CN118147308A - 一种检测尿路上皮癌的靶标组合、探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测尿路上皮癌的靶标组合、探针组合及其应用。所述靶标组合包括染色体不稳定区域和/或基因不稳定区域；所述染色体不稳定区域包括：1q、3q、5p15.3、6p23‑p25.3、7p、7q、8q、9p、9q、13q14.11‑q14.3、17p或17q中的任意一种或至少两种的组合；所述基因不稳定区域包括：TERT和/或FGFR3。通过本发明的靶标组合、探针组合或试剂盒能够更准确地诊断尿路上皮癌，其检测尿路上皮癌的ROC曲线下面积AUC达到0.9556，能够更全面地指导尿路上皮癌的诊断和预后，为应用二代测序技术对尿路上皮癌的临床早期诊断和制定个体化治疗方案提供了科学依据。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测尿路上皮癌的靶标组合、探针组合及其应用。
背景技术
尿路上皮癌(urotheilial cancer，UC)是指发生在膀胱、输尿管、肾盂的恶性肿瘤。尿路上皮癌中最常见的是膀胱尿路上皮癌，约占尿路上皮癌患者总数的90％以上，通常所说的尿路上皮癌就是指膀胱尿路上皮癌。
染色体不稳定和基因变异通常与肿瘤相关，具体包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增以及癌症相关基因的突变。含有与肿瘤发生相关的染色体或者染色体片段的扩增和缺失经常是肿瘤发生所特有的，检测肿瘤染色体不稳定区域对于研究肿瘤发生和开发肿瘤诊断技术都至关重要。当前临床上有使用原位荧光杂交的方法对染色体上部分区域的不稳定性进行检测，但缺少尿路上皮癌患者染色体不稳定性的分布特征。
通过二代测序可以同时检测基因组上多个区域，应用于全基因组或者基因组上大量区域同时检测分析。
因此，亟需提供一种高灵敏度和高特异性的检测尿路上皮癌的靶标组合和探针组合。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测尿路上皮癌的靶标组合、探针组合及其应用，通过二代测序技术分析尿路上皮癌全基因组不稳定信息，筛选出适宜表征尿路上皮癌的14个区域，并设计了相应探针和检测试剂盒，通过本发明的靶标组合、探针组合或试剂盒能够更准确地诊断尿路上皮癌，灵敏度和特异性高，能够更全面地指导尿路上皮癌的诊断和预后，为应用二代测序技术对尿路上皮癌的临床早期诊断和制定个体化治疗方案提供了科学依据。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测尿路上皮癌的靶标组合，所述靶标组合包括染色体不稳定区域和/或基因不稳定区域；
所述染色体不稳定区域包括：1q、3q、5p15.3、6p23-p25.3、7p、7q、8q、9p、9q、13q14.11-q14.3、17p或17q中的任意一种或至少两种的组合；
所述基因不稳定区域包括：TERT和/或FGFR3。
本发明通过二代测序技术分析尿路上皮癌全基因组不稳定信息，筛选出适宜表征尿路上皮癌的14个区域，这14个区域与尿路上皮癌的发生发展高度相关，通过检测14个区域的变异用于表征尿路上皮癌。各区域表征尿路上皮癌时的变异类型分别是：1q扩增、3q扩增、5p15.3扩增、6p23-25.3扩增、7p扩增、7q扩增、8q扩增、9p缺失、9q缺失、13q14.11-q14.3缺失、17缺失、17q扩增、TERT点突变(包括C228T、CC242-243TT、C250T)、FGFR3点突变(包括p.R248C、p.S249C、p.Y375C)。同时设计了相应探针和检测试剂盒，通过本发明的靶标组合、探针组合或试剂盒能够更准确地诊断尿路上皮癌，灵敏度和特异性高，能够更全面地指导尿路上皮癌的诊断和预后，为应用二代测序技术对尿路上皮癌的临床早期诊断和制定个体化治疗方案提供了科学依据。
本发明中涉及的染色体和基因不稳定区域的编号依据本领域惯用编号规则进行限定，例如不稳定区3q在本领域惯用规则中指第3号染色体的长臂，不稳定区域7p指7号染色体短臂，染色体臂又分为不同的亚区，5p15.3是指5号染色体断臂15.3基因组区域，本领域中基因名常使用斜体表示，如FGFR3指FGFR3基因。
本发明中所述染色体不稳定包括整个染色体或者染色体片段拷贝的缺失或扩增。
本发明中所述基因不稳定包括整个基因的拷贝数的缺失或扩增。
第二方面，本发明提供第一方面所述的检测尿路上皮癌的靶标组合的检测试剂在制备检测尿路上皮癌的产品中的应用。
