JP6645651B2 - 分子の検出方法及び分子検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、液体試料から目的分子を検出するための分子の検出方法及び分子検出装置に関する。

一般に真核生物は、運動を行うための広く保存された機構を有しており、この機構により、筋収縮、鞭毛運動、アメーバ運動のような細胞に変位をもたらす運動のほか、細胞内の物質輸送、染色体分配、細胞質分裂といった、細胞の基本的機能を維持するための活動を行っている。運動を行うためのこの機構は、細胞骨格タンパク質と、それと相互作用するモータータンパク質により実現されており、モータータンパク質は、生体におけるエネルギー分子であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加水分解する際に生じる自由エネルギーを駆動力として、細胞骨格タンパク質から構成されたフィラメントと相互作用して滑り運動を行っている。細胞骨格タンパク質の最も主要なものとしては、アクチン及びチューブリンが知られており、それぞれ、アクチンフィラメントや微小管を形成する。これに対して、モータータンパク質としては、アクチンと相互作用して滑り運動を起こすミオシンや、チューブリンと相互作用して滑り運動を起こすキネシン及びダイニンが知られている。

ところで、一般に、がんの転移や再発の診断には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用した腫瘍マーカー検査が多用されているが、腫瘍マーカー検査では、がんの種類を特定するために多種類の腫瘍マーカーを検査する必要があるほか、酵素免疫測定法を実施するための装置も大型であり、大病院以外では実施が難しいという問題点がある。特に、腫瘍マーカーの検査のコストが、検査する腫瘍マーカーの数に比例するため、検査コストの削減のために、本来は検査すべき腫瘍マーカーの検査が実施されない場合があり、がんの再発の発見が遅れるという問題がある。このため、がん治療技術が進展した現在であっても、がんの転移や再発は見逃されがちであり、限局性がんによる死亡率が激減したにもかかわらず、転移や再発によるがんの死亡率は改善されておらず、転移や再発によるがんの死亡率を改善するために、簡易で安価ながんの診断方法及び診断機器を開発することが求められている。

ここで、本発明の発明者らによる発明として、特許文献１には、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、平衡反応を利用して担体分子から目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、を含むことを特徴とするモータータンパクデバイスが開示されている。このモータータンパクデバイスによる診断装置は、細胞骨格タンパク質関連技術と半導体技術を活用して、がんセンサーチップに半導体を組み込むものであり、酵素免疫測定法に比べて、多くの腫瘍マーカーを同時に測定できるにもかかわらず、その測定装置ははるかに簡単な構造を有するのが特徴である。また、わずか３０分で多数の腫瘍マーカーの有無の判定を完了できるので、手術中等にモータータンパクデバイスを用いた判定を行うことも可能であり、手術中に採取した検体を使用して患者の免疫反応を調べることにより、患者ごとに適切な医薬品や手術方法を採用することも可能となる等、応用性に富んだものである。

国際公開第２０１３／０８１０３５号パンフレット

ここで、例えば、血液を使用して、特許文献１のモータータンパクデバイスを用いた目的分子の検出方法を実施しようとする場合、特許文献１のモータータンパクデバイスが細胞骨格タンパク質とモータータンパク質の相互作用を利用するものであるにもかかわらず、血液中には、細胞骨格タンパク質やモータータンパク質に結合し、これらのタンパク質の活性に影響を与える分子が多く存在しているため、特許文献１のモータータンパクデバイスが適切に動作しないことがある。したがって、本発明は、以上の課題に鑑みてなされたものであり、細胞骨格タンパク質とモータータンパク質との相互作用を利用したモータータンパクデバイスを利用した分子の検出方法であって、血液を使用しても目的分子を適切に検出することができる分子の検出方法を提供することを目的とする。

本発明の発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究を行った。その結果、モータータンパクデバイスに液体試料を注入するに先立つ前処理方法として、液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させ、その後これを分離することにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のものを提供する。

