CN112159844A

CN112159844A - 结直肠癌dna甲基化的检测方法及试剂

Info

Publication number: CN112159844A
Application number: CN202010453011.0A
Authority: CN
Inventors: 丁春明; 金胜男; 朱德雯; 栾菊
Original assignee: Zhejiang Zhongchuang Biomedical Co ltd
Current assignee: Zhejiang Zhongchuang Biomedical Co ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN112159844B; CN115516110A; WO2021237896A1

Abstract

本发明涉及结直肠癌DNA甲基化的检测方法及试剂。具体地，本发明涉及通过检测来自所述受试者的样本中的游离DNA中的甲基化标志物以判断所述DNA的甲基化水平来诊断受试者中是否存在肠癌、判断患有肠癌的受试者术后的预后、预测患有肠癌的受试者术后复发或评估对患有肠癌的受试者的治疗效果的方法。本发明还涉及用于所述方法的标志物、试剂盒和检测试剂。

Description

结直肠癌DNA甲基化的检测方法及试剂

技术领域

本发明涉及医学诊断领域，具体设计结直肠癌的早期诊断、预后、疗效评估等。并且还涉及用于所述诊断、预后和疗效评估的试剂盒以及试剂。

背景技术

结直肠癌是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一。据统计2018年结直肠癌新发患者约180万例，死亡人数约86万^[1]。在我国结直肠癌发病率和死亡率均居于肿瘤类第5位[^2]。但是近年来以美国为代表的发达国家的整体结直肠癌发病率已经开始下降^[3]，而我国结直肠癌发病人数和死亡人数呈上升趋势^[2]，这一增长变化值得关注并深入分析。一方面，高脂饮食、吸烟和酗酒等生活方式都可能会增加罹患结直肠癌的风险，因此I级预防能发挥35％的作用以减少癌症的发生。另外，九成以上的结直肠癌患者年龄超过50岁，他们经常忽视病变的早期症状，包括粪便带血或排便习惯的变化，导致确诊时肿瘤已发展至晚期，而晚期结直肠癌患者五年生存率不足15％，远低于早期患者的生存率。分析表明，在降低结直肠癌发病率上，美国通过开展结直肠癌早期筛查的II级预防发挥了53％的作用，而临床治疗发挥了12％的作用^[3]。

研究证实结直肠癌的发生是由一系列遗传和表观遗传学变异共同作用产生的^[4]，包括抑癌基因的功能丧失缺陷，癌基因的功能获得缺陷等，这些变异会赋予细胞选择性生长优势，被认为是“驱动”事件，并推动细胞克隆增殖向恶性肿瘤发展。典型的散发性结直肠癌可能仅包含2-8个驱动基因变异，其余为基因组不稳定和随机事件导致的“乘客”基因缺陷，这使得每位患者的肿瘤在遗传和表观遗传学上都是独特的，这一点也是目前精准医疗考虑的重要因素。根据这些分子特征可将结直肠癌分为不同的亚型，它们之间呈现不同的表型和预后特征^[5，6]。其中，在表观遗传学中研究较为深入的是DNA甲基化，具体机制是在基因组中通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移甲基基团到CpG二核苷酸胞嘧啶的5位碳原子上，使其变为5-甲基胞嘧啶^[7]。DNA甲基化可能导致相关基因(包括肿瘤抑制基因)的转录抑制和表达沉默。DNA异常甲基化在肿瘤形成过程中频繁发生，相对于基因突变等遗传学变异，其具有发生于肿瘤早期，范围广、变异模式多样等特点，因此可作为诊断、预后评估、个体化治疗等方面的肿瘤分子标志物^[8]。

患者的生存率和肿瘤发现的早晚相关，早发现是提高结直肠癌患者生存率和治愈率的关键。近几十年间，美国结直肠癌的发病率和死亡率总体呈下降趋势，主要归功于筛查的普及，目前美国结直肠癌筛查率达到60％；而我国由于筛查并未广泛开展，结直肠癌的早期诊断比例远低于欧美发达国家。现在临床可用的结直肠癌筛查方法包括粪便隐血实验(FOBT)、粪便免疫化学法检测(FIT)、结肠镜、Cologuard和EpiProcolon等，但这些方法各自有其优缺点，例如粪便隐血实验是一种非侵入性的检测方法，且操作简易，价格低廉，但敏感性较低，结果易受患者饮食、药物等因素影响；结肠镜检查是金标准，可检测整个肠道发生的病变并进行治疗，但此方法对肠道准备要求高，具有侵入性，存在出血、穿孔等胃肠道不良事件风险，患者依从性不高且许多地区无法广泛^[9]。因此，开发一种无创的、较为灵敏和特异的筛查方法是目前的研究热点。

当前对于结直肠癌患者的治疗手段主要为手术及术后辅助化疗。然而，对于初始治疗结束时认为已治愈的结直肠癌患者，在肿瘤切除后仍存在35％的复发率，其中80％出现于切除后2年内^[10]，复发转移往往较迟被发现。此外，高危的患者(如III期结直肠癌患者)在手术治疗后需要继续接受化疗以降低复发和转移的风险^[11，12]，但并非所有的病人都可以获益。临床上常规用于术后残留灶评估和指导治疗的指标是依据T、N、M系统对肿瘤进行分类，即肿瘤浸润深度(T)，淋巴结转移与否(N)，存在远处转移与否(M)。然而使用TNM分期对于部分II期和III期患者能提供的预测信息相对较弱。另外，在完成明确的治疗后，临床建议进行随访监测以尽早发现复发转移然后及时治疗，但是实际上许多复发事件发现较晚^[13]，并且只有10％-20％的异时转移得到治愈^[14]。目前常用的监测方法包括CT、内镜下活检等^[15]，这些方法具有辐射性、侵入性、缺乏敏感性等缺点。癌胚抗原(CEA)是目前唯一推荐用于结直肠癌监测和预测的血液标志物^[15]，但是其敏感性较低^[16]。因此，寻找非侵入性和高灵敏度的预后标志物，进行术后残留灶检测和准确的预后评估可以提供早期有效的治疗，对于改善患者生存至关重要。

术前新辅助放化疗是结直肠癌综合治疗的重要部分^[17]，通过不同层次的治疗，目的在于提高手术切除率，提高保肛率，有望改善患者的无疾病生存率。在临床实践中，接受新辅助放化疗的局部进展期直肠癌患者，部分患者肿瘤退缩效果好，其预后也明显改善，但也有部分患者肿瘤退缩效果不明显，且承受了不必要的放化疗不良反应和手术延迟。目前，尚未有明确指标能预测放化疗敏感性。同时，放化疗后判断是否达到完全缓解也是一大难题，通过影像学、肠镜、肿瘤标志物及体格检查等手段的判断存在较大误差。在个体化治疗的背景下，如何筛选合适的患者制定合理的新辅助治疗方案及进行疗效评估有重要意义。

随着分子生物学技术的不断发展，以检测血液中循环肿瘤细胞和游离核酸作为分子诊断标志物的液体活检技术得以实现且日益受到关注。在结直肠癌筛查方面，液态活检与肠镜、FIT等方法相比，兼具无创、简单经济、灵敏度高等特点，患者依从性更好，易于在人群中推广以提高普查率。在结直肠癌诊断、评估预后疗效、动态监测方面，相对于诊断“金标准”组织活检方法，液态活检可以更全面地反映肿瘤特性、克服肿瘤异质性，无创且可进行多次取样，能及时监测肿瘤的动态变化及对治疗的敏感性；而已有的血液蛋白类肿瘤标志物易受身体内环境影响，稳定性较差，且半衰期长，准确性受限，影像学检查手段灵敏度不够，往往在肿瘤发展至晚期才能分辨。因此液态活检在肿瘤的筛查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效以及高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值，可以使结直肠癌患者得到及时合理的诊治，改善预后生存，临床意义重大^{[18，19，20]}。外周血中存在细胞裂解释放的游离DNA(cfDNA，Cell-free DNA)，而cfDNA中包含的循环肿瘤DNA(ctDNA，Circulatingtumor DNA)是指肿瘤细胞产生的释放入外周血的DNA片段，ctDNA半衰期短，且携带有基因突变、拷贝数异常和甲基化等信息，多项研究表明可用于结直肠癌肿瘤的筛查诊断、术后残留灶检测、复发监测、预后评估等^[21]。

现有的Epi proColon检测产品是目前首个也是唯一获FDA批准的结直肠癌血液筛检产品。Epi proColon检测方法基于HeavyMethyl real-time PCR技术^[22，23]，可同时在一个QPCR反应中检测1个目的基因SEPTIN9和1个内参基因ACTB。对血浆提取cfDNA进行亚硫酸氢盐转化(Bisulfite Conversion)，然后在QPCR反应体系中加入根据SEPTIN9基因和内参基因ACTB设计的引物和探针以扩增转化后的cfDNA。其中目的基因SEPTIN9和内参基因ACTB的探针分别选用两种不同荧光信号进行标记，此外加入一种不可延伸的寡核苷酸blocker，blocker可结合至转化后的SEPTIN9基因非甲基化序列，并且结合位点与引物结合位点重叠，抑制非甲基化DNA的扩增。最后进行结果判读时分为三步：①根据同步处理的阴阳性对照样本结果判断反应的有效性；②通过内参基因的信号强度判断单个PCR反应中模板DNA的质量是否合格；③综合3个PCR重复的结果判读此待测样本的甲基化情况。

该技术存在以下缺点：

1)只检测了一个SEPTIN9基因的靶标，敏感性较低，阳性检出率较低，在实际的无症状人群筛查中显示结直肠癌检测的总体敏感性为48.2％，特异性为91.5％，其中I-IV期结直肠癌检测敏感性分别为35.0％、63.0％、46.0％、77.4％^[24]。

2)要确保反应中blocker特异地结合于非甲基化序列，否则可能会产生假阳性或假阴性结果。

3)临床应用有限。目前此方法仅应用于临床结直肠癌的辅助诊断和筛查，对于术后残留灶检测、预后评估、复发监测等方面未进行大规模临床实验评估。已有的一项研究将SEPTIN9测定用于结直肠癌患者随访过程中的复发检测，在复发患者中检测敏感性为71.4％(15/21)^[25]；另一项研究显示在4位结直肠癌复发患者中仅有1位患者SEPTIN9测定检测结果为阳性^[26]，假阴性问题严重。

4)检测结果为定性结果，由于单个标志物浓度低，虽然使用荧光定量PCR方法，但是结果只能定性解读，难以对血浆中ctDNA的量进行动态变化的检测，导致难以对肿瘤负荷等进行动态定量评估。

GRAIL公司目前正开发基于血液的“泛癌症”早期检测方法，首先通过对大量参与者的血液和组织样本进行全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)，建立了泛癌种甲基化数据库，结合机器学习的算法筛选出最终作为泛癌种筛查靶向甲基化测定的panel，包含了>100000甲基化区域^[29]。随后利用此靶向甲基化panel对参与者血浆进行检测，结果显示，该检测方法对12种特定癌症(包含所有分期)的特异性达到99.3％(假阳性率≤1％)，总检出率(灵敏度)为54.9％(95％CI：51.0％-58.8％)。在结直肠癌患者中，特异性为99.4％时，I期检出率约40-50％，II期检出率约60-70％，III期约70％，IV期约80-90％^[29]。

该技术存在以下缺点：

1)此方法基于全基因组甲基化测序，成本非常高，数据分析非常复杂，在临床推广性价比极差，不符合癌症筛查的卫生经济学。

2)此方法为泛癌种检测方法，对于单独的结直肠癌来讲，目前检测的敏感性低。

因此，本领域仍然需要能够对的甲基化标志物进行定量分析，从而早期检测结直肠癌的方法。

发明内容

本发明通过对血液中多个DNA甲基化标志物的检测来实现结直肠癌(CRC，Colorectal Cancer)的检测筛查、新辅助放化疗疗效评估、术后预后、术后残留灶检测、动态随访、复发和转移早发现等。研究过程中针对结直肠癌的多个特异性甲基化区域共设计了4种血液检测panel，主要检测方法为多重定量甲基化特异性PCR(mqMSP，multiplexquantitative methylation-specific PCR)，先后入组了多种类型临床血液样本，包括结直肠癌、进展性腺瘤、肠息肉、健康对照、无症状志愿者、食管癌、肺癌等，通过检测临床血液样本验证了本发明的可行性和实用性。另外开发了核酸飞行质谱检测技术，可同时对多个甲基化标志物分别进行定量分析，有助于血浆ctDNA的定量检测。

