CN115287352A

CN115287352A - 用于数字pcr检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及其试剂盒和应用

Info

Publication number: CN115287352A
Application number: CN202210619042.8A
Authority: CN
Inventors: 娄加陶; 王琳; 乔理华; 郭巧梅; 许万星; 罗声政; 黄凯峰; 高运通; 李会芳; 胡杰
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2022-06-01
Filing date: 2022-06-01
Publication date: 2022-11-04

Abstract

本发明公开了一种用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及其试剂盒和应用，属于基因突变检测技术领域，具体涉及Septin9、SDC2、BMP3和NDRG4四个基因的甲基化检测。本发明提供的引物探针组合及其试剂盒，可以根据需求自主搭配不同检测基因，且仅需一管体系就可以联合检测最多4种基因的甲基化程度，且通过实验验证，使用本发明的引物探针组合可使检测结直肠癌基因甲基化程度的灵敏度和特异性提高，且多基因联合检测，减少了上样量，也减少了操作。另外，本发明反应体系配制简单，成本低，易于医疗机构的临床推广。

Description

用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及其试剂盒和应用

技术领域

本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及其试剂盒和应用。

背景技术

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，我国的结直肠癌发病率和病死率都居于前列。多数结直肠癌患者在初诊时已属于中晚期，所以结直肠癌的早期诊断、疗效预测和预后评估分子标志物的检测结果对临床制定正确的治疗方案非常重要。结直肠癌主流的检测主要是肠镜检查，但该检查对人的伤害较大，接受度不高。DNA甲基化异常引起抑癌基因表达下降和癌基因激活是结直肠癌形成的分子机制之一，DNA异常甲基化的逆转也可能有助于结直肠癌的诊断和治疗。

目前，对结直肠癌基因甲基化的检测有以下两种：(1)常规的甲基化特异性PCR检测，该方法需要先提取DNA模板，再进行亚硫酸盐的转化，但亚硫酸盐等试剂的残留通常会影响PCR扩增，进而影响检测结果的判断；(2)采用荧光定量PCR的方法来对甲基化程度进行检测，该方法一般还需要设置多组平行实验，并且根据CT值来判断甲基化程度也不太精确。同时经过转化后纯化的DNA量也比较少，当需要检测多个甲基化位点时，就需要做多管的反应体系，往往检测模板就不够使用。特别是当检测模板是血浆提取的游离DNA时，有效核酸量少，为了保证准确检测甲基化程度，模板加入量就更大，一次提取的量往往难以支持多靶点的平行实验。

数字PCR作为近些年新兴的技术，也被称为“第三代PCR技术”，具有准确度高、重复性好、可绝对定量的特点。同时数字PCR将反应细分为几千至几十万个独立单元，对于一些PCR抑制剂的影响会大大减小，特别是对于甲基化特异性PCR中残留的亚硫酸盐成分有较好的抗抑制效果。但是目前在使用多引物、多探针对样本进行多基因甲基化检测时，仍旧存在因引物或探针的非特异性结合或竞争导致的检测灵敏度和特异性不高等问题。

因此，本领域亟需开发一种以高灵敏度和特异性进行结直肠癌单基因或多基因一次性检测的相关产品，且该检测产品所需有效模板量低。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及试剂盒，用以在一管扩增体系中高灵敏度和高特异性的检测多个结直肠癌相关基因的甲基化程度。本发明在具体应用时，所需有效模板量低，且操作简单，准确率高，大大降低了假阴性结果的出现。

为达到上述目的，本发明首先提供了一种用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，所述引物探针组合包括以下(1)至(4)所示的核酸序列组合中的任意一种或多种的组合：

(1)Septin 9甲基化检测的引物及探针：包括如SEQ ID NO：1所示序列的上游引物SEP-F、如SEQ ID NO：2所示序列的下游引物SEP-R，以及如SEQ ID NO：3所示序列的荧光探针SEP-P；

(2)SDC2甲基化检测的引物及探针：包括如SEQ ID NO：4所示序列的上游引物SDC-F、如SEQ ID NO：5所示序列的下游引物SDC-R，以及如SEQ ID NO：6所示序列的荧光探针SDC-P；

(3)BMP3甲基化检测的引物及探针：包括如SEQ ID NO：7所示序列的上游引物BMP-F、如SEQ ID NO：8所示序列的下游引物BMP-R，以及如SEQ ID NO：9所示序列的荧光探针BMP-P；