（１）本発明の第１の態様は、液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させる工程と、液体試料から、前記担体を分離する工程と、前記担体に担持されたモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスに液体試料を注入する工程と、モータータンパクデバイスからの出力を読み取って、液体試料中の目的分子の有無を判定する工程と、を有する、液体試料における分子の検出方法である。

（２）本発明の第２の態様は、（１）に記載の液体試料における分子の検出方法であって、前記モータータンパクデバイスが、前記細胞骨格タンパク質上に担持された抗体が目的分子を捕集する捕集領域と、前記細胞骨格タンパク質上に担持された抗体よりも高い、目的分子に対する結合能を有し、前記細胞骨格タンパク質に担持された抗体から目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域とを有し、前記細胞骨格タンパク質に担持された抗体が、捕集領域と荷降ろし領域との間で、前記モータータンパク質で被覆された基板上を往復可能であることを特徴とするものである。

（３）本発明の第２の態様は、（１）又は（２）に記載の液体試料における分子の検出方法であって、前記モータータンパク質及び前記細胞骨格タンパク質の組み合わせが、ミオシン及びアクチンの組み合わせ、ダイニン及びチューブリンの組み合わせ、又はキネシン及びチューブリンの組み合わせであることを特徴とするものである。

（４）本発明の第３の態様は、（１）から（３）のいずれかに記載の液体試料における分子の検出方法であって、前記モータータンパク質及び前記細胞骨格タンパク質を担持する担体が、マイクロビーズ又は磁性ビーズであることを特徴とするものである。

（５）本発明の第４の態様は、（４）に記載の液体試料における分子の検出方法であって、前記マイクロビーズ又は前記磁性ビーズを、チオール基含有シランカップリング剤又はポリドーパミンを介して、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と結合させることを特徴とするものである。

（６）本発明の第５の態様は、（４）又は（５）に記載の液体試料における分子の検出方法であって、フィルターを用いたろ過又は磁気を用いた除去により、液体試料から、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体を除去することを特徴とするものである。

（６）本発明の第６の態様は、液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させる液体試料−担体混合部と、液体試料から、前記担体を分離する担体分離部と、前記担体に担持されたモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスと、モータータンパクデバイスからの出力を読み取って、液体試料中の目的分子の有無を判定する判定部と、を有する液体試料における分子の検出装置である。

本発明においては、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスを用いて、液体試料における分子の検出方法を実施するにあたり、モータータンパクデバイスに液体試料を注入する前に、液体資料の前処理方法として、液体試料を、モータータンパクデバイスに利用されるモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させ、この担体を除去する。ここで、血液に代表される液体試料中には、モータータンパクデバイスを構成するモータータンパク質や細胞骨格タンパク質に結合して、モータータンパク質と細胞骨格タンパク質の結合を阻害したり、モータータンパク質や細胞骨格タンパク質の活性を阻害したりする物質が内在する可能性がある。しかしながら、モータータンパクデバイスへの液体試料の注入に先立って、液体試料とモータータンパク質や細胞骨格タンパク質を担持する担体とを接触させるので、担体に担持されたモータータンパク質や細胞骨格タンパク質にこれらの阻害物質が結合し、担体を除去することにより、これらの阻害物質を液体試料から除去することができる。このため、液体試料における分子の検出を、阻害物質の非存在下で実施することができる。

アクチンが担持された磁性粒子を用いて、血清からアクチン結合タンパク質を除去する方法を模式的に説明する図面である。 架橋物質を介した、磁性粒子とアクチンとの結合を模式的に説明する図面である。 ポリドーパミンの生成反応を説明する図面である。

以下、本発明について、図面を参照して詳細に説明する。

＜液体試料における分子の検出方法＞
本発明の液体試料における分子の検出方法は、液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させる工程（第１の工程）と、液体試料から、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体を分離する工程（第２の工程）とを有し、好ましくは、上記の担体に担持されたモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスに液体試料を注入する工程（第３の工程）と、モータータンパクデバイスからの出力を読み取って、液体試料中の目的分子の有無を判定する工程（第４の工程）と、を有する。本発明は、液体試料における分子の検出方法を実施するに当たって行われる、液体試料の前処理方法であってもよく、上記の第１の工程及び第２の工程からなるものでもある。