本发明利用DNA甲基化组学技术结合文献数据库，筛选了多个甲基化标志物。通过收集入组105个组织和血液样本(30例结直肠癌病人的癌组织和配对的正常组织、15例非进展性腺瘤组织、15例进展性腺瘤病组织、15例健康志愿者的血液样本)，进行文库构建和亚硫酸氢盐测序，根据测序结果和已有的文献、数据库进行生物信息学统计分析，筛选出包括ATP8B2、LONRF2、FGF12、CHST10、ELOVL2、HSPA1A等多个结直肠癌特异的甲基化标志物。

本发明利用qPCR技术，设计了定量检测技术，对多个标志物进行了总量测定。首先根据筛选出的多个结直肠癌特异的甲基化标志物分别设计qMSP引物和探针，然后对单个标志物测定和多重PCR反应条件进行逐步优化，得到一种灵敏且稳定的荧光定量检测方法，可在单管反应中对多个标志物进行总量测定，从而表现多个标志物的总体甲基化水平。

本发明利用核酸飞行质谱技术，同时对多个标志物进行了分别定量。本发明将甲基化敏感的限制性内切酶、real-competitive技术、单碱基延伸反应和核酸飞行质谱技术相结合，首先使用甲基化敏感的限制性内切酶对样本DNA进行处理，根据甲基化标志物所在区域设计测定引物和延伸引物，每个反应体系可包含10-20个测定，之后在PCR反应中引入与目标DNA相竞争的竞争物(competitor)DNA，竞争物拷贝数已知。最后根据目标DNA与竞争物的比值可以计算出目标DNA的拷贝数，从而实现对标志物的定量，可辅助高通量测序技术用于肿瘤标志物的验证，也可定量分析血浆ctDNA。

具体地，本发明涉及以下方面：

一方面，本发明涉及诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果的方法，包括检测来自所述受试者的样本中的游离DNA中的甲基化标志物以判断所述DNA的甲基化水平，如果所述甲基化水平高于正常对照样本的DNA甲基化水平，则确定所述受试者中存在结直肠癌、患有结直肠癌的受试者术后的预后不佳、患有结直肠癌的受试者术后容易复发或对所述受试者的治疗效果不佳，所述甲基化标志物是选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。

在该方面的一些实施方案中，所述甲基化标志物的检测是使用多重定量甲基化特异性PCR进行的，并且所述甲基化标志物是：

1)选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11和MBSR16中的一种或多种；

2)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4和QKI的一种或多种二

3)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、NDRG4、QKI、RD1和RD2的一种或多种二或

4)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种；

任选地，所述多重定量甲基化特异性PCR中包括内参基因ACTB的测定。

在该方面的一些实施方案中，所述多重定量甲基化特异性PCR使用针对上文所述甲基化标志物的引物和探针，以及针对内参基因ACTB的引物和探针，其中所述引物和探针包含如表4所示的序列。

在该方面的一些实施方案中，当甲基化标志物是选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种时，多重定量甲基化特异性PCR中不使用RD2_F引物。

在该方面的一些实施方案中，所述甲基化标志物的检测是使用多重定量甲基化特异性PCR进行的，在所述多重定量甲基化特异性PCR中，将甲基化标志物分为两组或更多组，针对每组标志物以及内参基因的探针各自使用不同的荧光标记。

在该方面的一些实施方案中，将甲基化标志物分为两组，第1组由MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、NPY和QKI组成，并且第2组由MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8和MBSR9组成，并且使用内参基因ACTB，其中针对第1组标志物的引物和探针包含如表5所示的序列，针对第2组标志物的引物和探针包含如表6所示的序列，并且针对内参基因ACTB的引物和探针包含如表7所示的序列。

在该方面的一些实施方案中，所述甲基化标志物的检测是使用核酸飞行质谱法进行的，并且所述甲基化标志物是选自RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5的一种或多种，任选地，所述核酸飞行质谱法包括内参基因ACTB的测定。

在该方面的一些实施方案中，所述核酸飞行质谱法使用针对所述甲基化标志物和内参基因的PCR引物和延伸引物并且同时扩增拷贝数已知的甲基化标志物的竞争物序列，根据甲基化标志物与竞争物的比值计算出甲基化标志物的拷贝数，其中针对甲基化标志物和内参基因的PCR引物包含如表9所示的序列，针对甲基化标志物和内参基因的延伸引物包含如表10所示的序列，甲基化标志物和内参基因的竞争物序列包含如表11所示的序列。

在该方面的一些实施方案中，所述样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。

另一方面，本发明涉及用于诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果的甲基化标志物，所述标志物选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。

在该方面的一些实施方案中，所述标志物选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、MBSF8、MBSR13、RD1、RD2、NPY、NDRG4、QKI、RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5。

另一方面，本发明涉及用于诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果的试剂盒，其中包含用于检测甲基化标志物的试剂，所述甲基化标志物是选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。

在该方面的一些实施方案中，所述甲基化标志物是选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、MBSF8、MBSR13、RD1、RD2、NPY、NDRG4、QKI的一种或多种，并且任选地，所述试剂盒包含用于检测内参基因ACTB的试剂。

在该方面的一些实施方案中，所述检测甲基化标志物和内参基因的试剂包含如表4所示的序列。

在该方面的一些实施方案中，所述甲基化标志物是选自RRB 10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5的一种或多种，并且任选地，所述试剂盒包含用于检测内参基因ACTB的试剂。

在该方面的一些实施方案中，所述检测甲基化标志物和内参基因的试剂包含如表9、表10和表11所示的序列。

在该方面的一些实施方案中，所述甲基化标志物是：

2)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4和QKI的一种或多种二

4)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种。

另一方面，本发明涉及多核苷酸，其包含选自SEQ ID NOs：1、2和9-120的核苷酸序列。

在本发明的各个方面中，所用的引物、探针和竞争物序列不限于上文所述表格和序列编号所列那些，而是包括了与其具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少99％同一性，并且仍然保持其功能的那些序列。其中，优选的是3′端的10个连续核苷酸与本发明的引物序列有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％同一性的序列。本领域技术人员可以通过常规程序确定序列同一性。

另一方面，本发明涉及用于检测甲基化标志物的试剂在制备用于诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果的试剂盒中的用途，所述甲基化标志物是选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。

在该方面的一些实施方案中，所述诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果是通过上文所述的本发明方法进行的。

附图说明

图1.通过RRBS方法筛选的候选基因在不同类型样本中的甲基化水平聚类分析。横轴为每个区域所在基因组位置，纵轴为样本类型。

图2.RRBS数据中候选基因在肿瘤组织和正常组织中的甲基化水平。横轴为候选标志物编号，纵轴为甲基化水平(Meth％)。图中白色箱线图表示正常组织(N)，灰色箱线图表示肿瘤组织(T)。

图3.内参测定测试的扩增曲线图。FAM表示甲基化标志物荧光信号，VIC表示内参基因荧光信号。

图4.mqMSP方法的特异性评估。Bis-CRC表示经亚硫酸氢盐处理的肿瘤组织DNA，Bis-BC表示经亚硫酸氢盐处理的血沉棕黄层DNA，BC表示未经亚硫酸氢盐处理的血沉棕黄层DNA，NTC表示不加入模板的空白对照。图5.mqMSP方法的灵敏度评估。0-1％指示不同甲基化水平样本中的甲基化标志物荧光信号，VIC表示内参基因荧光信号。

图6.单一甲基化标志物和多个甲基化标志物联合检测的灵敏度比较。

图7.V2测定建立过程中对非特异性信号检测的扩增曲线图。目标1表示甲基化标志物荧光信号，目标2表示内参基因荧光信号。

附图8.双荧光法对多个DNA甲基化标志物进行定量的扩增曲线图。目标1表示甲基化标志物荧光信号，目标2表示内参基因荧光信号。

图9.三荧光法对多个DNA甲基化标志物进行定量的扩增曲线图。目标1、目标2表示甲基化标志物荧光信号，目标3表示内参基因荧光信号。

图10.核酸飞行质谱法对多个DNA甲基化标志物进行定量。上图为甲基化标志物RRB14在不同样本中的质谱峰图，下图为甲基化标志物RRB17_1在不同样本中的质谱峰图。E-T1表示酶切的肿瘤组织DNA，E-N1表示酶切的正常组织DNA，E-B1表示酶切的血沉棕黄层DNA；M-T1表示未酶切的肿瘤组织DNA，M-N1表示未酶切的正常组织DNA，M-B1表示未酶切的血沉棕黄层DNA。三角形标记延伸引物的峰位置，箭头标记竞争物延伸产物所在峰位置，与之紧邻的为样本DNA延伸产物所在峰位置。

图11.一个阳性样本和一个阴性样本的血浆甲基化检测结果。FAM标示甲基化标志物荧光信号，VIC标示内参基因荧光信号。

图12.V1测定在各组别间的血浆甲基化水平及变化趋势。横坐标CRC表示肠癌，AA表示进展性腺瘤，“息肉”表示肠息肉，“正常”表示正常对照；纵坐标表示甲基化水平。

图13.V1测定在不同分期结直肠癌样本中的血浆甲基化水平及变化趋势。横坐标表示肠癌不同分期，纵坐标表示甲基化水平。

图14.V1测定的ROC曲线分析结果。

图15.V2测定在各组别间的血浆甲基化水平及变化趋势。CRC表示结直肠癌，AA表示进展性腺瘤，“息肉”表示肠息肉，“正常”表示正常对照，“志愿者”表示无症状志愿者；纵坐标表示甲基化水平。

图16.V2测定在不同分期结直肠癌样本中的血浆甲基化水平及变化趋势。

图17.V2测定的ROC曲线分析结果。

图18.V4测定在各组别间的血浆甲基化水平及变化趋势。CRC表示结直肠癌，AA表示进展性腺瘤，“息肉”表示肠息肉，GI表示胃肠道炎症，ESCC表示食管癌，“肺”表示肺癌，“正常”表示正常对照；纵坐标表示甲基化水平。

图19.V4测定在不同分期结直肠癌样本中的血浆甲基化水平及变化趋势。横坐标表示肠癌不同分期，纵坐标表示甲基化水平。

图20.V4测定的ROC曲线分析结果。

图21.77位结直肠癌患者术后ctDNA RFS生存曲线。

图22.复发和未复发结直肠癌患者术前与术后ctDNA比较。

图23.复发结直肠癌患者术后ctDNA RFS生存曲线。

图24.复发结直肠癌患者术后ctDNA定量分析结果。

图25.结直肠癌患者随访血ctDNA RFS生存曲线。

图26.新辅助治疗结直肠癌患者治疗、随访过程中的血浆ctDNA动态变化情况。

具体实施方式

本发明筛选和验证了多个结直肠癌肿瘤特异的DNA甲基化标志物，可用于样本的检测。

建立了特异性标志物的多重检测方法1(mqMSP方法)，可以同时检测多个DNA甲基化标志物，且可以有多种不同的组合方法和数据分析算法，检测标志物组合的总体甲基化水平。纳入组合中的标志物需遵循一定的原则，首先保证不能在血沉棕黄层样本中存在背景信号，在肿瘤样本中甲基化水平显著高于正常样本，并且不同标志物在多个不同样本之间最好具有互补性，标志物测定之间不能互相干扰产生非特异性信号，据此确保组合测定用于ctDNA检测的特异性和敏感性。

采用三种或者更多荧光通道的mqMSP方法，其中一种荧光用于内参信号检测，其它荧光信号可以对DNA甲基化标志物进行分组(2组或者更多)检测，对各组荧光信号利用特定算法进行组合，可以用于动态监测ctDNA量上的变化。

建立了特异性标志物多重检测方法2(核酸飞行质谱方法)，可以同步定量检测每个DNA甲基化标志物，并用于ctDNA分析。

临床用途1：建立了多个不同组合的mqMSP方法可用于结直肠癌筛查(4个测定形式)，标志物包括SEPTIN9、NDRG4、QKI基因的多个区域的不同组合，样本检测结果阳性提示受试者可能存在结直肠癌变。