(4)NDRG4甲基化检测的引物及探针：包括如SEQ ID NO：10所示序列的上游引物NDRG-F、如SEQ ID NO：11所示序列的下游引物NDRG-R，以及如SEQ ID NO：12所示序列的荧光探针NDRG-P。

优选地，所述引物探针组合还包括检测内参基因ACTB的引物及探针：包括如SEQID NO：13所示序列的上游引物ACTB-F、如SEQ ID NO：14所示序列的下游引物ACTB-R，以及如SEQ ID NO：15所示序列的荧光探针ACTB-P。

优选地，所述的荧光探针SDC-P、BMP-P、NDRG-P和ACTB的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团。

优选地，所述荧光探针SDC-P、BMP-P、NDRG-P和ACTB的荧光报告基团互不干扰。

优选地，所述荧光报告基团包括FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5中的任意一种；所述淬灭基团包括BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB中的任意一种。

本发明另一方面还提供了一种结直肠癌基因甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括前面任一项所述的引物探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

优选地，所述试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.5-1μM上游引物、0.5-1μM下游引物、0.2-0.6μM荧光探针。

优选地，所述试剂盒的数字PCR反应条件如下：

本发明另一方面还提供了前面任一项所述的引物探针组合或前面任一项所述的试剂盒在制备检测结直肠癌产品中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)与常规qPCR平台的甲基化检测试剂相比，本发明提供的用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，可以根据需求自主搭配不同检测基因，且仅需一管体系就可以联合检测最多4种基因的甲基化程度，减少了上样量，也减少了操作，避免样本被过度稀释。

(2)应用本发明的引物探针组合或试剂盒、反应体系及反应条件可使检测结直肠癌基因甲基化程度的灵敏度和特异性提高，且本发明反应体系配制简单，成本低。

(3)应用本发明的引物探针或试剂盒来检测结直肠癌基因高甲基化状态可作为结直肠癌的诊断、疗效观察、预后判断等的有力手段，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1为本发明实施例2各检测体系中甲基化标准品不同通道一维图的检测效果。

图2为本发明实施例2各检测体系中非甲基化标准品不同通道一维图的检测效果。

图3为本发明实施例2各检测体系中甲基化标准品FAM-HEX二维图的检测效果。

图4为本发明实施例3对待测样本进行多基因甲基化检测的结果图；其中，

A表示各反应体系中FAM-BMP3通道一维图的检测效果；

B表示各反应体系中HEX-Septin9通道一维图的检测效果；

C表示各反应体系中ROX-SDC2通道一维图的检测效果；

D表示各反应体系中CY5-ACTB通道一维图的检测效果。

图5为本发明实施例4对待测标准品进行多基因甲基化检测的结果图；

其中，

A表示T5检测体系甲基化标品和非甲基化标品检测一维图；

B表示T6检测体系甲基化标品和非甲基化标品检测一维图；

C表示T7检测体系甲基化标品和非甲基化标品检测一维图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，以使本领域技术人员能够容易地根据本说明书的公开内容实施本发明。

本发明通过TCGA数据库筛选结直肠癌高甲基化候选基因，并设计相关候选基因的甲基化特异性检测引物和探针。得到待检测结直肠癌DNA样品后，首先采用亚硫酸氢盐修饰法对待检测结直肠癌核酸样品进行转化处理。然后结合数字PCR技术，扩增经微滴化制备的待测DNA检测体系。最后根据PCR扩增的阳性微滴数来确定待测样本中目标基因的甲基化情况，对结直肠癌提供辅助诊断。

本发明首先提供了一种用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，所述引物探针组合包括以下(1)至(4)所示的核酸序列组合中的任意一种或多种的组合：

优选地，所述的用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，还包括检测内参基因ACTB的引物及探针：包括如SEQ ID NO：13所示序列的上游引物ACTB-F、如SEQID NO：14所示序列的下游引物ACTB-R，以及如SEQ ID NO：15所示序列的荧光探针ACTB-P。

优选地，所述的荧光探针SEP-P、SDC-P、BMP-P、NDRG-P和ACTB的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团。

优选地，所述荧光探针SEP-P、SDC-P、BMP-P、NDRG-P和ACTB的荧光报告基团互不干扰，即在一个反应体系中同时存在两个及以上荧光探针时，这些荧光探针连接不同的荧光报告基团，荧光信号互不干扰，从而不会影响最终检测结果的分析与判断。

优选地，所述荧光报告基团包括FAM、VIC或HEX、ROX、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5中的任意一种；所述淬灭基团包括BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB中的任意一种。

