CN114829631A - 通过使用特定基因中的cpg甲基化变化来诊断肝癌的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可以通过检测选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平诊断肝癌的一种组合物、试剂盒、核酸芯片和方法。本发明能够准确和快速地诊断肝癌，也能够进行早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及可以通过检测选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平来诊断肝癌的一种组合物、试剂盒、核酸芯片和方法：FAM110A，FAR1，VIM，LDHB，LIPE，INAFM1，ATL1，CELF6，MTHFD2，PAK1，NXPE3，SLC25A36和VANGL2。
背景技术
本申请要求2019年10月14日提交的韩国专利申请号2019-0127218的优先权，其全部内容作为本申请的参考。
肝癌是全球高发癌症之一。在韩国，肝癌的死亡率非常高，每10万人中有23人死于肝癌，而在韩国人的总死亡率中，约有10％与肝炎、肝硬化和肝癌有关。肝癌很难早期诊断，因为其没有知觉症状。一般来说，由于肝癌通常是在无法正确治疗的晚期癌症阶段被发现的，治疗非常有限且预后也很差。由于肝癌的预后根据诊断时的癌症进展而有很大差异，肝癌患者的早期检测对于提高肝癌患者的生存率非常重要。
另一方面，表观遗传学是在不改变DNA碱基序列的状态下研究基因表达调控的领域。表观遗传学是研究通过表观遗传变异对基因表达的调控，如DNA甲基化、乙酰化、甲基化、磷酸化、miRNA或组蛋白的泛素化等。
其中，DNA甲基化是研究最多的表观遗传变异。表观遗传变异可导致基因功能变异和变化为肿瘤细胞。因此，DNA甲基化与细胞中疾病调节基因的表达(或抑制和诱导)有关，并且最近已经提出了通过测量DNA甲基化来诊断癌症的方法。特别是，由于癌症特异性甲基化即使在癌前组织中也提前发生，癌症特异性甲基化的检测很有可能用于癌症的诊断。
因此，有必要开发能够预测肝癌风险的有效肝癌特异性甲基化标志物。
发明公开
技术问题
因此，本发明人发现肝癌中特定基因的CpG位点呈高甲基化状态，开发了能够通过检测甲基化水平来诊断肝癌的组合物、试剂盒、核酸芯片和方法，并然后完成本发明。
本发明的一个目的是提供一种用于诊断肝癌的组合物，其包含用于测量特定基因的CpG位点的甲基化水平的制备物。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断肝癌的试剂盒，其包含用于扩增包括特定基因的CpG位点的片段的PRC引物对和用于对由所述引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物。
本发明的再一个目的是提供一种用于诊断肝癌的核酸芯片，其中固定有能够在严格条件下与包括特定基因的CpG位点的片段杂交的探针。
本发明的再一个目的是提供一种诊断肝癌的方法，包括测量和比较来自不同样品的特定基因的CpG位点的甲基化水平。
本发明的又一个目的是提供用于测量基因的CpG位点甲基化水平的制备物在制备用于诊断肝癌的制备物中的用途。
技术方案
为了实现所述目的，提供一种用于诊断肝癌的组合物，其包含用于测量选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平的制备物：FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2。
为了实现另一个目的，提供一种用于诊断肝癌的试剂盒，其包含用于扩增包括选自以下的任一或多个基因的CpG位点的片段的引物对：FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2。
为了实现再一目的，提供一种用于诊断肝癌的核酸芯片，所述核酸芯片固定有能够与包括选自以下的任一或多个基因的CpG位点的片段杂交的探针：FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2。
为了实现再一个目的，提供一种诊断肝癌的方法，包括测量来自疑似患有肝癌的患者样本的选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平：FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2；和