临床用途2：建立的mqMSP检测方法可用于结直肠癌术后判断预后，标志物包括SEPTIN9、NDRG4、QKI基因的多个区域的不同组合，样本检测结果阳性提示受试者结直肠癌可能预后不良。

临床用途3：建立的mqMSP方法可用于结直肠癌病人术后监测和复发预测，标志物包括SEPTIN9、NDRG4、QKI基因的多个区域的不同组合，样本检测结果阳性提示受试者可能存在疾病复发进展的情况。

临床用途4：建立的mqMSP方法可用于结直肠癌病人新辅助治疗疗效、术后评估、术后监测等全覆盖动态监测，标志物包括SEPTIN9、NDRG4、QKI基因的多个区域的不同组合，样本检测结果阳性提示受试者接受新辅助治疗效果可能不理想，需要进一步综合评估。

本发明筛选验证了多个肿瘤特异的DNA甲基化标志物，包括SEPTIN9、NDRG4、QKI、ATP8B2、LONRF2、FGF12等，其中有些标志物目前并未有相关文献报道支持可用于结直肠癌的检测，如ATP8B2、HSPA1A等，这些标志物有待被进一步发掘用于结直肠癌的临床诊疗。

本发明运用多个DNA甲基化标志物联合检测，与单一标志物检测方法如EpiproColon相比，提高了检测的灵敏度，对于早期结直肠癌患者可提升阳性检出率，减少漏诊情况，从而达到早期筛查的目的。在对包括结直肠癌、腺瘤、息肉、正常等样本在内的多个队列中进行了验证，显示在I期结直肠癌中其检出率约42-74.4％，II期结直肠癌中其检出率约74.1-84.2％，优于目前的检测方法Epi proColon。

利用本发明的标志物和检测方法，不仅可用于临床结直肠癌的筛查，也有希望用于病人的预后评估、术后监测、检测复发转移、新辅助治疗疗效的评估，拓展了临床应用。在86位结直肠癌随访患者队列中进行了验证，结果显示术前ctDNA阳性率为89.5％(其中I期患者阳性率为80％，II期为90％，III期为90.9％，IV期为85.7％)；在对20位复发患者的术后ctDNA检测中，其中11位患者术后ctDNA阳性，9位患者术后ctDNA阴性，而仅有4位CEA检测为阳性，根据每位患者的复发情况和术后ctDNA状态绘制生存曲线，显示术后ctDNA为阳性结果的患者其无复发生存期比ctDNA阴性的患者明显缩短(P＝0.008)，说明本方法检测灵敏度高于现有的临床肿瘤标志物CEA，在结直肠癌的预后评估和复发监测方面有应用前景。另外对一位接受新辅助治疗的直肠癌患者进行了全程动态监测，在接受新辅助治疗前ctDNA检测结果为阳性，新辅助治疗结束后ctDNA结果转阴，随后患者进行了肿瘤切除术，术前、术后以及随访过程的ctDNA检测结果均为阴性，患者预后较好，影像学检查也未发现复发进展，说明此方法在结直肠癌的新辅助治疗疗效评估方面有应用前景。

利用本发明的检测方法，每个样本的检测成本约80元，较为经济。

本发明利用核酸飞行质谱技术，同时结合甲基化敏感的限制性内切酶、real-competitive PCR技术优化的设计方案，对ATP8B2、LONRF2、FGF12、CHST10、ELOVL2、HSPA1A等在内的多个DNA甲基化标志物分别进行了定量，该方案可在同一个反应体系中实现10-20个标志物的同时分别定量，评估它们在同一样本中的甲基化水平差异，可用于实际研究中肿瘤标志物的验证以及临床上样本ctDNA的检测。

此外，本发明设计的用于QPCR反应的引物和探针也可以用于ddPCR平台的检测。所选标志物也可能适用于其它消化道肿瘤如食管癌、胃癌等的检测。

实施例一

结直肠癌特异的DNA甲基化标志物筛选

1.实验方法

(1)基于RRBS高通量甲基化测序技术筛选结直肠癌特异的DNA甲基化标志物。具体操作如下：于温州医科大学附属第一医院收集入组I期和II期的结直肠癌病例各15例(组织样本包括癌组织及配对正常组织共60例)，非进展性腺瘤和进展性腺瘤病例各15例(良性肿块组织共30例)，健康志愿者的血液样本15例。

(2)提取上述105例样本的基因组DNA，Qubit测定浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA完整性。

(3)样本DNA文库制备及测序：首先利用MspI限制性内切酶消化基因组DNA以富集CpG片段；然后进行DNA末端修复，产物纯化；加A尾，产物纯化；衔接子(adapter)连接，连接产物纯化；接下来通过胶回收筛选衔接子连接后的大小为190-320bp的DNA文库；胶回收得到的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；PCR扩增文库并纯化。文库构建完成后，取1μL构建好的甲基化文库通过Agilent Bioanalyzer 2100检测其文库插入片段的大小，待符合预期结果后，使用实时荧光定量检测系统对文库的有效浓度进行准确定量。然后将质检合格的文库样本，通过Illumina Hiseq X Ten测序平台进行高通量、高深度的测序。

(4)测序数据分析：

A.第一次筛选条件如下：

1)测序深度满足Depth≥10，同时满足，病例数，血沉棕黄层(buffy coat)≥5例，正常组织≥10例，非进展性腺瘤≥5例，进展性腺瘤≥5例，癌组织≥10例；

2)对筛选出的每个位点进行秩和检验，挑选p≤0.05的位点；

3)基因组平均甲基化的背景为Avg(BC)≤2％，正常组织平均甲基化的背景为Avg(N)≤10％，正常组织与癌组织平均甲基化差值为Avg(T)-Avg(N)≥15％为条件筛选CpG位点，以连续CpG间距不超过150bp划定区域，且每个区域中至少包含3个CpG。此时一共得到1666个差异甲基化区域，2792,068个CpG位点；

再与TCGA甲基化数据库(450K)的33种肿瘤数据比对后，除掉两者无法匹配的区域后，得到两者共有的区域一共614个；之后将所选出的614个区域左右各延伸500bp，得到了1450个CpG位点和553个差异甲基化区域。

B.在第一次筛选结果的基础上，结合TCGA数据库，进一步设置条件如下：

1)RRBS数据：Avg(T)-Avg(N)≥15％；

2)TCGA数据库：READ_N≤15％；COAD_N≤15％；LIHC_N≤10％；LIHC_T≤10％；STAD_N≤15％；ESCA_N≤15％；

一共得到33个特异性较好的候选甲基化区域(分析结果见图1和图2)

C.得到的候选基因分析总结如下表1所示：

表1候选甲基化区域

2.实验结果

根据上述测序数据分析同时结合文献^[30-33]和相关数据库查阅，筛选出包括ATP8B2、LONRF2、FGF12、CHST10、ELOVL2、HSPA1A等多个结直肠癌特异的甲基化标志物，这些标志物在结直肠癌样本中的甲基化水平显著高于其它类型样本。(见图1和图2)

筛选的甲基化标志物如下表2所示：

表2本发明筛选得到的甲基化标志物所在基因及其染色位置

实施例二

内参测定的设计和测试

针对ACTB基因设计内参测定，可在mqMSP反应中与多个甲基化基因测定同时扩增，用以作为质控，反映样本DNA的质量。本技术的创新点为在内参测定的PCR引物序列中引入一个突变碱基，可保证在mqMSP反应中适当降低内参荧光信号(VIC荧光信号)，同时能减少对待测甲基化标志物信号(FAM荧光信号)的抑制。实验过程如下：

1.实验方法

(1)针对ACTB基因区域(chr7：5536826-5536901(hg38))设计了7种不同的PCR引物组合，包括野生型引物序列和引入突变碱基的引物序列，探针用VIC荧光基团标记。

测试的7种内参测定的引物命名及序列如下：下划线标记引入的突变碱基

内参测定探针命名及序列如下：

(2)选用1个亚硫酸氢盐转化后的血沉棕黄层DNA(Bis-BC)、1个未转化的血沉棕黄层DNA(BC)进行QPCR测试，每个反应使用10ng DNA，无模板对照(NTC)作为空白对照。

(3)将这7种内参测定分别加入包含多个甲基化标志物的V1测定(FAM荧光基团标记)，在同一反应中分别测试Bis-BC、BC、NTC样本。

每个QPCR反应体系配制如下：

(4)使用Bio-rad CFX96 QPCR仪，反应条件设置如下：

Channel	FAM/VIC
		聚合酶活化	95℃下3min
变性	95℃下3s
		退火	60℃下30s
延伸	72℃下30s
		循环数	45个循环

(5)QPCR数据采集和结果分析，选择最佳内参测定。

2.实验结果

见图3，显示了7种组合的检测扩增曲线，对应结果总结如下：

根据上述结果，理想的内参测定一方面自身不能在BC、NTC样本中产生非特异的信号，另一方面需保证在Bis-BC样本中产生合适的荧光信号来反映输入DNA的质量，同时不能减弱甲基化基因的FAM荧光信号强度，也不能干扰甲基化基因测定使其在Bis-BC、BC、NTC样本中产生非特异的FAM信号。因此满足上述条件的最佳内参测定为组合1，

即正向引物3’端倒数第2个碱基由T突变为A，反向引物序列保持不变的组合。

内参测定引物、探针命名及序列如下：下划线标记引入的突变碱基

实施例三

质控品的设置

设置阴阳性质控品用于mqMSP反应的质量控制，质控品与每批次cfDNA样本同时处理检测，通过阴阳性质控品的实验结果可以提示该产品的该次实验是否成功以及可信度有多少。

阳性质控品为HCT15肠癌细胞株DNA和人血沉棕黄层DNA按照1：99混合的DNA。阴性质控品为人血沉棕黄层DNA。每次反应分别取20ng作为参考样本用于实验有效性的评估。

1.实验方法

(1)提取HCT15肠癌细胞株和人血沉棕黄层基因组DNA，经Qubit测定浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA完整性。

(2)阳性质控品的准备：取5ng HCT15DNA，加入495ng血沉棕黄层DNA，加水补足成50μL体系，浓度为10ng/μL，将DNA分装储存于-80℃，每次反应取20ng。

(3)阴性质控品的准备：取500ng血沉棕黄层DNA，同样将浓度稀释为10ng/μL，DNA分装储存于-80℃，每次反应取20ng。

(4)每批样本在亚硫酸氢盐处理及QPCR检测时需对阳性质控品和阴性质控品进行相同处理。每份亚硫酸氢盐转化后的DNA一分为二，在QPCR中作双份反应，反应循环数为45个循环，反应结束后统计双份反应FAM信号和VIC信号的Cq值。

2.实验结果

针对不同测定形式，检测结果的标准和算法如下表：其中“+”代表Cq值≤45，“-”代表无扩增信号，其中ΔCq＝VIC_平均Cq-FAM_平均Cq。

如果质控品的QPCR反应结果满足下表中所列标准，该QPCR反应被验证为是有效的。

对于V1测定反应：

对于V2/V3/V4测定反应：

质控品检测结果	FAM Cq	VIC Cq
			有效的阳性对照	FAM(+/+)	VIC(+/+)
有效的阴性对照	FAM(-/-)	VIC(+/+)

实施例四

四种形式的标志物组合方式(V1、V2、V3、V4)的测试设计

根据核酸飞行质谱实验对SEPTIN9基因多个区域的检测结果分析，筛选出17个候选甲基化区域，设计相应的qMSP引物(见下表3)。

表3标志物对应的染色体位置总结：

对应基因	标志物名称	标志物所在染色体位置
			SEPTIN9	MBSF9	chr17：77373456-77373518
SEPTIN9	MBSF10	chr17：77373564-77373617
			SEPTIN9	MBSF15	chr17：77373973-77374049
SEPTIN9	MBSR5	chr17：77373985-77374054
			SEPTIN9	MBSR6	chr17：77373914-77373986
SEPTIN9	MBSR7	chr17：77373843-77373898
			SEPTIN9	MBSR8	chr17：77373747-77373824
SEPTIN9	MBSR9	chr17：77373691-77373745
			SEPTIN9	MBSR11	chr17：77373520-77373600
SEPTIN9	MBSR16	chr17：77373100-77373185
			SEPTIN9	MBSF8	chr17：77373359-77373422
SEPTIN9	MBSR13	chr17：77373361-77373438
			SEPTIN9	RD1	chr17：77373438-77373528
SEPTIN9	RD2	chr17：77373384-77373452
			NDRG4	NDRG4	chr16：58463491-58463554
QKI	QKI	chr6：163415625-163415707
			NPY	NPY	chr7：24284105-24284197
ACTB	ACTB	chr7：5536826-5536901

