TW201940879A - 利用影像分析技術辨識候選細胞 - Google Patents

Abstract

在此說明一種用以辨識及計算生物流體樣本中之候選標的細胞的方法。該方法包括下列步驟：取得生物流體樣本；執行該生物流體樣本之預備作業，包括將該生物流體樣本中之細胞特徵染色；擷取該生物流體樣本之數位影像，其中該數位影像具有複數個顏色通道；及對該數位影像進行影像分析。在此亦說明一種用以辨識生物流體樣本中之候選標的細胞的電腦程式產品。該電腦程式包含可令處理器執行上述影像分析之指令。

Description

利用影像分析技術辨識候選細胞

本發明係關於辨識樣本影像中之候選細胞，例如循環腫瘤細胞。

循環腫瘤細胞(CTC)係已脫離原發腫瘤並進入血管或淋巴系統之癌細胞，通常為上皮源癌細胞。CTC一旦侵入循環系統，此等惡性細胞便有機會進入其他器官。CTC自固體腫塊剝落後，可能停留在血管壁上，進而外滲至周圍組織。新腫瘤可透過血管生成而形成於遠離原始腫塊處。因此，CTC可視為萌發新腫瘤（即癌細胞轉移）之種子。

轉移性疾病（包括乳癌、結腸直腸癌及攝護腺癌）患者之無惡化存活率及整體存活率偏低，當然與末梢血液中CTC之數量有關。針對血液或其他體液樣本進行CTC之偵測及計算，即可評估腫瘤之預後，並有助於癌症患者之管理。

自腫瘤脫落之細胞量甚大。從每克腫瘤組織進入末稍血液之CTC估計可達百萬個。然而，僅0.1%在24小時內仍保有活力。活的CTC在癌症患者末稍血液中之濃度極低，實屬「罕見」；例如，白血球與CTC之數量比為10⁶ -10⁷ 比1（Sakurai等人，2016）。造血細胞於CTC所在環境中之數量亦十分龐大，因此，在轉移性疾病患者之全血中出現CTC之頻率為每1 mL約1-10個（Miller等人，2010）。由此可知，CTC不易準確偵測及計算。

生物染色法可提升顯微影像之分析效果。某些染劑可凸顯生物細胞之特徵與結構。若施以特定染色劑，CTC在顯微鏡下具有可供辨別之組織學特徵。

根據本發明之一態樣，一種用以辨識生物流體樣本中之候選標的細胞的方法包括下列步驟：取得生物流體樣本；執行該生物流體樣本之預備作業，包括將該生物流體樣本中之細胞核染色；擷取該生物流體樣本之數位影像，其中該數位影像具有複數個顏色通道；及對該數位影像進行影像分析。

根據另一態樣，一種用以辨識生物流體樣本中之候選標的細胞的電腦程式產品係具體實施為電腦可讀媒體。該電腦程式包含可令處理器執行上述影像分析之指令。

根據另一態樣，一種用以計算生物流體樣本中之標的細胞族群的方法包括上述用以辨識候選標的細胞之方法，以及接續其後之下列步驟：將候選物體分類為標的細胞或非標的元素，其分類依據為該影像中對應於其他已辨識出之空間重疊之第一連接區與第二連接區之部分；及計算所有被分類為標的細胞之候選物體，從而產生計數值。

根據另一態樣，一種用以求出人類受測者罹癌概度之方法包括下列步驟：將上述計數值與一無腫瘤病人對照組以統計方式求得之循環上皮細胞數加以比較；及當總數超過預定數值時，指定一癌症發生概度，其中該預定數值係由健康受測者循環上皮細胞數之統計平均值與癌症患者循環上皮細胞數之統計平均值比較而得。

執行該生物流體樣本之預備作業包括：將該生物流體樣本中之細胞核以第一生物共軛染劑染色，其中該第一生物共軛染劑具有第一顏色，且可與標的細胞之細胞核內之核酸結合；將該生物流體樣本中之細胞骨架細胞特徵以第二生物共軛染劑染色，其中該第二生物共軛染劑具有第二顏色，且可與標的細胞之細胞骨架細胞特徵結合；及將該生物流體樣本中之白血球以第三生物共軛染劑染色，其中該第三生物共軛染劑具有第三顏色，且可與該生物流體樣本中之人類白血球抗原結合。

進行影像分析包括：接收該數位影像；辨識在該複數個顏色通道之第一通道中具有最低第一強度之像素所構成之第一連接區；辨識在該複數個顏色通道之第二通道中具有最低第二強度之像素所構成之第二連接區；判定空間重疊之第一連接區與第二連接區；根據該複數個顏色通道中之一顏色通道，求出該等空間重疊之第一連接區與第二連接區之長寬比；辨識空間重疊且長寬比符合長寬比閾值之第一連接區與第二連接區；判定空間重疊之第二連接區與第三連接區；根據該複數個顏色通道中之兩個顏色通道，求出該等空間重疊之第二連接區與第三連接區之強度比；將空間重疊但強度比不符合強度比閾值之第二連接區與第三連接區所對應之空間重疊之第一連接區與第二連接區排除，使其不具候選資格；及提供該影像之一部分至分類器以待分類，其中該影像之該部分係對應於其他已辨識出之空間重疊之第一連接區與第二連接區。

本發明之實施例可包括下列特徵中之一或多項。

該第一顏色可為藍色，該第二顏色可為紅色或橙色，且該第三顏色可為綠色。

該第一染色劑或生物共軛染劑可包括DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。該第二染色劑或生物共軛染劑可包括與抗細胞角質蛋白(CK)抗體共軛之紅色或橙色螢光染劑。該第三染色劑或生物共軛染劑可包括與抗CD45抗體共軛之綠色螢光染劑，或由第一抗體、抗CD45抗體及預先與綠色螢光染劑共軛且以CD45為標的之第二抗體組合而成。

該第二染色劑或生物共軛染劑可包括與抗細胞角質蛋白(CK)抗體共軛之紅色或橙色螢光染劑，或由第一抗體、抗CK抗體及預先與紅色或橙色螢光染劑共軛且以CK為標的之第二抗體組合而成。

在一僅供示例之特定實施例中，該第二染色劑或生物共軛染劑可包括與ALEXA568.RTM.共軛之抗細胞角質蛋白抗體，且該第三染色劑或生物共軛染劑可包括抗CD45-ALEXA488.RTM.抗體，或由第一抗體、抗CD45抗體及預先與ALEXA488.RTM.共軛且以CD45為標的之第二抗體組合而成。

該第二染色劑或生物共軛染劑可包括與ALEXA568.RTM.共軛之抗細胞角質蛋白(CK)抗體，其包括與ALEXA568.RTM.共軛之單株抗體，或係由第一抗體、抗CK抗體及預先與ALEXA568.RTM.共軛且以CK為標的之第二抗體組合而成。

辨識所述第一連接區可包括辨識具有最小第一尺寸之第一連接區，且辨識所述第二連接區可包括辨識具有最小第二尺寸之第二連接區。辨識所述第一連接區可包括辨識具有最大第一尺寸之第一連接區，且辨識所述第二連接區可包括辨識具有最大第二尺寸之第二連接區。辨識所述第一連接區及辨識所述第二連接區包含最大穩定極值區域(MSER)演算法。

辨識所述第一連接區可包括：將該數位影像分割為複數個部分；搜尋各該部分以找出潛在第一連接區；及辨識該數位影像中以該搜尋所得之潛在第一連接區為中心之一新部分。判定空間重疊之第一連接區與第二連接區可包括判定第二連接區之邊界是否位於第一連接區之邊界內或係與第一連接區之邊界疊合。

可求出第一連接區與第二連接區之組合。求出所述長寬比可包括：求出一長軸，其係延伸於該組合之邊界上相距最遠之兩點之間；求出一短軸，其係垂直於該長軸，並延伸於該組合之邊界上分別位於該長軸兩側且相距最遠之兩點之間；及計算該短軸對該長軸之比值。該長寬比之閾值可為0.4或小於0.4。

可求出一圍繞該組合之邊界框，可求出該組合之邊界內之第一像素數，可求出一範圍內之第二像素數，可求出該第一像素數對該第二像素數之比值，且該比值可與範圍閾值相比較。該範圍閾值可介於0.4與0.85之間。該組合可為第一連接區與第二連接區之聯集。

求出所述強度比可包括：求出第二連接區之第一平均強度；求出第三連接區之第二平均強度；及求出該第一平均強度對該第二平均強度之比值。若該比值小於閾值即可排除該等空間重疊之第二連接區與第三連接區。令I2為該第一平均強度，I3為該第二平均強度，若(I2/I3)＜1即可排除該等空間重疊之第二連接區與第三連接區。

優點可包括下列一或多項。 可自動判定樣本區內可能含有所欲尋找之候選細胞之區域位在何處。該等區域可加以標記以利後續評估，從而大幅減少操作員所需檢視之樣本區數量。此一用於偵測及計算CTC之自動成像法有助於在治療過程中預測疾病之惡化情形及整體存活率，且可用於病人預後之連續監測，以便在選擇病人照護方式時提供所需資訊。

