WO2013099827A1 - 脳疾患の診断及び予後予測方法並びにそれらに使用するキット - Google Patents

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WO2013099827A1
WO2013099827A1 PCT/JP2012/083381 JP2012083381W WO2013099827A1 WO 2013099827 A1 WO2013099827 A1 WO 2013099827A1 JP 2012083381 W JP2012083381 W JP 2012083381W WO 2013099827 A1 WO2013099827 A1 WO 2013099827A1
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WO
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fabp7
antibody
brain
body fluid
serum
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Application number
PCT/JP2012/083381
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祐二 大和田
鈴木　倫保
昌次 柏原
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国立大学法人山口大学
Ｄｓファーマバイオメディカル株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating brain tumor diagnosis, disease evaluation, severity, and disease progression over time, and a technique for using the method. More specifically, the present invention relates to a method for diagnosing a brain tumor by detecting the amount or quantitative change of FABP7 in a body fluid. The present invention also relates to a kit for detecting the amount or quantitative change of FABP7 in a body fluid used for diagnosis or prognosis prediction of a brain tumor.
  • Brain tumor is a disease of the brain and means a neoplasm (tumor) that develops in intracranial tissue. That is, brain tumors originate not only from brain cells, but also from the dura mater, arachnoid membrane, intracranial blood vessels and peripheral nerves, and other tissues existing in the skull.
  • Brain tumors include primary brain tumors that originate from the brain tissue itself and metastatic brain tumors in which cancers of other organs have spread to the brain. For these classifications, the World Health Organization (WHO) ⁇ brain tumor tissue classification (histological typing of tumours of theron nervous system) is used worldwide.
  • WHO World Health Organization
  • brain tumors are roughly classified into tumors that originate from within the brain parenchyma and tumors that originate from outside the brain parenchyma.
  • Tumors that develop from within the brain parenchyma are called neuroepithelial derived tumors, and a typical tumor is a glioma.
  • Glioma arises from glia (glia cells).
  • astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells, etc. in glia, and tumors arising from these are called astrocytomas and oligodendroma, respectively.
  • the histopathological malignancy in glioma is also classified into four stages from Grade I, which has the lowest malignancy, to Grade IV, which has the highest malignancy, as is the case with the histological classification. Yes. Grade IV is called glioblastoma (GBM). This Grade is thought to correlate with prognosis and affects treatment options.
  • Brain diseases such as stroke, head trauma, and brain tumor all have severe brain tissue damage, and it is essential to promptly conduct differential diagnosis and grasp the severity and start early treatment.
  • differential diagnosis using an image diagnostic apparatus such as CT, MRI, and PET is indispensable, so there is no choice but to limit the facility size and medical hours.
  • biochemical screening tests that can be easily diagnosed early are desired.
  • Non-Patent Documents 1-3 a biomarker effective for the diagnosis of a brain tumor for the purpose of diagnosing a primary brain tumor has not been put into practical use. So far, comprehensive gene expression analysis using microarray technology has been confirmed to show different gene expression profiles in histological types of brain tumors (Non-Patent Documents 1-3). However, since gene expression is detected at the RNA level, it is necessary to collect samples by brain biopsy, which places a heavy burden on patients. For this reason, attempts have been made to detect soluble (secreted) proteins related to malignant tumors from body fluids such as serum (Patent Document 1), but there is a problem of lack of specificity for cancer types.
  • the present invention searches for biomarkers in body fluids of brain diseases such as brain tumors, and thus, a biochemical diagnostic method for minimally invasive brain diseases that does not require a brain biopsy, and the method can be simplified. It is to provide a clinical test kit to carry out.
  • the present inventors are FABP7 (Fatty Acid-Binding Protein 7; BLBP (Brain Lipid-Binding Protein), B-FABP (Brain-type Fatty Acid-Binding Protein)) highly expressed in fetal glial cells
  • BLBP Brain Lipid-Binding Protein
  • B-FABP Brain-type Fatty Acid-Binding Protein
  • a test method for diagnosing a brain tumor or cerebrovascular disorder comprising measuring the amount of FABP7 in a body fluid collected from a subject.
  • the body fluid is cerebrospinal fluid, blood, plasma or serum; The method described. 3.
  • the body fluid is cerebrospinal fluid The method described. 4).
  • the body fluid is plasma or serum; 2.
  • Plasma or serum is pretreated The method described. 6).
  • the amount of FABP7 is measured by immunoassay. ⁇ 5.
  • Diagnosis is diagnosis of presence or absence, severity of disease or prognosis ⁇ 6.
  • a test kit for diagnosis of brain tumor or cerebrovascular disorder comprising an antibody that specifically binds to human FABP7 and a device and / or reagent for collecting body fluid.
  • the body fluid is cerebrospinal fluid, blood, plasma or serum; 8.
  • the described kit. 10. 8. the body fluid is cerebrospinal fluid, The described kit. 11. 8. the body fluid is plasma or serum, The described kit. 12 10. further comprising reagents and / or instruments for plasma or serum pretreatment; The described kit. 13.
  • Diagnosis is the presence or absence of disease, severity of disease or prognosis, 8. ⁇ 12.
  • the kit in any one of.
  • test method and test kit of the present invention it is possible to quickly and easily determine a specific brain disease patient including a brain tumor by detecting FABP7 in a body fluid, and an objective and accurate determination result Can be obtained.
  • an evaluation system can be established that enables diagnosis of the brain disease, quantitative evaluation of severity, and evaluation of changes in disease state over time. For example, the determination can be made on the effectiveness of treatment in the patient. Therefore, using this evaluation system, the severity and risk of developing the brain disease can be determined more objectively than in the conventional method.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the expression of FABP7 protein in a cerebellar GBM case and a glioma stem cell line.
  • the vertical axis shows the expression level of FABP7 corrected with ⁇ -actin.
  • It is an immuno-staining image which shows expression of FABP7 (A) and an undifferentiation marker (B) in the cell line established from the glioblastoma case.
  • the present invention provides a test method for diagnosis of brain tumor or cerebrovascular disorder (hereinafter also referred to as “test method of the present invention”).
  • test method of the present invention The present inventors have found that in patients with brain tumors or cerebrovascular disorders, the concentration of FABP7 in body fluids is significantly higher than that in healthy subjects and other patients with brain diseases. Since FABP7 is a protein localized in the cell and is not secreted extracellularly, it is an unexpected finding that the concentration of FABP7 in body fluids correlates with these brain diseases.
  • the test method of the present invention is characterized by measuring the amount of FABP7 in a body fluid collected from a subject.
  • brain tumor refers not only to intracranial tissue, ie, brain cells, but also neoplasms that occur in the dura mater, arachnoid membrane, intracranial blood vessels and peripheral nerves, and other tissues existing in the skull. (Tumor) In general, it may be a primary brain tumor that originates from the brain tissue itself, or a metastatic brain tumor in which cancer of another organ has metastasized to the brain.
  • the WHO's histologic typing of tumours of the central nervous system uses neuroepithelial tissue tumors (gliomas such as astrocytoma and oligodendroma, ependymoma, choroid plexus) Tumors, other neuroepithelial tumors, neuronal tumors, pineal tumors, fetal tumors, etc., schwannoma tumors (eg schwannomas, neurofibromas), meningiomas (meningiomas, Other mesenchymal tumors, malignant melanoma, etc.), lymphomas and hematopoietic cell neoplasms (malignant lymphoma, plasmacytoma, etc.), germ cell tumors (germ cell tumor, yolk sac tumor, choriocarcinoma, teratomas, etc.) There are about 130 types of histology that are broadly divided into Turkish groin tumors (craniopharyngiomas, pituitary cell tumors, etc.)