第三方面，本发明提供了一种检测尿路上皮癌的探针组合，所述探针的靶标包括第一方面所述的靶标组合；
所述探针的长度为60-120nt；
所述探针的GC含量为30-70％；
所述探针的退火温度不低于70℃；
所述探针的内部连续反向互补的碱基数不超过10对；
所述探针的内部连续的CG或AT重复不超过5次；
所述探针与相邻探针之间共有碱基小于30个。
根据上述探针设计要求，共设计探针2775条，覆盖本发明中14个区域：1q、3q、5p15.3、6p23-p25.3、7p、7q、8q、9p、9q、13q14.11-q14.3、17p、17q、TERT和FGFR3，部分探针序列展示如下：
SEQ ID NO.1为1q上探针，具体序列为：
CAATATCTTGACTCCTGGTTGAGTGCTTTACACTGAGCTGTCTTTTCCGAATATGAGCACAGACTTGGGGATATTAGTGTCACCTAGCGTTATTAGCTAGTATTCTCCTTTTGTTTCCCC
SEQ ID NO.2为7p上探针，具体序列为：
ATCGCAGCAGCCCAGCCTATGCAGAGGCCATAGCAGGGCTGCCCCAT CCTGCCCCATCGACCTTGCAGGCAGATGCCCCGCCTCCCTGTGAAGTGCT CTCCACCGCTCACTCCAGCCGGC。
SEQ ID NO.3为13q上探针，具体序列为：
AGTTAAATGCCAAGTGACCGTAGGTTTTATACCATAAGGATTTTGTGA GCACATCTGAGAACTACCAGTGCATAATTAAGTCAGCAAGAACATTCACTT GAGTTCATTCTAAACACCTGA。
第四方面，本发明提供了一种检测尿路上皮癌的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶标组合或第三方面所述的探针组合。
优选地，所述试剂盒还包括阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、文库接头、杂交捕获试剂、杂交捕获探针、核酸提取试剂或核酸纯化试剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述酶包括打断酶、DNA聚合酶、DNA连接酶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阳性参考品包括含有第一方面所述的靶标组合的变异细胞系；所述阴性参考品包括无染色体变异的细胞系。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的靶标组合和/或第三方面所述的探针组合在制备用于治疗或辅助治疗尿路疾病的产品中的应用。
优选地，所述尿路疾病包括尿路上皮癌。
优选地，所述尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌或尿道上皮细胞癌中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供了一种检测尿路上皮癌的装置，所述装置包括检测单元和判定单元；
所述检测单元用于执行包括：
将待测样品与第四方面所述的试剂盒中的试剂混合，混合后检测第一方面所述靶标组合；
所述判定单元用于执行包括：
根据所述检测单元的检测结果进行尿路上皮癌的筛查、诊断、治疗方案选择、监测和预后评估。
优选地，所述待测样品包括体液、组织或细胞中的任意一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明开发流程图如图1所示，通过二代测序技术分析尿路上皮癌全基因组不稳定信息，筛选出适宜表征尿路上皮癌的14个区域，并设计了相应探针和检测试剂盒，通过本发明的靶标组合、探针组合或试剂盒能够更准确地诊断尿路上皮癌，灵敏度和特异性高，能够更全面地指导尿路上皮癌的诊断和预后，为应用二代测序技术对尿路上皮癌的临床早期诊断和制定个体化治疗方案提供了科学依据。
附图说明
图1为本发明开发流程图；
图2为本发明检测方法的ROC曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
全基因组测序。
1、基因组片段化：取20ng人基因组DNA，配制如表1所示的酶切反应体系，按照表2程序进行反应。本实施例中人基因组DNA的浓度为2ng/μL，反应体系中需加入10μL。
表1
| DNA打断反应 | 体系 |
| 基因组DNA | 10μL |
| 打断酶(KAPA，kk8602) | 3μL |
