件，如图1A所示。在一些实施方案中，盒300的入口端口和出口端口与盖上的歧管装置连接，所述盖封闭盒300以使得能够在盒300内进行样品孵育，即在将流体引入盒300之后进行孵育。例如，当使用盒300进行测定时，流体样品可以与盒装置内的磁珠溶液一起孵育，而不需要任何外部样品处理。在这样的实施方案中，所述盒可以放置在移动盒以增强样品混合的台上。例如，所述台可沿轴线移动，以使所述盒前后摇摆。

盒300包括选择器阀302D和304D，以分别调节流入和流出微孔芯片310B和多孔芯片310A的流体流量。选择器阀302D可用于调节通过多孔芯片310A上游的流体回路的流体流量，用于孵育流体样品和磁珠溶液，用于磁化靶实体。选择器阀304D可用于控制流体流过微孔芯片310B上游的流体回路。例如，选择器阀304D可用于允许多孔芯片310A的顶部腔室中的样品流体离开并进入微孔芯片310B的流体腔室，用于捕获如本文所述的微孔中的靶实体。

滑动门/盖件和手柄320覆盖微孔芯片310B。在完成细胞区室化到提取芯片中的特定已知位置时，打开滑动门320，例如使用微量移液管或其它细胞提取/拾取机构提供对细胞的直接接近(通过约1mm深的缓冲层)。该滑动门可以手动地或自动地打开，例如，通过将扫描x-y和机动化z台配置为一起工作，以在凸缘、凹口或其它机械机构下方移动盒，从而打开门。在其它实施方案中，可以使用单独的机械系统，例如机械臂，来打开滑动门和手柄320。然后可以将提取的细胞置于单独的仓或孔中，例如置于微孔板中，例如96孔微孔板中。

试剂盒

附图说明4A-B是可以与图1A所示的系统100一起使用的试剂盒400的示例的示意图。图4A描绘了用于存储分析试剂的衬底402中的储存器的实例。图4B示出了放置在配合歧管420上的试剂盒400的实施方案，与手动或半自动测定系统一起使用。

盒400的储存器可适当地确定尺寸以存储在测定的不同阶段中使用的正确体积的试剂。储存器410可用于存储试剂，例如PBS，其用于在孵育之间的冲洗和洗涤步骤。储存器412,414,422,424,432,434,442和444可用于储存荧光染料、磁珠溶液或在进行测定时以小体积使用的其它溶液。储存器452,462,472和482可储存用于调节其它溶液浓度的洗涤溶液和稀释剂。在一些实施方案中，储存器410的尺寸被设计成储存大约40毫升的液体，储存器412,414,422,424,432,434,442和444的尺寸被设计成储存0.5-2毫升的液体，并且储存器452,462,472和482的尺寸被设计成储存5-10毫升的液体。在一些实施方式中，储存器410储存PBS，储存器412,414,422,424,432,434,442和444储存荧光染料、固定试剂，并且储存器452,462,472和482储存去离子水、

冲洗液、BSA或乙醇。尽管图4A示出了用于储存器阵列的储存器构造的一个示例，在本公开内容中可以涵盖其它构造。例如，基于将由系统100执行的特定测定，储存器可以具有不同的形状、深度和间隔。

在某些实施方案中，试剂盒400用于对血液样本中的肺癌进行CTC分析。在这样的实施方案中，试剂盒400可以储存以下试剂：例如具有用定向肺癌的捕获抗体(例如，抗EpCAM、抗EGFR和抗PD-L1)涂覆的珠的磁珠溶液、去离子水、乙醇、

洗涤液、RBS pF洗涤剂、红细胞裂解缓冲液、PBS缓冲液、多聚甲醛(PFA)、以及用荧光标签(例如细胞角蛋白、CD45)和核染色剂(例如Hoechst染色)改性的染色抗体溶液。

试剂溶液可以以确保它们正常工作并满足可重复标准的方式存储在试剂盒400中。例如，抗体-珠缀合物可以特定的浓度范围例如1-10mg/mL在4℃储存以维持长期性能。在一些实施方式中，试剂盒400被存储在冰箱中，例如长达6个月，直到在分析工作流被启动之前(在该点，试剂盒400被插入到系统中，例如系统500中。如果需要，该系统可以为试剂提供冷却。例如，一些需要冷藏储存的试剂，例如染料，抗体溶液等，可以高浓度/低体积(或甚至冻干)储存，然后在测定期间用PBS或水自动复原。