将测量的甲基化水平与正常对照样品中相同基因的CpG位点的甲基化水平进行比较。
为了实现又一目的，提供用于测量选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平的制备物在制备诊断肝癌的制备物中的用途：FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。以下参考文献为本领域技术人员提供了本说明书中使用的各种术语的一般定义：Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2thed.1994)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered.,1988)及Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明涉及一种用于诊断肝癌的组合物，其包含用于测量选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平的制备物：FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2。
如本文所用，术语“甲基化”是指甲基连接于构成DNA的碱基上。优选地，在本发明中，甲基化是指特定基因的特定CpG位点的胞嘧啶是否发生甲基化。当甲基化发生时，转录因子的结合受到干扰，以抑制特定基因的表达。相反，当发生未甲基化或低甲基化时，特定基因的表达会增加。
在哺乳动物细胞的基因组DNA中，除了A、C、G和T之外，还有第五个碱基，称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)，其甲基连接于胞嘧啶环的第五个碳。5-甲基胞嘧啶的甲基化仅发生在称为CpG的CG二核苷酸(5'-mCG-3')的C，以及CpG的甲基化抑制alu或转座子和基因组重复序列的表达。此外，由于CpG的5-mC自然脱氨基，很容易转化为胸腺嘧啶(T)，因此CpG是哺乳动物细胞中最常发生表观遗传变化的位点。
如本文所用，术语“甲基化水平的测量”是指测量选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平，以及甲基化水平可以根据亚硫酸氢盐处理的检测方法或无亚硫酸氢盐检测方法测量。甲基化水平可以通过甲基化特异性PCR测量，例如甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、实时甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR或定量PCR。可选地，甲基化水平可以通过自动测序例如焦磷酸测序和亚硫酸氢盐测序来测量，但不限于此。此外，甲基化水平可以使用使用10-11易位蛋白(TET蛋白)作为无亚硫酸氢盐检测方法的检测方法来测量(参见Nature Biotechnology,volume 37,pages 424-429(2019))。TET蛋白是一种作用于DNA并参与碱基化学变化的酶，以及当用亚硫酸氢盐处理时，除甲基化C外的所有C都转化为T碱基，而在Tet蛋白中，只有甲基化C转化为T以实现有效检测。
优选地，选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点是指基因的DNA上的CpG位点。基因的DNA是包括基因表达所需的并且可操作地相互连接的所有一系列结构单元的概念，并且可以包括例如启动子区域、开放读框(ORF)和终止子区域。因此，选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点存在于相应基因的启动子区域、开放读框(ORF)或终止区域。
优选地，在本发明中，测量选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2中任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平可以意味着测量下表1中所示基因的CpG位点中胞嘧啶的甲基化水平。
[表1]
在本发明中，其特征在于选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2中的任一或多个基因的CpG位点为位于距基因转录起始位点(TSS)在+/-2000个碱基(2kb)之间。