對實體腫瘤(solid tumor)進行採樣乃癌症診斷之例行程序。目前，次世代之定序技術使吾人得以利用靈敏、快速且低成本之方式，從已脫離原組織並進入細胞間流體組分（例如組織間隙液、淋巴液、血液、唾液、腦脊液、滑液、尿液、糞便及其他分泌物）之癌細胞或其組成DNA中偵測出腫瘤DNA並加以分析。從原發腫瘤採樣所得之癌細胞碎片可作為監測疾病惡化之標記，未來可望在癌症症狀出現前即可依此標記做出診斷。

若欲辨識樣本玻片上之CTC，首先需縮小樣本玻片上候選CTC所在之區域，以利後續人工檢視。CTC之尺寸大多介於8 μm與25 μm之間，但一般樣本面積則介於約50 mm² 與1200 mm² 之間。必須目視檢查腫瘤細胞之形態或其他細胞特徵以確認「陽性事件」。由於可從中找出CTC之樣本面積甚大，以人工方式辨識整個玻片區域內之候選物體既困難又費工，導致操作員評估玻片樣本影像時效率不彰。此外也可能錯漏部分陽性事件，尤其在影像中出現候選物體之頻率偏低時更是如此。因此，CTC之偵測與量化極具挑戰。以本文所述之數位影像分析技術搭配高解析度顯微鏡即可有效率地辨識所欲尋找之候選CTC。

圖1為CTC辨識程序100之示意圖。參閱圖1所示，先從一臨床地點取得一生物流體（例如血液、淋巴液、腦脊液、唾液、滑液、尿液、糞便或其他分泌物等體液）之樣本10（步驟115）。例如，醫師可能希望病人接受檢查，以便在癌症症狀出現前偵測出癌症、診斷特定癌症、監測癌症之惡化，或判定癌細胞之DNA特徵，進而選擇適當之治療方法。

可於醫師辦公室或診所收集病人之血液或其他體液樣本，然後將樣本送交系統200之操作員。在其他實施例中，亦可於該系統200所在地點收集樣本。

可對樣本施行一富集程序（步驟120至步驟125）。若待評估之癌細胞樣本為血液樣本，則富集之效益尤其顯著。

許多CTC富集技術均可用於減少待分析之細胞總數。此等技術之實施例包括以抗體修飾之微流控裝置、基於細胞尺寸之過濾、被動細胞分選及免疫磁性分選。其他可用以分離所欲尋找之癌細胞之方法、組合物及系統包括PCT/US2015/023956所揭露者，該專利申請案主張下列專利申請案之優先權：2014年4月1日提出申請之第61/973,348號美國臨時專利申請案、2014年4月4日提出申請之第61/975,699號美國臨時專利申請案、第14/065,265號美國專利申請案（亦即第2014/0120537號美國專利公開申請案，其主張2012年10月29日提出申請之第61/719,491號美國臨時專利申請案之優先權）及第14/836,390號美國專利申請案（亦即第2016/0059234號美國專利公開申請案，其主張2014年8月26日提出申請之第62/042,079號美國臨時專利申請案之優先權），以上所有專利申請案均以引用之方式併入本文，特此說明。

舉例而言，上列參考文獻述及使標的CTC流經一包含表面（例如玻璃）之微流控渠道（圖1之步驟125）。該表面可包含一結合部分，以利所欲尋找之CTC附著其上（圖1之步驟125以示意方式繪示EpCAM之結合）。該表面可包含一無吸附性組合物（例如脂質組合物、具有生物活性之組合物及／或官能基，藉以減少非特定粒子之結合）。藉由減少非特定粒子之結合，即可提高所欲尋找之CTC之純度。所欲尋找之CTC經由該表面捕集後（例如該表面可包含脂質雙層），便可以一系列抗體加以清洗及染色（圖1之步驟127至步驟130），且為維持細胞完整性，該清洗及染色作業係以輕撫方式完成。例如，此輕撫力可為氣泡之剪力、空氣泡沫之剪力、乳化液之剪力、超音波震動或油相。在一特定實施例中，可令一包含氣泡之泡沫組合物流經該表面以去除已結合之細胞及／或無吸附性組合物（圖1之步驟127）。在另一實施例中，如PCT/US2012/044701（即第14/128,354號美國專利申請案，亦即第2014/0255976號美國專利公開申請案，其主張2011年6月29日提出申請之第61/502,844號美國臨時專利申請案及2012年3月2日提出申請之第61/606,220號美國臨時專利申請案之優先權，上開所有專利申請案均以引用之方式併入本文，特此說明）所述，一「具有釋放功能」之組合物可潤滑該表面，因此僅需低流量剪應力即可去除或釋放該表面塗層上之非特定細胞或血液組份。

舉例而言，如PCT/US2015/023956（其主張2014年4月1日提出申請之第61/973,348號美國臨時專利申請案及2014年4月4日提出申請之第61/975,699號美國臨時專利申請案之優先權，上開所有專利申請案均以引用之方式併入本文，特此說明）所述，可使泡沫流經該微流控表面，藉此釋放標的CTC以利成像與分析。此一做法可提高效率及細胞之活力。

在較為一般且複雜度較低之實例中，可利用紅血球(RBC)裂解液搭配陽性免疫磁性分選法以富集末稍血液中之有核細胞。裂解紅血球之方式係先添加RBC裂解液，繼而反轉混合，再加以培養。

上述富集程序之另一實例係使用對CTC具有高專一性、高敏感性且高度過度表現之細胞表面生物標記，例如上皮細胞黏著分子(EpCAM)。CELLSEARCH SYSTEM.RTM. (Veridex)使用以抗EpCAM抗體包覆之磁性微粒，並藉此實現CTC之捕集與富集，然後才進行細胞角質蛋白免疫染色。ADNATEST.RTM.（德國AdnaGen AG）係另一種可自市面購得之CTC偵測系統，此系統使用類似之免疫磁性技術，但改用與抗EpCAM抗體及Mucin 1 (MUC1)共軛之磁珠。新近開發用於偵測及富集CTC之「CTC晶片」係植基於以抗EpCAM抗體包覆之微流控晶片（Nagrath等人，Nature 2007，450：1235-9）。前文所引用之專利申請案係處理血液細胞與抗EpCAM抗體之間非專一性結合之問題。

接著對樣本執行染色程序（步驟130）。在某些情況下，所欲尋找之細胞可以免疫學方法（亦即透過以特徵細胞組份為標的之抗體）染色。為細胞染色時，可使用能辨識一細胞族群中特定細胞類型與特徵之單株抗體。此種抗體可直接以螢光化合物加以標記，或改為間接標記，例如以具有螢光標記且可辨識第一抗體之第二抗體加以標記。若採用多標記成像法，則可利用一系列抗體分析一細胞族群。例如，不同抗體可以不同顏色加以標記，然後成像。在某些情況下，多標記成像法可提高CTC偵測之靈敏度。

之所以能偵測及計算體液樣本中之CTC，其前提係將上皮源細胞大致定義為核酸⁺ 、CD45^- 及細胞角質蛋白⁺ (CK)。可利用螢光共軛抗體或抗體片段對任一數量之不同細胞角質蛋白(CK)進行免疫細胞化學染色。可將細胞固定在冰冷甲醇中，再以磷酸鹽緩衝液(PBS)加以淋洗，然後加以培養，所用培養基可包括抗細胞角質蛋白免疫血清或以下列任一項為標的之單株抗體或抗體片段：泛細胞角質蛋白（包括各種細胞角質蛋白）、第一或二型細胞角質蛋白、個別細胞角質蛋白同種型（例如細胞角質蛋白1至細胞角質蛋白20）及任一數量之細胞角質蛋白同種型之組合。

細胞培養基亦可包括另一種以白血球(WBC)為標的之第一（主要）抗體（例如CD45）及／或以主要抗體CD45為標的之第二抗體。之後便可在室溫下以0.5 μg/mL之DAPI（PBS溶液）對樣本進行10分鐘之對比染色，然後放入甘油-明膠中。

可將樣本固定在中性、經緩衝之福馬林中，然後加以透化（步驟135）。或者，可先將玻片弄乾，再以三乙酸纖維素薄膜或網狀物覆蓋，以防止褪色。在步驟135中，每片玻片上之細胞總數可介於100與1.5x10⁶ 之間。玻片上之黏著區可由一至三個彼此分離之圓圈組成，使影像分析之總面積達100至530 mm² 。