在某些实施方案中，抗体-珠缀合物可以储存在Good's缓冲液(PMID5942950)中，补充有50-200mM NaCl,0-50mM KCl和0-10％甘油。在缓冲液中可以包括叠氮化物(0.2％)以减轻污染。在与抗体偶联后，用缓冲液洗涤珠三次，并在4℃下储存。可每月两次取等分试样，并测试比活性，并与零时对照比较，以确保储存的缓冲液不被污染。该测试可用于允许官能化的珠粒在密封的试剂盒中在延长的储存时间内保持大于90％的比活性。在一些实施例中，磁珠是

T1珠(尺寸为1μm)，其具有足够小的尺寸，使得其在全血中孵育期间扩散并充分混合，但足够大以避免非特异性聚集。

自动化分析系统

图5是自动化分析系统500(例如，全自动化系统)的示例的示意图。系统500可以被配置为执行分析以使用本文所述的技术从流体样品中分离、捕获和/或提取靶实体。该测定可以在操作者最小程度的干预或不干预的情况下进行，从而减少了进行测定的容易使用。系统500还可以用于通过降低由于手动样品处理中的可变性而产生的误差的可能性来改善测定的可重复性。

系统500包括显示器510、壳体520和壳体520内的隔室530。在一些实施方式中，该系统包括孵育室，在该孵育室中混合样品流体(例如血液)和磁珠，并根据特定样品流体的需要将其温热或冷却。这种孵化室可以在壳体内或壳体外。如果孵化室在壳体内，则样品流体可以从样品流体容器(例如，试管，小瓶或真空容器)流过流体导管，例如塑料或橡胶管，进入壳体内的孵育室内的样品流体储存器，其中可以通过轻微的运动添加和混合磁珠，并且可以根据需要加热或冷却样品流体。

隔室530包围用于执行自动分析以从流体样品中分离、捕获和/或提取靶实体的组件。例如，隔室530包围测试盒532，试剂盒534，取样管536，管架538，成像物镜542和采集装置544。测试盒532放置在平移台546的顶部，该平移台546容纳一个或多个磁体和其它电子元件，用于相对于用于成像和分析的物镜542调节测试盒532的放置。试剂盒534被盒盖548密封或覆盖。在一些实施方案中，测试盒532是图3所示的盒300，而试剂盒534是图4A和4B所示的盒400。

系统500包括成像显微镜(图5中未示出)，用于捕获使用测试盒532分离和/或捕获的靶实体的图像。显微镜通过物镜542采集测试盒532的流体腔室的图像。显微镜可以由计算装置自动操作，而不需要大量的人工干预。在一些实施方案中，显微镜是使用原始设备制造商(OEM)显微镜组件的定制成像装置。在这样的实施方案中，计算装置可以运行软件，该软件将显微术制造商的软件开发套件(SDK)与定制代码集成在一起，该定制代码在分析操作期间提供对平移台546的控制。例如，定制代码可以在MATLAB上开发，或者可替代地，以合适的面向目标的编程语言(例如C/C#)来编码。

测试盒532被放置在平移台546上，并且可以用各种机械紧固件固定就位，例如在盒壳体上的简单的球制动器和/或闩锁门。在盒装载期间的精确定位不是必需的，尽管在扫描测试盒532中的微孔芯片以进行细胞计数期间和之后可以实现测试盒532的位置配准。在该步骤中，可以从显微镜在扫描期间获得的图像中确定微孔芯片内具有已知相对位置的几个孔的实际“x”和“y”位置，从而导致位置校准。试剂盒534的放置可以以类似的方式实现。例如，试剂盒534的储存器可以位于用于防止任何泄漏的穿通硅树脂层之上。

测试盒532具有流体入口，用于接收来自支持器552的样品流体，以及来自试剂盒534的磁珠溶液和试剂溶液。测试盒532还包括气动输入(未示出)，以驱动选择器引导流动，以及来自微孔芯片和多孔芯片的出口，以及控制从多孔芯片112A到微孔芯片112B的流动的另一气动通路(未示出)，如本文所述。分离的真空通道(未示出)从试剂盒534拉动选定的试剂穿过系统。例如，能够产生真空和气动压力的小隔膜泵(未示出)用于从试剂盒534中提取试剂。

系统500包括计算机控制的阀矩阵(未示出)和泵，例如图1A所示的流体控制装置130。阀矩阵可以由小的流体阀(Lee Company,Essex,CT)组成，该流体阀连接试剂盒534中的每个试剂储存器的下游。流体控制阀可以是试剂盒534内的储存器上游的气动阀。