在本发明中，人基因组染色体区域的碱基序列是根据2009年2月人参考序列(GRCh37)表达的，但是人基因组染色体区域的特定序列的表达可以随着更新的基因组序列研究结果而略有改变，并且本发明的人基因组染色体区域的表达可以根据变化而变化。因此，在根据本发明的2009年2月人参考序列(GRCh37)表达的人基因组染色体区域中，由于人参考序列在本发明的申请日之后已经更新，即使人基因组染色体区域的表达被改变而与现在不同，显然本发明的范围影响改变的人基因组染色体区域。本发明所属领域的普通技术人员可以容易地看到这些变化。
在本发明中，用于测量CpG位点甲基化水平的制备物可以包括修饰胞嘧啶碱基的化合物或甲基化灵敏性限制酶，特异于选自以下的任一或多个基因的甲基化等位基因序列的引物：FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2，以及特异于未甲基化等位基因序列的引物。
所述修饰胞嘧啶碱基的化合物是修饰未甲基化胞嘧啶或甲基化胞嘧啶的化合物，以及可以是亚硫酸氢盐或其盐，优选修饰未甲基化胞嘧啶的亚硫酸氢钠，或修饰甲基化胞嘧啶的TET蛋白，但不限于此。通过修饰胞嘧啶碱基来检测CpG位点是否被甲基化的方法是本领域众所周知的(WO 01/26536；US 2003/0148326A1)。
此外，甲基化灵敏性限制酶可以是能特异性检测CpG位点甲基化的限制酶，并且可以是含有CG作为限制酶的识别位点的限制酶。其实例包括SmaI、SacII、EagI、HpaII、MspI、BssHII、BstUI、NotI等，但不限于此。取决于限制酶识别位点的C处的甲基化或未甲基化，限制酶的切割会有所不同，并且可以通过PCR或Southern印迹分析检测。除了所述限制酶之外的甲基化灵敏性限制酶在本领域中也是众所周知的。
所述引物可以包括特异于选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的甲基化等位基因序列的引物，以及特异于未甲基化的等位基因序列的引物。
在本发明中，术语“引物”是指具有短的游离3-末端羟基的核酸序列，以及能与互补模板形成碱基对并作为拷贝模板链的起点的短核酸序列。在适当的缓冲液和温度下，在存在聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)和四种不同的三磷酸核苷条件下，所述引物可以启动DNA合成。此外，所述引物是具有7至50个核苷酸序列的有义和反义核酸，并且可以掺入额外的特征而不改变用作DNA合成起始位点的引物的基本性质。
本发明的引物可以是优选根据分析甲基化的特异性CpG位点的序列设计的，以及更优选可以是选自以下的至少一个引物对：能特异性扩增未被亚硫酸氢盐修饰的甲基化的胞嘧啶的引物对，能特异性扩增被亚硫酸氢盐修饰的未甲基化的胞嘧啶的引物对，能特异性扩增被基于Tet的蛋白质修饰的甲基化的胞嘧啶的引物对，及能特异性扩增未甲基化的且未被基于Tet的蛋白质修饰的胞嘧啶的引物对。
因此，本发明提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，其包含用于扩增包括选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的片段的引物对。
在所述组合物和试剂盒中，除了所述制备物之外，还可以另外包括电泳所需的聚合酶、琼脂糖、缓冲液等。
此外，本发明提供一种用于诊断肝癌的核酸芯片，其固定有能与包括选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的片段杂交的探针。
在本发明中，术语“核酸”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其片段，单链或双链基因组或合成来源的DNA或RNA，有义或反义链的基因组或合成来源的DNA或RNA，及肽核酸(PNA)或天然或合成来源的DNA或RNA类似物材料。如果所述核酸是RNA，本领域技术人员将清楚的是，代替脱氧核苷酸A、G、C和T，分别取代核糖核苷酸A、G、C和U。
由于甲基化从基因的调控位点的外部开始并进行到其内部，可以通过检测调控位点外的甲基化来早期诊断参与细胞转化的基因。