优选地，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

优选地，所述试剂盒的数字PCR反应条件如下：

本发明所述的数字PCR法，是采用微滴PCR技术(droplet digital PCR)，通过将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴后进行PCR扩增和扩增后终点荧光检测的通用技术平台。PCR扩增反应后，根据荧光信号的类型和荧光值高低判断待测样品中的检测基因是否发生甲基化。为确定检测基因的甲基化程度，同时设置内参基因ACTB，依据公式：检测基因甲基化率＝[检测基因甲基化拷贝数/内参基因拷贝数]×100％，计算得出待测样品中检测基因的甲基化程度。

本发明实施例中无特别说明外，采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。

实施例1用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的特异性引物和探针的设计

本发明所提供的Septin 9、SDC2、BMP3、NDRG4基因甲基化的数字PCR探针和引物，是依据人Septin 9基因启动子区域、SDC2基因启动子区域、BMP3基因启动子区域、NDRG4基因启动子区域经过亚硫酸氢盐修饰后的序列，经本申请发明人反复试验和推敲获得的特异性和灵敏度均高的数字PCR探针和引物，并将设计好的引物和探针送生物技术公司合成，各组引物及探针序列如下：

(1)Septin 9甲基化检测的引物及探针：

SEP-F：5’-CGTAGGGTTCGGGTTTCGTC-3’(SEQ ID NO：1)；

SEP-R：5’-AACTACGCGTTAACCGCG-3’(SEQ ID NO：2)；

SEP-P：5’-CGTTTTTTCGTCGTTGTTTTTCGCG-3’(SEQ ID NO：3)；

(2)SDC2甲基化检测的引物及探针：

SDC-F：5’-AAGCGAGCGTTTTCGAGTTTC-3’(SEQ ID NO：4)；

SDC-R：5’-ACGAATCCGAAACAAAATACCG-3’(SEQ ID NO：5)；

SDC-P：5’-CAACGATTACGACTCAAACTCGAA-3’(SEQ ID NO：6)；

(3)BMP3甲基化检测的引物及探针：

BMP-F：5’-TTGGAAAAGGTAATCGAGC-3’(SEQ ID NO：7)；

BMP-R：5’-CTATTTTAAACGCCAAATCG-3’(SEQ ID NO：8)；

BMP-P：5’-TTCGGATCGTTGCGTATAGTTTCG-3’(SEQ ID NO：9)；

(4)NDRG4甲基化检测的引物及探针：

NDRG-F：5’-TTTGGTTGTTCGTATTTGTATTC-3’(SEQ ID NO：10)；

NDRG-R：5’-AAATACGAACGAAACAAACGCG-3’(SEQ ID NO：11)；

NDRG-P：5’-AAACGAAACTTCGACGCCGCCGAC-3’(SEQ ID NO：12)。

同时设置针对内参基因ACTB的特异性引物及探针，具体序列如下：

ACTB-F：5’-TAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3’(SEQ ID NO：13)；

ACTB-R：5’-TCTTTCCCACCAAACTATAACC-3’(SEQ ID NO：14)；

ACTB-P：5’-CCCATTAACTAAACACAACCTTATACC-3’(SEQ ID NO：15)。

其中上述探针序列的5’端修饰有互不干扰的荧光报告基团，选自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5中的任意一种；3’端标记有荧光淬灭基团，选自BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB中的任意一种。

实施例2结直肠癌基因甲基化标准品和非甲基化标准品检测验证引物探针组合效果

在数字PCR仪小海龟-青pro上使用本发明实施例1提供的引物探针组合来检测甲基化标准品和非甲基化标准品，以验证本发明提供的引物探针组合的效果。

待检测的甲基化标准品和非甲基化标准品均采购于QIAGEN的EpiTect ControlDNA and Control DNA Set，将待检测标准品在T1-T4不同检测体系下完成其数字PCR的检测，数字PCR检测体系如表1所示，配制PCR反应液的各组分及用量如表2所示。

表1实施例2数字PCR检测体系

表2实施例2数字PCR反应体系

按照表1和表2配制单基因检测待测标准品甲基化的数字PCR反应液。将上述反应液用移液器反复吹打混匀30s，瞬时离心使反应液收集于管底；然后将八连排安装于全自动样本处理系统的96孔板位，并固定。