如本文所述，样品流体可以与测试盒532内的磁珠溶液一起孵育。为了增强混合，可以将平移台546编程为在孵育期间例如以振荡方式水平地移动。在测试盒532的壳体内的磁体，例如电磁体或永磁体，可以由具有可忽略的磁滞的低损耗、高频铁氧体磁芯构成。磁体的铜绕组可以例如通过将它们浸没在Peltier冷却块内而被冷却。这种结构使得紧凑的电磁体组件几何结构能够产生替换当前使用的永磁体所需的大磁力。

收集装置544用于提取捕获在微孔芯片的微孔中的靶实体，如本文所述。在一些实施方案中，收集装置544是连接到泵的微量移液管，例如高精度活塞泵，例如能够无故障地超过5百万次循环的活塞泵。活塞泵可以在小体积的液体(例如亚微升体积)中拉动和推动细胞通过微移液管尖端。活塞泵可连接到三通阀以使得清洁试剂能够被推动通过尖端并用于自动冲洗。微量移液管尖端可以连接到垂直微型线性致动器，该致动器可以将微量移液管降低到用于细胞提取的精确高度。在一些实施方案中，微量移液管尖端的x-y坐标被固定为绝对参考系，并且平移台546可被移动以相对于固定微量移液管尖端的定位来调整测试盒532的定位。可以将通过微量移液管收集的靶实体引入到放置在管架538上的管中，用于下游分析，例如PCR。

在典型的测定操作过程中，操作者最初将样品管536连接到支持器552上。支持器552连接到气动管系统，该气动管系统用于将样品管536中的流体样品输送通过管件并进入测试盒532的流体回路。操作者访问在显示器510上呈现的界面，以指定例如要执行的分析类型，要由系统100分析的靶实体，和/或要从样品流体中提取的靶实体的数量。在一些实施方案中，在系统500能够对不同的靶实体执行不同类型的分析的情况下，操作者可以使用界面从不同类型的分析中选择操作来执行特定的分析。然后，接收到的用户选择被用于配置系统500的计算装置以指定如本文所述的分析参数。

图6是用于使用如本文所述的系统来捕获细胞的过程600的示例的流程图。简言之，过程600可以包括以下操作：将包含靶实体的样品流体从流体储存器引入到一次性盒的腔室中(610)，将一种或多种试剂从试剂储存器引入到一次性盒的腔室中(620)，孵育样品流体和引入到盒中的一种或多种试剂(630)，使用可调节地布置在盒下方的磁体组件将可变磁力施加到腔室中(640)。使所述样品流体通过所述盒(650)的多孔表面，并调节所述磁体组件相对于所述盒的位置、场强或两者(660)。

更详细地，过程600可以包括将包含靶实体的样品流体从流体储存器引入到一次性盒(610)的腔室中的操作。例如，如图1A所示，包含靶实体的样品流体可以使用流体控制装置130从样品管132引入到微流体装置110的室中。该腔室可以是多孔芯片112A的流体腔室114(如图1B所示)，或微孔芯片112B的微流体腔室124(如图1C所示)。

过程600可包括将一种或多种试剂从试剂容器引入一次性盒的腔(620)。例如，如图1所示1A，可以使用流体控制装置130将一种或多种试剂从试剂盒134的试剂容器引入到微流体装置110的室中。该室可以是微孔芯片112B的微流体腔室124(如图1C所示)。

过程600可以包括孵育样品流体和引入到盒中的一种或多种试剂(630)。例如，如本文所讨论的，一旦样品流体和试剂已经被引入到微流体装置110中，就可以将混合物孵育一段时间，该段时间由使用微流体装置110进行的测定的类型来指定。

过程600可包括使用可调节地布置在盒(640)下方的磁体组件将可变磁力施加到腔室。例如，如图1A所示，可使用可调节地布置在微流体装置110下方的磁体组件144在微流体装置110下方施加可变磁力。

过程600可包括使样品流体通过盒的多孔表面(650)。例如，如图1A所示，流体控制装置130可用于通过微流体装置110的流体回路引入流动流体并使样品流体通过多孔芯片112A的多孔表面118。如图1B所示，由流体控制装置130施加的流量可以足以移动非磁性实体，例如非靶实体104越过和离开多孔表面118，但是不足以将磁性靶实体，例如靶实体102移离多孔表面118，在多孔表面118处它们通过可变磁力保持在孔118A上。