染色程序包括至少兩種顏色互異之染色劑，以便將生物流體樣本中之細胞核染成第一顏色，並將生物流體中之細胞骨架細胞特徵染成第二顏色。若有需要，可將生物流體中之白血球或其他非標的細胞染成第三顏色。前兩種染色劑中之一或兩者係設計為可優先與所欲尋找之細胞結合，例如使用可專一辨識細胞表面標記或細胞角質蛋白並與之專一結合之抗體。在某些實施例中，細胞核可以第一生物共軛染劑染色，其中該第一生物共軛染劑係設計為可於成像時提供第一顏色，並與標的細胞之細胞核內之核酸結合。細胞骨架細胞特徵可以第二生物共軛染劑染色，其中該第二生物共軛染劑係設計為可於成像時提供第二顏色，並與標的細胞之細胞骨架細胞特徵結合。詳言之，第二染色劑可包括可與細胞骨架細胞特徵結合（例如透過直接免疫螢光法而與細胞角質蛋白結合）之抗體或抗體片段。此抗體可與螢光蛋白、第二抗體或其他可被光激發而發光之螢光化學化合物共軛，使吾人可透過間接免疫螢光法，以兩種抗體產生放大效果。第二染色劑在辨識諸如細胞角質蛋白等細胞骨架細胞特徵時，可標記任一數量具有細胞骨架之細胞。具有細胞骨架之細胞包括但不限於上皮細胞、內皮細胞、內皮先驅細胞、「癌症幹細胞」及彌散性腫瘤細胞。白血球可以第三生物共軛染劑染色，例如綠螢光蛋白(GFP)，其中該第三生物共軛染劑係設計為可於成像時提供第三顏色，並與人類白血球抗原結合。間接免疫螢光法亦可搭配第三染色劑或生物共軛染劑使用，以達放大訊號之目的。

請參閱圖2，在一特定實施例中，第一染色劑可包括諸如DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）之核染色劑。CTC以核酸染劑（例如DAPI）染色後應呈陽性反應，顯示細胞核在細胞質內且小於細胞質。細胞核之存在代表該細胞並非紅血球，因為紅血球無細胞核。

第二染色劑可包括一或多種與染劑共軛之抗細胞角質蛋白(CK)抗體。上述抗體可包含對細胞角質蛋白具有專一性且與別藻藍蛋白(APC)、藻紅素(PE)或任一數量之市售螢光分子（例如ALEXA FLUOR.RTM.或DYLIGHT.RTM.染劑）共軛之單株抗體。參閱圖2所示之特定實施例中，第二染色劑包括對（小卵形）細胞角質蛋白(CK)具有專一性且因與ALEXA568.RTM.（一種可發出紅色螢光之小分子有機染劑）共軛而可標記並鑑別上皮細胞之抗體。CTC以ALEXA568.RTM.共軛抗細胞角質蛋白抗體染色後應呈陽性反應，且為圓形、卵形或多邊形，同時具有完整細胞膜，大小至少為約4 μm。

第三染色劑可包括與綠螢光蛋白(GFP)（舉例而言）或任一數量之市售有機染劑（例如ALEXA488.RTM.或DYLIGHT488.RTM.，兩者皆可發出綠色螢光）共軛之抗CD45抗體（一種對CD45具有專一性之單株抗體，其中CD45係存在於白血球表面之抗原）。CTC不應產生CD45之陽性反應，因為上述染色劑係用於辨識白血球上之抗原，而CTC不可能為白血球。在此雖針對特定染劑進行討論，但亦可使用本項技藝中之其他類似染劑。

第一顏色可為紅色或橙色，第二顏色可為藍色，第三顏色可為綠色，但其他顏色組合亦無不可。該染劑可為可在成像過程中因光線（例如紫外線、可見光或紅外線）照射而發光之螢光染劑。或者，該染劑可為吸收性染劑。

施用染色劑後，該樣本10便被移至觀察玻片20上（圖1之步驟135）。例如，該觀察玻片20可包括過濾器22（例如一多孔膜或網狀物，參閱圖1及圖3），而該樣本10則施放於該過濾器22上，使該過濾器22可捕集候選細胞（例如候選CTC）但容許其他流體通過。該過濾器22亦可能捕集到其他細胞，例如白血球或其他非標的細胞。該過濾器22可安裝在該觀察玻片20之頂面。該觀察玻片20可為玻璃、樹脂玻璃或本項技藝中類似之適當材料。該過濾器22之直徑可為約5至25 mm，平均孔徑（例如網眼大小）不超過10 μm，例如介於1至3 μm與2至5 μm之間。此平均孔徑可小於2 μm。該過濾器22可為塑膠，例如聚碳酸酯。

此時便可進行樣本分析（圖1之步驟140至150）。詳言之，可利用後述之該系統200（參閱圖3）辨識候選細胞（例如候選CTC）而無需技術人員輸入資料。可將該觀察玻片20置於定位以利成像（步驟140），繼而為樣本成像（步驟145），然後分析所得影像以辨識候選細胞（步驟150）。

圖3係CTC辨識系統之示意圖。參閱圖3所示，該系統200包括成像顯微鏡210及至少一台電腦250，該電腦250可設計為用於控制該成像顯微鏡210之影像擷取機構、控制該成像顯微鏡210與一平台220間之相對移動（例如沿X、Y及／或Z方向移動），及／或控制光源之啟動及／或濾光器之移動以激發並捕集不同波長之螢光。該電腦250亦可設計為用於分析來自該成像顯微鏡210之影像並辨識樣本中之候選細胞，例如候選CTC。

該成像顯微鏡210包括數位攝影機212及諸如透鏡等光學元件214，該等光學元件214可將該數位攝影機212聚焦於該平台220所載該觀察玻片20上之一特定位置。該平台220可在該電腦250之控制下，以電動方式沿X、Y及／或Z方向移動。該成像顯微鏡210所擷取之數位影像具有至少兩個顏色通道，例如三個顏色通道，例如紅色通道、綠色通道及藍色通道。各顏色通道可對應上述染劑其中之一所產生之顏色，但顏色通道之波長不需精準對應染劑顏色之波長。該成像顯微鏡之解析度及放大倍數可經適當選擇，期使個別像素之邊長對應於0.3至1.3 μm，例如使像素面積為約0.648 μm² 。在一實施例中，該成像顯微鏡210可使用10倍物鏡及一可產生大小為1392x1040像素且具有三個顏色通道之數位影像之該數位攝影機212，其中各像素之各通道均包含12個位元。

該數位攝影機212可連結至或包括記憶體232，藉以儲存來自該數位攝影機212之數位影像。該記憶體232可為控制器230之一部分。例如，該控制器230係可執行應用程式（例如用以控制該成像顯微鏡210之應用程式）之通用電腦。

該平台220可由致動器222加以支撐。例如，該致動器222係可使該平台220沿兩正交水平軸線及一垂直軸線移動之三軸該致動器222，其中該兩水平軸線係平行於該觀察玻片20所在之平面，而該垂直軸線則垂直於該平面。或者，該平台220係固定不動，而該致動器222則可移動該數位攝影機212及該光學元件214。

該致動器222連結至該控制器230。該控制器230可設計為可使該平台220與該數位攝影機212相對移動，以便自動掃描該觀察玻片20上需由該成像顯微鏡210成像之區域，並且控制該數位攝影機212擷取影像之時機，期能產生一系列涵蓋樣本所在區域（例如該過濾器22所在區域）之數位影像。該控制器230可設計為允許操作者調整該成像顯微鏡210之組態或調整掃描參數。

該成像顯微鏡210亦可包括光源240。假設染色劑包括螢光染劑，則該光源240所發出光線之波長應可使該等染劑發光（例如由該光源240發出紫外線、可見光或紅外線），以利該成像顯微鏡210產生該等染色劑（例如核染色劑、細胞角質蛋白染色劑及CD45染色劑）之數位影像。假設使用螢光染劑，且該過濾器22係由不會因該光源240照射而發光之材料構成，則該過濾器22不應在數位影像中出現。或者，若使用被動式染劑，則該光源240可發出白光。

該數位影像係傳送至該電腦250以便儲存及分析。該等數位影像可以不失真之格式（例如tiff）儲存及／或傳輸。舉例而言，該電腦250可連結至該成像顯微鏡210，例如透過串列匯排流（例如USB）連接，或透過網路（例如乙太網路或網際網路）連接，且該電腦250可設計為能自動檢索該記憶體232中之數位影像。或者，該電腦250本身可提供該控制器230；在此情況下，該記憶體232可為該電腦250之一部分。又或者，該記憶體232可為可攜式裝置，例如快閃記憶體，其可由操作員從該成像顯微鏡210上拔除，然後插入該電腦250中，且該電腦250可與用以操作該成像顯微鏡210之電腦不同且彼此分離。

但無論如何，該電腦250均係設計為可接收數位影像並加以分析以辨識候選細胞，例如候選CTC及／或白血球(WBC)。一般而言，由該電腦250所辨識出之候選細胞之數位影像需由技術人員加以檢視，以確認各候選物體的確為所欲尋找之細胞，例如CTC。藉由自動剔除數位影像中之大量異物，送交技術人員評估之候選物體可望大幅減少，因而提高效率，並縮短產生檢測結果所需之時間。

請參閱圖4所示，圖中用以辨識候選細胞之電腦實施程序包括三大步驟。在第一步驟中，該電腦250辨識數位影像兩顏色通道中之重疊「斑點」（亦即由最低強度之像素所構成之連接區）（步驟302a及302b）。第一顏色通道可對應於第一顏色，例如對應於標的細胞之細胞核內之核酸所染之顏色；第二顏色通道可對應於第二染劑之顏色，例如對應於標的細胞之細胞骨架細胞特徵所染之顏色。在第二步驟中，該電腦250對重疊斑點組合而成之形狀進行一或多種形狀檢定（步驟304）。此步驟可排除假影及某些種類之細胞。在第三步驟中，電腦250可根據第三顏色通道之評估結果排除形狀（步驟306）。第三顏色通道可對應於第三顏色，例如對應於白血球所染之顏色。此步驟可排除白血球。若先前之程序（例如富集）已有效去除樣本中之白血球，則此第三步驟並非必要。上述各步驟將在下文中有更詳盡之說明。