在多个样本中分别测试了各候选DNA甲基化标志物，分析了多种可能的标志物组合方式(V1、V2、V3、V4测定)(见下文实施例五-九)。建立了mqMSP方法，其检测灵敏度是单个标志物的10倍，并制定了相应的数据分析算法。纳入组合中的标志物需遵循一定的原则：首先保证不能在血沉棕黄层样本中存在背景信号；在肿瘤样本中甲基化水平显著高于正常样本；并且不同标志物在多个不同样本之间最好具有互补性，据此确保组合测定的特异性和敏感性；另外组合后的多个测定之间不能互相干扰产生非特异性信号，这些标志物在多个样本的qMSP测试和cfDNA mqMSP产物测序结果中也得到了验证。此外，根据荧光通道数目，可以做到3类或者更多类标志物。下文(实施例十一)也将分别展示双荧光法和三荧光法的设计，三荧光法中荧光1、2用于阳性标志物，荧光3用于质控标志物。

表4. 4个形式的所有测定(包括内参ACTB测定)中使用的引物和探针命名以及序列(下划线标记引入的突变碱基)。

实施例五

V1测定的特异性和灵敏度评估

根据纳入组合的标志物需遵循的原则，选择10个标志物(MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16)设计MGB探针，然后将这些组合成1个多重测定。

多重测定中添加ACTB内参测定作为质控，并优化最佳反应条件提高测定的灵敏度，因此得到Vl测定组合，包括：MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、ACTB。

1.实验方法

(1)选取结直肠癌肿瘤组织、配对正常组织、血沉棕黄层样本，提取基因组DNA并进行亚硫酸氢盐转化。

(2)使用的标志物为：MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、ACTB，各标志物的引物和探针序列见实施例四中的总表。

(3)QPCR引物和探针混合液准备：

各引物初始浓度为200μM，按照如下比例混合：

V1测定甲基化标志物引物成分	体积
		MBSF9上下游引物	各10μL
MBSF10上下游引物	各10μL
		MBSF15上下游引物	各10μL
MBSR5上下游引物	各10μL
		MBSR6上下游引物	各10μL
MBSR7上下游引物	各10μL
		MBSR8上下游引物	各10μL
MBSR9上下游引物	各10μL
		MBSR11上下游引物	各10μL
MBSR16上下游引物	各10μL
		去酶水	200μL

内参基因引物成分	体积
		ACTB上下游引物	各10μL
去酶水	380μL

各探针初始浓度为100μM，按照如下比例混合：

内参基因探针成分	体积
		ACTB探针	10μL
去酶水	190μL

(4)QPCR反应体系如下：

QPCR反应条件如下：

(3)方法的特异性评估：通过本方法在不加入模板的空白对照、未经亚硫酸氢盐处理的血沉棕黄层DNA(BC)、经亚硫酸氢盐处理的血沉棕黄层DNA(Bis-BC)、经亚硫酸氢盐处理的肿瘤组织DNA(Bis-CRC)中进行测试，每种样本均加40ng于mqMSP反应中。结果见图4。

(4)方法的灵敏度评估：将亚硫酸氢盐转化后的癌组织DNA(作为甲基化样品)和亚硫酸氢盐修饰后的血沉棕黄层DNA(作为未甲基化样品)按照不同比例混合(1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％)，模拟甲基化程度不同的样本，每种样本均加10ng于mqMSP反应中。

(结果见图5)

2.实验结果

(1)见图4，在不加入模板的空白对照、未经亚硫酸氢盐处理的血沉棕黄层DNA及经亚硫酸氢盐处理的血沉棕黄层DNA，均未产生任何信号，只在经亚硫酸氢盐处理的癌组织DNA中才产生明显特异性信号，并在多组不同样本中得到验证，说明此方法特异性较好。

对应结果如下：

(2)见图5，扩增曲线中Cq值随甲基化程度的降低而增大，扩增曲线显示不同甲基化程度(1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0％)的样品荧光信号从左到右依次分开排列，可区分开来。最左侧FAM信号最强的曲线为1％甲基化样品，最右侧FAM信号最弱的曲线为0％甲基化样品，结果提示本方法可以检测甲基化程度低至0.05％的样品。

对应结果如下：

样品	FAM Cq	VIC Cq
			1％	32.78	35.50
1％	32.40	36.00
			1％	32.04	35.56
0.5％	34.50	35.69
			0.5％	34.52	35.90
0.5％	34.08	35.84
			0.2％	34.72	36.02
0.2％	N/A	36.01
			0.2％	34.51	35.58
0.1％	36.04	35.86
			0.1％	36.51	35.98
0.1％	36.98	35.94
			0.1％	39.25	35.99
0.05％	39.23	36.17
			0.05％	38.55	36.12
0.05％	35.71	35.92
			0.05％	36.88	35.88
0％	NA	36.08
			0％	NA	36.07
0％	NA	36.11

实施例六

单一甲基化标志物和多个甲基化标志物联合检测的灵敏度比较

1.实验方法

(1)单一甲基化标志物检测方法的引物和探针序列如下：

甲基化基因测定的引物和探针：

内参基因测定的引物和探针：下划线标示引入的突变碱基

反应体系如下：

成分	初始浓度	体积
			KAPA探针FAST qPCR主混合物	2×	12.5μL
MBSF9引物混合物	5μM	1.25μL
			MBSF9探针	5μM	0.5μL
ACTB引物混合物	5μM	0.3μL
			ACTB探针	5μM	0.25μL
待测DNA样本	/	10μL
			去酶水	/	定容至25μL

反应条件如下：

(2)多个甲基化标志物联合检测方法见上述实施例五描述的mqMSP方法(V1测定方法)。

(3)将亚硫酸氢盐转化后的癌组织DNA和亚硫酸氢盐转化后的血沉棕黄层DNA(作为未甲基化样品)按照1％比例混合，总DNA量为10ng，同一样本分别用两种方法进行检测比较。

2.实验结果

见图6，同一样本在两种方法的检测结果中相差约3-4个Cq，多个甲基化标志物联合检测较单一甲基化标志物检测信号更强，说明多个甲基化标志物联合检测的灵敏度大概是单一标志物检测的10倍。

实施例七

V2测定方法的建立和测试

由于不同标志物组合建立的方法可能具有不同的检测效果，在V1测定的测试基础上，为了摸索灵敏度和特异性更佳的方法，我们设计并建立了V2测定，主要流程如下述：

(1)根据文献报道和课题组数据筛选多个候选甲基化标志物，包括SEPTIN9、NDRG4、QKI、NPY等，针对每个区域设计相应的qMSP引物和MGB探针。

(2)然后在多种类型样本DNA(多个肿瘤组织、正常组织、血沉棕黄层样本)中通过QPCR探针法分别测试每个候选甲基化标志物。

(3)分析每个标志物测定在不同样本中的结果，根据纳入组合的标志物需遵循的原则进行相应组合，选择MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、NPY、QKI组合为1个多重测定，将这些标志物均用FAM荧光基团标记，加入的内参ACTB使用VIC荧光基团标记，然后选用不同类型样本cfDNA(结直肠癌、息肉、腺瘤、健康人)和质控样本进行mqMSP测试。

(4)由于上述组合在健康对照、阴性对照、空白对照样本中出现假阳性信号，选择空白对照样本测试不同组合测定观察信号强度变化，以剔除组合中产生非特异性信号的测定。

(5)去除产生非特异信号的NPY测定后，最终得到V2测定组合，包括：MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4、QKI、ACTB。

具体过程如下：

1.实验方法

(1)根据文献报道和课题组数据筛选多个候选基因甲基化标志物，包括SEPTIN9、NDRG4、QKI、NPY等，针对每个区域设计相应的qMSP引物和MGB探针。

(2)提取肿瘤组织DNA(T)、正常组织DNA(N)、血沉棕黄层DNA(B)，各取1μg用于亚硫酸氢盐转化处理。

(3)在肿瘤组织DNA(T)、正常组织DNA(N)、血沉棕黄层DNA(B)样本中使用QPCR探针法对每个测定进行测试，反应体系和反应条件同V1测定(实施例五)。

(4)综合上一步结果，根据纳入组合标准选择MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、NPY、QKI组合为1个多重测定，将这些标志物均用FAM荧光基团标记，加入的内参ACTB使用VIC荧光基团标记，然后选用不同类型样本cfDNA(结直肠癌、息肉、腺瘤、健康人)和质控样本进行mqMSP测试。

(5)根据上一步检测结果，由于在健康对照、阴性对照、空白对照样本中均出现假阳性信号，因此接下来需要剔除组合中产生非特异性信号的测定，选择NTC(无模板对照)观察信号强度变化，按照以下组合测试：

(6)根据上一步检测结果，认为非特异性信号主要来自NPY，同时比较了去除NPY的测定和未去除NPY的测定的敏感性，使用1％Meth DNA样本测试，两者敏感性相差不大。

(7)因此去除NPY测定后，最终得到V2测定组合，包括的测定为：MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4、QKI、ACTB，各测定序列见实施例四的总表。

(8)V2测定QPCR引物和探针混合液准备：

各引物初始浓度为200μM，按照如下比例混合：

V2测定甲基化基因引物成分	体积
		MBSF9上下游引物	各10uL
MBSR8上下游引物	各10uL
		MBSR13上下游引物	各10uL
MBSR16上下游引物	各10uL
		NDRG4上下游引物	各10uL
QKI上下游引物	各10uL
		去酶水	40uL

内参基因引物成分	体积
		ACTB上下游引物	各10μL
去酶水	380μL

各探针初始浓度为100μM，按照如下比例混合：

内参基因探针成分	体积
		ACTB探针	10μL
去酶水	190μL

(9)反应体系如下：

反应条件如下：

2.实验结果

(1)在多种类型样本DNA(多个肿瘤组织-T、正常组织-N、血沉棕黄层样本-B)中分别测试每个候选甲基化标志物，部分标志物的结果总结如下：其中样本P表示甲基化程度100％的阳性对照DNA样本，ΔCq＝VIC_平均Cq-FAM_平均Cq，表示甲基化水平。

肿瘤组织样本测试结果如下表：

正常组织样本测试结果：

血沉棕黄层样本测试结果：

	RD1	RD2	MBSF8	MBSR13	NDRG4	QKI	MBSF9	MBSR16
									样本编号	ΔCq	ΔCq	ΔCq	ΔCq	ΔCq	ΔCq	ΔCq	ΔCq
P	2.25	1.50	/	/	/	/	7.12	5.45
									B1	/	/	-11.29	-11.55	-11.51	-11.14	-11.11	-10.71
B2	/	/	-11.60	-11.80	-1.85	-11.48	-11.36	-11.43
									B3	/	/	-11.75	-11.82	-4.09	-11.42	-11.55	-11.22
B4	/	/	-11.60	-11.71	-6.17	-11.26	-11.38	-11.07
									B5	-10.14	-10.17	/	/	/	-9.63	-10.46	-10.27
B6	/	/	-10.88	-10.96	-10.91	-10.74	-10.63	-10.50
									B7	/	/	-11.51	-11.81	-4.81	-3.21	-11.28	-11.16
B8	/	/	-11.22	-11.48	-11.27	-11.07	-11.14	-10.79
									B9	/	/	-11.58	-12.10	-4.72	-11.54	-11.38	-11.36
B10	/	/	-11.80	-11.94	-11.77	-11.60	-11.49	-11.34
									B11	-11.84	-11.82	-11.96	-12.23	-12.11	-11.81	-11.94	-11.73
B12	-5.89	-11.62	/	/	-4.75	-11.61	-11.64	-11.70
									B13	-5.90	-11.68	/	/	-11.76	-11.72	-11.75	-11.75
B14	-11.59	-11.65	/	/	-7.09	-11.75	-11.42	-11.40
									B15	-11.45	-11.48	/	/	-5.15	-11.61	-11.34	-11.27
B16	-11.71	-11.95	/	/	-5.68	-11.99	-11.92	-11.70
									B17	-11.74	-11.67	/	/	-4.27	-3.56	-11.88	-11.64
B18	-11.77	-11.72	/	/	-6.97	-11.98	-11.84	-11.86
									B19	-11.63	-11.62	/	/	-4.57	-11.83	-11.62	-11.62
B20	/	/	/	/	-11.71	-11.62	-11.73	-11.63