［液体試料における分子の検出方法の適用対象］
ここで、本発明を利用して検出される分子としては、抗体と結合可能な分子であれば、特に限定されるものではなく、具体的には、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、及び核酸等を挙げることができる。また、本発明を利用して検出される分子は、各種の抗原、免疫グロブリン、腫瘍マーカー、リガンド、ウイルス、細菌等であってもよい。

本発明が適用される液体試料としては、特に限定されるものではなく、血液、血清、血漿、尿、汗、痰、前立腺液、胃液、腸液、腎液、肺液、脳脊髄液、髄液、精液等の体液；脳、食道、胃、肺、小腸、大腸、すい臓、肝臓、腎臓、膀胱、脾臓、甲状腺、睾丸、子宮、骨等の組織から採取又は調製された液体試料を含む。本発明を生体から得られる液体試料に適用する場合、本発明の液体試料における分子の検出方法は、がん、ウイルス性感染症、細菌性感染症、自己免疫性疾患、代謝性疾患、心因性疾患等、任意の疾患の診断のために使用されることが好ましく、がんの診断のために使用されることが特に好ましい。本発明の液体試料における分子の検出方法を、がんの診断のために用いる場合、検出される目的分子は腫瘍マーカーであるが、そのような腫瘍マーカーとしては、ＡＦＰ、ＢＣＡ２２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、ＤＵＰＡＮ−２、ＮＭＰ２２、ＮＳＥ、ＰＡ（ＰＳＡ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＰｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＳＬＸ、ＴＰＡ、γ−Ｓｍ、抗ｐ５３抗体、エラスターゼ１等を挙げることができる。

また、本発明の液体試料における分子の検出方法が適用される液体試料としては、生体由来の液体試料に限定されず、河川又は湖沼から採取した淡水、雨水、海水、上水、下水、植物分泌液、植物抽出液等、環境中の液体試料であってもよい。このような環境中の液体試料を本発明に適用する場合、本発明の液体試料における分子の検出方法は、薬用成分、毒物、各種汚染物質、環境ホルモン（例えば、ポリ塩化ビフェニル、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸）等の検出のために使用することができる。さらに、上記液体試料として、培養細胞の抽出液、培養液や、ウイルス由来のプラーク、細菌及び真菌の抽出液や培養液等、実験室において得られる各種液体試料を採用して、本発明の液体試料における分子の検出方法を、実験室における所定分子の検出のために使用してもよい。

［第１の工程］
第１の工程においては、液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させる。液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させることにより、モータータンパクデバイスを構成するモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と相互作用し、これらの機能を阻害しうる液体試料中の物質を、担体上のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と結合させて、液体試料をモータータンパクデバイスに注入するに先立って、除去することができる。

（モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質）
ここで、担体に担持させるモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質としては、モータータンパクデバイスに使用されるモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を使用することができ、モータータンパク質と細胞骨格タンパク質との具体的な組み合わせとしては、ミオシン及びアクチンの組み合わせ、ダイニン及びチューブリンの組み合わせ、並びにキネシン及びチューブリンの組み合わせを挙げることができる。本発明において、特に、モータータンパクデバイスにモータータンパク質と細胞骨格タンパク質との複数の組み合わせを採用する場合には、担体に担持させるモータータンパク質と細胞骨格タンパク質との組み合わせも複数採用してもよい。

（担体）
モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を担持させる担体としては、タンパク質を担持させるために使用される従来公知の任意の担体を採用することができる。担体としては、粒子状の担体であっても、膜状の担体であってもよいが、具体的には、ポリスチレン、でんぷん、ポリ乳酸、デキストラン、ガラス、シリカ等からなるマイクロビーズ；金属酸化物等からなる磁性ビーズ；ろ紙、ニトロセルロース膜、セルロースアセテート膜、官能化ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜等の膜担体を挙げることができる。これらの中でも、マイクロビーズ及び磁性ビーズが好ましい。これらの担体を使用するに際しては、物質の非特異的結合を防止するため、事前にブロッキング処理を施していてもよい。