| 缓冲液 | 7μL |
| 无核酸水 | 补至35μL |
振荡混匀、离心(避免气泡)后在PCR仪上运行以下程序：
表2
2、接头连接反应：将接头连接预混液(15μL/样本)、接头连接增强剂(0.5μL/样本，外购NEB公司)按照所检测的样本数目吸取适当的体积进行混合后，吸取15.5μL混合液加入到上一步的末端处理反应混合液中，振荡混匀、离心后再吸取1.5μL实施例1中制备的混合接头加入到上述反应液中，振荡混匀、离心。最终形成下表3中的反应体系。
表3
| 接头连接反应 | 体系 |
| 末端修复反应混合液(上一步) | 35μL |
| 接头连接预混液 | 15μL |
| 接头连接增强剂 | 0.5μL |
| 混合接头 | 1.5μL |
| 总体系 | 52μL |
将上述体系置于PCR仪中，运行程序：20℃，30min，热盖关闭。
3、连接反应后纯化步骤：
a、提前从磁珠试剂盒中取出文库纯化磁珠，25℃静置30min，使用前需混匀。
b、将上述步骤中的接头连接反应液转移到相应编号的1.5mL离心管，加入46μL重悬的文库纯化磁珠，匀速吸打20次，25℃孵育5min。
c、将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上层清液。
d、向其中加入新鲜配置的200μL 80％的乙醇，静置30s后，弃上层清液。
e、重复步骤d一次。
f、磁力架上取下离心管，瞬时离心3s，离心管放回磁力架上，吸弃掉残留的80％乙醇，注意不要吸到磁珠。打开管盖，25℃晾干10min。
g、待磁珠成亚光色，离心管中加入16μL Low TE缓冲液，轻微震荡使磁珠重悬，25℃孵育5min。
h、将离心管置于磁力架上，静置2min。待溶液澄清后，取15μL上清留待下一步扩增反应。
4、PCR扩增：依下表4，加入相应试剂至PCR管中：
表4
| PCR反应 | 体系 |
| 接头连接纯化后产物 | 15μL |
| PCR扩增酶预混液 | 25μL |
| PCR扩增通用引物 | 5μL |
| PCR扩增标签引物 | 5μL |
| 总体系 | 50μL |
通用引物和标签引物序列如下表5：
表5
将混合好的PCR管放入至PCR仪中，运行以下表6程序。
表6
5、PCR产物纯化参考步骤3纯化步骤，其中：
步骤b中重悬的文库纯化磁珠的用量为22.5μL；
步骤g中Low TE缓冲液加入量为31μL；
步骤h中取30μL上清留待下一步操作。
6、文库定量上机
上述纯化文库使用Agilent BioAnalyzer生物芯片分析系统对片段大小进行分析，使用dsDNAHSAssay Kit对文库质量浓度进行测量，通过质量浓度和片段大小计算文库摩尔浓度，根据上测序仪说明书使用Illumina Hiseq X-ten进行测序。
结果：按照实施例1共完成235例尿路上皮癌和132例非尿路上皮癌患者的全基因组检测，通过统计，筛选出本发明中14个染色体及基因不稳定区域，具体包括：1q、3q、5p15.3、6p23-p25.3、7p、7q、8q、9p、9q、13q14.11-q14.3、17p、17q、TERT、FGFR3。该14个靶标在尿路上皮癌中整体发生率达到91.9％，每个靶标在尿路上皮癌中发生率不低于10％。在132例非尿路上皮癌患者中，只有3例检测到上述14个靶标，整体特异性达到97.7％。
实施例2
根据本发明14个靶标设计的探针组合进行检测，探针杂交捕获试剂采购自Nanodigmbio(货号1005101，包括杂交试剂和文库洗脱试剂)。
1、文库浓缩
多文库混合杂交捕获时，具体的杂交文库混合方法如下表7：
表7
| 组分 | 加入量 | 数量 |
| 总文库 | 500ng/文库 | 10个文库 |
| 人CotDNA | 7.5μL | |
| 纯化磁珠 | 以上体积的 |
充分混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
提前取出纯化磁珠，25℃静置30min，使用前需充分混匀。
按照上表混合杂交文库，涡旋混匀，25℃孵育10min。
将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。
向其中加入加入超过纯化体系体积的新鲜配制的80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s后，弃上清。
重复上面步骤一次，即向其中加入加入超过纯化体系体积的新鲜配制的80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s后，弃上清。