因此，可以使用甲基化基因标记物早期诊断可能形成肝癌的细胞。当确认在癌细胞中甲基化的基因在临床或形态学上看起来正常的细胞中是甲基化的时，所述看起来正常的细胞正在癌化。因此，可以通过在看起来正常细胞中确认肝癌特异性基因的甲基化来早期诊断肝癌。
此外，本发明提供一种诊断肝癌的方法，包括测量来自疑似患有肝癌患者样本的选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平；及
将测量的甲基化水平与正常对照样品中相同基因的CpG位点的甲基化水平进行比较。
用于测量甲基化水平的方法可以选自PCR、甲基化特异性PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、使用甲基化灵敏性限制酶测量是否存在甲基化、定量PCR、DNA芯片、焦磷酸测序和亚硫酸氢盐测序，但不限于此。
具体而言，甲基化特异性PCR的方法是在用亚硫酸氢盐处理样品DNA后，根据CpG二核苷酸是否被甲基化，设计和使用不同类型的引物作为引物进行PCR的方法。如果引物结合位点已被甲基化，则使用甲基化引物进行PCR，如果引物结合位点未甲基化，则使用正常引物进行PCR。即，所述方法是用亚硫酸氢盐处理样品DNA，同时使用两种引物进行PCR，并比较结果的方法。
实时甲基化特异性PCR是将甲基化特异性PCR方法转换为实时测量方法，并通过用亚硫酸氢盐处理基因组DNA、设计与甲基化对应的PCR引物并使用这些引物来进行实时PCR。此时，有两种方法：使用与扩增的碱基序列互补的TanMan探针的检测方法，和使用Sybergreen的检测方法。因此，实时甲基化特异性PCR可以选择性地仅定量分析甲基化DNA。在这种情况下，所述方法是使用体外甲基化DNA样品制备标准曲线，并通过扩增碱基序列中没有5’-CpG-3’序列的基因一起作为用于标准化的阴性对照来定量分析甲基化水平。
在使用甲基化灵敏性限制酶测量甲基化的方法中，所述甲基化灵敏性限制酶使用CpG二核苷酸为作用位点，并且该位点被甲基化时其不作为酶起作用。因此，当将样品DNA用甲基化灵敏性限制酶处理，然后通过PCR扩增以包括酶靶位点时，所述限制酶在甲基化的情况下不起作用，而是通过PCR扩增，但未甲基化的正常位点被所述限制酶切割而不被PCR扩增，从而测量特定DNA位点是否被甲基化。
在使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR或DNA芯片方法中，当将仅与甲基化DNA特异性结合的蛋白质与DNA混合时，所述蛋白质仅与甲基化DNA特异性结合，因此可以选择性地仅分离甲基化DNA。在将基因组DNA与甲基化DNA特异性结合蛋白混合后，仅选择性分离甲基化DNA。这是使用对应于内含子位点的PCR引物扩增这些分离的DNA，以及然后通过琼脂糖电泳测量是否发生甲基化的方法。此外，甲基化可以通过定量PCR来测量，以及将通过甲基化DNA特异性结合蛋白分离的甲基化DNA用荧光染料标记，并与整合有互补探针的DNA芯片杂交以测量甲基化。在此，所述甲基化的DNA特异性结合蛋白不限于MBD2bt。
此外，亚硫酸氢盐处理的DNA的焦磷酸测序基于以下原理。当CpG二核苷酸位点发生甲基化时，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，其中修饰的碱基在用亚硫酸氢盐处理后转化为尿嘧啶。如果当从样品中提取的DNA用亚硫酸氢盐处理时CpG二核苷酸已被甲基化，则CpG二核苷酸被保留为胞嘧啶，以及剩余的未甲基化胞嘧啶则转化为尿嘧啶。亚硫酸氢盐处理的DNA的测序可以优选使用焦磷酸测序方法进行。焦磷酸测序的详细描述在现有技术中是已知的[Ronaghi et al,Science 1998Jul 17,281(5375),363-365；Ronaghi et al,AnalyticalBiochemistry 1996Nov 1,242(1),84-9；Ronaghi et al.AnalyticalBiochemistry2000Nov 15,286(2):282-288；Nyr,P.Methods Mol Biology 2007,373,114]。
另一方面，通过使用Tet蛋白的无亚硫酸氢盐检测方法，使用Tet蛋白只有甲基化C可以被转化为T以检测甲基化位点的碱基(见LIU,Yibin,et al.,Nature Biotechnologyvolume 37,pages 424).-429(2019))。