参照小海龟数字PCR仪的通用试剂盒说明书，按照油相A：3mL，油相B：1.3mL的比例装配油相。然后将油槽板放置于全自动样品处理系统的油槽板位并固定。

取一盘数字PCR芯片放置于全自动样品处理系统的芯片位；取一盒新吸头放置于全自动样品处理系统的吸头位。然后按照小海龟-青pro的使用说明设置并运行全自动样品处理系统，仪器会自动完成数字PCR芯片的进样和液滴生成。

芯片生成结束后，将芯片转移至核酸扩增仪的扩增板上，按照表3的PCR反应条件进行热循环反应。

表3实施例2PCR反应条件

将反应完成的PCR 96孔板放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft^TM软件，按照样本量及样本布局，建立样本模块信息，设置完成后运行。数据读取完成后，自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。样本调整划分阈值，甲基化数据收集和分析显示在QuantaSoft^TM软件界面中。

对各组扩增的结果进行分析，四个不同甲基化基因分别搭配内参基因ACTB的结果显示：图1是甲基化标品的检测一维图，上方为FAM通道一维图，从左至右分别为Septin9、SDC2、BMP3、NDRG4四个基因的甲基化检测效果；下方为HEX通道一维图，显示每组的内参ACTB基因检测效果。由图1可知，甲基化标准品的FAM、HEX通道的阴阳性微滴都区分明显，甲基化检测效果较好。

图2是非甲基化标品的检测一维图，FAM通道皆无阳性微滴，HEX通道阴阳性微滴区分明显，表明参照基因检测正常且四种基因皆无甲基化，符合预期。

图3的A-D图是甲基化标品的检测二维图，四组二维图的横坐标依次是Septin9、SDC2、BMP3、NDRG4四个基因的FAM通道荧光值，横坐标是内参基因ACTB的HEX通道荧光值。由图可见，甲基化标品四种基因的检测结果准确且阴阳性微滴区分较好。

实施例3临床样品检测验证引物探针组合效果

1、样本信息：一份结直肠癌患者的粪便样本。一份粪便样本分三个重复实验，分别编号样本1、样本2和样本3。同时还包设置甲基化标准品和非甲基化标准品(QIAGEN的EpiTect Control DNA and Control DNA Set)。

2、DNA提取：从样本中提取基因组DNA。提取试剂盒为粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328)，购自天根生化科技(北京)有限公司，具体提取步骤参见试剂盒操作说明书。提取完成后，使用分光光度计检测DNA浓度。

3、硫化处理与回收：使用DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒处理上述提取出来的DNA，试剂盒购自桂林优瑞生物科技有限公司，具体操作步骤参见试剂盒操作说明书。

4、使用数字PCR仪SNIPER–DQ24进行数字PCR检测。

基于数字PCR技术，使用表4所示的检测体系分别对样本1、样本2、样本3、甲基化标准品和非甲基化标准品进行多基因甲基化的数字PCR检测，同时设置空白对照NTC(即不加模板的反应体系)，该检测体系联合检测3种甲基化基因，配制酶体系各组分及用量如表5所示。

表4实施例3多探针数字PCR检测体系

基因位点	荧光基团	淬灭基团	工作浓度(μM)
				BMP3	FAM	BHQ2	引物0.8/探针0.4
Septin9	HEX	MGB	引物0.8/探针0.4
				SDC2	ROX	MGB	引物0.8/探针0.4
ACTB	CY5	MGB	引物0.8/探针0.4

表5实施例3多探针数字PCR反应体系

组分	用量体积(μL)
		2×dPCR Master Mix(probe)	11
模板	8.8
		10×引物探针mix	2.2
无核酸酶水	0

按照表4和表5配制待测样本的多基因甲基化检测的数字PCR反应液，配制完成后将PCR反应管涡旋混匀15s后，瞬时离心。将含有前述反应体系的八连排加入SNIPER–DQ24的样本槽中，并按照SNIPER–DQ24的使用说明书依次加入芯片、芯片盖和油槽，然后关闭仪器盖，按照表6的PCR反应条件运行仪器。

表6实施例3PCR反应条件

扩增结束后，通过仪器分析软件对各组扩增的结果进行分析，各样本检测结果如图4的A-D图所示：空白对照(NTC)各个荧光通道都无阳性微滴；甲基化标准品各甲基化位点都有阳性微滴，且各通道定量结果基本一致，符合甲基化标准品特点；非甲基化标准品仅在内参基因ACTB通道有阳性微滴，其他甲基化基因对应通道无阳性微滴，符合非甲基化标准品特点。