(2)综合考虑上述结果，根据纳入组合标准选择7个标志物：MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、NPY、QKI组合为1个多重测定，它们在血沉棕黄层样本中背景信号较低，在肿瘤样本中甲基化水平显著高于正常样本，并且在多个不同肿瘤样本之间具有一定互补性，将这些标志物均用FAM荧光基团标记，内参ACTB使用VIC荧光基团标记，然后选用不同类型样本血浆cfDNA(结直肠癌、息肉、腺瘤、健康人)和质控样本进行mqMSP测试，结果如下：(失败的组合检测结果)

(3)上述结果显示健康对照、阴性对照、空白对照均出现假阳性信号，因此接下来为了剔除组合中产生非特异性信号的测定，选择NTC(无模板对照)观察信号强度变化，按照以下组合测试：

检测的的扩增曲线见图7，对应结果如下：

根据上述测试结果，图7中可看出组合2背景信号最低，由于组合2中剔除了NPY，因此认为非特异性信号主要来自NPY。

(4)接下来同时比较去除NPY的测定和未去除NPY的测定的敏感性，使用1％MethDNA，两者敏感性相差不大，结果如下：

由此得到V2测定组合为MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4、QKI、ACTB。

实施例八

V3测定方法的建立和测试

由于不同标志物组合建立的方法可能具有不同的检测效果，在V2测定测试基础上，为了摸索灵敏度和特异性更佳的方法，我们设计并建立了V3测定，主要流程如下述：

(1)根据文献报道和课题组数据筛选多个候选甲基化标志物，包括SEPTIN9、NDRG4、QKI、NPY、SDC2等，针对每个区域设计相应的qMSP引物和MGB探针。

(2)参照V2测定方法分析各uniplex测定在不同类型样本(多个肿瘤组织、正常组织、血沉棕黄层样本)中的测试结果。

(3)根据纳入组合标准组成V3测定，包括：MBSF9、MBSF8、MBSR13、NDRG4、QKI、RD1、RD2、ACTB，各测定序列见实施例四中的总表。

反应体系、反应条件：同V2测定方法。

(4)测试组合V测定的敏感性和特异性。

具体过程如下：

1.实验方法

(2)参照V2测定方法分析每个标志物测定在不同类型样本(多个肿瘤组织-T、正常组织-N、血沉棕黄层样本-B)中的测试结果。

(3)根据纳入组合标准组成V3测定，包括：MBSF9、MBSF8、MBSR13、NDRG4、QKI、RD1、RD2、ACTB，各测定的引物和探针序列见实施例四中的总表。

(4)V3测定QPCR引物和探针混合液准备：

各引物初始浓度为200μM，按照如下比例混合：

V3测定甲基化基因引物成分	体积
		MBSF9上下游引物	各10uL
MBSR8上下游引物	各10uL
		MBSR13上下游引物	各10uL
NDRG4上下游引物	各10uL
		QKI上下游引物	各10uL
RD1上下游引物	各10uL
		RD2上下游引物	各10uL
去酶水	20uL

内参基因引物成分	体积
		ACTB上下游引物	各10μL
去酶水	380μL

各探针初始浓度为100μM，按照如下比例混合：

V3测定甲基化基因探针成分	体积
		MBSF9探针	10uL
MBSR8探针	10uL
		MBSR13探针	10uL
NDRG4探针	10uL
		QKI探针	10uL
RD1探针	10uL
		RD2探针	10uL
去酶水	30uL

内参基因探针成分	体积
		ACTB探针	10μL
去酶水	190μL

(5)反应体系如下：

反应条件如下：

(6)使用1％、0.5％、0.2％、0％Meth DNA测试组合测定的敏感性，10ng DNA/反应。

(7)使用8个血沉棕黄层DNA(610B、624B、630B、642B、646B、662B、671B、625B)测试组合测定的特异性，25ng DNA/反应。

2.实验结果

(1)敏感性测试结果如下：

可见在不同甲基化程度的DNA样品中，1％Meth DNA甲基化程度最高，对应的甲基化基因荧光信号(FAM平均Cq)也最强，即FAM平均Cq值最小，0.5％、0.2％Meth DNA的甲基化基因荧光信号依次减弱，0％Meth DNA未产生甲基化信号，说明本方法可以检测甲基化程度低至0.2％的样品，敏感性较好。

(2)特异性测试结果如下：

由于血沉棕黄层DNA(buffy coat DNA)为未发生甲基化或者甲基化程度较低的DNA样本，相应的甲基化基因荧光信号(FAM平均Cq)理论上应不存在或者较弱，通过此方法检测多个不同人的血沉棕黄层DNA样本，可见除了610B、624B样本外，其余样本甲基化信号均较弱，说明本方法可以较为特异的区分癌组织DNA和血沉棕黄层DNA样本。

实施例九

V4测定方法的建立和测试

由于不同标志物组合建立的方法可能具有不同的检测效果，在V3测定的测试基础上，为了摸索灵敏度和特异性更佳的方法，我们设计并建立了V4测定，主要流程如下述：

(1)在上述V3测定的基础上，去除其中的NDRG4测定组合成新的多重测定，得到V4测定，包括：MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1、RD2(其中去掉RD2_F引物)、ACTB，各测定序列见实施例四中的总表。

反应体系、反应条件：同V2测定方法。

(2)测试V4测定的特异性和敏感性。

具体过程如下：

1.实验方法

(1)根据V3测定的测试结果，血沉棕黄层DNA中出现假阳性信号，因此去除其中的NDRG4测定组合成新的多重测定，得到V4测定，包括：MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1、RD2(其中去掉RD2_F引物)、ACTB，各测定序列见实施例四中的总表。

(2)V4测定QPCR引物和探针混合液准备：

各引物初始浓度为200μM，按照如下比例混合：

V4测定甲基化基因引物成分	体积
		MBSF9上下游引物	各10uL
MBSR8上下游引物	各10uL
		MBSR13上下游引物	各10uL
QKI上下游引物	各10uL
		RD1上下游引物	各10uL
RD2下游引物	10uL
		去酶水	50uL

内参基因引物成分	体积
		ACTB上下游引物	各10μL
去酶水	380μL

各探针初始浓度为100μM，按照如下比例混合：

(3)反应体系如下：

反应条件如下：

(4)使用8个血沉棕黄层DNA(610B、624B、630B、642B、646B、662B、671B、625B)测试组合测定的特异性，25ng DNA/反应。

(5)使用10个肿瘤DNA混合物(10个I-II期结直肠癌肿瘤组织DNA和健康人血沉棕黄层DNA分别按照1∶9混合，甲基化程度为0.1％-0.8％)测试组合测定的敏感性，10ng DNA/反应。

2.实验结果

(1)特异性测试结果如下：

由于血沉棕黄层DNA为未发生甲基化或者甲基化程度较低的DNA样本，相应的甲基化基因荧光信号(FAM平均Cq)理论上应不存在或者较弱，通过此方法检测多个不同人的血沉棕黄层DNA样本，可见所有样本甲基化信号均不存在或者极弱，说明本方法可以较为特异的区分癌组织DNA和血沉棕黄层DNA样本。

(2)敏感性测试结果如下：

可见在不同甲基化程度(0.1％-0.8％)的肿瘤DNA混合物中，所有样本均能稳定检测到明显的甲基化基因荧光信号(FAM平均Cq)，说明本方法可以检测到甲基化程度低至0.1％的样品，敏感性较好。

实施例十

cfDNA mqMSP产物扩增子测序

1.实验方法

(1)为了分析V1/V2测定中每个测定在不同类型cfDNA样本mqMSP反应中的扩增效果和信号差异，我们共挑选了83个不同类型的样本mqMSP产物样本进行建库测序，其中包括的样本类型有：M.Sssi酶处理的血沉棕黄层DNA(100％甲基化DNA对照)、1％Meth DNA、结直肠癌cfDNA、进展性腺瘤cfDNA、良性息肉cfDNA、健康人cfDNA、志愿者cfDNA。经V2测定测试的产物样本有28个，经V1测定检测的产物样本有55个。

83个样本情况如下：

(2)mqMSP产物文库构建和测序：使用Zymo Oligo Clean&Concentrator试剂盒对上述样本mqMSP产物进行纯化，纯化后DNA取1μL经Qubit定量；剩余DNA进行T4PNK磷酸化反应，然后磷酸化产物加入衔接子和T4DNA Ligase进行连接反应；连接产物使用ZymoOligoClean&Concentrator试剂盒进行纯化，纯化后的DNA经Qubit定量以及Agilent 2100bioanalyzer检测；然后将文库混样送二代测序。

(3)测序数据比对分析。

2.实验结果

测序数据分析处理：首先统计样本产物中包括V1/V2测定的所有扩增子内每个CpG位点的depth(记作N)，若某位点未测到则记作N＝1，然后计算以2为底N的对数x，即x＝log₂N，最后取扩增子内所有位点x的均值X代表此扩增子的整体水平。X即为下述表格中经过处理得到的数值，可以表示各标志物在mqMSP反应中经有效扩增的信号大小，反映样本中此标志物所在区域的甲基化水平，颜色深浅可视化地表现数值大小，颜色越深表示信号越强，甲基化水平越高。表格中每一行表示一个测定扩增子在不同样本中的数值，每一列表示一个样本对应的所有测定扩增子的数值。

此处我们选取部分样本结果进行解释说明：

(1)对于V1测定中各甲基化标志物的分析如下：结果显示，在结直肠癌样本中，MBSR5、MBSR6、MBSR7这几个测定在大部分结直肠癌患者中检测信号较强，大约覆盖70％以上的患者(假定以大于14作为评判测定最优的标准)；但仍有部分患者未被覆盖，这部分样本可由其它标志物作为互补发挥作用，例如对于22号和26号结直肠癌患者样本，MBSF10标志物可以起到互补作用，在17号结直肠癌样本中MBSF9可作为互补标志物。另外，可以看到整体上这些标志物在结直肠癌样本中的信号明显高于健康人。进一步证明了V1多重测定中这些标志物组合的规律性和合理性。

(2)对于V2测定中各甲基化标志物的分析如下：结果显示，在结直肠癌样本中，QKI测定在大部分结直肠癌患者中检测信号较强，大约覆盖90％以上的患者(假定以大于10作为评判测定最优的标准)；但仍有部分患者未被覆盖，这部分样本可由其它标志物作为互补发挥作用，例如在16号结直肠癌患者样本中，NDRG4标志物可以起到互补作用；另外6号、13号、14号、15号、16号结直肠癌样本中，MBSF9和QKI、NDRG4可作为互补标志物。进一步证明了V2多重测定中这些标志物组合的规律性和合理性。

实施例十一

双荧光法和三荧光法对多个DNA甲基化标志物进行定量

1.实验方法

(1)双荧光mqMSP方法：将针对DNA甲基化标志物(MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、QKI)设计的多个MGB探针均使用FAM荧光基团标记，用于定量的内参基因的MGB探针使用VIC荧光基团标记，测定序列见实施例四中的总表，检测方法见上述实施例七描述的mqMSP方法(V2测定方法)。

(2)三荧光mqMSP方法：将多个甲基化标志物分为两组，一组(MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、NPY、QKI)使用FAM标记的MGB探针，另一组(MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9)使用VIC标记的MGB探针，用于定量的内参基因则使用CY5标记的MGB探针。

表5.第1组引物和探针序列：

表6.第2组引物和探针序列：

表7.内参基因引物和探针序列(下划线标示引入的突变碱基)

反应体系如下：

在ABI 7500QPCR仪上设置反应条件如下：

(3)三荧光mqMSP方法的灵敏度测试：将细胞株DNA和血沉棕黄层DNA按照不同比例混合成2％、1％、0.5％、0.1％Bis-Meth DNA作为模型样本，10ng/反应，测试三荧光mqMSP方法的灵敏度。