过程600可以包括调整磁体组件相对于盒(660)的位置、场强或两者。例如，如本文所描述的，由磁体组件144施加的可变磁力可以通过调整磁体组件144相对于微流体装置110的位置，通过增大或减小磁体组件144的磁场强度，或两者来调整。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1-掺加的细胞测定

用系统100进行实验，以评估在从掺有已知量的靶实体的血液样品中捕获和分离靶实体的性能。通常，掺加实验用掺加到已知体积的流体中的已知数目的细胞进行，以产生样品流体，例如8mL血样，并在微流体装置110中纯化、捕获和提取。

制备细胞的储备悬浮液，然后将外推至一定数量细胞的悬浮液的一小部分注射到血液样品中。例如，绒毛膜癌细胞(JEG3)获自ATCC并培养。通过一个接一个地确定性地吸取已知数量的细胞(例如，6个细胞)或使用含有大量细胞的小体积储备悬浮液，将已知数量的细胞掺入血液样品中。通过用EpCAM抗体功能化一组珠和用HLA-G抗体功能化另一组珠来制备抗体包被的磁珠的混合物。抗体可以已经生物素化的形式购买，并与链霉亲和素蛋白包被的珠偶联。在捕获细胞后，用荧光标记的EpCAM和HLA-G抗体对它们进行染色，以证实细胞确实在其表面上具有这些抗原。细胞也用Hoechst染色以验证核DNA。

在6个细胞的情况下，将每个细胞分别注射到血液样品样中。然后将血液样品与抗体包被的珠一起孵育，流过多孔芯片用于初始分离，然后引入微孔芯片用于如本文所述的单细胞区室化。

通常，由于靶细胞的数目少，多孔芯片上的中间纯度，即检测的细胞与多孔芯片上的细胞总数(检测的和WBC)的比率，通常是低的。这就是细胞随后转移到孔芯片上并分到单个孔的原因，这允许系统或使用者在不接触任何其它细胞的情况下(例如，通过微量移液)挑选和提取单个细胞，导致100％的“最终纯度”。

尽管在这个例子中，通过掺加来评估模型细胞，但本文描述的系统和技术可以被用于在多种样品中检测许多类型的稀有细胞。例如，可以进行其它实验来检测CTCs，其样品来自患有胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌和肾癌的患者，以及来自孕妇血液样品的胎儿滋养层。

在一些实施方案中，本文所述的靶实体捕获和分离技术可以使用具有标准抗体亲和力和特异性的市售抗体来应用。在其它实施方案中，可开发系统特异性抗体，例如非市售抗体，以提供对抗体亲和力和特异性的微调控制，从而改善与本文所述的颗粒捕获系统一起使用时的可靠性，并减少进行测定操作的性能变异。

系统特异性抗体也可以被设计成与在肺癌CTCs的表面上过表达的三种抗原，例如EpCAM,EGFR和PD-L1特异性结合。抗体混合物可用于捕获多种CTC。例如，该混合物可用于捕获为上皮(EpCAM)的CTC、经过上皮细胞至间质细胞转变(EGFR)的CTC、和代表易于被基于单克隆抗体的药物如阿替利珠单抗靶向的肿瘤组织的CTC。

实施例2–来自NSCLC患者的血液样品的CTC计数

本文所述的颗粒捕获系统用于从患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者的血液样品中分离、捕获和/或分析CTC。用来自诊断为IV期NSCLC的患者的样品进行实验。一些患者可能已经接受了癌症治疗。EpCAM,EGFR和波形蛋白抗体的混合物用于功能化磁珠。将功能化的磁珠与每个收集的血液样品一起孵育。

1微米直径的链霉亲和素蛋白包被的珠粒可以从Sigma Aldrich获得，并与从Abcam(EGFR,Vimentin)和R&D(EpCAM)系统获得的生物素化抗体偶联。在摇动或旋转条件下，将珠与稀释至16mL的8mL血液样品孵育35至60分钟。然后使混合物以2mL/min的流体流速通过多孔芯片。用PBS以及红细胞裂解缓冲液进行洗涤以除去任何残留的红细胞。

图7A显示了来自这样的实验的可能结果。结果显示在一些患者样品中鉴定了一种或多种CTC。在来自未接受癌症治疗的患者的患者样品中通常观察到更多数量的CTC，表明CTC计数与总肿瘤负荷相关。