請再參閱圖3，該電腦250辨識出候選細胞後，將儲存各候選細胞之辨識資訊。例如，該電腦250可將一標籤（例如書籤）插入數位影像中，或將候選細胞在數位影像中之座標儲存在一資料庫中，或裁剪數位影像中對應於候選細胞之部分並將該部分儲存在一獨立檔案或資料庫中。

該辨識資訊（連同數位影像，若有必要的話）可進一步傳送至一分類器以進行後處理或離線檢查，藉以判定各候選物體是否應被分類為標的細胞。候選細胞之辨識亦可由該分類器負責執行。

該分類器可為一負責數位影像後續檢查之技術人員。例如，該電腦250可透過網路260（例如區域網路(LAN)或網際網路）連結至電腦270。

技術人員可利用該電腦270檢視數位影像中對應於各候選細胞之部分，例如目視數位影像中之上述部分，從而判定各該候選物體是否的確為標的細胞，例如CTC。舉例而言，該電腦270可設計為能自動接收該辨識資訊，並根據該辨識資訊找出數位影像之特定部分，然後依照受控之順序，在該電腦270之顯示器上顯示該特定部分以供技術人員檢視。例如，該電腦270可接收候選細胞之座標，進而選出數位影像中以該座標為中心之一部分，然後自動顯示所選之部分。如此一來，技術人員便無需自行搜尋數位影像中之候選物體。在另一實施例中，技術人員可接收一候選物體清單，且清單中之各個項目均聯結至數位影像之一部分。技術人員從清單中選出某一項目後，電腦便對技術人員顯示數位影像之對應部分。

或者，未來若能將判定候選細胞是否為標的細胞之工作完全自動化，則執行上述工作時僅需對電腦272提供適當指令即可。在此情況下，上述分類器即為該電腦272。例如，該電腦250可透過該網路260連結至該電腦272。

在某些實施例中，該電腦270或該電腦272係設計為可計算被判定（例如由技術人員判定或自動判定）為標的細胞之細胞數。此計數值可用於產生一分數，例如CTC之總數、一百分比、一相對於健康個體之比率，或類似數值。在其他實施例中，此分數可由一迴歸方程式產生，且該方程式除CTC之計數值外，尚包括其他風險因子，例如年齡、性別、身體質量指數、家族癌症史、飲酒狀況、體力活動或其他生活型態等。檢查結果將傳送至檢查醫令之下達者，例如醫師。檢查結果可包括上述分數、數位影像中對應於標的細胞之部分，或其兩者。例如，根據檢查結果，醫師可將該分數與一無腫瘤病人對照組以統計方式求得之循環上皮細胞分數加以比較，進而求出癌症發生或復發之概度。根據比較結果，當所得總分超過以健康受測者循環上皮細胞數之統計平均值為基礎之一預定數值時，醫師便可指定一癌症發生或復發概度。

上述分數亦可用於篩檢健康個體未被檢出之癌症，或對已出現癌症症狀之病人進行癌症診斷，或偵測病患狀態之推定變化。在某些實施例中，該分數有助於決定侵略性癌症或無痛癌症之適當治療方式。在此方面，可利用次世代定序技術為採樣自病人之CTC內之DNA定序，藉以找出致癌驅動突變。而在評估該等突變時，可對照一系列已知與特定標靶治療相關之基因標記。標靶治療係攻擊特定種類之癌細胞，對正常細胞之傷害較小。標靶治療之一實例係使用HERCEPTIN.RTM.（美國Genentech），其係以人類表皮生長因子受體2 (HER2)為標的之抗體藥物，HER2會在罹癌之卵巢及乳房組織表面過度表現。

病人樣本中之CTC可接受其他基因檢測。以肺癌而言，若病人太過虛弱，無法提供肺腫瘤切片，可改以抽血方式進行CTC之評估，對病人較為有利。透過簡易抽血及CTC定序，CTC DNA之基因檢測結果可透露病人是否罹患非小細胞肺癌，其原因在於非小細胞肺癌會出現表皮生長因子受體(EGFR)之基因突變。瞭解腫瘤之基因組成有助於醫師決定病人應接受常規化療或抗癌標靶藥物（例如TARCEVA.RTM.，其可抑制EGF受體特定形式之致活突變）。

透過檢測及計算CTC並為CTC之DNA定序，醫師可進一步瞭解病人之特定癌症亞型。這將為治療方法之選擇提供判斷基礎，且可改善治療結果。例如，以乳癌而言，70%之腫瘤細胞均有荷爾蒙受體過多之現象；荷爾蒙受體可與雌激素或助孕酮結合，刺激細胞成長。此類腫瘤最好採用荷爾蒙療法。約20%之其他乳癌亞型則有人類表皮生長因子受體2 (HER2)過多之現象。此種細胞最好以TYKERB.RTM.（美國Novartis）及HERCEPTIN.RTM.（美國Genentech）等藥物（上述兩者均以HER2受體為標的）加以攻擊。約10%之其他乳癌細胞具有「三重陰性」之特性，亦即並無上述受體過多之現象，但有可能出現BRCA抑瘤基因突變。此類腫瘤不宜以HERCEPTIN.RTM.（美國Genentech）治療，且治療病人時若未透過CTC之偵測、定量及定序取得相關資訊，其治療效果可能僅達次佳水準，死亡率也可能上升。

以下將說明該電腦250所執行之程序，請參閱圖5所示，其為一用以辨識數位影像中之重疊「斑點」之電腦實施程序之流程圖。為能辨識出各個「斑點」，該電腦先辨識由最低強度之像素所構成之連接區。所述連接區係數位影像中由相鄰像素所構成之鄰接區域。各連接區可接受尺寸檢測，例如檢測各連接區之大小（以像素總數計）是否介於上限閾值與下限閾值之間。該等上、下限閾值可依影像解析度（亦即每微米之像素數）而預定，以對應CTC之實際大小（例如以微米計）。

詳言之，為辨識第一顏色通道中之各個「斑點」，該電腦先辨識在第一顏色通道中具有最低第一強度之像素所構成之第一連接區（步驟312）。

接著判定第一連接區是否具有最小第一尺寸（步驟314）。例如，可計算第一連接區之像素總數。若第一連接區之像素總數小於第一下限閾值（例如50個像素），則排除該連接區，使其不具候選資格。由於細胞核具有一最小尺寸，倘若第一連接區過小，代表第一通道中之此一「斑點」並非細胞核，亦即並非候選物體。

此外，可判定第一連接區是否具有最大第一尺寸。例如，若第一連接區之像素總數大於第一上限閾值（例如1500或1000個像素），則排除該連接區，使其不具候選資格。由於細胞核具有一最大尺寸，倘若第一連接區過大，代表此「斑點」並非細胞核，亦即並非候選物體。

類似程序亦可應用於第二顏色通道。為辨識第二顏色通道中之各個「斑點」，該電腦先辨識在第二顏色通道中具有最低第二強度之像素所構成之第二連接區（步驟316）。

接著判定第二連接區是否具有最小第二尺寸（步驟318）。例如，可計算第二連接區之像素總數（例如，在判定出該區域後，先將影像網格化，再計算有多少像素被標示為位於該第二連接區內）。若第二連接區之像素總數小於第二下限閾值（例如100個像素），則排除該連接區，使其不具候選資格。由於細胞具有一最小尺寸，倘若第二連接區過小，代表第二顏色通道中之此一「斑點」並非細胞，亦即並非候選物體。

此外，可判定第二連接區是否具有最大第二尺寸。例如，若第二連接區之像素總數大於第二上限閾值（例如1500個像素），則排除該連接區，使其不具候選資格。由於細胞具有一最大尺寸，倘若第二連接區過大，代表此「斑點」並非細胞，亦即並非候選物體。

上述像素數可不與像素數之閾值比較，而改為先依解析度分類（例如根據單位面積之像素數分類），再與代表尺寸之閾值（以面積單位計，例如以平方微米計）相比較。

辨識最低強度像素連接區之一實施例係透過定限之方式將灰階影像轉換為二元影像（例如將強度低於最低強度之像素設為0，並將強度高於最高強度之像素設為1）。此方法之後續步驟包括檢查二元影係之像素（例如依照從上往下、由左至右之順序檢查數位影像），藉此判定受檢像素旁之像素是否已劃歸某一斑點。若受檢像素旁之像素係一既有斑點之像素，可將受檢像素劃歸該既有斑點，否則將建立並儲存新的斑點資料紀錄（例如將受檢像素劃歸新的斑點紀錄）。選擇最低強度時，可依實證研究選定一可區分細胞與雜訊之數值，例如操作員可針對顯示中之樣本影像調整各顏色通道之最低強度，並以目視檢查之方式判定所選閾值能否可靠區分細胞與雜訊。

亦可對影像施行額外的影像過濾技術，例如以強度平滑化為基礎者。濾除雜訊可避免假的「開啟(on)」像素，從而避免產生新的斑點資料（例如當斑點尺寸夠小時）。濾除雜訊亦可避免假的「關閉(off)」像素，藉以改善第二連接區像素總數之計算。