  • Preferred examples include, but are not limited to, primary brain tumors, particularly gliomas.
  • the histopathological grade may be any of Grade I to Grade IV classified by WHO, but the FABP7 concentration in the body fluid is positively correlated with the grade of malignancy. Since it is highly expressed in Grade III and Grade IV, which have a high growth rate, the test method of the present invention can also evaluate the transition of the brain tumor state by quantitative evaluation of FABP7 and monitoring of changes over time.
  • Cerebral vascular disorder is used as a general term for ischemic or hemorrhagic brain diseases represented by, for example, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, and the like. What develops is called a stroke. Cerebrovascular disorders also include those resulting from head trauma (eg, acute subdural hematoma, acute epidural hematoma, chronic subdural hematoma).
  • the subject to be tested in the test method of the present invention is a human who is currently suffering from a brain tumor or cerebrovascular disorder, who has been completely cured or ameliorated from the disease by treatment, or who is suspected of suffering or suffering in the future. is there.
  • the body fluid collected from the subject is not particularly limited as long as it contains FABP7 at a detectable level.
  • blood fluid, plasma, serum, saliva, urine, tear fluid that can be easily collected from a living body
  • cerebrospinal fluid Cerebrospinal fluid
  • Bone marrow fluid Bone marrow fluid
  • pleural effusion ascites, joint fluid, aqueous humor, vitreous fluid, and the like
  • Cerebrospinal fluid, plasma or serum is preferable.
  • cerebrospinal fluid can be collected from the subject using a method known per se (eg, lumbar puncture method, suboccipital puncture method, ventricular puncture method, etc.).
  • the lumbar puncture method is generally performed, and a puncture needle is inserted into the spinal canal from the lumbar intervertebral space, and cerebrospinal fluid is removed therefrom. Collect 0.5 to 2 mL in a sterile test tube.
  • the cerebrospinal fluid can be used for measurement as it is, but preferably the supernatant after the cerebrospinal fluid cells are precipitated by centrifugation can be used.
  • blood is used as a body fluid, for example, venous blood is collected using a method known per se, and blood cells are collected by centrifugation in the presence of whole blood or coagulation supernatant after clotting, or in the presence of an anticoagulant.
  • Plasma which is the supernatant from which the sample has been removed, can be used for the measurement. Plasma or serum is preferable, and plasma is more preferable.
  • an anticoagulant eg, EDTA (usually K or Na salt), sodium citrate, heparin
  • centrifuged to collect the supernatant.
  • a body fluid sample is derived from blood (eg, plasma, serum)
  • the amount of FABP7 present in the body fluid sample may be extremely small.
  • a large amount of known protein can be removed in advance.
  • proteins to be removed include serum albumin, immunoglobulin (IgG, IgA, IgM), transferrin, haptoglobin, ⁇ 1-antitrypsin, fibrinogen, ⁇ 2-macroglobulin, ⁇ 1-acid glycoprotein, complement C3, apolipoprotein AI, apolipoprotein A-II, transthyretin, etc. are mentioned.
  • Examples of a method for removing these proteins include a method in which a plasma or serum sample is contacted with an affinity carrier formed by immobilizing an antibody against these proteins. For example, a method in which a plasma or serum sample is passed through an affinity column in which one or more anti-plasma / serum protein antibodies are immobilized and a flow-through fraction is collected, or in a container containing magnetic beads in which the antibodies are immobilized, Examples include a method of separating beads and sample liquid by magnetism after adding a serum sample and incubating.
  • pretreatment methods for plasma or serum samples include, for example, the addition of organic solvents, surfactants, inorganic salts, compounds (polymers, low molecules), polysaccharides, etc., and changes in specimen pH (acidic or alkaline treatment) ), Heat treatment (heating, low temperature), molecular sieve separation, adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, centrifugation, etc. can be measured after separating or stabilizing FABP7 from other proteins and lipid components, It is not limited to them.
  • human FABP7 to be detected has a molecular weight consisting of 132 amino acids (UniProtKB / Swiss-Prot accession No. O15540; however, the starting methionine has been removed from the mature protein). It is a protein with a cytoplasmic localization of about 15 kDa.
  • “human FABP7” includes not only the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also a naturally occurring allelic variant (polymorphism) (for example, the 61st registered in ds22NP as rs2279381) In which Thr is replaced with Met).
  • the method for measuring FABP7 in the test method of the present invention is not particularly limited as long as FABP7 present in the body fluid of a subject can be measured with good quantitativeness, but an immunological measurement method is preferably used. That is, FABP7 in body fluid is measured using an antibody that specifically recognizes FABP7 (anti-FABP7 antibody).
  • the “anti-FABP7 antibody” in the present invention may recognize any region of the human FABP7 protein as long as it specifically recognizes and binds to human FABP7, but other FABP family proteins (FABP1 ⁇ It is desirable that a partial amino acid sequence of human FABP7 other than a region having an amino acid sequence common to these proteins is used as an epitope so that there is no cross reaction with FABP6, PMP2, FABP9).
  • the amino acid sequences of FABP1 to FABP6, PMP2, and FABP9 are registered in the UniProtKB / Swiss-Prot database with accession numbers of P07148, P12104, P05413, P15090, Q01469, P51161, P02689, and Q0Z7S8, respectively.
  • FABP7 can be aligned with these other FABP family proteins, and those skilled in the art can easily predict epitopes of antibodies that can specifically bind to human FABP7. Can do.
  • the epitope may be a continuous partial amino acid sequence of human FABP7, or a three-dimensional structure formed by two or more intermittent partial amino acid sequences.
  • the anti-FABP7 antibody is, for example, a commercially available anti-FABP7 antibody (for example, HPA028825 (Atlas Antibodies), SAB1405785, SAB1101096 (Sigma-Aldrich)) or other polyclonal or monoclonal antibodies produced by a known technique, or fragments thereof (for example, Fab, F (ab ′) 2 , ScFv, minibody, etc.) may be used.
  • Fab, F (ab ′) 2 , ScFv, minibody, etc. may be used.
  • mammal-derived monoclonal antibodies and polyclonal antibodies are preferable.
  • Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies derived from mammals are produced in animal blood, produced in hybridomas, and produced in hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques. The best antibody is screened from a huge clone library of 1 trillion molecules by phage display, and the gene is mass-produced at a CHO cell factory, or directly from a transgenic mouse producing a human antibody Examples include human antibodies obtained.
  • Monoclonal and polyclonal antibodies can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • FABP7 used as an immunogen can be a full-length protein of human FABP7 or a fragment thereof (if necessary, a complex cross-linked to a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) ).
  • a fragment of FABP7 it is preferable to use a partial peptide having low homology with other FABP family proteins.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with myeloma cells.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled FABP7 described below with an antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, etc., and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG1000 to PEG6000
  • the cell fusion can be efficiently carried out by incubating at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes.
  • hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as a protein is adsorbed directly or with a carrier, and then radioactive.
  • a solid phase eg, microplate
  • a method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A examples include a method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. .
  • Selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, but can usually be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium may be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture
  • a culture medium SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20-40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
  • Separation and purification of monoclonal antibodies can be carried out in the same way as in the separation and purification of ordinary polyclonal antibodies (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method for obtaining antibody by dissociating the binding using active adsorbent such as protein A or protein G]
  • active adsorbent such as protein A or protein G
  • a polyclonal antibody against FABP7 can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a protein) and a carrier protein is prepared, and a mammal is immunized or a chicken is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. It can be produced by collecting the contents and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are such that the antibody is more efficient than hapten immunized by cross-linking to carrier.
  • any material may be cross-linked at any ratio.
  • bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin and the like are about 0.1 to 20 by weight ratio to hapten 1.