(4)三荧光mqMSP方法对cfDNA的检测效果：提取不同类型样本血浆cfDNA(结直肠癌、良性息肉、进展性腺瘤、健康对照)并加入200ng载体(carrier)DNA，然后进行亚硫酸氢盐转化处理，用此方法进行检测。

(5)双荧光mqMSP方法和三荧光mqMSP方法的比较：选取结直肠癌样本cfDNA并加入200ng载体DNA，然后进行亚硫酸氢盐转化处理，用两种方法分别进行mqMSP定量检测。

2.实验结果

(1)三荧光mqMSP方法的灵敏度测试结果如下：对于模拟的不同浓度的甲基化样本，均能检测到甲基化信号(FAM和VIC荧光信号)，且可检测到甲基化程度低至0.1％的信号，说明此方法的灵敏度较好。

(2)三荧光mqMSP方法对不同类型样本血浆cfDNA的检测结果如下：对于结直肠癌样本，均能检测到甲基化信号(FAM和VIC荧光信号)，而健康对照样本甲基化水平均很低，几乎检测不到信号。

(3)双荧光mqMSP方法和三荧光mqMSP方法的比较结果：

见图8，双荧光法检测结果中FAM荧光信号(target1)表示结直肠癌样本中基因甲基化水平，VIC荧光信号(target2)表示内参基因，反映输入DNA的质量。

图9中，三荧光法检测结果中FAM信号(target1)和VIC信号(target2)分别表示两组基因的甲基化水平，CY5荧光信号(target3)表示内参基因，反映输入DNA的质量。

说明两种方法均能反映肠癌样本的甲基化水平。

实施例十二

核酸飞行质谱法对多个DNA甲基化标志物进行定量

本实施例将甲基化敏感的限制性内切酶、real-competitive技术、单碱基延伸反应和核酸飞行质谱技术相结合设计了定量检测方案。

1.实验方法

(1)选择1个肿瘤组织样本、1个正常组织样本、1个血沉棕黄层DNA样本，提取基因组DNA，取1μL使用Thermo

dsDNA HS测定试剂盒对其进行定量；

(2)取1μg上述DNA对其超声破碎打断成170bp左右的DNA片段，使用Bioruptor超声破碎仪，超声条件设置如下：

循环条件(开/关循环时间)	循环数
		30”/30”	13

(3)超声样本纯化：使用Zymo Oligo Clean&Concentrator试剂盒对每个超声后DNA进行纯化，以去除极小片段的DNA并浓缩DNA体积，最终每管洗脱于32μL，将同一个样本混和于1管，然后取1μL通过Qubit定量；

(4)样本酶切处理：选取4种甲基化敏感的限制性内切酶，包括HpaII(NEB)、Hha I(NEB)、Aci I(NEB)、BstU I(NEB)，设置50μL反应体系，20U每种酶/反应，100ng DNA/反应，先加入除BstU I之外的其它3种酶，37℃孵育16h，取出加入2μL Bst U I酶再60℃孵育6h。

酶切反应体系配制如下：

成分	体积
		H<sub>2</sub>O	31.6μL
10X Cutsmart缓冲液	5μL
		HpaII(50U/μL)	0.4μL
Hha I(20U/μL)	1μL
		AciI(10U/μL)	2μL
DNA(10ng/μL)	10μL
		总反应体积	50μL
反应条件	先37℃孵育16h，再60℃孵育6h

同样条件下，不加酶，设置模拟对照(mock control)反应：

成分	体积
		H<sub>2</sub>O	35μL
10X Cutsmart缓冲液	5μL
		DNA(10ng/μL)	10μL
总反应体积	50μL
		反应条件	先37℃孵育16h，再60℃孵育6h

(3)酶切产物DNA纯化：使用DNA clean Clean&Concentrator试剂盒对50μL酶切产物中的DNA进行纯化以去除杂质并浓缩体积，最终洗脱于12μLH2O中，取1μL通过Qbit测浓度，剩余用于后续反应测试。

(4)real-competitive PCR反应：

根据RRBS甲基化测序结果，FGF1 2、ELOVL2、HSPA1A等14个基因区域在结直肠癌肿瘤组织中的甲基化水平显著高于其它组织样本和血沉棕黄层，可作为肿瘤特异的DNA甲基化标志物，故针对FGF12、ELOVL2、HSPA1A等基因上的多个区域分别设计了PCR扩增引物和延伸引物。遵循扩增子内酶切位点数至少有3个的原则，同时加入一个内参基因ACTB测定(各样本中甲基化程度接近于0)作为质控。

表8.标志物信息

对应基因	标志物名称	标志物所在染色体位置
			ACTB	QC	chr7：5530563-5530637
FGF12	RRB10	chr3：192408801-192408861
			ELOVL2	RRB13	chr6：11044173-11044248
HSPA1A	RRB14	chr6：31815656-31815713
			ELOVL2/ELOVL2-AS1	RRB16	chr6：11043728-11043798
SYNE1	RRB17_1	chr6：152636778-152636838
			SYNE1	RRB17_2	chr6：152636910-152636974
SFMBT2	RRB20	chr10：7409123-7409201
			FLI1/SENCR	RRB21_4	chr11：128693445-128693513
FBN1	RRB26_2	chr15：48645387-48645456
			/	RRB2	chr1：34930091-34930158
AL096828.1	RRB30	chr20：63179214-63179293
			LONRF2	RRB6_1	chr2：100322008-100322068
LONRF2	RRB6_4	chr2：100322347-100322411
			LONRF2	RRB6_5	chr2：100322420-100322494

A.根据DNA甲基化标志物所在区域设计PCR引物如下：

表9.本实验所用PCR引物

表10.本实验所用延伸引物：

引物名称	序列(5′至3′)
		RRB6_5-U	GCTGCTCTTGCGATG(SEQ ID NO：91)
RRB20-U	CGGCGTGGAGGAAAG(SEQ ID NO：92)
		RRB6_4-U	TCTGAGCCCCTGCCCA(SEQ ID NO：93)
RRB21_4-U	GGCGGCTGGTAACCCA(SEQ ID NO：94)
		RRB16-U	CCCCAGAACTCCCGAGG(SEQ ID NO：95)
RRB10-U	GGAAGGCAGCAATTTAA(SEQ ID NO：96)
		QC-U	gGGCTGGGGTGGCGCGT(SEQ ID NO：97)
RRB2-U	GCTTAGGGAACTCTCCTT(SEQ ID NO：98)
		RRB17_2-U	aGCCCCCTGCCCTCCGCGA(SEQ ID NO：99)
RRB14-U	gtccAAGGACCGAGCTCTT(SEQ ID NO：100)
		RRB13-U	aCGCTGCGGATCATGGTGA(SEQ ID NO：101)
RRB30-U	CCCTCCGCCCAGGGTCCAAA(SEQ ID NO：102)
		RRB26_2-U	ggtcaGGGCCAGGAAGCTGT(SEQ ID NO：103)
RRB17_1-U	CCTGCCAAGCCGCCCTGGTGA(SEQ ID NO：104)
		RRB6_1-U	gggccCGGCTCCGCGCGGTCG(SEQ ID NO：105)

设计竞争物序列如下：分别对应步骤A所设计的每对PCR引物所扩增的目的序列，在延伸引物3’末端位点处引入变异碱基(下划线标注碱基为引入的变异碱基)。

表11.本实验所用竞争物序列

B.配制1μM(每个引物)PCR引物混合物如下：

由于后续引物工作液浓度设置为0.5μM，取上述混液(1μM)50μL于新的Ep管，加入50μL ddH₂O稀释为0.5μM。

竞争物准备：将竞争物干粉稀释成1μM溶液，用Thermo

ssDNA测定试剂盒测定浓度，根据各竞争物分子量换算成实际拷贝浓度，然后对各竞争物进行稀释混合，使得后续PCR反应中竞争物加入量满足下述条件：

未酶切样本(肿瘤组织DNA/正常组织DNA/血沉棕黄层DNA)：

	未酶切样本中加入竞争物
		每个目标	6600个拷贝/PCR反应
QC	3300个拷贝/PCR反应

酶切样本(正常组织DNA/血沉棕黄层DNA)：

N/BC	酶切样本中加入竞争物
		每个目标	66个拷贝/PCR反应
QC	33个拷贝/PCR反应

酶切样本T(肿瘤组织DNA)：

T	酶切样本中加入竞争物
		每个目标	3300个拷贝/PCR反应
QC	33个拷贝/PCR反应

延伸引物混合液：

先将UEP干粉稀释为200μM原液，然后如下混合成混合物：

C.PCR反应：在同一体系中同时加入酶切纯化后的样本DNA或模拟对照样本以及竞争物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

将待测样本依序加入反应孔位。

PCR反应程序设置如下表：

D.取5μL PCR产物加入2μL SAP(虾碱性磷酸酶)反应液进行SAP反应，SAP反应液体系如下：

E.延伸反应：取7μLSAP反应产物加入2μL延伸反应液进行延伸反应，延伸反应液体系如下：

反应条件：

F.核酸飞行质谱平台点样分析获取数据。

G.结果分析算法。

结果需要收集不同样本中竞争物和目标各自的峰值信号(peaksignal)和比值，“call”表示产物得到延伸产生的具体峰值信号，“0”表示产物未能延伸，峰值信号为0，分析按照如下算法：

已知每个反应输入竞争物的拷贝数如下：

未酶切样本(肿瘤组织DNA/正常组织DNA/血沉棕黄层DNA 20ng/反应)PCR反应：

酶切样本(正常组织DNA/血沉棕黄层DNA 20ng/反应)PCR反应：

酶切样本T(肿瘤组织DNA 20ng/反应)PCR反应：

对于未酶切样本反应结果的解释如下表：

对于正常组织DNA/血沉棕黄层DNA酶切样本反应结果的解释如下表：

对于肿瘤组织DNA酶切样本反应结果的解释如下表：

(8)利用此核酸飞行质谱方法检测血浆样本cfDNA：选择28个不同类型血浆样本cfDNA，包括15个结直肠癌、4个进展性腺瘤、4个肠息肉、5个健康对照，利用此方法定量分析样本中的各候选甲基化标志物，操作同上述。

2.实验结果

(1)见图10，上图，同时分析了酶切处理的肿瘤样本、正常组织样本、血沉棕黄层样本以及对应未酶切的3种模拟对照样本中的甲基化标志物RRB14，3种模拟对照样本(M-T1、M-N1、M-B1)中竞争物信号峰与样本信号峰比值接近1∶1，说明PCR反应效率较好，未酶切输入DNA拷贝数与输入竞争物拷贝数相当；3种酶切样本(E-T1、E-N1、E-B1)中竞争物信号峰与样本信号峰比值各不相同，肿瘤样本E-T1中两者信号比值为0.76，正常样本E-N1中两者信号比值为2.19，血沉棕黄层样本E-B1中两者信号比值为0.12，据此可算出3种酶切样本DNA拷贝数分别为2508拷贝、144.54拷贝、7.92拷贝，说明此标志物在结直肠癌肿瘤中甲基化程度明显高于其它类型样本。

同理，图10，下图分析了甲基化标志物RRB17_1，3种酶切样本DNA拷贝数分别为3696拷贝、133.98拷贝、9.24拷贝。

同时分析的所有标志物定量结果如下：单位-拷贝

对应基因	标志物名称	E-T1	E-N1	E-B1	M-T1	M-N1	M-B1
								FGF12	RRB10	8283	324.72	357.06	8382	8910	8646
ELOVL2	RRB13	2706	27.06	0	4356	8580	7458
								HSPA1A	RRB14	2508	144.54	7.92	4950	6006	7854
ELOVL2	RRB16	4851	84.48	35.64	5280	6996	6732
								SYNE1	RRB17_1	3696	133.98	9.24	2376	4092	4290
SYNE1	RRB17_2	4785	196.02	17.82	9240	12804	13332
								SFMBT2	RRB20	6567	239.58	73.26	8052	9372	10956
FBN1	RRB26_2	1551	18.48	17.82	2640	4224	4224
								AL096828.1	RRB30	2046	126.06	0	2244	3168	3300
LONRF2	RRB6_4	5907	1.98	5.28	7326	10494	12276