当甲基化发生在CpG二核苷酸位点从而胞嘧啶作为5-甲基胞嘧啶(5-mC)形成时，CpG二核苷酸当用10-11易位(Tet)蛋白处理时已被甲基化以转化为尿嘧啶，以及未甲基化的胞嘧啶被保留。Tet处理的DNA的测序不仅限于焦磷酸测序方法，还可以使用诸如甲基化灵敏性PCR(MSP)、微阵列和下一代测序(NGS)的方法进行。
优选地，本发明的诊断肝癌的方法可以通过特征在于包括以下步骤的方法进行：a)从对象获得样品，b)从样品中获得基因组DNA，c)用修饰未甲基化胞嘧啶碱基的化合物处理获得的基因组DNA，d)通过使用能扩增选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个CpG位点的引物通过PCR扩增处理的DNA获得PCR产物，以及e)测量所述PCR产物的甲基化水平。
步骤b)中基因组DNA的获得可以使用本领域常用的苯酚/氯仿提取法、SDS提取法(Tai et al.,Plant Mol.Biol.Reporter,8:297-303,1990)、CTAB分离法(CetylTrimethyl Ammonium Bromide；Murray et al.,Nuc)Res.,4321-4325,1980)或可商购的DNA提取试剂盒进行。
在本发明中，术语“样品”是指广泛的体液，包括从个体获得的所有生物液、体液、细胞系、组织培养物等，这取决于要进行的分析类型。从哺乳动物获得体液和组织活检的方法通常是众所周知的，并且在本发明中，所述样品可以优选选自人衍生物，包括组织、细胞、血液、血浆、血清、粪便和尿液。由于癌组织中的异常甲基化变化与得自如细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰液、脑脊液或尿液的生物样品的基因组DNA中的甲基化变化呈现显著相似性，在使用根据本发明的标志物时，对于预测肝癌发生，具有可以通过血液、体液等容易诊断的优点。
此外，本发明提供了用于测量选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平的制备物在制备用于诊断肝癌的制备物中的用途。
有利效果
如上所述，由于选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的高甲基化特别发生在肝癌中，使用本发明的组合物、试剂盒、芯片或方法可以准确及快速地肝癌以及早期诊断肝癌。
附图描述
图1是在总计33种癌症类型中确认FAM110A基因的甲基化信息的结果。
图2是在总计33种癌症类型中确认FAR1基因的甲基化信息的结果。
图3是在总计33种癌症类型中确认VIM基因的甲基化信息的结果。
图4是在总计33种癌症类型中确认LDHB基因的甲基化信息的结果。
图5是在总计33种癌症类型中确认LIPE基因的甲基化信息的结果。
图6是在总计33种癌症类型中确认INAFM1基因的甲基化信息的结果。
图7是在总计33种癌症类型中确认ATL1基因的甲基化信息的结果。
图8是在总计33种癌症类型中确认CELF6基因的甲基化信息的结果。
图9是在总计33种癌症类型中确认MTHFD2基因的甲基化信息的结果。
图10是在总计33种癌症类型中确认PAK1基因的甲基化信息的结果。
图11是在总计33种癌症类型中确认NXPE3基因的甲基化信息的结果。
图12是在总计33种癌症类型中确认SLC25A36基因的甲基化信息的结果。
图13是在总计33种癌症类型中确认VANGL2基因的甲基化信息的结果。
图14是确认根据本发明选择的总计14个基因的肝细胞癌诊断准确性的结果。
图15是确认肿瘤组织(肿瘤)细胞系组和非肿瘤组织(其它)细胞系组之间甲基化差异的结果。
图16A和16B是将肝癌组织和正常邻近组织中qMSP后FAR1、PAK1、ATL1和LIPE基因的甲基化水平呈现结果，以ΔCt+10值表示。
图17是确认作为比较实施例的GRASP基因的甲基化信息的结果。
发明模式
在下文中，将提出优选实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，以及本发明的内容不受实施例的限制。
实施例1：肝细胞癌特异性甲基化基因的筛选
为了筛选在肝细胞癌中特异性发现的甲基化基因，使用来自三个大规模甲基化微阵列芯片的数据(见表2)，对结直肠癌患者癌症手术获得的癌组织与正常组织之间的甲基化进行了大规模比较研究。本研究中使用的肿瘤组织是指肝细胞癌的癌组织，以及非肿瘤组织是指包括正常肝组织在内的除了癌组织以外的组织。
[表2]
| 数据集#1 | 数据集#2 | 数据集#3 | 总计 | |