辨識最低強度像素連接區之另一實施例係使用最大穩定極值區域(MSER)演算法。此技術將數位影像之像素依強度之高低順序分類。分類後之像素則逐一放入空白影像中以形成斑點。詳言之，此方法包括一try-catch敘述，且該敘述包括以分類後之強度索引為迭代變數之for迴圈。此for迴圈先檢查終止條件，藉此判定是否已達影像背景強度。終止條件可包括兩方面：影像中之斑點數是否達20個？以及影像中最大斑點之尺寸是否達3000個像素？在給定之影像位置以給定之像素強度進行迭代時，若未達終止條件，則將該給定之像素強度放置在該給定之影像位置以完成該次迭代。

完成任一像素之放置後，需檢查其相鄰像素，藉以判定是否已有像素被放置在該影像中。若有，則根據當前被放置之像素更新既有之斑點資料紀錄（例如將當前被放置之像素劃歸一已有紀錄之斑點）；若無，則建立並儲存新的斑點資料紀錄（例如將當前被放置之像素劃歸新的斑點紀錄）。上述之像素放置步驟將持續進行，直到滿足終止條件為止。一旦滿足終止條件，迭代隨即停止，並離開該迴圈，從而完成該try-catch敘述。最大穩定極值區域詳見J. Matas等人之專文「Robust Wide Baseline Stereo from Maximally Stable Extremal Regions」(Electronic Proceedings of The 13th British Machine Vision Conference, 2002)。

某些實施例係將數位影像分割為複數個區域，並針對各區域進行分析。該等區域之像素數可經適當選擇，以使各區域大於標的細胞之預期尺寸（例如大3至10倍左右）。舉例而言，可將數位影像分割為複數個邊長為50至200個像素（例如面積為100x100平方像素）之矩形區域。假設像素邊長為0.648 μm，則此100x100像素區域可代表觀察玻片上面積為64.8 μm x 64.8 μm之區域。由於CTC之尺寸介於8 μm與20 μm之間，上述區域足可將CTC完整容納其中。

在某些實施例中，若一連接區內之像素數被判定為超過閾值，則另選一重新置中區，此重新置中區係以該連接區為中心。接著對該重新置中區執行重疊「斑點」之辨識。重新置中之動作可包括形成一影像，其中該影像包括一斷面影像陣列中多個相鄰區域之若干部分。

下一步驟係判定各第一連接區是否與一第二連接區重疊（步驟302b）。由於循環腫瘤細胞同時包括細胞核與細胞骨架，若第一與第二顏色通道其中之一出現連接區，但第一與第二顏色通道中之另一通道並未出現對應之連接區，則代表該連接區並非標的細胞或其一部分；該連接區將作如是標記。該電腦250可判定第一顏色通道與第二顏色通道中「斑點」之重疊區域；若無重疊，則排除該斑點，使其不具候選資格。

在某些實施例中，若第二連接區與第一連接區重疊且／或位於第一連接區內，則可將第二連接區視為與第一連接區重疊。在某些實施例中，第一連接區必須包圍第二連接區，例如第一連接區形成一圍繞第二連接區之連續圓環。亦可對其中兩顏色通道（例如藍色與紅色通道）執行二元過濾，並以此作為判定藍色斑點與紅色斑點是否重疊的步驟之一。

而後，由第一與第二顏色通道重疊連接區所指示之潛在候選物體便可接受一或多種形狀檢定。

第一形狀檢定係判定重疊連接區之長寬比是否在長寬比之閾值範圍內。標的細胞（例如CTC）通常並非長形。假設長寬比係相對較短之量測值對相對較長之量測值之比值，則一重疊連接區之長寬比小於閾值代表該重疊連接區過長，不具備候選資格。

在某些實施例中，為求出長寬比，可先判定一由第一連接區及與之重疊之第二連接區聯集而成之組合區域，然後判定此組合區域之外邊界，參閱圖6A所示。該外邊界可為一組位於該組合區域外緣之像素。

而後計算該組合區域之長軸，參閱圖6B所示。該長軸可為該邊界上距離最遠之兩像素所連成之線段。例如，為求出長軸，可執行一用以判定該邊界上各像素至該邊界上其他任一像素之距離之功能，而長軸即由距離最遠之一對像素定義而成。

然後便可計算該組合區域之短軸，參閱圖6C所示。長軸將該組合區域分為兩半。短軸可為與長軸垂直且由該邊界上位於長軸兩側之兩像素連接而成之最長線段。例如，為求出短軸，可先求出該邊界上位於長軸一側之各像素沿垂直於長軸之方向延伸至該邊界上位於長軸相反側之像素之距離，而短軸即由距離最遠之一對像素定義而成。

上述長寬比可為短軸長度對長軸長度之比值。該長寬比可與一閾值比較。例如，若長寬比小於0.4，例如小於0.35，又例如小於0.3，則排除該重疊連接區，亦即判定其並非候選細胞。

第二形狀檢定係比較重疊連接區之填充因子。此檢定係另一種偵測長形區域或排除極端不規則形狀之方法。

在某些實施例中，求得填充因子之方式係建立一圍繞組合區域之邊界框，參閱圖7所示。此邊界框為矩形，其上、下邊界分別匹配組合區域之最上端與最下端像素，左、右邊界則分別匹配組合區域之最左端與最右端像素。

可計算組合區域外邊界內之像素數，以及位於組合區域外但位於邊界框內（又稱「範圍」內）之像素數。外邊界內之像素數對「範圍」內之像素數之比值將與一填充因子閾值比較。若該比值小於該填充因子閾值，則該組合區域不具候選資格。該填充因子閾值可介於約0.4與0.85之間，例如為0.60。

通過上述所有檢測之組合區域可視為候選物體，但非標的細胞及白血球亦可能通過該等檢測。因此，可利用一道額外程序篩除白血球。一般而言，此步驟包括求出組合區域兩不同顏色通道間之強度比。

兩通道其中之一可為前述第二通道。另一通道可為前述第三通道。在此情況下，需判定第三通道中之第三連接區（例如依照前述判定第一與第二連接區之方式加以判定），然後判定第二連接區與第三連接區之間的重疊區域。可利用此重疊區域之兩通道強度值求出強度比。空間重疊但強度比不符合強度比閾值之第二連接區與第三連接區將被排除，使其不具候選資格。

簡言之，白血球應包含較大量之第三染色劑，因而在第三顏色通道中具有較高強度。因此，若一候選區在第三顏色通道中亦呈現高強度，則可將此候選區排除。

在某些實施例中，上述檢測步驟之執行方式係計算第二連接區之平均強度I2。此外尚可判定在第三顏色通道中具有最低第三強度之像素所構成之第三連接區，例如以前述判定第一及第二連接區之技術判定之。另計算第三連接區之平均強度I3。

某些實施例則計算一顏色通道之平均背景強度，例如前述「範圍」區域內之強度或一包括組合區域之所選影像次區域之強度。將此顏色通道之連接區平均強度減去該通道之平均背景強度即為調整後之平均強度。

可以下列公式判定細胞為候選細胞（例如CTC）（第1組）、不明細胞（第2組）或白血球（第3組）： 22第1組：≦ 2 第2組：2且﹥1 第3組：﹤1 其中I2及I3為上述之平均值或調整後之平均值。

可排除第3組所對應之組合區。滿足I2/I3³2之組合區則可標示為候選物體並交由技術人員評估。

綜言之，利用上述演算法，該電腦250可判定數位影像第一與第二顏色通道中相互重疊之第一連接區與第二連接區，然後根據一或多個顏色通道求出該等空間重疊之第一連接區與第二連接區之長寬比，繼而判定一或多個空間重疊且長寬比符合閾值之第一連接區與第二連接區，然後對操作員顯示該影像中對應於該等已辨識出之空間重疊之第一連接區與第二連接區之部分，而該等部分即為待分類之候選細胞。

圖8係一流程圖，顯示判定影像中之物體應否分類為候選物體時應考慮哪些因素。此流程圖中之順序未必為該電腦250中軟體作業之順序。

實施例：

癌症之診斷及預後係CTC偵測之重要應用領域。轉移性乳癌患者經治療後之無惡化存活率及整體存活率偏低，與末梢血液中出現CTC且CTC之表面表現出「上皮細胞黏著分子」（EpCAM，一種幾乎所有上皮細胞癌均會表現之泛（綜括性）上皮細胞分化抗原）有關。表現出EpCAM之CTC在此簡寫為「EpCAM+CTC」。就某些平台而言，每約7.5 mL血液中之EpCAM+CTC數量達5個以上即代表無惡化存活率及整體存活率有下降之虞。

在另一應用中，每個樣本可取血液2至10 mL加以處理，而經辨識出之循環腫瘤細胞數可用於預測疾病之風險或復發率。在另一實施例中，從血液中辨識出之CTC數量可能僅為迴歸方程式眾多變數之一，其他變數包括CTC以外之其他風險因子。