  • a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
  • Various coupling agents can be used for coupling between the hapten and the carrier, but active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group or dithiopyridyl group are used.
  • the condensation product is administered to a mammal or chicken together with itself, a carrier, or a diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration can be performed about once every 2 to 6 weeks, usually about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, breast milk and the like of mammals immunized by the above method, preferably from blood and egg yolk in the case of chickens.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, and colored particles.
  • radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • the enzyme is preferably stable and has a large specific activity.
  • ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • As the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • the colored particles include metal colloid particles and colored latex.
  • a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
  • a test sample is reacted with an insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), and another labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), followed by a labeling agent on an insolubilized carrier.
  • primary reaction an insolubilized antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled antibody of the present invention
  • a labeling agent on an insolubilized carrier By measuring the amount (activity), the amount of the peptide of the present invention in the test sample can be quantified.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times.
  • Monoclonal antibodies against human FABP7 can also be used in measurement systems other than the sandwich method, such as competition method, immunometric method, or nephelometry.
  • competition method the antigen in the test sample and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( B / F separation), measure the amount of labeled B or F, and quantify the amount of antigen in the test sample.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • a B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or
  • the first antibody is soluble
  • the second antibody is a solid phase method using a solid phase antibody.
  • the antigen of the test sample and the immobilized antigen are competitively reacted with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen and excess in the test sample are separated.
  • the labeled antibody is allowed to react, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test sample. In nephelometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephelometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test sample is small and only a small amount of precipitate is obtained.
  • the FABP7 concentration in body fluid can be measured by, for example, western blotting, gel electrophoresis (eg, SDS-PAGE, two-dimensional gel electrophoresis, etc.), various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobicity) Chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, isoelectric focusing, capillary electrophoresis, etc.), ionization (eg, electron impact ionization, field desorption, secondary ionization, Fast atom bombardment method, matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method, electrospray ionization method, etc.), mass spectrometer (eg, double-focusing mass spectrometer, quadrupole analyzer, time-of-flight mass spectrometer, (Fourier transform mass spectrometer, ion cyclotron mass spectrometer, etc.) It can be carried out by the.
  • the FABP7 level in the body fluid sample from the subject measured by any of the above methods is significantly higher than the FABP7 level in the non-brain tumor / non-cerebrovascular disorder patient or healthy subject control sample
  • the subject can be diagnosed as having a high possibility of suffering from a brain tumor or cerebrovascular disorder or having a high possibility of suffering in the future.
  • the malignancy of cancer in a brain tumor patient can be determined. Specifically, in a brain tumor patient with a known grade by grade according to the grade of malignancy, the FABP7 concentration in the body fluid is measured, the reference value of the FABP7 concentration in each grade is determined in advance, and the grade of malignancy is unknown The patient's Grade can be determined by comparing the measured FABP7 concentration with the reference value for the patient.
  • the therapeutic effect (prognosis) in a brain disease patient who is currently undergoing treatment can be predicted or determined early. That is, compare FABP7 concentrations in body fluids collected from patients with brain disease before and after treatment, and if the FABP7 concentration during or after treatment is lower than the FABP7 concentration before treatment, the treatment is effective It can be said that. According to the examples described below, it was revealed that FABP7 levels were higher in cancer stem cells than in normal cancer cells in brain tumors, particularly in glioma patients. Alternatively, if it does not die, it is possible that the level of FABP7 in the body fluid remains high after treatment or rises after a certain period after treatment.
  • the present invention also provides a test kit for determining a brain tumor or cerebrovascular disorder.
  • the test kit of the present invention includes a reagent (and instrument) for measuring the amount of FABP7 in body fluid. By measuring the amount of FABP7 fragment using the test kit of the present invention, a brain tumor or cerebrovascular disorder can be determined.
  • the kit of the present invention comprises an anti-FABP7 antibody that specifically recognizes human FABP7. Examples of the anti-FABP7 antibody include those described above.
  • the antibody may be provided as a fluorescence-labeled antibody, an enzyme-labeled antibody, a streptavidin-labeled antibody, a biotin-labeled antibody, or a radiolabeled antibody, or an unlabeled antibody and a labeling agent may be provided separately.
  • the anti-FABP7 antibody is usually tested in accordance with the present invention in the form of an aqueous solution dissolved in water or in an appropriate buffer (eg, TE buffer, PBS, etc.) to an appropriate concentration, or in the form of a lyophilized product. Included in kit.
  • the test kit of the present invention may further include other components necessary for the implementation of the method as a component depending on the FABP7 measurement method.
  • the test kit of the present invention can further include a blotting buffer, a labeling reagent, a blotting membrane, a detection reagent, a standard solution, and the like.
  • the “standard solution” include an aqueous solution in which the purified preparation of “FABP7” is dissolved in water or a suitable buffer solution (eg, TE buffer, PBS, etc.) to a specific concentration.
  • the test kit of this invention can further contain a solid-phase antibody measurement plate, a washing
  • Detection of FABP7 using LC / MS, LC-MS / MS, or immunochromatography can include antibody-coated columns, microcolumns, or macrochips as part of the detection instrument. Furthermore, as long as the time-resolved fluorescence measurement method or a fluorescence measurement method similar thereto, a plurality of labeled anti-FABP7 antibodies and other necessary components may be included as components.
  • the present invention is based on the discovery that in patients with brain tumors or cerebrovascular disorders, FABP7 levels in body fluids are significantly higher than those in healthy subjects and patients with other diseases. Therefore, the test kit of the present invention includes an instrument and / or a reagent for collecting body fluid as a test sample.
  • a blood collection tube or syringe an anticoagulant, a coagulation promoter, a serum separating agent, etc.
  • a cerebrospinal fluid is used as a body fluid
  • a sterile test tube for collection, puncture, etc.
  • a pretreatment reagent and / or a device for removing a protein present in a large amount in blood or concentrating a sample can be further included.
  • Example 1 1-1 Acquisition of mouse anti-human FABP7 monoclonal antibody Recombinant human FABP7 was suspended in an adjuvant (Complete Freund's adjuvant: CFA), and BALB / c mice (five weeks old, female) were immunized at intervals of two weeks. Partial blood sampling was performed in the middle, and the degree of titer increase at the antiserum level was confirmed using the reactivity with recombinant human FABP7 as an immunogen as an index. After confirming that the antibody titer was sufficiently increased by multiple immunizations, a physiological saline solution of recombinant human FABP7 was administered intraperitoneally or intravenously.
  • CFA Complete Freund's adjuvant
  • Antibody-producing cells were collected from the spleen and fused with myeloma (P3X63Ag8.653, ECACC). Cell fusion was performed by the PEG method, and the fused cells were seeded on a culture plate. Thereafter, the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. Next, the hybridoma culture supernatant was collected, and the antibody titer was confirmed using the reactivity with recombinant human FABP7 as an index. Then, the antibody-producing clone cells were subcultured and cloned by limiting dilution. The obtained cell derived from a single colony was used as an anti-human FABP7 monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the obtained monoclonal antibody-producing hybridoma was cultured in large quantities.
  • Pristane was administered intraperitoneally in advance, and the hybridoma was administered to preliminarily raised BALB / c mice. They were raised for 10-25 days and waited for ascites to accumulate. Thereafter, ascites was collected, and the obtained ascites antibody was subjected to ammonium sulfate salting out and affinity purification to obtain a mouse anti-human FABP7 monoclonal antibody.