吸弃掉残留的80％乙醇，注意不要吸到磁珠。将磁珠于25℃静置干燥5min，至乙醇挥发完全。
2、探针杂交捕获
按照下表8配制杂交反应混合液。
表8
| 组分 | 体积(μL) |
| 杂交试剂1 | 9.5 |
| 杂交试剂2 | 3 |
| 封闭序列 | 2 |
| 本发明探针组合 | 4.5 |
| 总体积 | 19 |
将杂交反应混合液加入离心管中涡旋至混合均匀，25℃孵育5min。
将离心管置于磁力架至液体完全澄清，移取17μL上清至新的0.2mL PCR管中放置PCR仪中启动表9杂交程序。
表9
| 温度 | 时间 |
| 热盖 | On |
| 95℃ | 30s |
| 65℃ | 16h |
| 65℃ | 保持 |
反应结束后，瞬时离心，进入下步反应。
3、文库洗脱
取出Hybrid Capture Reagents中的试剂25℃自然融解，涡旋混合均匀。
从4℃取出链霉亲和素磁珠(StreptavidinBeads)涡旋混合均匀，25℃平衡30min后方可进行链霉亲和素磁珠的清洗和捕获步骤。
按照下表10准备洗脱缓冲液(乘以反应数，并多配制10％富余量)
表10
按照下表11准备磁珠悬浮液(乘以反应数，并多配制10％富余量)。
表11
将链霉亲和素磁珠涡旋至完全混匀，吸取50μL至新的1.5mL的离心管中吸取100μL磁珠洗脱缓冲液至离心管中，轻柔吹洗混匀10次，瞬时离心后置于磁力架上数分钟待液体完全澄清移弃上清。
将离心管从磁力架移出，重复步骤上一步两次。
吸取17μL磁珠悬浮液至离心管中，轻柔吹吸混匀并将全部磁珠悬浮液转移至1个新的0.2mLPCR管中，至PCR仪中65℃5min，热盖70℃。
将重悬的链霉亲和素磁珠迅速加入至杂交反应后的杂交体系中涡旋混匀(勿将液体溅到管盖)，立即放至65℃孵育45min(期间每10min轻柔混匀一次，共4次，确保磁珠完全重悬。)
孵育结束后取下PCR管，加入100μL 65℃孵育的Wash Buffer 1，轻柔吹吸混匀含有磁珠的杂交体系。
将PCR管置于磁力架上待液体澄清后移弃上清。
将PCR管从磁力架移出，加入150μL65℃孵育的Wash Buffer 2，轻柔吹吸10次混合均匀，放置PCR仪中65℃5min，热盖70℃。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上，待液体完全澄清后移弃上清，加入150μL 25℃Wash Buffer 1，涡旋混匀，25℃孵育2min(期间涡旋30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀)。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上，待液体完全澄清后移弃上清，加入150μL 25℃Wash Buffer 3，涡旋混匀，25℃孵育2min(期间涡旋30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀)。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上3min，待液体完全澄清后移弃上清，加入150μL25℃Wash Buffer4，涡旋混匀，25℃孵育2min(期间涡旋30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀)。
将PCR管瞬时离心后置于磁力架上3min，待液体完全澄清后移弃上清，换用10μL吸头移弃残留Buffer。
将PCR管从磁力架上移出，加入20μL无核酸酶水，轻柔吹吸10次以确保混合均匀，转移至一个新的0.2mLPCR管中(包括磁珠，切勿丢弃磁珠)。
4、PCR扩增
按照下表12配制扩增体系：
表12
| 组分 | 体系(μL) |
| 带捕获DNA的磁珠 | 20 |
| DNA聚合酶 | 25 |
| i5引物 | 2.5 |
| i7引物 | 2.5 |
| 总体系 | 50 |
充分混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
将PCR管置于PCR仪中，运行如下表13程序。
表13
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a.提前取出纯化磁珠，25℃静置30min，使用前需充分混匀。
b.将PCR产物转移到相应编号的1.5mL离心管，加入60L重悬的纯化磁珠，充分混匀。25℃孵育7min。