(2)血浆样本cfDNA的检测结果如下：单位-拷贝结直肠癌血浆cfDNA检测结果：

样本类型	CRC	CRC	CRC	CRC	CRC	CRC	CRC	CRC
									肿瘤分期	1	1	1	1	2	2	2	2
测定	2463RP	1451RP	1501RP	2064RP	3569RP	2477RP	2932RP	zyl-238
									RRB10	111.21	99	69.63	17.16	41.25	119.13	181.17	112.53
RRB13	0	0	0	0	2.97	0	0	0
									RRB14	0	4.62	0	0	0	5.28	2.31	5.61
RRB16	0	6.27	3.3	11.55	0	76.89	>660	31.35
									RRB17_1	4.62	0	0	0	0	7.26	0	11.55
RRB17_2	0	0	6.27	0	0	35.31	18.48	17.49
									RRB20	12.87	57.75	9.57	0	15.84	10.89	27.06	13.2
RRB21_4	0	15.18	3.3	0	14.52	2.64	7.59	0
									RRB26-2	0	0	0	0	0	0	0	2.64
RRB30	0	0	0	0	0	7.26	3.3	0
									RRB6_4	0	0	0	0	0	0	0	10.23

进展性腺瘤和肠息肉血浆cfDNA检测结果：

样本类型	AA	AA	AA	AA	Polyps	Polyps	Polyps	Polyps
									测定	331YP	367YP	439YP	499YP	592YP	487YP	ZDW96P	808YP
RRB10	129.69	49.83	246.51	3.96	67.32	55.44	126.39	20.79
									RRB13	0.33	0	0	0	0	1.32	0	0
RRB14	0	0	0	0	0	0.66	1.98	0
									RRB16	0	6.6	0	0	0	8.25	7.26	0
RRB17_1	0	0	6.27	0	0	0	3.63	3.3
									RRB17_2	11.22	9.9	18.15	14.52	0	7.26	0	7.92
RRB20	19.47	0.33	20.13	3.96	8.58	0	6.6	0
									RRB21_4	0	0	16.17	0	0	0	0	0
RRB26-2	0	2.97	0	0	0	0	0.99	1.32
									RRB30	0	7.92	18.48	0	0	0	7.26	4.62
RRB6_4	0	0	0	0	0	0	20.79	0

健康对照血浆cfDNA检测结果：

结果显示结直肠癌样本各基因甲基化水平总体较其它类型样本高，且癌症分期越晚，甲基化水平越高，即甲基化DNA拷贝数越多。证明此方法可用于血浆样本DNA甲基化标志物的定量检测。

实施例十三

V1测定用于血样的检测

1.实验方法

(1)2016-2019年期间通过温州医科大学附属第一医院及公开招募方式收集入组300位受试者，类型包括结直肠癌、进展性腺瘤、良性息肉、正常对照、无症状志愿者；

(2)对受试者使用EDTA采血管采集10mL静脉血；

(3)通过两次离心法分离全血得到血浆，收集于去酶Ep管-80℃保存；

(4)使用Apostle cfDNA提取试剂盒提取人外周血游离核酸DNA，取1μL用ThermoFisher Qubit测定核酸浓度；

(5)质控品准备：阳性质控品为HCT15细胞株DNA和正常人血沉棕黄层DNA按照1∶99混合的DNA，阴性质控品为正常人血沉棕黄层DNA，浓度均为10ng/μL，每次反应分别取20ng作为参考样本用于实验有效性的评估；(对于质控品的详细说明参见实施例三)

(6)取上述样本游离核酸DNA 5-100ng，阳性质控品和阴性质控品各取20ng，使用EZ methylation-Gold试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐转化，转化后洗脱于21μL去酶水；

(7)用引物和探针对上述亚硫酸氢盐转化后的DNA进行多重实时荧光定量PCR检测，V1测定引物探针序列、反应体系、反应条件、结果判读如下：

A.V1测定包括的测定为：MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、ACTB，各测定序列见实施例四中的总表。

B.QPCR引物、探针混合液准备：见实施例五。

C.多重荧光定量PCR反应体系和反应条件：见实施例五。

D.检测结果的标准和算法如下：使用Bio-rad CFX96 QPCR检测平台，设置FAM阈值100.17，VIC阈值33；使用ABI 7500 QPCR检测平台，设置FAM阈值0.2，VIC阈值0.09；表格中“+”代表Cq值≤45，“-”代表无扩增信号，其中ΔCq＝VIC_平均Cq-FAM_平均Cq

首先通过质控品验证QPCR反应的有效性：

如果质控品的QPCR反应满足下表中所列标准，并且受试者样本随同质控品在同一次QPCR反应中测定，该QPCR反应被验证为是有效的。

待测样本QPCR反应结果的解释：

2.实验结果

入组300位受试者的临床特征及阳性检出率如下：

本方法对结直肠癌检测的敏感性为86.21％，特异性为83.33％。其中I-IV期的检出率分别为64.3％、84.2％、100％、100％。

图11为一个阳性样本的血浆甲基化检测结果和一个阴性样本的血浆甲基化检测结果。

图12中显示结直肠癌患者血浆甲基化水平明显高于其它组别，差异具有统计学意义；图13中显示血浆甲基化水平与肿瘤分期有关，肿瘤分期越晚血浆甲基化水平越高。图14中ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.8912，说明此方法诊断准确性较高。

实施例十四

V2测定用于血样的检测

1.实验方法

(1)2016-2019年期间通过温州医科大学附属第一医院及公开招募方式收集入组305位受试者，类型包括结直肠癌、进展性腺瘤、良性息肉、正常对照、无症状志愿者；

(2)对受试者使用EDTA采血管采集10mL静脉血；

(6)取上述样本游离核酸DNA 5-100ng加入200ng载体DNA，阳性质控品和阴性质控品各取20ng也分别加入200ng载体DNA，使用EZ methylation-Gold试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐转化，转化后洗脱于21μL去酶水；

(7)用引物和探针对上述亚硫酸氢盐转化后的DNA进行多重实时荧光定量PCR检测，V2引物探针序列、反应体系、反应条件、结果判读如下：

A.V2测定包括的测定为：MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4、QKI、ACTB，各测定序列见实施例四中的总表。

B.QPCR引物、探针混合液准备：见实施例七。

C.多重荧光定量PCR反应体系和反应条件：见实施例七。

首先通过质控品验证QPCR反应的有效性：

待测样本QPCR反应结果的解释：

2.实验结果

入组305位受试者的临床特征及阳性检出率如下：

本方法对结直肠癌检测的敏感性为67.54％，特异性为98.25％。其中I-IV期的检出率分别为42％、75％、67.7％、91.7％。

图15中显示结直肠癌患者血浆甲基化水平明显高于其它组别，差异具有统计学意义；图16中显示血浆甲基化水平与肿瘤分期有关，肿瘤分期越晚血浆甲基化水平越高。图17中ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.8663，说明此方法诊断准确性较高。

实施例十五

V4测定用于血样的检测

1.实验方法

(1)2016-2019年期间通过温州医科大学附属第一医院及公开招募方式收集入组194位受试者，类型包括结直肠癌、进展性腺瘤、良性息肉、肠胃炎、食管癌、肺癌、正常对照；

(2)对受试者使用EDTA采血管采集10mL静脉血；

(3)通过两次离心法分离全血得到血浆，收集于去酶Ep管-80℃保存；然后由第三方公司参与将样本顺序打乱重新标记，进行盲法试验，实验人员在不知道受试者样本类型的情况下对样本进行后续处理；

(7)用引物和探针对上述亚硫酸氢盐转化后的DNA进行多重实时荧光定量PCR检测，V4引物探针序列、反应体系、反应条件、结果判读如下：

A.V4测定包括的测定为：MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1、RD2(其中去掉RD2_R引物)、ACTB，各测定序列见实施例四中的总表。

B.QPCR引物、探针混合液准备：见实施例九。

C.多重荧光定量PCR反应体系和反应条件：见实施例九。

D.检测结果的标准和算法如下：使用Bio-rad CFX96 QPCR检测平台，设置FAM阈值100.17，VIC阈值33；使用ABI 7500 QPCR检测平台，设置FAM阈值0.2，VIC阈值0.09；表格中“+”代表Cq值≤45，“-”代表无扩增信号，其中ACq＝VIC_平均Cq-FAM_平均Cq

首先通过质控品验证QPCR反应的有效性：

待测样本QPCR反应结果的解释：

2.实验结果

入组194位受试者的临床特征及阳性检出率如下：

本方法对结直肠癌检测的敏感性为80.3％，特异性为80％。其中I-IV期的检出率分别为74.4％、74.1％、95％、95％。

图18中显示结直肠癌患者血浆甲基化水平明显高于其它组别，差异具有统计学意义；图19中显示血浆甲基化水平与肿瘤分期有关，肿瘤分期越晚血浆甲基化水平越高。图20中ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.8567，说明此方法诊断准确性较高。

实施例十六

DNA甲基化标志物在肠癌预后评估和复发预测中的应用

1.实验方法

(1)2016-2019年期间通过温州医科大学附属第一医院收集入组86位受试者，均为接受手术治疗的结直肠癌患者，采集术前血样、术后血样及随访血样；

(2)血样处理及质控品准备同实施例十三所述；

(3)用V1测定引物和探针对上述亚硫酸氢盐转化后的DNA进行多重实时荧光定量PCR检测，V1引物探针序列、反应体系、反应条件、结果判读同实施例十三所述。

2.实验结果

结果显示，77位患者术前ctDNA阳性，9位患者术前ctDNA阴性，阳性检出率为89.5％(77/86)。随后对77位术前ctDNA阳性的患者继续检测其术后血以及随访血的ctDNA，结合患者临床信息和监测指标，通过ctDNA来评估结直肠癌患者的预后和复发情况。

77位结直肠癌患者中有20位复发患者，其余为未复发患者。复发患者中11位术后ctDNA阳性，9位患者术后ctDNA阴性，51位未复发患者中36位患者术后ctDNA为阴性结果，15位患者呈阳性结果。根据每位患者的复发情况和术后ctDNA状态绘制生存曲线(见图21)，可见术后ctDNA为阳性结果的患者其无复发生存期比ctDNA阴性的患者明显缩短(P＝0.006)。这些患者术前ctDNA均为阳性，手术切除肿瘤后，绝大部分患者ctDNA甲基化水平均有不同程度的下降(见图22)。

另外，对于20位复发患者，术后ctDNA阳性的患者RFS比术后阴性的患者RFS明显缩短(中位RFS 288 vs 460天，P＝0.008，见图23)，说明术后能检测到ctDNA的患者其复发时间更短。对阳性结果进一步进行定量分析，显示ctDNA甲基化水平与患者RFS成负相关，高水平甲基化ctDNA提示预后更加不良(见图24)。由此表明此方法检测术后ctDNA能用于评估患者术后的预后情况。

在77位患者中，其中有51位患者收集到了至少一份术后1个月以上的随访血，我们对这些随访血继续进行了ctDNA的检测来进一步评估患者的复发情况。在复发患者中，4位术后ctDNA阴性的患者有3位患者期随访血或复发时的ctDNA呈阳性，1位患者其随访血仍是阴性，而术后ctDNA阳性的未复发患者中有5位患者随访血转为阴性。根据51位患者随访血期间ctDNA的状态，绘制RFS生存曲线(见图25)，可见ctDNA阳性的患者较ctDNA阴性的患者其RFS明显缩短(P＝0.002)，表明在随访过程中通过该方法检测ctDNA能有效评估患者的复发情况，样本检测结果阳性提示受试者存在疾病复发转移的风险。

实施例十七

DNA甲基化标志物在结直肠癌病人新辅助治疗疗效、术后评估、术后监测等全覆盖动态监测方面的应用

1.实验方法

(1)通过温州医科大学附属第一医院入组了1位接受新辅助治疗的直肠癌患者，采集新辅助治疗前血样、新辅助治疗期间血样、手术前血样、手术后血样及动态随访系列血样共12份；