（担体へのモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質の結合）
モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を上記の担体に結合させるに際しては、担体へのタンパク質の導入に関する従来公知の架橋物質を使用し、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と、担体とを、架橋物質を介した共有結合により結合させればよい。そのような架橋物質としては、アミノ基、イミノ基、水酸基、チオール基、アルコキシ基、エポキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基等の官能基を２以上有する、２価以上の結合価を有する任意の架橋物質を挙げることができる。これらの架橋物質の中でも、特にチオール基含有シランカップリング剤、エポキシ基含有シランカップリング剤、及びポリドーパミンが好ましく、チオール基含有シランカップリング剤及びポリドーパミンがより好ましい。図２にチオール基含有シランカップリング剤及びポリドーパミンを架橋物質として使用した場合の、担体とモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質との架橋反応の概念図を示す。本発明で好ましく使用される単体であるマイクロビーズや磁性担体には、担体粒子表面に水酸基が存在しているが、この水酸基にチオール基含有シランカップリング剤のアルキコシル基が加水分解することにより生じるシラノール基が反応して、チオール基含有シランカップリング剤が担体の表面に固定される。そして、チオール基含有シランカップリング剤のチオール基が、モータータンパク質や細胞骨格タンパク質中に存在するシスティン残基のチオール基と反応して結合することにより、チオール基含有シランカップリング剤を介して、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担体上に固定される。また、例えば、磁性粒子をドーパミン溶液に浸漬することにより、図３に示すように、ドーパミンの酸化が起きて磁性粒子表面にポリドーパミン皮膜が形成される。このポリドーパミン皮膜は、マイケル付加反応やシッフ塩基反応の化学反応により、モータータンパク質や細胞骨格タンパク質中に存在するアミノ基、チオール基等の側鎖求核性基と反応して架橋構造を形成するため、モータータンパク質や細胞骨格タンパク質を担体上に結合させることができる。

なお、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質は、必ずしも同一の担体に双方を担持させておく必要はなく、２種類の担体を用意して一方の担体にモータータンパク質を担持させ、他方の担体に細胞骨格タンパク質を担持させてもよい。

（液体試料と担体との接触）
液体試料を担体と接触させるにあたっては、液体試料の体積の少なくとも２倍の容器に、液体試料とモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を担持させた担体を投入し、ボルテックスミキサー等を使用して液体試料と担体とを十分に混合させることが好ましい。なお、液体試料と担体は、必ずしも、液体試料を採取した容器と別の容器で混合して接触させる必要はなく、例えば、フィルターを備えるマイクロシリンジを用い、マイクロシリンジで液体試料を採取する際に、フィルターで区画された領域に液体試料を誘導し、フィルターで区画された領域にあらかじめ収容された上記の担体と、液体試料とを接触させて混合してもよい。このようにする場合、マイクロシリンジから液体試料を排出する際に、マイクロシリンジに備えられたフィルターによって液体試料と担体とが分離されるので、後述する第２の工程を別途設けなくても、一段階で、第１の工程と第２の工程を実施することができ、本発明の液体試料における分子の検出方法を、より小規模且つ低コストで実施可能なものとすることができる。

［第２の工程］
第２の工程においては、液体試料から、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体を分離する。液体試料から上記の担体を分離するにあたっては、ろ過又は磁気を用いた除去により、液体試料から、上記の担体を分離して除去する。ろ過を用いた除去により、液体試料から担体を除去する場合、ろ過のための装置を別途設けてもよいし、上述のとおり、液体試料を採取するためのマイクロシリンジにフィルターを内在させてもよいし、マイクロシリンジの先端に小型のろ過装置を取り付けてろ過してもよい。また、磁気を用いた除去を行う場合、担体として磁性ビーズを用い、液体試料と担体とを混合した容器からデカンテーションや吸引等により液体試料を回収する際に、磁気を使用して担体を一箇所に固定し、液体試料と分離すればよい。