  • recombinant human FABP7 was suspended in an adjuvant and immunized NZW rabbits (3 months old, male) at 2-week intervals. Partial blood sampling was performed in the middle, and the degree of titer increase at the antiserum level was confirmed using the reactivity with recombinant human FABP7 as an immunogen as an index. After confirming that the antibody titer was sufficiently increased by multiple immunizations, a physiological saline solution of recombinant human FABP7 was intravenously administered. After that, the whole blood was collected. Thereafter, the obtained serum was subjected to ammonium sulfate salting out and affinity purification to obtain a rabbit anti-human FABP7 polyclonal antibody.
  • Enzyme immunoassay was performed by sandwich enzyme immunoassay using a kit composed of the following reagents.
  • Standard reagent A dilution series prepared after dissolving the recombinant FABP7 prepared in 1-1 and 1-2 above in a PBS buffer containing 1% BSA to a concentration of 2 ng / mL.
  • a buffer containing no human FABP7 is designated as standard reagent 0.
  • Sample dilution solution PBS buffer containing 1% BSA. Use as is.
  • Enzyme-labeled antibody solution It consists of a horseradish peroxidase (HRP) -labeled enzyme-labeled anti-human FABP7 polyclonal antibody diluted 16,000 times in a 1% BSA-containing PBS buffer. Use as is.
  • Reaction plate An anti-human FABP7 monoclonal antibody immobilized on a 96-well microplate and then blocked is used. One well is used for one measurement.
  • Washing solution 0.05% Tween 20, PBS buffer. Use as is.
  • Substrate solution A solution containing tetramethylbenzidine (3, 3 ', 5, 5'-tetramethyl benzidine stabilized substrate: TMB, DAKO). Use the substrate solution as is.
  • Reaction stop solution 3N sulfuric acid. Use as is.
  • the standard curve was created according to the following procedure. First, 150 ⁇ L of enzyme-labeled antibody solution was added to the reaction plate. Subsequently, the standard reagent was appropriately diluted with the sample dilution solution to prepare human FABP7 solutions of various concentrations. Then, 50 ⁇ L of each diluted standard solution was added to the reaction plate, stirred with a mixer, and incubated overnight at room temperature. Thereafter, the reaction solution was removed from each well using an ELISA washer, and 0.3 mL of a cleaning solution prepared by diluting the washing stock solution was added to each well for washing. After this washing was repeated 3 times, the washing solution remaining in the well was removed with a paper towel or the like.
  • Example 2 Measurement of FABP7 level in cerebrospinal fluid from patients with various brain diseases 2-1 Collection of cerebrospinal fluid specimens 2 cases as primary brain tumor (2 cases of glioblastoma (GBM)), 3 cases as metastatic brain tumor (1 case of cerebellar metastasis, 1 case of parietal lobe metastasis, cavernous hemangioma 1) Example), subarachnoid hemorrhage 2 cases, control group 4 cases (1 meningioma, idiopathic normal pressure hydrocephalus 1 case, Chiari malformation / hydrocephalus 1 case, spinocerebellar degeneration 1 case) Cerebrospinal fluid was collected. This clinical study was conducted with the approval of the Committee for Drug Clinical Trials and Clinical Research, Yamaguchi University Hospital.
  • Example 3 Tissue staining using human FABP7-specific antibody Immunohistochemical staining with anti-FABP7 antibody was performed using paraffin-embedded tissue sections of brain tumor lesions extracted from patients with cerebellar GMB and metastatic brain tumor of Example 2. did. As a result, a strong stained image was confirmed in GBM (FIG. 2A), but no metastatic brain tumor was stained (FIG. 2B).
  • Example 4 Relationship between the degree of brain tumor differentiation and FABP7 expression
  • GBM glioblastoma
  • source neurosurgery, Yamaguchi University School of Medicine
  • G144 University of Toronto (G144: distributed from)
  • Proteins were extracted by the method and separated by 0.1% SDS-polyacrylamide electrophoresis.
  • Western blot analysis was performed using anti-human FABP7 polyclonal antibody as the primary antibody, HRP-labeled anti-rabbit antibody as the secondary antibody, and ECL as the substrate, and the band intensity was measured. The measured values were corrected using ⁇ -actin as an internal standard. The results are shown in FIG.
  • Example 5 Relationship between Brain Tumor Differentiation and FABP7 Expression (2) About the cell line U-373 MG (Uppsala) (Cat # 08061901, ECACC) established from a glioblastoma case (Grade III, a 61-year-old male), immune tissue using anti-FABP7 antibody and antibodies against various undifferentiated markers Staining was performed. The results are shown in FIG. High expression of FABP7 was observed in cells with a high degree of undifferentiation.