表7实施例3的检测结果

检测结果的定量统计如表7所示。三个临床重复样本的结果中，BMP3、Septin9和SDC2基因都检出阳性微滴，其中BMP3基因计算的甲基化率为3.31％、2.49％、1.90％；Septin9基因计算的甲基化率为7.02％、9.98％、7.93％；SDC2基因计算的甲基化率为3.11％、3.00％、2.58％。由此可见，本发明提供的引物探针组合用于检测甲基化程度的效果较好，平行实验结果接近。

实施例4结直肠癌基因甲基化检测靶点的不同组合方式测试。

在数字PCR仪SNIPER–DQ24上，参照本发明实施例1提供的结直肠癌基因甲基化的特异性引物和探针，使用不同的基因组合方式来检测甲基化标准品和非甲基化标准品，以验证本发明提供的多种引物探针组合检测的效果。检测使用的甲基化标准品和非甲基化标准品均采购于QIAGEN的EpiTect Control DNA and Control DNA Set。

使用表8所示检测体系将待检测标准品在T5-T7不同检测体系下完成其数字PCR的检测。按照实施例3中表5所示的PCR反应体系配制各检测组合的扩增反应液。配制完成后将PCR反应管涡旋混匀15s后，瞬时离心。将含有前述反应体系的八连排加入SNIPER–DQ24的样本槽中，并按照SNIPER–DQ24的使用说明书依次加入芯片、芯片盖和油槽，然后关闭仪器盖，按照同实施例3中表6所示的PCR反应条件运行仪器。

表8实施例4不同组合的数字PCR检测体系

扩增结束后，通过仪器分析软件对各组扩增的结果进行分析，不同的组合方式的检测结果如图5的A-C图所示。在三种不同检测基因组合方式T5、T6、T7的检测结果中，非甲基化标品的检测结果都是仅有ACTB位点有阳性信号；甲基化标品的检测结果，四个检测位点都可以检测到阳性信号，符合标品特性。并且不同组合方式多重检测的一维图中，阴阳性微滴的区分效果都较好，都可以明显的画出阈值线并界定阴阳性微滴。

综上所述，本发明提供了一种用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，可以根据需求自主搭配不同检测基因，且仅需一管体系就可以联合检测最多4种基因的甲基化程度，且通过实验验证，应用本发明的引物探针组合或试剂盒、反应体系及反应条件可使检测结直肠癌基因甲基化程度的灵敏度和特异性提高。另外，本发明反应体系配制简单，成本低，易于医疗机构的临床推广。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 用于数字PCR 检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合及其试剂盒和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtagggttc gggtttcgtc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactacgcgt taaccgcg 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgttttttcg tcgttgtttt tcgcg 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcgagcgt tttcgagttt c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgaatccga aacaaaatac cg 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacgattac gactcaaact cgaa 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttggaaaagg taatcgagc 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctattttaaa cgccaaatcg 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcggatcgt tgcgtatagt ttcg 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttggttgtt cgtatttgta ttc 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaatacgaac gaaacaaacg cg 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacgaaact tcgacgccgc cgac 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taggaaggag gttgtttgtt tt 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctttcccac caaactataa cc 22

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cccattaact aaacacaacc ttatacc 27

Claims

1.用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括以下(1)至(4)所示的核酸序列组合中的任意一种或多种的组合：

2.如权利要求1所述的用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，其特征在于，还包括检测内参基因ACTB的引物及探针：包括如SEQ ID NO：13所示序列的上游引物ACTB-F、如SEQ ID NO：14所示序列的下游引物ACTB-R，以及如SEQ ID NO：15所示序列的荧光探针ACTB-P。

3.如权利要求2所述的用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，其特征在于，所述的荧光探针SDC-P、BMP-P、NDRG-P和ACTB的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团。

4.如权利要求3所述的用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针SDC-P、BMP-P、NDRG-P和ACTB的荧光报告基团互不干扰。

5.如权利要求4所述的用于数字PCR检测结直肠癌基因甲基化的引物探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、VIC、HEX、ROX、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5中的任意一种；所述淬灭基团包括BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB中的任意一种。

6.一种结直肠癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述的引物探针组合。

7.如权利要求6所述的结直肠癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

8.如权利要求6所述的结直肠癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.5-1μM上游引物、0.5-1μM下游引物、0.2-0.6μM荧光探针。

9.如权利6所述的结直肠癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的数字PCR反应条件如下：

10.权利要求1-5中任一项所述的引物探针组合或权利要求6-9中任一项所述的试剂盒在制备检测结直肠癌产品中的应用。