図１に模式的に示されるように、第１の工程及び第２の工程を経ることにより、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質に結合して、それらの機能を阻害する物質を、液体試料から除去することができる。なお、本発明においては、これらのモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質の機能を阻害する物質を完全に除去するため、第１の工程及び第２の工程を繰り返して行ってもよい。

第１の工程及び第２の工程は、比較的小規模且つ簡便な装置を用いて、低コストで実施することができる。本発明の液体試料における分子の検出方法を、腫瘍マーカーの検出によるがんの診断のために使用する場合、多種類の腫瘍マーカーの検出を頻回に亘って実施するため、上記検出方法は、小規模且つ簡便なものであって、低コストで実施できるものであることが求められる。第１の工程及び第２の工程に関する上記構成は、そのような規模及びコストに関する要求にこたえうるものである。

なお、本発明は、第１の工程及び第２の工程のみからなる、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスに注入する液体試料の前処理方法の発明として構成してもよい。この液体試料の前処理方法についても、本件明細書の開示の範囲に含まれるものである。

［第３の工程及び第４の工程］
第３の工程では、上述の担体に担持されたモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスに液体試料を注入することが好ましく、第４の工程では、モータータンパクデバイスからの出力を読み取って、液体試料中の目的分子の有無を判定することが好ましい。第１の工程及び第２の工程に加えて、任意的に第３の工程及び第４の工程を実施することにより、液体試料において、目的の分子を検出することができる。これら、第３の工程及び第４の工程の実施にあたっては、国際公開第２０１３／０８１０３５号パンフレット（特許文献１）に示されるモータータンパクデバイスを使用することができるが、以下に本発明において好適に使用されるモータータンパクデバイスの一例について簡単に説明することとする。

（モータータンパクデバイス）
モータータンパクデバイスは、細胞骨格タンパク質上に担持された抗体が目的分子を捕集する捕集領域と、細胞骨格タンパク質上に担持された抗体よりも高い、目的分子に対する結合能を有し、細胞骨格タンパク質に担持された抗体から目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域とを有し、細胞骨格タンパク質に担持された抗体が、捕集領域と荷降ろし領域との間で、モータータンパク質で被覆された基板上を往復可能なものであることが好ましい。そして、モータータンパクデバイスに注入された液体試料中の目的分子は、捕集領域において細胞骨格タンパク質上に担持された抗体に捕集され、目的分子を結合した抗体が、荷降ろし領域に移動した後、荷降ろし領域に存在する抗体等の目的分子への結合部に目的分子が結合することにより、荷降ろし領域に目的分子が濃縮され、この目的分子の濃縮による荷降ろし領域の物性変化を検出することにより、液体試料中の目的分子の存在が検出されることが好ましい。

本発明のモータータンパクデバイスにおける、捕集領域及び荷降ろし領域は、例えば、タンパク質を固定化可能な基板上に設けられ、この基板を含む区画が緩衝液等で満たされている。そして、上記の緩衝液には、必要に応じ、モータータンパク質に自由エネルギーを提供するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）等を含有させることができる。

（（捕集領域））
捕集領域は、細胞骨格タンパク質上に担持された抗体が目的分子を捕集する領域である。抗体を担持する細胞骨格タンパク質としては、例えば、アクチン（繊維状アクチン；Ｆ−アクチン）を挙げることができるが、アクチンに限定されるわけではなく、チューブリンを用いてもよい。上記の細胞骨格タンパク質としてアクチンを用いる場合、捕集領域及び後述する荷降ろし領域等の基板には、ミオシン（ヘビーメロミオシン）を固定することが好ましい。

（（荷降ろし領域））
荷降ろし領域は、平衡反応を利用して細胞骨格タンパク質に担持された抗体から、目的分子を荷降ろしする領域である。このため、荷降ろし領域は、領域全体として、細胞骨格タンパク質に担持された抗体よりも高い、目的分子に対する結合能を有している。このような高い結合能を実現するために、荷降ろし領域は、上記の抗体よりも高い補足力の結合物質を含んでいてもよいし、同一の抗体をより高濃度で含んでいてもよい。これにより、細胞骨格タンパク質上の目的分子に強力に結合することができ、平衡反応を利用して荷降ろし領域に目的分子を濃縮することができる。