  • the present invention can determine or predict brain tumor, presence or absence of cerebrovascular disorder, severity (malignancy), and prognosis using FABP7 level in body fluid as an index, even in a facility without an image diagnostic apparatus, Without performing a brain biopsy, various diagnoses of these brain diseases are possible, which is useful in that the burden on the patient is greatly reduced.

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Abstract

　本発明は、被験者より採取した体液中のFABP7量を測定することを特徴とする、脳腫瘍又は脳血管障害の診断のための検査方法、並びに、ヒトFABP7と特異的に結合する抗体と、体液を採取するための器具及び／又は試薬とを含んでなる、脳腫瘍又は脳血管障害の診断のための検査キットを提供するものである。

Description

脳疾患の診断及び予後予測方法並びにそれらに使用するキット
　本発明は、脳腫瘍診断、病勢評価、重症度、経時的な病勢推移についての評価方法およびその利用技術に関する。より具体的には、本発明は体液中のFABP7の量又は量的変化を検出することによる脳腫瘍の診断方法に関する。また、本発明は、脳腫瘍の診断又は予後予測に用いる、体液中のFABP7の量又は量的変化を検出するためのキットに関する。
　脳腫瘍（Brain tumor）は、脳の疾病のひとつで、頭蓋内組織に発生する新生物（腫瘍）のことを意味する。すなわち、脳腫瘍は脳細胞だけでなく、硬膜、クモ膜、頭蓋内の血管や末梢神経、その他の頭蓋内に存在するあらゆる組織から発生する。
　脳腫瘍には、脳組織自体から発生する原発性脳腫瘍と、他の臓器の癌が脳へ転移した転移性脳腫瘍とがある。これらの分類には発生母地を基準にした、世界保健機構 (WHO) による脳腫瘍組織分類 (histological typing of tumours of the central nervous system) が世界的に用いられている。
　脳腫瘍は、腫瘍の発生部位、大きさ、浸潤性であるかどうか、放射線もしくは薬剤に対する反応性などについても考慮する必要性がある。発生場所が、脳という生命維持に重要な器官であり、かつ丈夫な頭蓋骨に囲まれた狭い場所であるという特殊条件ゆえに、病理学的な判断だけでなく、患者の症状など臨床的情報も大切である。
　また、脳腫瘍は、脳実質内から発生する腫瘍と脳実質外から発生する腫瘍に大別される。脳実質内から発生する腫瘍は、神経上皮由来腫瘍と呼ばれ、その代表的腫瘍が神経膠腫（グリオーマ）である。グリオーマは、グリア（神経膠細胞）から発生する。グリアには、星状膠細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞などがあり、これらから発生する腫瘍はそれぞれ星状細胞腫、乏突起膠腫などと呼ばれている。グリオーマにおける病理組織学的な悪性度も、組織型の分類と同じくWHOによる分類法が利用されており、悪性度が最も低いGrade Iから悪性度が最も高いGrade IVまでの4段階に分類されている。Grade IVは、膠芽腫（glioblastoma：GBM）と呼ばれている。このGradeは予後に相関すると考えられており、治療法の選択に影響する。
　脳卒中、頭部外傷、脳腫瘍などの脳疾患は、いずれも重篤な脳組織損傷が生じており、速やかに鑑別診断・重症度把握を実施し、早期治療を開始することが必須である。しかし現状の臨床診断においては、CT・MRI・PETなどをはじめとする画像診断装置による鑑別診断が不可欠であるため、施設規模や診療時間帯などの制約を受けざるを得ない。特に、悪性脳腫瘍においては、症状が認められた時点で既に治療困難になっている例が多いため、簡単に早期診断が可能な、生化学的スクリーニング検査が待望されている。
　脳腫瘍に関して原発性脳腫瘍の診断を目的とする脳腫瘍の診断に有効なバイオマーカーは実用化されていない。これまで、マイクロアレイ技術を用いた網羅的遺伝子発現解析により、脳腫瘍の組織学的な型において異なった遺伝子発現プロファイルを示すことが確認されている（非特許文献１－３）。しかしながら、遺伝子発現をRNAレベルで検出するため、脳生検によるサンプル採取が必要となり、患者への負担が大きい。そのため、悪性腫瘍に関連する可溶性（分泌）タンパク質を血清などの体液から検出する試みも実施されている（特許文献１）が、癌種に対する特異性に欠ける問題がある。
特開2011-153992号公報
Pomeroy,S.L.,et al., Nature, 415: 436-42, 2002 Rickman,D.S.,et al., Cancer Res., 61: 6885-6891, 2001 Sallinen,S.L.,etal., Cancer Res., 60: 6617-22, 2000
　本発明は、脳腫瘍をはじめとする脳疾患の体液中バイオマーカーを探索し、以って、脳生検を必要としない低侵襲性の脳疾患の生化学的診断法、並びに当該方法を簡便に実施するための臨床検査キットを提供することである。
　本発明者らは、胎児期のグリア細胞で高発現するFABP7（Fatty Acid-Binding Protein 7; BLBP（Brain Lipid-Binding Protein）、B-FABP（Brain-type Fatty Acid-Binding Protein）とも呼ばれる）に着目し、種々の脳疾患患者から採取した体液中のFABP7量を測定し比較した結果、原発性及び転移性の脳腫瘍並びに脳血管障害の患者では、他の脳疾患患者と比較して有意に体液中のFABP7レベルが高いことを見出した。特に、低分化で悪性度が高い神経膠腫において、感度・疾患特異性とも優れていた。本発明者らは、これらの知見に基づいて、体液中のFABP7をマーカーとして用いた、脳腫瘍をはじめとする特定の脳疾患の早期発見及び治療効果の判定に有用な臨床検査システムを構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りのものである。
１．被験者より採取した体液中のFABP7量を測定することを特徴とする、脳腫瘍又は脳血管障害の診断のための検査方法。
２．体液が脳脊髄液、血液、血漿又は血清である、１．記載の方法。
３．体液が脳脊髄液である、２．記載の方法。
４．体液が血漿又は血清である、２．記載の方法。
５．血漿又は血清が前処理されている、４．記載の方法。
６．FABP7量が免疫学的測定により測定される、１．～５．のいずれかに記載の方法。
７．診断が罹患の有無、疾患の重症度又は予後の診断である、１．～６．のいずれかに記載の方法。
８．ヒトFABP7と特異的に結合する抗体と、体液を採取するための器具及び／又は試薬とを含んでなる、脳腫瘍又は脳血管障害の診断のための検査キット。
９．体液が脳脊髄液、血液、血漿又は血清である、８．記載のキット。
１０．体液が脳脊髄液である、９．記載のキット。
１１．体液が血漿又は血清である、９．記載のキット。
１２．血漿又は血清の前処理のための試薬及び／又は器具をさらに含む、１１．記載のキット。
１３．診断が罹患の有無、疾患の重症度又は予後の診断である、８．～１２．のいずれかに記載のキット。
　本発明の検査方法および検査キットによれば、体液中のFABP7を検出することにより、脳腫瘍をはじめとする特定の脳疾患患者を迅速かつ簡便に判定することができ、客観的で正確な判定結果を得ることができる。更に、これにより該脳疾患の診断および重症度の定量的な評価、経時的な病勢推移の評価が可能となる評価系が確立できる。例えば患者における治療の奏功性についてその判定を行うことができる。従ってこの評価系を用いて、従来法に比べてより客観的に該脳疾患の重症度および発症リスクを判定することができる。
脳腫瘍（小脳GBM及び転移性脳腫瘍）、クモ膜下出血、並びに他の脳疾患患者から採取した髄液中のFABP7濃度を示す図である（小脳GBM群、転移性脳腫瘍群及びクモ膜下出血群の対照群に対するp値は、それぞれ0.007、0.019及び0.032である）。 小脳GBM（Ａ）及び転移性脳腫瘍（Ｂ）患者より摘出した脳腫瘍病巣の組織切片におけるFABP7の発現の有無を示す免疫染色像である。スケールバーは50μmを示す。 小脳GBM症例及び神経膠腫幹細胞株におけるFABP7タンパク質の発現を示す図である。縦軸はβ-アクチンで補正したFABP7の発現量を示す。 神経膠芽腫症例から樹立された細胞株におけるFABP7（Ａ）及び未分化マーカー（Ｂ）の発現を示す免疫染色像である。
　本発明は、脳腫瘍又は脳血管障害の診断のための検査方法（以下、「本発明の検査方法」ともいう。）を提供する。
　本発明者らは、脳腫瘍又は脳血管障害の患者では、健常者や他の脳疾患患者と比較して、体液中のFABP7濃度が有意に高いことを見出した。FABP7は細胞内局在性のタンパク質であり、本来細胞外に分泌するものではないので、体液中のFABP7濃度とこれらの脳疾患とが相関することは予想外の知見である。
　本発明者らはまた、分化度が低く悪性度の高い癌細胞（例、癌幹細胞）で、特にFABP7の発現が上昇している傾向があり、FABP7の高発現は未分化マーカー（例、Oct3/4、Nanog）の発現と相関することを見出した。従って、本発明の検査方法は、被験者より採取した体液中のFABP7量を測定することを特徴とする。