| 肿瘤 | 66 | 37 | 377 | 480 |
| 非肿瘤 | 66 | 37 | 50 | 153 |
为了筛选肝细胞癌特异性甲基化基因，从每种组织中提取DNA，并使用Infinium人甲基化450微珠芯片微阵列确认基因区域的甲基化水平。
将从每种组织中提取的DNA通过亚硫酸氢盐处理进行转化。通过这种方式，胞嘧啶碱基根据DNA区域的甲基化进行了修饰。微阵列实验中使用的探针特别设计用于甲基化和未甲基化，以确认基因甲基化区域中的胞嘧啶碱基是否被修饰。
所述微阵列实验通过代表每个基因的甲基化区域的约450,000(450k)个探针测量基因的甲基化水平，并且来自实验的每个探针的结果以β值呈现。所述β值为0至1的值，并确定该值越接近1，则对应基因区域的甲基化水平越高。
为了鉴定肿瘤组和非肿瘤组之间的差异甲基化的区域(DMR)，通过使用经验贝叶斯(Bayes)t检验，微阵列数据线性模型(Limma)方法，鉴定了组之间具有统计学显著的甲基化差异的基因区域。
已知Limma方法在鉴定组间差异的几种甲基化统计分析方法中受异常值影响最小。因此，该方法是一种适合发现癌症特异性标志物的方法，因为该方法受某些样品异常测量值的影响较小。在实验中，确定了两组之间的甲基化存在显著差异，因为通过Limma方法得出的调整后的p值降低。
特别地，为了寻找肿瘤特异性甲基化区域，在肿瘤组和非肿瘤组之间β值差异显著的基因区域中，选择肿瘤组织中甲基化程度高于非肿瘤组织的基因区域作为癌症特异性候选生物标志物。
结果，在三个数据集中均进行的limma分析的结果是，与非肿瘤组相比，当比较肿瘤组时，选择具有组间显著较低p值及0.2或更大的较大β值差异的基因区域作为肿瘤特异性高甲基化区域。结果，在大约450,000个基因区域中，选择了所有数据集中常见的示出肿瘤特异性高甲基化的1,777个基因区域作为候选生物标志物。
实施例2：肝细胞癌特异性高甲基化基因的筛选
在实施例1中鉴定的作为生物标志物的1,777个基因区域中，鉴定并比较除肝细胞癌以外的肿瘤中的每个相应区域的甲基化水平，从而在生物标志物中找到肝癌特异性基因区域。通过分析公共癌症基因数据库The Cancer Genome Atlas(TCGA)的DNA甲基化450k阵列测试结果，确认了对应于33种癌症类型的基因区域的甲基化信息。其中，通过与肝细胞癌(称为肝癌)和其它32种癌症相比，鉴定了在肝癌中具有显著高β值的基因区域的结果，确认了在1,777个基因区域中的42个基因区域中发生肝癌特异性甲基化。
通过对肿瘤组织(肝细胞癌的癌组织)和非肿瘤组织(包括正常肝组织在内的除了癌症组织之外的组织)进行针对基因的微阵列实验，所述基因的甲基化水平如图15所示。在甲基化水平上，通过实验得出的每个探针的结果都表示为一个β值，以及β值为0至1，并且经确定β值越接近1，则对应基因区域的甲基化水平越高。
同时，在比较肝癌的肿瘤组织和非肿瘤组织时观察到甲基化差异的基因区域的情况下，甲基化可能发生在除肝癌之外的癌症中。即，肝癌特异性甲基化未被确认。
例如，磷酸肌醇1相关的支架蛋白(GRASP)基因的一般受体是其中在实施例1中鉴定的1,777个基因区域中确认肿瘤组织和非肿瘤组织之间甲基化差异最大的区域之一。然而，如图16所示，确认了在肝癌中发生了高甲基化，以及同时在包括前列腺癌、直肠癌、胃癌等多种癌症类型中也发生了高甲基化。
33种癌症类型如下：急性髓性白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，子宫内膜样癌，食道癌，胶质母细胞瘤，头颈癌，肾嫌色细胞癌，肾透明细胞癌，肾乳头状细胞癌，大B细胞淋巴瘤，肝癌，低级别胶质瘤，肺腺癌，黑色素瘤，间皮瘤，眼黑色素瘤，卵巢癌，胰腺癌，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤，前列腺癌，直肠癌，肉瘤，胃癌，睾丸癌，胸腺瘤，甲状腺癌和子宫癌肉瘤。
在这些基因区域中，当相应区域不是假基因时，存在于CpG岛位点中，位于距基因转录起始位点(TSS)+/-2000个碱基(2kb)之间的基因区域中，并且存在于常染色体中，选择相应区域作为肝细胞癌特异性高甲基化基因。结果，如下表3所示，总计选择了13个基因(见图1至13)。
[表3]
特别地，与其它癌症类型相比，FAR1(图2)、LIPE(图5)、MTHFD2(图10)和NXPE3(图12)对肝癌显示出明显的特异性高甲基化。