（（捕集領域及び荷降ろし領域間の往復））
モータータンパクデバイスの捕集領域及び荷降ろし領域を結ぶ領域（搬送路）の基板は、モータータンパク質で被覆されており、細胞骨格タンパク質が一方向に移動して捕集領域及び荷降ろし領域を往復可能になっている。これにより、細胞骨格タンパク質に担持された抗体は、捕集領域で目的分子に結合した後、目的分子を結合したまま、荷降ろし領域に移動し、荷降ろし領域で目的分子を荷降ろしすることとなる。そして、荷降ろし領域で荷降ろしした細胞骨格タンパク質上の抗体分子は、再び、捕集領域に移動して、目的分子に結合することとなる。細胞骨格タンパク質上の抗体が、捕集領域と荷降ろし領域の間を繰り返し往復することにより、捕集領域に注入された液体試料中の目的分子が、荷降ろし領域に濃縮されることとなる。この搬送路は、捕集領域から独立した領域であってもよく、捕集領域又は荷降ろし領域の一部であってもよい。搬送路は、別々の捕集領域から、１つの荷降ろし領域に到達する複数の領域からなっていてもよい。

なお、搬送路は、全体的に環状の通路の形状を有していてもよく、この環状の通路である搬送路の全面がミオシンで被覆されたものとすることができる。そして、この場合、捕集領域において目的分子を捕集した細胞骨格タンパク質上の抗体は、荷降ろし領域において目的分子を荷降ろしした後、搬送路の経路に沿って、再び捕集領域に戻ることができる。したがって、細胞骨格タンパク質上の抗体は、目的分子を捕集して荷降ろし領域に搬送して荷降ろしすることを繰り返し、目的分子を荷降ろし領域に濃縮し続けることができる。

以上のような細胞骨格タンパク質上の抗体の移動には、緩衝液を流動させるための機構は必要なく、緩衝液中にＡＴＰ等のエネルギー分子を供給することにより可能となるものである。したがって、本発明のモータータンパクデバイスは、無動力で動作可能な目的分子の濃縮手段として構成することが可能である。

（目的分子の検出）
モータータンパクデバイスは、例えば、荷降ろし領域における目的分子の濃度変化を検出する分析部に接続しており、これにより、目的分子が荷降ろし領域に荷降ろしされたことを、外部から検出することができる。分析部としては、例えば、電気的検出手段の一部としての電極を備え、これらの電極を介して荷降ろし領域のインピーダンス又はその変化を検出することができる構成を挙げることができる。すなわち、この場合、モータータンパクデバイスにおいて、荷降ろし領域のインピーダンス又はその変化として、荷降ろし領域における目的分子の濃度変化を検出すればよい。

また、目的分子の検出に際して、荷降ろし領域における目的分子の濃度変化を光学的に検出してもよい。この場合、荷降ろし領域には、例えば、光路を設ければよく、当該光路は、特定の波長領域の光を透過する光透過性材料等で構成すればよい。これにより、荷降ろし領域における目的分子の濃度変化は、光路を介した上記特定波長における吸光度変化として検出することができる。

＜液体試料における分子の検出装置＞
本発明は、液体試料における分子の検出装置にも関する。本発明の液体試料における分子の検出装置は、液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させる液体試料−担体混合部と、液体試料から、上記の担体を分離する担体分離部とを有し、上記担体に担持されたモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスと、モータータンパクデバイスからの出力を読み取って、液体試料中の目的分子の有無を判定する判定部と、を有していることが好ましく、モータータンパクデバイスが上記で説明した構成を有するものであることが好ましい。本発明においては、本発明の目的に反しない範囲で、液体試料−担体混合部及び担体分離部を、独立した液体試料の前処理装置として構成してもよいし、液体試料における分子の検出装置の、液体試料−担体混合部及び担体分離部と、モータータンパクデバイス及び判定部とを、別々のユニットからなるものとして構成してもよいし、これらを完全に一体の装置の一部として構成してもよい。本発明の液体試料における分子の検出装置における各機能単位の具体的構成は、上記で説明したもの以外については、従来公知の構成を採用すればよい。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。なお、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