　本明細書において「脳腫瘍」とは、頭蓋内組織、即ち、脳細胞だけでなく、硬膜、クモ膜、頭蓋内の血管や末梢神経、その他の頭蓋内に存在するあらゆる組織に発生する新生物（腫瘍）全般を意味し、脳組織自体から発生する原発性脳腫瘍であっても、他の臓器の癌が脳へ転移した転移性脳腫瘍であってもよい。発生母地を基準にしたWHOによる脳腫瘍組織分類 (histological typing of tumours of the central nervous system) では、神経上皮組織性腫瘍（星細胞腫、乏突起細胞腫などの神経膠腫、上衣腫、脈絡叢腫瘍、その他の神経上皮性腫瘍、神経細胞性腫瘍、松果体部腫瘍、胎児性腫瘍など）、神経鞘性腫瘍（神経鞘腫、神経線維腫など）、髄膜性腫瘍（髄膜腫、その他の間葉性腫瘍、悪性黒色腫など）、リンパ腫および造血細胞性新生物（悪性リンパ腫、形質細胞腫など）、胚細胞性腫瘍（胚細胞腫、卵黄嚢腫瘍、絨毛癌、奇形腫など）、トルコ鞍部腫瘍（頭蓋咽頭腫、下垂体細胞腫など）及び転移性腫瘍に大別された約130種類の組織型が定義されているが、それらのいずれに分類されるものであってもよい。好ましくは原発性脳腫瘍、特に神経膠腫が挙げられるが、それらに限定されない。
　また、病理組織学的な悪性度についても、WHOによる分類のGrade I～Grade IVのいずれであってもよいが、体液中のFABP7濃度は悪性度と正の相関が認められ、より未分化で増殖速度の速いGrade IIIやGrade IVで高発現するので、本発明の検査方法は、FABP7の定量的評価や経時変化のモニタリングにより、脳腫瘍の病勢の推移を評価することもできる。
　本明細書において「脳血管障害」とは、例えば脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血等に代表される虚血性もしくは出血性の脳疾患の総称の意味で用いられる、脳血管障害のうち急激に発症したものを脳卒中と呼ぶ。脳血管障害には、頭部外傷に起因するもの（例、急性硬膜下血腫、急性硬膜外血腫、慢性硬膜下血腫）も包含される。
　本発明の検査方法において検査対象となる被験者は、脳腫瘍又は脳血管障害に現に罹患しているか、治療により当該疾患から完治もしくは寛解したか、あるいは罹患しているか将来罹患することが疑われるヒトである。
　被験者より採取される体液は、FABP7を検出可能なレベルで含有する限り特に制限はなく、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液など生体から容易に採取できるものや、脳脊髄液（髄液）、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液など比較的容易に採取されるものが挙げられる。好ましくは、髄液、血漿又は血清である。
　体液として髄液を用いる場合、自体公知の手法（例、腰椎穿刺法、後頭下穿刺法、脳室穿刺法など）を用いて被験者より髄液を採取することができる。ヒトの場合、一般的に行われるのは腰椎穿刺法であり、腰椎椎間腔より脊柱管に穿刺針を刺入して、そこから髄液を取り出す。通常0.5～2 mLずつを滅菌試験管に採取する。髄液はそのまま測定に供することもできるが、好ましくは遠心により髄液細胞を沈殿させた後の上清を用いることができる。
　一方、体液として血液を用いる場合も、自体公知の手法を用いて、例えば静脈血を採取し、全血、あるいは凝固後の遠心上清である血清や、抗凝固剤存在下で遠心により血球成分を除去した上清である血漿を測定に供することができる。好ましくは血漿又は血清であり、より好ましくは血漿である。FABP7の測定に血漿を用いる場合は、抗凝固剤（例、EDTA（通常KもしくはNa塩）、クエン酸Na、ヘパリン）入りの採血管に採血し、遠心して上清を回収すればよい。
　体液サンプルが血液由来（例、血漿、血清）である場合には、該体液サンプル中に存在するFABP7は極めて微量である場合があるので、検出感度を高めるために、例えば、血漿もしくは血清中に多量に含まれる既知タンパク質を、予め除去しておくことができる。除去対象となる既知タンパク質としては、血清アルブミン、免疫グロブリン（IgG、IgA、IgM）、トランスフェリン、ハプトグロビン、α1-アンチトリプシン、フィブリノーゲン、α2-マクログロブリン、α1-酸糖タンパク質、補体C3、アポリポタンパク質A-I、アポリポタンパク質A-II、トランスサイレチンなどが挙げられる。これらのタンパク質を除去する方法としては、例えば、これらのタンパク質に対する抗体を固定化してできたアフィニティー担体に血漿もしくは血清サンプルを接触させる方法が挙げられる。例えば、1以上の抗血漿/血清タンパク質抗体を固定化したアフィニティーカラムに血漿もしくは血清サンプルを通液して素通り画分を回収する方法や、該抗体を固定化した磁性ビーズを含む容器に血漿もしくは血清サンプルを添加してインキュベートした後、磁気によりビーズとサンプル液とを分離する方法などが挙げられる。
　あるいは、高濃度のアセトンに血漿もしくは血清を混和してすべてのタンパク質、ペプチドを沈殿させた後、高分子量タンパク質と低分子量タンパク質・ペプチドとの溶解度の差を利用して、例えば70%アセトニトリル等の有機溶媒を用いて、例えば分子量約2万以下の低分子量タンパク質・ペプチドのみを溶解・回収することもできる。
　さらに限外ろ過により得られた溶液を濃縮することもできる。
　血漿もしくは血清サンプルの他の前処理方法としては、例えば、有機溶媒、界面活性剤、無機塩、化合物（高分子、低分子）、多糖類などの添加や、検体pHの変更（酸性またはアルカリ性処理）、熱処理（加温、低温）、分子篩分離、吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、遠心分離等によって、FABP7をその他タンパク質および脂質成分などと分離または安定化させた後に測定することもできるが、それらに限定されない。
　本発明の検査方法において、検出対象であるヒトFABP7は、配列番号１で示される132アミノ酸（UniProtKB/Swiss-Prot accession No. O15540；但し、成熟タンパク質では開始メチオニンは除去されている）からなる分子量約15 kDaの細胞質局在性のタンパク質である。本明細書における「ヒトFABP7」には、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質だけでなく、天然に存在するアレル変異体（多型）（例、dsSNPにrs2279381として登録されている61番目のThrがMetに置換された変異体）が包含される。
　本発明の検査方法におけるFABP7の測定方法は、被験者の体液中に存在するFABP7を定量性よく測定し得る限り特に限定されないが、好ましくは免疫学的測定法が用いられる。即ち、FABP7を特異的に認識する抗体（抗FABP7抗体）を用いて、体液中のFABP7を測定する。
　本発明における「抗FABP7抗体」は、ヒトFABP7を特異的に認識して結合する限り、ヒトFABP7タンパク質のいずれかの領域を認識するものであってもよいが、他のFABPファミリータンパク質（FABP1～FABP6、PMP2、FABP9）との交差反応がないように、これらのタンパク質と共通したアミノ酸配列を有する領域以外のヒトFABP7の部分アミノ酸配列をエピトープとするものであることが望ましい。FABP1～FABP6、PMP2、FABP9のアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss-ProtデータベースにそれぞれP07148、P12104、P05413、P15090、Q01469、P51161、P02689及びQ0Z7S8のaccession No.で登録されており、例えば、該データベースが提供するアラインメントソフトウェア（UniProt Align）を用いて、FABP7とこれらの他のFABPファミリータンパク質とをアラインさせることができ、当業者は容易にヒトFABP7に特異的に結合し得る抗体のエピトープを予測することができる。尚、ここでエピトープはヒトFABP7の連続する部分アミノ酸配列であってもよいし、2以上の断続的な部分アミノ酸配列により形成される立体構造であってもよい。
　抗FABP7抗体は、例えば市販の抗FABP7抗体（例えば、HPA028825（Atlas Antibodies）、SAB1405785、SAB1101096（Sigma-Aldrich））など、公知の手法を用いて製造されるポリクローナル又はモノクローナル抗体、あるいはこれらのフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、minibody等）であってもよい。
　本発明で使用される抗FABP7抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が好ましい。
　哺乳動物由来のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体としては、動物の血中に産生されるもの、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの、ファージディスプレイにより１兆個の分子からなる莫大なクローンライブラリーから最適抗体がスクリーニングされ、その遺伝子をCHO細胞工場で大量生産されるもの、もしくは、ヒトの抗体を生産するトランスジェニックマウスから直接得られるヒト抗体などが挙げられる。
　モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は当業者に公知の方法によって作製することができる。
（１）モノクローナル抗体の作製
　FABP7は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。免疫原として使用するFABP7は、ヒトFABP7の全長タンパク質であっても、そのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアータンパク質に架橋した複合体とすることもできる）であってもよい。免疫原としてFABP7のフラグメントを用いる場合、他のFABPファミリータンパク質とのホモロジーの低い部分ペプチドを用いることが好ましい。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2～6週毎に１回ずつ、計2～10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウス及びラットが好ましく用いられる。
　モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された哺乳動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2～5日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化FABP7と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Nature, 256, 495 (1975年)］に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
　骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1～20:1程度であり、PEG（好ましくは、PEG1000～PEG6000）が10～80%程度の濃度で添加され、約20～40℃、好ましくは約30～37℃で約1～10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）又はプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した蛋白質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
　モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1～20%、好ましくは10～20%のウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地、1～10%のウシ胎児血清を含むGIT培地（和光純薬工業（株））又はハイブリドーマ培養用無血清培地（SFM-101、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常20～40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日～3週間、好ましくは1週間～2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
　モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
　FABP7に対するポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（蛋白質等の抗原）とキャリアー蛋白質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行なうかニワトリに免疫を行ない、該免疫動物からFABP7に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
　哺乳動物及びニワトリを免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類及びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1～20、好ましくは約1～5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
　又ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
　縮合生成物は、哺乳動物又はニワトリに対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2～6週毎に1回ずつ、計約3～10回程度行なうことができる。
　ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水、母乳など、好ましくは血液から採取することができ、ニワトリの場合は血液及び卵黄から採取できる。
　抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
　標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、着色粒子などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。着色粒子としては、例えば、金属コロイド粒子、着色ラテックスなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
　抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
　サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被験試料を反応させ（1次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応（2次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被験試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
　ヒトFABP7に対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフェロメトリーなどに用いることもできる。
　競合法では、被験試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原（B）とを分離し（B/F分離）、B，Fいずれかの標識量を測定し、被験試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
　イムノメトリック法では、被験試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被験試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被験試料中の抗原量を定量する。
　また、ネフェロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被験試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフェロメトリーなどが好適に用いられる。
　これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
　例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
　或いは、体液中のFABP7濃度の測定は、例えば、ウエスタンブロッティング、ゲル電気泳動（例：SDS-PAGE、二次元ゲル電気泳動など）や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動など）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）等に供することにより行うことができる。
　上記のいずれかの方法により測定された被験者由来の体液サンプル中のFABP7レベルが、非脳腫瘍・非脳血管障害患者もしくは健常者由来の対照サンプル中のFABP7レベルに比べて有意に増加している場合、該被験者は脳腫瘍又は脳血管障害に罹患している可能性が高いか、将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
　後述の実施例に示されるとおり、脳腫瘍患者においては、その悪性度が高い（分化度が低い）ほど、体液中のFABP7レベルが高い傾向にある。従って、本発明の検査方法によれば、脳腫瘍患者における癌の悪性度を判定することができる。具体的には、悪性度による分類でどのGradeにあるかが既知の脳腫瘍患者において体液中のFABP7濃度を測定し、予め各GradeにおけるFABP7濃度の基準値を決定しておき、悪性度が未知の患者について、測定されたFABP7濃度を当該基準値と比較することにより、該患者のGradeを判定することができる。
　また、本発明の検査方法によれば、現に治療を受けている脳疾患患者における治療効果（予後）を早期に予測又は判定できる。即ち、治療を受ける前と治療中もしくは治療後の脳疾患患者から採取した体液中のFABP7濃度を比較し、治療中又は治療後のFABP7濃度が治療前のFABP7濃度より低ければ、当該治療は有効であるということができる。
　後述の実施例によれば、脳腫瘍、特に神経膠腫患者において、通常の癌細胞に比べて癌幹細胞においてFABP7レベルが高値を示すことが明らかとなったことから、治療において癌幹細胞が完全に切除もしくは死滅しなかった場合には、体液中のFABP7レベルが治療後も依然として高値を示すか、治療後ある程度の期間を経過した後に再上昇することが考えられる。したがって、例えば、腫瘍摘出手術後、あるいは放射線もしくは化学療法後に寛解した脳腫瘍患者につき、経時的に体液を採取してFABP7レベルをモニタリングし、FABP7レベルの上昇が認められた場合には、再発したか、再発するおそれがあると判定することができる。
　本発明はまた、脳腫瘍又は脳血管障害を判定するための検査キットを提供する。本発明の検査キットには、体液中のFABP7量を測定するための試薬（及び器具）が含まれる。本発明の検査キットを用いてFABP7断片量を測定することにより、脳腫瘍又は脳血管障害を判定することができる。
　本発明のキットは、具体的には、ヒトFABP7を特異的に認識する抗FABP7抗体を含むものである。抗FABP7抗体としては、例えば、上述したとおりのものを挙げることができる。抗体は、蛍光標識抗体、酵素標識抗体、ストレプトアビジン標識抗体、ビオチン標識抗体あるいは放射性標識抗体として提供されてもよいし、未標識の抗体と標識剤とが別個に提供されてもよい。
　抗FABP7抗体は、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様、あるいは凍結乾燥品の態様で、本発明の検査キットに含まれる。
　本発明の検査キットは、FABP7の測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、ウエスタンブロッティングで測定する場合には、本発明の検査キットは、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等、検出試薬、標準液などをさらに含むことができる。ここで「標準液」としては、上記「FABP7」の精製標品を水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に特定の濃度となるように溶解した水溶液が挙げられる。
　また、サンドイッチELISAで測定する場合には、本発明の検査キットは、上記に加え固相化抗体測定プレート、洗浄液等をさらに含むことができる。ラテックス凝集法を含む凝集法で測定する場合には、抗体コーティングしたラテックス、ゼラチン等を含むことができる。化学蛍光法、化学蛍光電子法で測定する場合には、抗体結合磁性粒子、適当な緩衝液を含むことができる。LC/MS、LC-MS/MSあるいはイムノクロマトグラフィー法を用いたFABP7の検出には、抗体コーティングしたカラムあるいはマイクロカラム、マクロチップを検出機器の一部として、含むことができる。さらに時間分解蛍光測定法あるいはそれに類似した蛍光測定法であれば、複数のラベル化した抗FABP7抗体と必要な他の成分を構成として含んでもよい。