实施例3：确认选择的基因在细胞系中的肝癌特异性
为了确认13个选择的基因是否表现出与其它癌症不同的肝癌特异性甲基化，使用公共数据库分析了来自14个组织的1,022个癌细胞系的甲基化模式。对于相应的数据，根据制造商的标准化甲基化分析测试程序，对从每个细胞系中提取的DNA进行Infinium人甲基化450微珠芯片微阵列实验。
在进行的实验的结果值中，与实施例1一样，通过约450,000个探针测量基因的甲基化水平，并且每个探针的甲基化值以β值表示。β值为0至1的值，以及经确定β值越接近1，则对应基因区域的甲基化水平越高。
所述14个组织如下：上呼吸消化道、血液、骨骼、乳腺、消化系统、肾、肺、神经系统、胰腺、皮肤、软组织、甲状腺、泌尿生殖系统、其它组织。
为了确认14个选择的基因的肝癌特异性甲基化，将来自1,022个细胞系的甲基化数据主要分为肝癌细胞系组(n＝19)和非肝癌细胞系组(n＝1,003)。
为了鉴定两个分类组之间的差异甲基化区域(DMR)，通过使用经验贝叶斯t检验、微阵列数据线性模型(Limma)方法，鉴定了所述组之间具有统计学显著性的甲基化差异的基因区域。
[表4]选择的基因在肝癌细胞系组与非肝癌细胞系组之间的甲基化差异
| 符号 | 差异(平均△β) | 调整的p值 |
| FAM110A | 0.39 | 3.13e-06 |
| FAR1 | 0.59 | 1.94e-149 |
| VIM | 0.18 | 2.60e-06 |
| LDHB | 0.45 | 5.11e-27 |
| LIPE | 0.45 | 2.69e-46 |
| INAFM1 | 0.10 | 1.71e-01 |
| ATL1 | 0.44 | 1.26e-07 |
| CELF6 | 0.51 | 1.87e-14 |
| MTHFD2 | 0.43 | 1.34e-121 |
| PAK1 | 0.55 | 3.49e-23 |
| NXPE3 | 0.30 | 3.87e-25 |
| SLC25A36 | 0.10 | 1.91e-15 |
| VANGL2 | 0.12 | 3.57e-01 |
特别地，在FAR1、LIPE、MTHFD2和NXPE3的情况下，其在实际患者样本中与其它癌症类型相比，在肝癌中表现出明显的特异性高甲基化，即使在使用细胞系进行分析的情况下，证实了与其它癌细胞系相比，肝癌细胞系具有特异于肝癌的非常低的调整的p值。此外，确认了与其它细胞系相比，例如LDHB和PAK1的基因在肝癌细胞系中显示出明显的甲基化。
实施例4：肝癌诊断候选标记物的诊断性能评估
为了确认选择的基因作为肝细胞癌诊断标志物的有用性，评估了根据甲基化水平诊断肝细胞癌的准确性。
为了评估诊断的准确性，使用灵敏性和特异性。通过计算连续诊断测试测量值的可行截止值的灵敏性和特异性值，可以示出根据截止值呈现的灵敏性和特异性变化的接受者操作特性(ROC)曲线。诊断的准确性可以通过ROC曲线下面积(AUC)来测量。AUC值为0.5至1之间的值，以及经评估该值越高，则诊断准确性越高。如果AUC值为1，则表示诊断结果是完全准确的测试，但如果AUC值为0.5，则确定诊断结果与随机结果相同。
作为使用通过使用收集的甲基化数据集而选择的基因根据非肿瘤组织和肿瘤组织之间的甲基化水平分析癌症分类准确性的结果，如图14所示，确认所有选择的基因均具有0.860或更高的曲线下面积(AUC)值，具有诊断准确性，因此所述选择的基因可用于诊断肝细胞癌。
实施例5：选择的基因在肝癌组织中基于qMSP的甲基化的测量
在选择的13个基因中，对4个基因FAR1、PAK1、ATL1和LIPE进行了使用癌组织的额外验证测试，这些基因在非肿瘤组织和肿瘤组织之间具有较大的甲基化水平差异，以及在肿瘤组织中具有较高的平均甲基化水平。为了确认在癌组织中这四个选择的基因的肝癌特异性甲基化，使用定量甲基化特异性PCR(qMSP)技术测量在癌组织和非癌组织之间的甲基化差异。为此，从总计15名肝癌患者的一对癌组织和癌旁组织中分离出基因组DNA，从2c期到4c期每个阶段各5名患者，并用亚硫酸氢盐处理，然后根据一般的qMSP实验方法，对FAR1、PAK1、ATL1和LIPE中每个基因观测了特异性基因区域的扩增和甲基化水平。
另外，将ACTB基因用作内部对照，所述基因特异性结合被亚硫酸氢盐转化的待扩增基因区域，且与标准化相应区域的扩增值的甲基化无关。
通过PCR扩增的亚硫酸氢盐转化的DNA的甲基化水平表示为ΔCt+10，这是用作内部对照的用ACTB的循环阈值(Ct)值调整的值。ΔCt+10定义如下：