在某些實施例中，CTC以CK-ALEXA568.RTM.（一種紅色染劑）染色後應呈陽性反應，且為圓形、卵形或多邊形，同時具有完整細胞膜，大小至少為約4 μm。CTC以CD45-ALEXA488.RTM.（一種綠色染劑）染色後不應產生陽性反應，因為此一染色劑係用於辨識白血球上之抗原，而CTC不可能為白血球。CTC以DAPI核染色劑（一種藍色染劑）染色後亦應呈陽性反應，顯示細胞核在細胞質內且至少比細胞質小30%。細胞核之存在代表該細胞並非紅血球，因為紅血球無細胞核。

CTC自腫塊脫落後便進入血流。及早追蹤及計算末梢血液中之CTC可改變治療方式，甚至延緩轉移。在各種細胞中，CTC屬於罕見細胞，且不易分類。如圖6A至圖6C之視野圖所示，取自末梢血液之細胞（以示意圖呈現）先經染色再以光學方式檢視。有多個系列之細胞影像可供檢視，各系列均包括一CK-ALEXA568.RTM.（細胞角質蛋白）欄、一DAPI核對比染色欄，以及一針對WBC（或其他非標的細胞）之CD45-ALEXA488.RTM.染色劑欄（舉例而言）。技術人員可檢視各列影像，並依特定判別標準選出有資格被判定為腫瘤細胞之細胞。在某些實施例中，技術人員可將系列影像中之物體解讀為循環腫瘤細胞(CTC)、白血球(WBC)、鱗狀細胞、與白血球同框之腫瘤細胞、非標的細胞或雙重陽性細胞（舉例而言）。在檢視影像中之物體時，其他考慮因素包括無核細胞、像素化細胞、已脫離之細胞核，以及諸如假影及電腦雜訊等非細胞碎片。

透過光控制器，先以紅光擷取第一影像，再以藍光擷取第二影像，然後以綠光擷取第三影像。

所用之顯微鏡可具有一電動平台，以便掃描玻片上之樣本並擷取斷面影像。本文所述之電腦實施程序可利用自動化之步驟解讀重疊之顏色與形狀（圓形／卵形與非細胞之形狀）。在某些實施例中，該電動平台可調整玻片方位以找出具有CTC之斷面。其可儲存所欲尋找之斷面影像以供檢視。

若出現大型非典型細胞，不應將其納入CTC計算。像素化、模糊且不完整之細胞不應納入CTC計算。罕見污染物可能因CK-ALEXA568.RTM.或DAPI信號過度放大而出現。上述影像均不符合CTC之 判別標準。

在某一實施例中，一影像擷取裝置（例如顯微鏡）可辨識具有最低第一強度之藍色像素所構成之第一連接區。具有最低第一強度且彼此相連接之藍色像素係對應推定之WBC或CTC細胞核。藍色像素連接區之辨識係以100´100像素之區塊為單位。一旦完成辨識，系統將重新調整區塊之中心位置，使藍色像素連接區位於100x100像素區塊之中央。

該影像擷取裝置將接著辨識具有最低第二強度之紅色像素所構成之第二連接區，然後辨識空間重疊之藍色像素第一連接區與紅色像素第二連接區，進而求出該等空間重疊之第一與第二連接區之長寬比，接著辨識一或多個空間重疊且長寬比符合閾值之區域，然後再對操作員顯示影像中對應於該等空間重疊之第一連接區與第二連接區之部分，亦即有待分類之部分。

定義：

「循環腫瘤細胞」(CTC)一詞在本文中係指循環流體（較佳者為末梢血液）中非白血球之有核細胞。

CTC係離開原發腫瘤後進入血流或淋巴系統之罕見細胞。以膀胱癌而言，CTC可脫離腫塊並進入尿液中。以唾腺癌而言，CTC脫離腫塊後可進入唾液中。因此，本文所說明之方法及程序將CTC定義為具有細胞核（例如以DAPI染色後呈陽性反應）、具有上皮細胞特徵（例如以細胞角質蛋白染色後呈陽性反應）且非白血球（例如不會產生CD45之陽性染色反應）之物體。此物體必須大於4´4 μm² 且具有類似細胞之形態。

在本文中，「DAPI」一詞係指4',6-二脒基-2-苯基吲哚，其為一種可發出藍色螢光且可與DNA中富含A-T之區域強力結合之染色劑。用於螢光顯微技術時，DAPI兼可通過活細胞與固定細胞之完整細胞膜，故可用於標記及區分有核細胞與無核細胞（例如紅血球）。

在本文中，「CK」一詞係指細胞角質蛋白，其為一種可在上皮細胞之細胞質內細胞骨架中發現且含有角質蛋白之中間絲狀體。「抗CK/ALEXA568.RTM.抗體」係指對細胞角質蛋白具有專一性且與ALEXA568.RTM.（一種可發出紅色螢光之橙色染劑）共軛之單株抗體，可用於標記及判別上皮細胞。請留意，抗CK/ALEXA568.RTM.抗體亦可指第一抗體與第二抗體之組合，其中該第一抗體可辨識CK，該第二抗體則與染劑（例如ALEXA568.RTM.）共軛並以該第一抗體為標的。抗細胞角質蛋白(CK)抗體可為以下列任一項為標的之抗體：泛（綜括性）細胞角質蛋白、個別細胞角質蛋白同種型（例如細胞角質蛋白1至細胞角質蛋白20）及任一數量之細胞角質蛋白同種型之組合。更廣義而言，「抗CK/PE抗體」及「抗CK/APC抗體」係指對細胞角質蛋白具有專一性且與可發出紅色螢光之有機染劑（例如別藻藍蛋白(APC)及藻紅素(PE)）共軛之單株抗體。

在本文中，「CD45」一詞係指分化簇（又稱分化群）45，其為一種存在於白血球表面之抗原。抗CD45-ALEXA488.RTM.抗體係對CD45具有專一性且與ALEXA488.RTM.（一種可發出綠色螢光之有機染劑）共軛之單株抗體，可用於標記及判別白血球(WBC)。請留意，抗CD45-ALEXA488.RTM.抗體亦可指第一抗體(CD45)與第二抗體(ALEXA488.RTM.)之組合，其中該第二抗體係以該第一抗體為標的。

在本文中，「體液」一詞包括腹水、唾液、尿液、滑液、腹膜液、羊水、腦脊液、漿膜液及／或脊髓液。

「核染色劑」一詞係指一種用以顯示細胞內具有細胞核之染劑化合物。核染色劑包括諸如吖啶橙、溴化乙啶(ethidium bromide)、疊氮溴化乙啶(ethidium monoazide)、赫斯特染劑(Hoeshst dye)、碘化丙啶(propidium iodide)及DAPI等嵌合染劑。

在本文中，「螢光標記」一詞係指可與另一分子（例如蛋白或核酸）共價鍵結之螢光團，其中共價鍵通常係由該螢光團之一反應性衍生物與目標分子之一官能基選擇性結合而成。螢光標記包括但不限於別藻藍蛋白(APC)、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、玫瑰紅（FAM、R6G、TET、TAMRA、JOE、HEX、CAL Red、VIC及ROX）、Texas Red、BODIPY、香豆素、花青染劑（噻唑橙(thiazole orange, TO)、噁唑黄(oxazole yellow, YO)、TOTO、YOYO、Cy3、Cy5）、ALEXA FLUOR.RTM.染劑、DYLIGHT.RTM.染劑、綠螢光蛋白(GFP)及藻紅素(PE)。

在本文中，「生物樣本」一詞係採用其最廣義之解釋，泛指含有核酸或其蛋白轉譯產物之樣本。樣本可包含：體液（例如血液）；細胞製備物之可溶部分（或細胞生長介質之可分量）；染色體、胞器、或從細胞分離或擷取之薄膜；溶液中（或與基質結合）之DNA、RNA或cDNA；單一細胞；單一組織；組織轉印物；指紋；多個細胞；皮膚及其類似物。在較佳實施例中，「生物樣本」一詞係指取自受測者且含有細胞之生物材料，涵蓋所有可偵測出CTC之生物材料。例如，樣本可為全血、血漿、唾液或其他含有細胞之體液或組織。一較佳實施例為全血，若為末梢血液則更佳，尤佳者為末梢血液之細胞部分，特佳者係從血液中分離或富集之CTC。

在本文中，「抗體」一詞係指可中和抗原並因此產生免疫反應之多種原本存在於體內或因應抗原而產生之蛋白中之任何一種。較佳者，抗體包含IgG亞型免疫球蛋白。

在本文中，「與…專一反應」係指抗體與抗原間之專一結合（所述抗體與抗原通常亦具有結合親和力），此結合方式優於同一抗原與不具專一性之抗體間之結合。

本文所述系統及方法之分析所需血液量（或其他身體分泌物之所需用量）可約等於或少於25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL、4 mL、4.5 mL、5 mL、5.5 mL、6 mL、6.5 mL、7 mL、7.5 mL或8 mL、9 mL、10 mL、11 mL、12 mL、13 mL、14 mL、15 mL或16 mL。本文所述系統及方法之分析所需血液量可等於或多達25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL、4 mL、4.5 mL、5 mL、5.5 mL、6 mL、6.5 mL、7 mL、7.5 mL或8 mL、9 mL、10 mL、11 mL、12 mL、13 mL、14 mL、15 mL或16 mL。在本文中，「約」字可指其後數值±1%、±2%、±3%、±4%、±5%、±6%、±7%、±8%、±9%或±10%範圍內之量。