　上述のように、本発明は、脳腫瘍又は脳血管障害患者において、体液中のFABP7レベルが健常者及び他の疾患の患者と比較して有意に高いことの発見に基づくものである。従って、本発明の検査キットは、被検サンプルである体液を採取するための器具及び／又は試薬を構成として含む。例えば、体液として血液（血漿、血清）を用いる場合は、採血管やシリンジ、抗凝固剤、凝固促進剤、血清分離剤など、体液として髄液を用いる場合は採取用の滅菌試験管、穿刺などがそれぞれ挙げられる。さらに血液（血漿、血清）を用いる場合には、血中に大量に存在するタンパク質を除去したり、サンプルを濃縮したりするための前処理用試薬及び／又は器具をさらに含めることができる。
　以下に具体例を挙げて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの具体例により何ら制限されるものではない。
実施例１
1-1　マウス抗ヒトFABP7モノクローナル抗体の取得
　組換えヒトFABP7をアジュバント(Complete Freund's adjuvant：CFA)に懸濁し、BALB/cマウス(5週齢、雌)に2週間間隔で免疫した。途中で部分採血を行い、抗血清レベルでの力価上昇度を免疫原である組換えヒトFABP7との反応性を指標に確認した。複数回の免疫にて抗体力価が十分上昇していることを確認した上で、組換えヒトFABP7の生理食塩水溶液を腹腔内もしくは静脈内投与した。脾臓より抗体産生細胞を採取し、ミエローマ（P3X63Ag8.653、ECACC）と細胞融合した。細胞融合はPEG法で行い、融合細胞を培養プレートに播種した。その後、37℃の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。
　次に、ハイブリドーマ培養上清を採取し、抗体力価を組換えヒトFABP7との反応性を指標に確認した。そして抗体産生クローンの細胞を継代培養し、限界希釈法によりクローニングを行った。得られた単一コロニー由来の細胞を抗ヒトFABP7モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとした。
　次に得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを大量培養した。予め腹腔内にプリスタンを投与し、予備飼育したBALB/cマウスに対し、ハイブリドーマを投与した。そして10～25日間飼育し、腹水の貯留を待った。その後、腹水を採取し、得られた腹水抗体を硫安塩析、アフィニティー精製を行うことによりマウス抗ヒトFABP7モノクローナル抗体を取得した。
1-2　ウサギ抗ヒトFABP7ポリクローナル抗体の取得
　上記1-1と同様、組換え体ヒトFABP7をアジュバントに懸濁し、NZWウサギ（3月齢、雄）に2週間間隔で免疫した。途中で部分採血を行い、抗血清レベルでの力価上昇度を免疫原である組換えヒトFABP7との反応性を指標に確認した。複数回の免疫にて抗体力価が十分上昇していることを確認した上で、組換えヒトFABP7の生理食塩水溶液を静脈内投与した。そして更にその後に全採血をした。その後、得られた血清を硫安塩析、アフィニティー精製を行うことによりウサギ抗ヒトFABP7ポリクローナル抗体を取得した。
1-3　ヒトFABP7特異測定系の構築
　以下の試薬で構成したキットを用いて、サンドイッチ型酵素免疫測定法による酵素免疫測定を行った。
（１）標準試薬：上記1-1及び1-2で調製した組換えFABP7を1%BSA含有PBS緩衝液に2ng/mLの濃度となるように溶解後に希釈系列を作成したもの。ヒトFABP7を含まない緩衝液を標準試薬０とする。
（２）検体希釈溶液：1%BSA含有PBS緩衝液。そのまま使用する。
（３）酵素標識抗体液：西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識された酵素標識抗ヒトFABP7ポリクローナル抗体を、1%BSA含有PBS緩衝液にて16,000倍に希釈したものからなる。そのまま使用する。
（４）反応プレート：抗ヒトFABP7モノクローナル抗体を96穴マイクロプレートに固相化後、ブロッキングを施したものを用いる。一回の測定に1ウェルを使用する。
（５）洗浄液：0.05%Tween20、PBS緩衝液。そのまま使用する。
（６）基質液：テトラメチルベンジジン（3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine stabilized substrate：TMB、DAKO）を含む溶液からなる。基質液はそのまま使用する。一回の測定では基質液を100μL使用する。
（７）反応停止液：3N硫酸。そのまま使用する。一回の測定では反応停止液を100μL使用する。
　以下の手順に従って標準曲線を作成した。はじめに、酵素標識抗体液150μLを反応プレートに加えた。ついで検体希釈溶液にて標準試薬を適宜希釈して、各種濃度のヒトFABP7溶液を調製した。そして、この希釈した標準溶液をそれぞれ50μLずつ反応プレートに加えてミキサー撹拌し、室温で一晩インキュベーションを行った。その後、ELISA用ウォッシャーを用いて各ウェルから反応液を除去するとともに、各ウェルに洗浄原液を希釈して調製した洗浄液0.3mLを加えて洗浄した。この洗浄を3回繰り返した後、ウェル中に残った洗浄液をペーパータオル等により除去した。ついで、基質液200μLを加え、室温、暗所で正確に30分間インキュベーションを行った。その後、反応停止液100μLを加えて素早くミキサーにて撹拌することで、酵素反応を停止させた。各ウェルについて450nmの吸光度を測定し、標準曲線を作成した。
実施例２　各種脳疾患患者由来の髄液中のFABP7レベルの測定
2-1　髄液検体の採取
　原発性脳腫瘍として２例（膠芽腫（GBM）２例）、転移性脳腫瘍として３例（小脳転移性１例、頭頂葉転移性１例、海綿状血管腫１例）、クモ膜下出血２例、対照群として４例（髄膜腫１例、特発性正常圧水頭症１例、キアリ奇形・水頭症１例、脊髄小脳変性症１例）より、常法により髄液を採取した。なお、本臨床研究は、山口大学医学部附属病院医薬品治験・臨床研究等審査委員会の承認の下で実施した。
2-2　髄液検体中のFABP7レベルの測定
　上記2-1で採取された検体について、上記1-3で構築したヒトFABP7特異測定系を用いて測定を行った。その結果、GBM患者髄液のFABP7レベルは、対照群に比べ、明らかに高い値を示した。また、クモ膜下出血、転移性脳腫瘍は、対照群より高い値を示したが、GBMより低かった（図１）。
実施例３　ヒトFABP7特異抗体を用いた組織染色
　実施例２の小脳GMB、転移性脳腫瘍の各患者より摘出された脳腫瘍病巣のパラフィン包埋組織切片を用い、抗FABP7抗体にて免疫組織染色を実施した。その結果GBMにおいては強い染色像が確認されたが（図２Ａ）、転移性脳腫瘍は染色されなかった（図２Ｂ）。
実施例４　脳腫瘍の分化度とFABP7発現との関係（１）
　神経膠芽腫（GBM）の外科手術標本（凍結検体）20例（入手先：山口大学医学部脳神経外科）、神経膠腫幹細胞株（G144：トロント大学株（G144：より分与））より、常法によりタンパク質を抽出し、0.1%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動により分離した。抗ヒトFABP7ポリクローナル抗体を一次抗体に、HRP標識された抗ウサギ抗体を二次抗体、基質にECLを用いてウェスタンブロット分析を行い、バンド強度を測定した。内部標準としてβ-アクチンを用い、測定値を補正した。結果を図３に示す。GBM20例中13例でFABP7レベルが正常皮質に比べて高値を示した。一方、癌幹細胞である神経膠腫幹細胞株（G144）でFABP7レベルは高値を示し、GBMで高値を示した症例よりもFABP7レベルは顕著に高かった。
実施例５　脳腫瘍の分化度とFABP7発現との関係（２）
　神経膠芽腫症例（Grade III、61歳男性）から樹立された細胞株U-373 MG（Uppsala）（Cat# 08061901、ECACC）について、抗FABP7抗体及び各種未分化マーカーに対する抗体を用いて免疫組織染色を実施した。結果を図４に示す。未分化度の高い細胞においてFABP7の高発現が認められた。
　本発明は、体液中のFABP7レベルを指標として、脳腫瘍、脳血管障害の罹患の有無、重症度（悪性度）、並びに予後を判定又は予測することができるので、画像診断装置のない施設でも、脳生検を行うことなく、これらの脳疾患の各種診断が可能となり、患者の負担が大いに軽減される点で有用である。
　本出願は日本で出願された特願２０１１－２９０００４（出願日：２０１１年１２月２８日）を基礎としており，その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (13)

  1. 　被験者より採取した体液中のFABP7量を測定することを特徴とする、脳腫瘍又は脳血管障害の診断のための検査方法。
  2. 　体液が脳脊髄液、血液、血漿又は血清である、請求項１記載の方法。
  3. 　体液が脳脊髄液である、請求項２記載の方法。
  4. 　体液が血漿又は血清である、請求項２記載の方法。
  5. 　血漿又は血清が前処理されている、請求項４記載の方法。
  6. 　FABP7量が免疫学的測定により測定される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　診断が罹患の有無、疾患の重症度又は予後の診断である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　ヒトFABP7と特異的に結合する抗体と、体液を採取するための器具及び／又は試薬とを含んでなる、脳腫瘍又は脳血管障害の診断のための検査キット。
  9. 　体液が脳脊髄液、血液、血漿又は血清である、請求項８記載のキット。
  10. 　体液が脳脊髄液である、請求項９記載のキット。
  11. 　体液が血漿又は血清である、請求項９記載のキット。
  12. 　血漿又は血清の前処理のための試薬及び／又は器具をさらに含む、請求項１１記載のキット。
  13. 　診断が罹患の有無、疾患の重症度又は予後の診断である、請求項８～１２のいずれか１項に記載のキット。
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