ΔCt+10＝(ACTB基因的Ct值-待检测基因的Ct值)+10
如图16A和16B所示，证实了FAR1、ATL1、PAK1和LIPE中的每个基因的甲基化在不论处于哪个阶段的结直肠癌组织中与癌邻近的正常组织相比均显示出相对高的ΔCt+10值，因此这四个基因FAR1、ATL1、PAK1和LIP在肝癌中是高甲基化的。这是实际上示出选择的基因FAR1、ATL1、PAK1和LIPE的甲基化作为用于诊断、特别是早期诊断肝癌的生物标志物是有效的结果。
结果发现，所述选择的基因甚至可以用于肝癌的诊断。
工业实用性
如上所述，由于选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的高甲基化在肝癌中特异性出现，因此通过使用本发明的组合物、试剂盒、芯片或方法可以准确且快速地肝癌以及早期诊断肝癌。
Claims (10)
1.一种用于诊断肝癌的组合物，其包含用于测量选自FAM110A、FAR1、VIM、LDHB、LIPE、INAFM1、ATL1、CELF6、MTHFD2、PAK1、NXPE3、SLC25A36和VANGL2的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平的制备物。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述CpG位点位于距所述基因的转录起始位点+/-2000个碱基(2kb)之间。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述用于测量所述基因的CpG位点的甲基化水平的制备物选自：
修饰未甲基化胞嘧啶或甲基化胞嘧啶碱基的化合物；
特异于选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化序列的引物：FAM110A，FAR1，VIM，LDHB，LIPE，INAFM1，ATL1，CELF6，MTHFD2，PAK1，NXPE3，SLC25A36和VANGL2；及
特异于未甲基化序列的引物。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述修饰未甲基化胞嘧啶碱基的化合物是亚硫酸氢盐或其盐，以及所述修饰甲基化胞嘧啶碱基的化合物是Tet蛋白。
5.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其包含用于扩增包括选自以下的任一或多个基因的CpG位点的片段的引物对：FAM110A，FAR1，VIM，LDHB，LIPE，INAFM1，ATL1，CELF6，MTHFD2，PAK1，NXPE3，SLC25A36和VANGL2。
6.一种用于诊断肝癌的核酸芯片，其固定有能与包括选自以下的任一或多个基因的CpG位点的片段杂交的探针：FAM110A，FAR1，VIM，LDHB，LIPE，INAFM1，ATL1，CELF6，MTHFD2，PAK1，NXPE3，SLC25A36和VANGL2。
7.一种用于诊断肝癌的方法，包含以下步骤：
测量来自疑似患有肝癌的患者的样品中选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平：FAM110A，FAR1，VIM，LDHB，LIPE，INAFM1，ATL1，CELF6，MTHFD2，PAK1，NXPE3，SLC25A36和VANGL2；及
将测量的甲基化水平与正常对照样品中相同基因的CpG位点的甲基化水平进行比较。
8.根据权利要求7的方法，其中所述测量甲基化水平的方法选自无亚硫酸氢盐检测方法、甲基化特异性聚合酶链反应、实时甲基化特异性聚合酶链反应、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR、焦磷酸测序和亚硫酸氢盐测序。
9.根据权利要求7的方法，其中所述样品选自组织、细胞、血液、血浆、血清、粪便和尿液。
10.用于测量选自以下的任一或多个基因的CpG位点的甲基化水平的制备物在制备用于诊断肝癌的制备物中的用途：FAM110A，FAR1，VIM，LDHB，LIPE，INAFM1，ATL1，CELF6，MTHFD2，PAK1，NXPE3，SLC25A36和VANGL2。
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