＜試験例１；アクチンが担持された担体の作製＞
［磁性粒子のチオール基含有シランカップリング剤又はポリドーパミンでの修飾］
平均粒径０．２３μｍのＦｅ_３Ｏ_４（磁性粒子）をチオール基含有シランカップリング剤、エポキシ基含有シランカップリング剤とそれぞれ反応させ、チオール基及びエポキシ基で官能化した磁性粒子を得た。チオール基含有シランカップリング剤として、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）を、エポキシ基含有シランカップリング剤として、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＳ）を使用し、トルエン溶媒下にて、各シランカップリング剤と未処理Ｆｅ_３Ｏ_４粒子とを１１０℃で２４時間還流することにより、ＭＰＴＳ−Ｆｅ_３Ｏ_４及びＧＰＴＳ−Ｆｅ_３Ｏ_４を得た。

さらに、塩基性条件下でドーパミンと未処理Ｆｅ_３Ｏ_４粒子とを反応させることにより、Ｆｅ_３Ｏ_４表面にポリドーパミン（ＰＤＡ）を形成させて、ＰＤＡ−Ｆｅ_３Ｏ_４を得た。

［修飾磁性粒子へのアクチンの結合］
修飾Ｆｅ_３Ｏ_４とトリ骨格筋由来のＧ−アクチンをＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、４℃で２４時間回転転倒することによって反応させ、アクチンを担持させたＦｅ_３Ｏ_４を得た。修飾磁性粒子に固定化されたアクチンの量は、固定化に使用したアクチンの量とアクチンが結合した磁性粒子を取り出した後の溶液中における、吸光度から算出した残存するアクチンの量の差から求めた。

＜試験例２；血清からのアクチン結合物質の除去＞
ヒト血清（プール）をＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で２０倍から１２０倍に希釈し、これに試験例１で得られたアクチンを担持させた磁性粒子を添加した。磁性粒子を添加した希釈血清を室温で３０分間攪拌した後、ネオジム磁石を用いて希釈血清から磁性粒子を除去した。

＜試験例３；血清存在下での繊維状アクチンの観察＞
一般に、蛍光標識した繊維状アクチン（Ｆ−アクチン）は、蛍光顕微鏡下、ヘビーメロミオシン（ＨＭＭ）を固着したスライドガラス上を移動する様子が観察されることが知られているが、本試験例では、これを利用してアクチンを担持させた磁性粒子と接触させた血清中に、アクチン及びミオシンの活性を阻害する物質が含まれていないか否かを検討した。ヘビーメロミオシンを固着したスライドガラス上に、蛍光標識した繊維状アクチンを添加した。ここに、アクチンを担持させた磁性粒子に接触させていない２０倍希釈の血清を添加したが、繊維状アクチンの移動は観察されず、１２０倍希釈の血清を添加した場合、アクチン繊維が短くなった状態で運動する様子が観察された。これは、血清中に存在するアクチン結合物質が繊維の切断や重合阻害を引き起こすためであると考えられる。一方、アクチンを担持させた磁性粒子で処理した２０倍又は１２０倍の血清を添加した場合、繊維状アクチンが移動する様子を観察できた。よって、アクチンを担持させた磁性粒子で血清を処理することにより、アクチン結合物質が除去されたと考えられる。

＜試験例４；インピーダンスの変化を検出することによるタンパク質の濃縮の検出＞
荷降ろし領域における目的分子の濃縮を検出するために利用できる方法であるインピーダンス分光法の有用性を検討するため、金電極、ＩＴＯ電極、Ｐ型シリコン電極を用いた非ファラディックインピーダンス分光法（ｎＦＩＳ）でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度変化の検出を行った。