舉例而言，11 mL之血液樣本亦可指約10 mL之血液樣本。本文在提供任一數值範圍時，除非上下文另有指明，否則自然等同於明確揭露該範圍上、限之間以該下限單位十分之一為間隔之各個中間數值。本發明涵蓋所述範圍之任一所述數值（或中間數值）與同範圍中另一所述數值（或中間數值）間之較小範圍。上述較小範圍之上、下限可獨立包括在或不包括在各該範圍內，且所述較小範圍無論其上、下限中之任一者是否包括在各該範圍內，均涵蓋於本發明之中，唯若任一限值已敘明不包括在所述範圍內則從其說明。若所述範圍包括其限值中之一或兩者，則本發明涵蓋不包括該或該等已包括限值之範圍。下文透過實例詳細說明本發明之較佳實施方式，但所述實例不應視為對本發明之寬廣範圍有所限制。

電腦系統：

前述電腦中之一或多者（例如該電腦250）包括該處理器252、該記憶體254、該儲存裝置256、及一或多個輸出／入介面裝置258。上述元件該處理器252、該記憶體254、該儲存裝置256及該輸出／入介面裝置258可以系統匯流排259（舉例而言）相互連接。

該處理器252可處理該電腦系統250內所需執行之指令。「執行」一詞在此係指由程式碼指示處理器落實一或多道處理器指令之技術。在某些實施例中，該處理器252係單執行緒處理器。在某些實施例中，該處理器252係多執行緒處理器。在某些實施例中，該處理器252係量子電腦。該處理器252可處理該記憶體254或該儲存裝置256所儲存之指令。

該記憶體254儲存該電腦系統250內之資訊。在某些實施例中，該記憶體254係電腦可讀媒體。在某些實施例中，該記憶體254係揮發性記憶體單元。在某些實施例中，該記憶體254係非揮發性記憶體單元。

該儲存裝置256可為該電腦系統250提供大量儲存。在某些實施例中，該儲存裝置256係非暫態電腦可讀媒體。在多種不同實施例中，該儲存裝置256可包括諸如硬碟裝置、光碟裝置、固態硬碟、快閃記憶體、磁帶或某些其他大容量儲存裝置。在某些實施例中，該儲存裝置256可為雲端儲存裝置，例如一邏輯儲存裝置，其包括一或多個分布在網路中且可透過網路（參閱圖3所示之該網路260）存取之實體儲存裝置。在某些實施例中，該儲存裝置256可儲存長期資料，例如數位影像。

該輸出／入介面裝置258為該電腦系統250提供輸出／入功能。在某些實施例中，該輸出／入介面裝置258可包括一介面裝置網路中之一或多個介面裝置，例如乙太介面、序列通訊裝置（例如RS-232介面）及／或無線介面裝置（例如802.11介面、3G無線數據機、4G無線數據機等）。網路介面裝置使該電腦系統250得以對外通訊，例如透過該網路260收、發資料（例如數位影像）。在某些實施例中，該輸出／入裝置可包括用以接收輸入資料並將輸出資料發送至其他輸出／入裝置（例如鍵盤、印表機及顯示裝置）之驅動裝置。某些實施例則可使用行動計算裝置、行動通訊裝置及其他裝置。

用以執行影像分析及該系統200其他作業之軟體可透過指令實現，該等指令一經執行即可令一或多個處理裝置實施上述程序及功能。例如，該等指令可包括直譯語言指令（例如手稿語言指令）、可執行編碼或其他儲存於電腦可讀媒體中之指令。

以上雖已說明一處理系統之實例，但前述發明標的及功能運作亦可透過他種數位電子電路、電腦軟體、韌體或硬體實施，包括本說明書所揭露之結構、其結構等同物或其中一或多種之組合。本說明書所述之發明標的（例如假影之儲存、保持及顯示）可落實為一或多個電腦程式產品，亦即一或多個編碼於有形程式載體（例如電腦可讀媒體）上之電腦程式指令模組，該等電腦程式指令模組可由一處理系統執行，或用於控制該處理系統之運作。該電腦可讀媒體可為機器可讀儲存裝置、機器可讀儲存基材、記憶體裝置或上述一或多種之組合。

「系統」一詞涵蓋所有用於處理資料之設備、裝置及機器，例如包括單一可程式化處理器、單一電腦、複數個處理器或複數台電腦。處理系統在硬體之外尚可包括可為所需電腦程式建立執行環境之程式碼，例如用以構成處理器韌體之程式碼、協定疊、資料庫管理系統、作業系統或上述一或多種之組合。

電腦程式（又稱為程式、軟體、軟體應用程式、指令碼、可執行邏輯或程式碼）可以任一種程式語言撰寫，包括編譯或直譯語言、宣告語言或程序式語言，且電腦程式可採用任一種部署形式，包括獨立程式、模組、元件、次常式或其他適用於計算環境之單元。電腦程式未必對應於檔案系統中之檔案。程式可儲存為檔案之一部分，且同一檔案尚可包括其他程式或資料（例如一或多個儲存在標示語言文件中之指令碼）；或儲存在所需程式之專用單一檔案中；或儲存為多個協同檔案（例如複數個儲存有一或多個模組、次程式或部分程式碼之檔案）。電腦程式經部署後，可由單一電腦或複數台電腦執行，其中該複數台電腦可位於同一處，或者分散在多處但以通訊網路相互連接。

適合儲存電腦程式指令之電腦可讀媒體包括各種形式之非揮發性或揮發性記憶體、媒體及記憶體裝置，例如包括半導體記憶體裝置（例如可抹除可程式化唯讀記憶體(EPROM)、電子可抹除可程式化唯讀記憶體(EEPROM)及快閃記憶體裝置）；磁碟（例如內部硬碟、可移式磁碟或磁帶）；磁光碟；以及唯讀光碟(CD-ROM)、唯讀式數位多功能光碟(DVD-ROM)及藍光光碟。所述處理器及記憶體可附加特殊用途邏輯電路或與之整合。在某些情況下，伺服器係一通用電腦；在某些情況下，其為一客製化特殊用途電子裝置；在某些情況下，其為上述物品之組合。實施例可包括後端元件（例如資料伺服器）、中間軟體元件（例如應用伺服器）、前端元件（例如具有圖形使用介面或網路瀏覽器之客戶端電腦，使用者可透過該圖形使用介面或網路瀏覽器與本說明書所述發明標的之實施例互動）或一或多種後端、中間軟體或前端元件之組合。該系統之元件可以任一種數位資料通訊方式或媒體（例如通訊網路）相互連接。通訊網路之實例包括區域網路(LAN)及廣域網路(WAN)（例如網際網路）。

雖然以上討論係針對如何偵測屬於上皮細胞之CTC，但本文所述技術在原則上亦適用於其他種類之細胞，例如其他循環罕見細胞(CRC)、彌散性癌細胞、幹細胞（例如腫瘤幹細胞及骨髓幹細胞）、胎兒細胞、細菌、內皮細胞或其類似物。

雖然本文已說明多種實施例，但應瞭解，所述實施例可以多種方式修改而不脫離本揭露內容之精神與範圍。因此，其他實施方式亦包含在後附之申請專利範圍中。

10‧‧‧樣本

20‧‧‧觀察玻片

22‧‧‧過濾器

100‧‧‧CTC辨識程序

200‧‧‧系統

210‧‧‧成像顯微鏡

212‧‧‧數位攝影機

214‧‧‧光學元件

220‧‧‧平台

222‧‧‧致動器

230‧‧‧控制器

232‧‧‧記憶體

240‧‧‧光源

250‧‧‧電腦/電腦系統

252‧‧‧處理器

254‧‧‧記憶體

256‧‧‧儲存裝置

258‧‧‧輸出／入介面裝置

259‧‧‧系統匯流排

260‧‧‧網路

270‧‧‧電腦

272‧‧‧電腦

I2‧‧‧第二連接區之平均強度

I3‧‧‧第三連接區之平均強度

圖1係CTC辨識程序示意圖。 圖2係染色程序示意圖。 圖3係CTC辨識系統示意圖。 圖4係一電腦實施程序之流程圖，該程序係用於辨識數位影像中之候選細胞。 圖5係又一電腦實施程序之流程圖，該程序係用於辨識數位影像中之重疊「斑點」。 圖6A說明了縱橫比的確定方法。 圖6B說明了縱橫比的確定方法。 圖6C說明了縱橫比的確定方法。 圖7說明數位影像中圍繞「斑點」之邊界框。 圖8之流程圖係說明判定影像中之物體應否分類為候選物體時之考慮因素。 不同圖式中之相同參考標號代表相同元件。

Claims (22)