图7B显示了具有CTC的患者血液样品的可能荧光图像。将血液样品用细胞角蛋白_CK染色，用于CTC的荧光鉴定。CD45+白细胞用作CTC鉴定的阴性对照。使用高流量洗去几乎所有不需要的细胞，使得在初始分离期间在多孔芯片上仅捕获几百个WBCs(在100×10⁶细胞中)。随后将样品引入微孔芯片以将每个细胞分到单独的隔室，从而允许仅提取所需的单细胞。这种技术将CTC的纯度增加到大约100％。

其它实施方案

已经描述了许多实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。此外，附图中所描绘的逻辑流程不需要所示的特定次序或相继次序来获得所需结果。此外，可以从所述流程中提供其它步骤，或者可以省去步骤，并且可以将其它组件添加到所述系统中，或者从所述系统中去除其它组件。因此，其它实施方案在所附权利要求的范围内。

Claims (23)

1.用于对有磁性的靶实体或被制备为有磁性的靶实体进行分析的系统，所述系统包括：

壳体，所述壳体包括：

接收区域，其被配置为接收测试盒装置，所述测试盒装置用于当包含靶实体的样品流体流过所述测试盒装置时捕获靶实体，其中所述测试盒装置包括一个或多个微流体芯片；

样品流体储存器，其与所述接收区域流体连通并被配置为存储所述样品流体；

一个或多个试剂储存器，每个储存器与所述接收区域流体连通并且被配置为存储一种或多种试剂；

一个或多个磁体组件，所述磁体组件被布置成邻近所述接收区域并且被配置为在测试盒内产生磁力，所述磁力在流体流过所述微流体芯片内的表面时足以将磁性靶实体与非磁性实体分离并将至少一个磁性靶实体保持在至少一个所述微流体芯片内的至少一个已知位置处；

流体控制装置，其用于控制所述样品流体和所述一种或多种试剂通过所述一个或多个微流体芯片的流动，其中所述流体控制装置使所述样品流体以足以将非磁性实体移出所述一个或多个微流体芯片但不足以将磁性靶实体从所述一个或多个微流体芯片移除的流量通过所述一个或多个微流体芯片；

任选地，分析器装置，其用于对在微流体芯片内的至少一个已知位置处的所述至少一个磁性靶实体进行成像；和

计算装置，其被布置和编程以控制所述分析器装置和所述流体控制装置。

2.如权利要求1所述的系统，其还包括所述测试盒装置，其中所述测试盒装置包括纯化芯片，所述纯化芯片包括多孔表面，其中所述多孔表面的孔小于所述靶实体，并且其中控制所述磁力以吸引和移动磁性靶实体朝向所述多孔表面，并且当所述样品流体流过所述多孔表面时将至少一个磁性靶实体保持在所述多孔表面上，以及吸引未结合到靶实体的磁珠穿过所述孔。

3.如权利要求2所述的系统，其中所述测试盒装置还包括提取芯片，所述提取芯片包括微孔表面，所述微孔表面包括布置在所述微孔表面的一个或多个阵列中的多个微孔，其中所述微孔大于所述靶实体，并且其中当所述样品流体流过所述微孔表面时，控制所述磁力以将至少一个磁性靶实体吸引并保持在所述多个微孔中的至少一个微孔中。

4.如权利要求1所述的系统，其中所述系统还包括用于选择以下任一项的选择阀：

使存储在所述样品流体储存器中的流体样品流入所述测试盒，或

使存储在所述试剂储存器中的一种或多种试剂流体流入所述测试盒。

5.如权利要求1至4中任一项所述的系统，其还包括一组磁珠，所述磁珠被配置为特异性地结合到所述靶实体。

6.如权利要求5所述的系统，其中所述磁珠被功能化以特异性结合特定类型的细胞，例如循环肿瘤细胞、包括胎儿细胞的滋养层细胞、或有核红细胞。

7.如权利要求5所述的系统，其中所述磁珠在其表面上包含与所述靶实体表面上的分子特异性结合的一个或多个结合部分。

8.如权利要求1至7中任一项所述的系统，其还包括靶实体提取模块，所述靶实体提取模块被配置成从至少一个已知位置，例如微孔提取靶实体。

9.如权利要求8所述的系统，其中所述靶实体提取模块包括微量移液管。

10.如权利要求2至9中任一项所述的系统，其中所述多孔表面的孔的尺寸为0.5μm至20μm，例如5至15μm。

11.如权利要求3至10中任一项所述的系统，其中所述多个微孔中的每个微孔具有允许仅一个靶实体进入所述微孔的尺寸，并且所述多个微孔中的每个微孔具有大致相同的尺寸。

12.如权利要求3至11中任一项所述的系统，其中所述微孔表面的所述一个或多个阵列包括：

布置在所述微孔表面上的第一位置处的微孔的第一阵列；以及

第二和后续阵列(如果存在)，其在第二和后续位置处顺序地布置在所述微孔表面上，使得样品流体首先流过微孔的第一阵列，然后顺序地流过微孔的第二和后续阵列，并且其中第二和后续阵列(如果存在)中的微孔在给定阵列内各自具有比先前相邻阵列中的微孔的尺寸大至少10％的尺寸。