c.将离心管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。
d.向其中加入新鲜配制的200μL 80％的乙醇，静置30s，弃上清。
e.重复步骤d一次。
f.吸弃掉上层残留的80％乙醇，注意不要吸到磁珠。打开管盖，25℃晾干。
g.待磁珠成哑光色，离心管中加入30μL无核酸酶水，充分使磁珠重悬，25℃孵育7min。注：磁珠不可过度干燥。
h.将离心管置于磁力架上，静置。待溶液澄清后，取28μL上清至新的离心管中。
5、文库定量上机
上述纯化文库使用Agilent BioAnalyzer生物芯片分析系统对片段大小进行分析，使用dsDNAHSAssay Kit对文库质量浓度进行测量，通过质量浓度和片段大小计算文库摩尔浓度，根据上测序仪说明书使用Illumina Hiseq X-ten进行测序。
结果：按照实施例2对实施例1筛选的14个区域表征尿路上皮癌的性能进一步验证，验证组共完成320例尿路上皮癌和210例非尿路上皮癌患者的检测，通过统计，295例尿路上皮癌患者检出染色体和基因变异，其灵敏度达到92.2％；210例非尿路上皮癌患者中，只有6例检测到上述14个靶标，整体特异性达到97.1％。验证数据的ROC曲线(图2)的AUC面积达到0.9556，充分说明本发明中14个区域可以很好的用于尿路上皮癌的诊断。
综上所述，本发明通过二代测序技术分析尿路上皮癌全基因组不稳定信息，筛选出适宜表征尿路上皮癌的14个区域，并设计了相应探针和检测试剂盒，通过本发明的靶标组合、探针组合或试剂盒能够更准确地诊断尿路上皮癌，灵敏度和特异性高，能够更全面地指导尿路上皮癌的诊断和预后，为应用二代测序技术对尿路上皮癌的临床早期诊断和制定个体化治疗方案提供了科学依据。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种检测尿路上皮癌的靶标组合，其特征在于，所述靶标组合包括染色体不稳定区域和/或基因不稳定区域；
所述染色体不稳定区域包括：1q、3q、5p15.3、6p23-p25.3、7p、7q、8q、9p、9q、13q14.11-q14.3、17p或17q中的任意一种或至少两种的组合；
所述基因不稳定区域包括：TERT和/或FGFR3。
2.权利要求1所述的检测尿路上皮癌的靶标组合的检测试剂在制备检测尿路上皮癌的产品中的应用。
3.一种检测尿路上皮癌的探针组合，其特征在于，所述探针的靶标包括权利要求1所述的靶标组合；
所述探针的长度为60-120nt；
所述探针的GC含量为30-70％；
所述探针的退火温度不低于70℃；
所述探针的内部连续反向互补的碱基数不超过10对；
所述探针的内部连续的CG或AT重复不超过5次；
所述探针与相邻探针之间共有碱基小于30个。
4.一种检测尿路上皮癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的靶标组合或权利要求3所述的探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性参考品、阴性参考品、缓冲液、酶、文库接头、杂交捕获试剂、杂交捕获探针、核酸提取试剂或核酸纯化试剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述酶包括打断酶、DNA聚合酶、DNA连接酶中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性参考品包括含有权利要求1所述的靶标组合的变异的细胞系；所述阴性参考品包括无染色体变异的细胞系。
7.权利要求1所述的靶标组合和/或权利要求3所述的探针组合在制备用于治疗或辅助治疗尿路疾病的产品中的应用。
8.根据权利要求所述的应用，其特征在于，所述尿路疾病包括尿路上皮癌。
9.根据权利要求所述的应用，其特征在于，所述尿路上皮癌包括：肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌或尿道上皮细胞癌中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种检测尿路上皮癌的装置，其特征在于，所述装置包括检测单元和判定单元；
所述检测单元用于执行包括：
将待测样品与权利要求4-6中任一项所述的试剂盒中的试剂混合，混合后检测权利要求1所述靶标组合；
所述判定单元用于执行包括：
根据所述检测单元的检测结果进行尿路上皮癌的筛查、诊断、治疗方案选择、监测和预后评估。
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