1. 一種用以辨識生物流體樣本中之候選標的細胞的方法，包含下列步驟： 取得生物流體樣本； 將該生物流體樣本中之細胞核以第一生物共軛染劑染色，其中該第一生物共軛染劑具有第一顏色，且可與標的細胞之細胞核內之核酸結合；將該生物流體樣本中之細胞骨架細胞特徵以第二生物共軛染劑染色，其中該第二生物共軛染劑具有第二顏色，且可與所述標的細胞之細胞骨架細胞特徵結合；及將該生物流體樣本中之白血球以第三生物共軛染劑染色，其中該第三生物共軛染劑具有第三顏色，且可與該生物流體樣本中之人類白血球抗原結合，來製備該生物流體樣本； 擷取該生物流體樣本之數位影像，其中該數位影像具有複數個顏色通道； 對該數位影像進行影像分析，包括： 將該數位影像接收至電腦中； 於該電腦中，辨識在該複數個顏色通道之第一通道中具有最低第一強度之像素所構成之第一連接區； 於該電腦中，辨識在該複數個顏色通道之第二通道中具有最低第二強度之像素所構成之第二連接區； 於該電腦中，判定空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區； 於該電腦中，根據該複數個顏色通道中之一顏色通道，求出該等空間重疊之第一連接區與第二連接區之長寬比； 於該電腦中，辨識空間重疊且所述長寬比符合長寬比閾值之所述第一連接區與所述第二連接區； 於該電腦中，判定空間重疊之所述第二連接區與第三連接區；於該電腦中，根據該複數個顏色通道中之兩個顏色通道，求出該等空間重疊之第二連接區與第三連接區之強度比； 於該電腦中，將空間重疊但所述強度比不符合強度比閾值之所述第二連接區與所述第三連接區所對應之空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區排除，使其不具候選資格；以及 提供該影像之一部分至分類器以待分類，其中該影像之該部分係對應於其他已辨識出之空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區。
2. 如請求項1所述之用以辨識生物流體樣本中的候選標的細胞的方法，其中該第一顏色為藍色，該第二顏色為紅色或橙色，且該第三顏色為綠色。
3. 如請求項1所述之用以辨識生物流體樣本中的候選標的細胞的方法，其中該第一生物共軛染劑包括DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚），該第二生物共軛染劑包括與抗細胞角質蛋白(CK)抗體共軛之紅色或橙色螢光染劑，且該第三生物共軛染劑包括與抗CD45抗體共軛之綠色螢光染劑，或為第一抗體、抗CD45抗體及預先與綠色螢光染劑共軛且以CD45為標的之第二抗體之組合。
4. 如請求項1所述之用以辨識生物流體樣本中的候選標的細胞的方法，其中該第二生物共軛染劑包括與抗細胞角質蛋白(CK)抗體共軛之紅色或橙色螢光染劑，或為第一抗體、抗CK抗體及預先與紅色或橙色螢光染劑共軛且以CK為標的之第二抗體之組合。
5. 一種用以辨識生物流體樣本中之候選標的細胞的電腦程式產品，該電腦程式產品係具體實施為非暫態電腦可讀媒體，包含可令處理器執行下列步驟之指令： 接收該生物流體樣本之數位影像，其中該數位影像具有複數個顏色通道； 辨識在該複數個顏色通道之第一通道中具有最低第一強度之像素所構成之第一連接區； 辨識在該複數個顏色通道之第二通道中具有最低第二強度之像素所構成之第二連接區； 判定空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區； 根據該複數個顏色通道中之一顏色通道，求出該等空間重疊之第一連接區與第二連接區之長寬比； 辨識空間重疊且所述長寬比符合長寬比閾值之所述第一連接區與所述第二連接區； 判定空間重疊之所述第二連接區與第三連接區；根據該複數個顏色通道中之兩個顏色通道，求出該等空間重疊之第二連接區與第三連接區之強度比； 將空間重疊但所述強度比不符合強度比閾值之所述第二連接區與所述第三連接區所對應之空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區排除，使其不具候選資格；以及 提供該影像之一部分至分類器以待分類，其中該影像之該部分係對應於其他已辨識出之空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區。
6. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中所述用以辨識該等第一連接區之指令包含用以辨識具有最小第一尺寸之所述第一連接區之指令，且其中所述用以辨識該等第二連接區之指令包含用以辨識具有最小第二尺寸之所述第二連接區之指令。
7. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中所述用以辨識該等第一連接區之指令包含用以辨識具有最大第一尺寸之所述第一連接區之指令，且其中所述用以辨識該等第二連接區之指令包含用以辨識具有最大第二尺寸之所述第二連接區之指令。
8. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中所述用以辨識該等第一連接區之指令及所述用以辨識該等第二連接區之指令包含最大穩定極值區域(MSER)演算法。
9. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中所述用以辨識該等第一連接區之指令包含用以執行下列步驟之指令：將該數位影像分割為複數個部分；搜尋各該部分以找出潛在第一連接區；及辨識該數位影像中以該搜尋所得之潛在第一連接區為中心之一新部分。
10. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中所述用以判定空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區之指令包含用以判定所述第二連接區之邊界是否位於所述第一連接區之邊界內或係與該第一連接區之該邊界疊合之指令。
11. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中包含用以求出所述第一連接區與所述第二連接區之組合之指令。
12. 如請求項11所述之電腦程式產品，其中所述用以求出該長寬比之指令包含用以執行下列步驟之指令：求出一長軸，其係延伸於該組合之邊界上相距最遠之兩點之間；求出一短軸，其係垂直於該長軸，並延伸於該組合之該邊界上分別位於該長軸兩側且相距最遠之兩點之間；及計算該短軸對該長軸之比值。
13. 如請求項12所述之電腦程式產品，其中如申請專利範圍第12項之電腦程式產品，其中該長寬比之閾值為0.4或小於0.4。
14. 如請求項11所述之電腦程式產品，還包含用以執行下列步驟之指令：求出一圍繞該組合之邊界框；求出該組合之邊界內之第一像素數；求出一範圍內之第二像素數；求出該第一像素數對該第二像素數之比值；及將該比值與範圍閾值相比較。
15. 如請求項14所述之電腦程式產品，其中該範圍閾值介於0.4與0.85之間。
16. 如請求項11所述之電腦程式產品，其中該組合係所述第一連接區與所述第二連接區之聯集。
17. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中所述用以求出該強度比之指令包含用以執行下列步驟之指令：求出所述第二連接區之第一平均強度；求出所述第三連接區之第二平均強度；及求出該第一平均強度對該第二平均強度之比值。
18. 如請求項17所述之電腦程式產品，其中若該比值小於該強度比閾值，則排除該等空間重疊之第二連接區與第三連接區。
19. 如請求項18所述之電腦程式產品，其中若則排除該等空間重疊之第二連接區與第三連接區，其中：I2為該第一平均強度，I3則為該第二平均強度。
20. 如請求項5所述之電腦程式產品，其中該第一顏色為藍色，該第二顏色為紅色或橙色，且該第三顏色為綠色。
21. 一種用以計算生物流體樣本中之標的細胞族群的方法，包括下列步驟： 取得生物流體樣本； 將該生物流體樣本中之細胞核以第一生物共軛染劑染色，其中該第一生物共軛染劑具有第一顏色，且可與標的細胞之細胞核內之核酸結合；將該生物流體樣本中之細胞骨架細胞特徵以第二生物共軛染劑染色，其中該第二生物共軛染劑具有第二顏色，且可與所述標的細胞之細胞骨架細胞特徵結合；及將該生物流體樣本中之非標的細胞以第三生物共軛染劑染色，其中該第三生物共軛染劑具有第三顏色，且可與該生物流體樣本中之人類白血球抗原結合，來製備該生物流體樣本； 擷取該生物流體樣本之數位影像，其中該數位影像具有複數個顏色通道及至少兩個顏色通道； 對該數位影像進行影像分析，包括： 將該數位影像接收至電腦中； 於該電腦中，辨識在該複數個顏色通道之第一通道中具有最低第一強度之像素所構成之第一連接區； 於該電腦中，辨識在該複數個顏色通道之第二通道中具有最低第二強度之像素所構成之第二連接區； 於該電腦中，辨識在該複數個顏色通道之第三通道中具有最低第三強度之像素所構成之第三連接區； 於該電腦中，判定空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區； 於該電腦中，根據該複數個顏色通道中之兩個顏色通道，求出該等空間重疊之第一連接區與第二連接區之長寬比； 於該電腦中，辨識空間重疊且所述長寬比符合長寬比閾值之所述第一連接區與所述第二連接區； 於該電腦中，判定空間重疊之所述第二連接區與第三連接區；於該電腦中，根據該複數個顏色通道中之兩個顏色通道，求出該等空間重疊之第二連接區與第三連接區之強度比； 於該電腦中，將空間重疊但所述強度比不符合強度比閾值之所述第二連接區與所述第三連接區所對應之空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區排除，使其不具候選資格； 根據該影像中對應於其他已辨識出之空間重疊之所述第一連接區與所述第二連接區之部分，將候選物體分類為標的細胞或非靶元素；以及 計算所有被分類為標的細胞之候選物體，從而產生計數值。
22. 一種用以求出人類受測者罹癌概度之方法，包含下列步驟： 將請求項21所取得之該計數值與一無腫瘤病人對照組以統計方式求得之循環上皮細胞數加以比較；及 當總數超過預定數值時，指定一癌症發生概度，其中該預定數值係由健康受測者循環上皮細胞數之統計平均值與癌症患者循環上皮細胞數之統計平均值比較而得。