［ニトロセルロース修飾電極の作製］
エタノールで洗浄した電極（金、Ｐ型シリコン、ＩＴＯ）を室温で乾燥させた後、１％ニトロセルロース溶液に浸漬して室温で乾燥させた。その後、エタノールで洗浄して室温で乾燥させた。

［ＢＳＡ濃度の測定］
作用極に金電極、対向極に白金電極、参照極に銀塩化銀電極を用いた三電極系で電圧０Ｖ ｖｓ． Ａｇ／ＡｇＣｌ、振幅２０ｍＶで周波数を８ＭＨｚから１００ｍＨｚまで変化させてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）濃度の測定を行った。なお、測定したＢＳＡ溶液はＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）に、５．０×１０^−６ｇ／ｍｌ、５．０×１０^−５ｇ／ｍｌ、５．０×１０^−４ｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡを添加したものを使用した。このＢＳＡ溶液のそれぞれ５０μｌを、測定溶液７５０μｌに混合して、各濃度におけるインピーダンスの測定を行った。なお、ＢＳＡの最終濃度はそれぞれ、３．１×１０^−７ｇ／ｍｌ、３．１×１０^−６ｇ／ｍｌ、３．１×１０^−５ｇ／ｍｌである。同様の試験を、５．０×１０^−４ｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液について、作用極をＰ型シリコン電極及びＩＴＯ電極に変更したものでも実施した。

得られたインピーダンス変化を、横軸を容量の実数成分、縦軸を容量の虚数成分として、Ｃｏｌｅ−Ｃｏｌｅプロットしたところ、ＢＳＡの濃度が高いほどプロットの縦軸方向の高さが小さくなる傾向が見られた。これはＢＳＡが電極表面に吸着したことで、容量が減少したためであると考える。金電極を使用した場合のＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅプロットの最大高さの２倍値の具体的な数値を表２に示した。

Claims (7)

1. 液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させる工程と、
   液体試料から、前記担体を分離する工程と、
   前記担体に担持されたモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスに液体試料を注入する工程と、
   モータータンパクデバイスからの出力を読み取って、液体試料中の目的分子の有無を判定する工程と、を有する、液体試料における分子の検出方法。
2. 前記モータータンパクデバイスが、前記細胞骨格タンパク質上に担持された抗体が目的分子を捕集する捕集領域と、前記細胞骨格タンパク質上に担持された抗体よりも高い、目的分子に対する結合能を有し、前記細胞骨格タンパク質に担持された抗体から目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域とを有し、前記細胞骨格タンパク質に担持された抗体が、捕集領域と荷降ろし領域との間で、前記モータータンパク質で被覆された基板上を往復可能である、請求項１に記載の液体試料における分子の検出方法。
3. 前記モータータンパク質及び前記細胞骨格タンパク質の組み合わせが、ミオシン及びアクチンの組み合わせ、ダイニン及びチューブリンの組み合わせ、又はキネシン及びチューブリンの組み合わせである、請求項１又は２に記載の液体試料における分子の検出方法。
4. 前記モータータンパク質及び前記細胞骨格タンパク質を担持する担体が、マイクロビーズ又は磁性ビーズである、請求項１から３のいずれかに記載の液体試料における分子の検出方法。
5. 前記マイクロビーズ又は前記磁性ビーズを、チオール基含有シランカップリング剤又はポリドーパミンを介して、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と結合させる、請求項４に記載の液体試料における分子の検出方法。
6. フィルターを用いたろ過又は磁気を用いた除去により、液体試料から、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体を除去する、請求項４又は５に記載の液体試料における分子の検出方法。
7. 液体試料を、モータータンパク質及び細胞骨格タンパク質が担持された担体と接触させる液体試料−担体混合部と、
   液体試料から、前記担体を分離する担体分離部と、
   前記担体に担持されたモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質と同一のモータータンパク質及び細胞骨格タンパク質を利用したモータータンパクデバイスと、
   モータータンパクデバイスからの出力を読み取って、液体試料中の目的分子の有無を判定する判定部と、を有する液体試料における分子の検出装置。

Images