13.用于使用磁珠从液体样品中纯化和提取靶实体的测试盒装置，所述靶实体是有磁性的或被制备为有磁性的，所述装置包括：

主体，其包括至少一个主体入口和至少一个主体出口；

第一微流体组件，其被布置在所述主体内并且包括腔室以及板，所述腔室具有与所述主体入口流体连通的第一入口和第一出口；所述板被设置在所述腔室内并将所述腔室分成第一部分和第二部分，其中所述板包括多个孔，其中每个孔小于靶实体且大于磁珠；

第二微流体组件，其被布置在所述主体内并且包括具有第二入口和第二出口的第二腔室，其中所述第二腔室包括微孔表面，所述微孔表面具有布置在所述微孔表面上的一个或多个阵列中的多个微孔，其中所述微孔大于所述靶实体；和

阀，其被布置在所述主体内并被配置为提供与所述第一出口、所述主体出口和所述第二入口的选择性流体连通；

其中所述第一和第二微流体组件被串联布置，并且所述阀被布置在所述第一和第二腔室之间，并且其中所述阀提供从所述第一出口到所述主体出口或所述第二入口的选择性流体连通。

14.如权利要求13所述的测试盒装置，其中所述多个微孔中的每个微孔具有允许仅一个靶实体进入所述微孔的尺寸，并且所述多个微孔中的每个微孔具有大致相同的尺寸。

15.如权利要求13或14中任一项所述的测试盒装置，其中所述微孔表面的所述一个或多个阵列包括：

布置在所述微孔表面上的第一位置处的微孔的第一阵列；以及

第二和后续阵列，其在第二和后续处顺序地布置在所述微孔表面上，使得样品流体首先流过微孔的第一阵列，然后顺序地流过微孔的第二和后续阵列，并且其中第二和后续阵列中的微孔在给定的阵列内各自具有比先前相邻阵列中的微孔的尺寸大至少10％的尺寸。

16.捕获靶实体的方法，所述方法包括：

任选地当容纳在权利要求1至12中任一项所述的系统中时，将含有磁性靶实体的流体样品从样品流体储存器引入到权利要求13至15中任一项所述的测试盒装置的主体入口中；

将一种或多种试剂从试剂储存器引入到所述测试盒装置的主体入口中；

孵育样品流体和引入到所述测试盒装置中的所述一种或多种试剂；

使用磁体组件向所述测试盒装置施加可变磁力；

使所述样品流体以足以使非磁性实体在所述多孔表面上移动并离开所述多孔表面但不足以将磁性靶实体从所述多孔表面移开的流量流过所述测试盒装置的所述多孔表面，在所述多孔表面处所述磁性靶实体被所述可变磁力保持；以及

调节所述磁体组件相对于所述测试盒装置的位置、场强或两者，使得所施加的磁力将所述磁性靶实体吸引并保持在多个微孔中。

17.如权利要求16所述的方法，其还包括使用检测器组件分析所述磁性靶实体的特性。

18.如权利要求17所述的方法，其中待分析的特性包括包含在所述靶实体内的分子、DNA、RNA、蛋白质、小分子和酶，或者所述靶实体表面上的分子标记，或者所述靶实体分泌的分子的量、大小、序列和/或构象。

19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述分析包括检测由所述靶实体发射的荧光。

20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其还包括从所述多个微孔中的至少一个中提取靶实体。

21.如权利要求20所述的方法，其还包括将所提取的靶实体传送到所述测试盒装置外部的容器。

22.如权利要求16至21中任一项所述的方法，其中调节所述磁体组件的位置包括相对于所述测试盒装置沿两个水平轴移动所述磁体组件。

23.如权利要求16至22中任一项所述的方法，其中当所述流体样品流入所述测试盒装置的所述第一微流体组件时，所述可变磁力被施加到所述测试盒装置。

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