(2)血样处理及质控品准备同实施例十三所述；

2.实验结果

图26显示了此患者治疗及随访过程中系列血样的ctDNA变化情况，可见在接受新辅助治疗前ctDNA检测结果为阳性，新辅助治疗结束后ctDNA结果转阴，随后患者进行了肿瘤切除术，术前、术后以及随访过程的ctDNA检测结果均为阴性，患者预后较好，影像学检查也未发现复发进展，说明此方法在结直肠癌的新辅助治疗疗效评估、术后评估和监测方面有一定意义。

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序列表

<110> 浙江中创生物医药有限公司

<120> 结直肠癌DNA甲基化的检测方法及试剂

<130> CPCH2060654N

<160> 120

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

gagggaggaa gttatggtag gttat 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

tcctaaccac cttctcaacc ttaaa 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gagggaggaa gttatggtag gttct 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gagggaggaa gttatggtag gttgt 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gagggaggaa gttatggtag gtttt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tcctaaccac cttctcaacc ttata 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

tcctaaccac cttctcaacc ttaca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

tcctaaccac cttctcaacc ttaga 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 9

agaaggtagt ttgaagttgg t 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

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<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gttaaccgcg aaatccg 17

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 12

aacaacgaat cgcgc 15

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gttggttgtt gcggtc 16

<210> 14

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

gccaaaccca cccg 14

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 15

tccaacacgt ccgc 14

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

tttcgtttgg attcggtaac 20

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cccgaacaaa acgcg 15

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 18

tttattttcg attgagtgga t 21

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gtttattcga gtaggacgc 19

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ccgacaacga aataaaaaaa tcg 23

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 21

ttatttagtc ggaggtgagg a 21

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

gggtttaagc ggggttc 17

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

atttcactct aaaaaatcca tcg 23

<210> 24

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 24

tccccgacga ctct 14

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gtttcgaggt agtttcgc 18

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ttatatttac caaacgacaa cg 22

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 27

ctcgaaaact cgcgaaa 17

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

aaatttaggc ggtagtgc 18

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

cctattaaaa acacccgcg 19

<210> 30

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 30

ctacgcgccc tcacaa 16

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

ttttttacgt aggcggc 17

<210> 32

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ccgctaaaaa cgccg 15

<210> 33

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 33

cccgtacccg cgcc 14

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ggtttttttt agtacgttcg c 21

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

cgcaactaaa taaaatcatt tcg 23

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 36

taaactaact actacgaccg c 21

<210> 37

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

ggggttcgag tggtc 15

<210> 38

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

cgtcccctaa acgcg 15

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 39

tatacgatcg gagcgttt 18

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gtttaggggt tttttcggc 19

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

ctaactaaaa cgccgcg 17

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 42

tagttttgta ttgtaggagc gc 22

<210> 43

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

gttcgggttt tgcgc 15

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ctaaaaactc ctccgacg 18

<210> 45

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 45

acgcgaacgc gacgc 15

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

cggttttcgt tcgttttttc g 21

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

gtaacttccg ccttctacgc 20

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 48

ctaaaatacc cgataaac 18

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

tttagtttcg gcggttatat tttc 24

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

ctactctcga aaaaactcga cg 22

<210> 51

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 51

caccgaatcc gcgca 15

<210> 52

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

ttagttgcgc gttgatc 17

<210> 53

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

ccccgccgaa aacg 14

<210> 54

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 54

tagcgggtcg cgc 13

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

ttttgtattg taggagcgc 19

<210> 56

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

acgcccccga cg 12

<210> 57

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 57

tagggttcgg gtttc 15

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

ggagttattt aagcgtgatt gttc 24

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

aataaaatac aaaaaacgaa tcgcg 25

<210> 60

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 60

aaacttcctc gccgcga 17

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

acgttggatg gctgcggtaa cgcagtgac 29

<210> 62

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

acgttggatg caggagccct caggcgagt 29

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

acgttggatg aagcttcggt cccggtcc 28

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

acgttggatg cgcgctgcac ttaatagtgg 30

<210> 65

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

acgttggatg accgcgggcg caatctgag 29

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

acgttggatg ttacctaagc cggcgggact 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

acgttggatg tatggaggga gagttggcta 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

acgttggatg ttttcgtccg agtcttcccc 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

acgttggatg ttagggcccg aaccccagaa 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

acgttggatg tggagcggag aacggcgttt 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

acgttggatg agagaaggag aggaaggcag 30

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

acgttggatg ctcctaatct tcagaaccgc 30

<210> 73

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

acgttggatg gaggctctgt gctcgcggg 29

<210> 74

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 74

acgttggatg ggcgccctat aaaacccag 29

<210> 75

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

acgttggatg cccgtccgct taggagact 29

<210> 76

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

acgttggatg ccaagccagg agctgaggt 29

<210> 77

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 77

acgttggatg tgctcagccg cgctcccc 28

<210> 78

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 78

acgttggatg ctcacccccc agcgagcag 29

<210> 79

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 79

acgttggatg agtttccggc gtccggaag 29

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 80

acgttggatg ctggaaacgg aacactggat 30

<210> 81

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 81

acgttggatg ccacagccgc tgcggatca 29

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 82

acgttggatg tccaggagag aaagaaagcg 30

<210> 83

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 83

acgttggatg aggaccaggc ttgcatggg 29

<210> 84

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 84

acgttggatg atgcggtccg gcgtgtcca 29

<210> 85

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 85

acgttggatg accaagagcc ccgggccag 29

<210> 86

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 86

acgttggatg tgtcccggaa cgtccacag 29

<210> 87

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 87

acgttggatg tctgcaggac tgcgggagc 29

<210> 88

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 88

acgttggatg cagcgggctg agattgttg 29

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 89

acgttggatg tcctctaagc gctgggcgat 30

<210> 90

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 90

acgttggatg cgccgccgcc ccagtgtc 28

<210> 91

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 91

gctgctcttg cgatg 15

<210> 92

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 92

cggcgtggag gaaag 15

<210> 93

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 93

tctgagcccc tgccca 16

<210> 94

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 94

ggcggctggt aaccca 16

<210> 95

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 95

ccccagaact cccgagg 17

<210> 96

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 96

ggaaggcagc aatttaa 17

<210> 97

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 97

gggctggggt ggcgcgt 17

<210> 98

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 98

gcttagggaa ctctcctt 18

<210> 99

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 99

agccccctgc cctccgcga 19

<210> 100

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 100

gtccaaggac cgagctctt 19

<210> 101

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 101

acgctgcgga tcatggtga 19

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 102

ccctccgccc agggtccaaa 20

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 103

ggtcagggcc aggaagctgt 20

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 104

cctgccaagc cgccctggtg a 21

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 105

gggcccggct ccgcgcggtc g 21

<210> 106

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 106

gctgcggtaa cgcagtgacc gcgctccagg tccgcgtctc ttgcgatggt tcccccactc 60

gcctgagggc tcctgc 76

<210> 107

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 107

aagcttcggt cccggtcccc cacctcccac cccagagcgg cgtggaggaa aggaggagcc 60

cactattaag tgcagcgcgc 80

<210> 108

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 108

accgcgggcg caatctgagc ccctgcccag gcgcagcggc ctctcagtcc cgccggctta 60

ggtaac 66

<210> 109

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 109

gttttcgtcc gagtcttccc cggcagtagg cggtgggtta cccgcagccc tagccaactc 60

tccctccata c 71

<210> 110

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 110

gttagggccc gaaccccaga actcccgagg gagggtgtgt gccgcgcgcg ggaaacgccg 60

ttctccgctc ca 72

<210> 111

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 111

gagagaagga gaggaaggca gcaatttaag tccctgcggc ccgcggttct gaagattagg 60

ag 62

<210> 112

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 112

gaggctctgt gctcgcgggg cggacgcggt ctcggcggtg gtggcgcgtg gcgccgctgg 60

gttttatagg gcgcc 75

<210> 113

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 113

gcccgtccgc ttaggagact ctccttgggg ctttcccggt cggccgcctg acctcagctc 60

ctggcttgg 69

<210> 114

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 114

tgctcagccg cgctccccgc cctccgcgag cggttcctcc tcccggctgc tcgctggggg 60

gtgag 65

<210> 115

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 115

gagtttccgg cgtccggaag gaccgagctc ttgtcgcgga tccagtgttc cgtttccagc 60

<210> 116

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 116

gtccaggaga gaaagaaagc gcggcggtgt cggtggcggc gcgcggcccc agtcaccatg 60

atccgcagcg gctgtggc 78

<210> 117

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 117

aggaccaggc ttgcatgggg acgggggtct gcgtccgcgt ccagggtcca aaggagggcg 60

gtggacacgc cggaccgcat c 81

<210> 118

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 118

accaagagcc ccgggccagg aagctgtgag gcaggggagg gccagcgcca gctgtggacg 60

ttccgggaca 70

<210> 119

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 119

gtctgcagga ctgcgggagc ccagccgccc tggtgagaga ggacaacaat ctcagcccgc 60

tgc 63

<210> 120

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 竞争物

<400> 120

tcctctaagc gctgggcgat cggctccgcg cggtcggagc caggacactg gggcggcggc 60

g 61

Claims

1.诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果的方法，包括检测来自所述受试者的样本中的游离DNA中的甲基化标志物以判断所述DNA的甲基化水平，如果所述甲基化水平高于正常对照样本的DNA甲基化水平，则确定所述受试者中存在结直肠癌、患有结直肠癌的受试者术后的预后不佳、患有结直肠癌的受试者术后容易复发或对所述受试者的治疗效果不佳，所述甲基化标志物是选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。

2.权利要求1的方法，其中所述甲基化标志物的检测是使用多重定量甲基化特异性PCR进行的，并且所述甲基化标志物是：

2)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4和QKI的一种或多种；

3)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、NDRG4、QKI、RD1和RD2的一种或多种；或

4)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种；

3.权利要求2的方法，其中所述多重定量甲基化特异性PCR使用针对权利要求2所述甲基化标志物的引物和探针，以及针对内参基因ACTB的引物和探针，其中所述引物和探针包含如表4所示的序列或与表4所示序列具有至少80％序列同一性的序列。

4.权利要求3的方法，其中当甲基化标志物是选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种时，多重定量甲基化特异性PCR中不使用RD2_F引物。

5.权利要求1的方法，其中所述甲基化标志物的检测是使用多重定量甲基化特异性PCR进行的，在所述多重定量甲基化特异性PCR中，将甲基化标志物分为两组或更多组，针对每组标志物以及内参基因的探针各自使用不同的荧光标记。

6.权利要求5的方法，其中将甲基化标志物分为两组，第1组由MBSF9、MBSR16、MBSF8、MBSR13、NDRG4、NPY和QKI组成，并且第2组由MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8和MBSR9组成，并且使用内参基因ACTB，其中针对第1组标志物的引物和探针包含如表5所示的序列或与表5所示序列具有至少80％序列同一性的序列，针对第2组标志物的引物和探针包含如表6所示的序列或与表6所示序列具有至少80％序列同一性的序列，并且针对内参基因ACTB的引物和探针包含如表7所示的序列或与表7所示序列具有至少80％的序列同一性。

7.权利要求1的方法，其中所述甲基化标志物的检测是使用核酸飞行质谱法进行的，并且所述甲基化标志物是选自RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5的一种或多种，任选地，所述核酸飞行质谱法包括内参基因ACTB的测定。

8.权利要求7的方法，其中所述核酸飞行质谱法使用针对所述甲基化标志物和内参基因的PCR引物和延伸引物并且同时扩增拷贝数已知的甲基化标志物的竞争物序列，根据甲基化标志物与竞争物的比值计算出甲基化标志物的拷贝数，

其中针对甲基化标志物和内参基因的PCR引物包含如表9所示的序列或与表9所示序列具有至少80％序列同一性的序列，针对甲基化标志物和内参基因的延伸引物包含如表10所示的序列或与表10所示序列具有至少80％序列同一性的序列，甲基化标志物和内参基因的竞争物包含如表11所示的序列或与表11所示序列具有至少80％序列同一性的序列。

9.权利要求1-8的任一项的方法，其中所述样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。

10.用于诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果的甲基化标志物，所述标志物选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。

11.权利要求10的甲基化标志物，其选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、MBSF8、MBSR13、RD1、RD2、NPY、NDRG4、QKI、RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5。

12.用于诊断受试者中是否存在结直肠癌、判断患有结直肠癌的受试者术后的预后、预测患有结直肠癌的受试者术后复发或评估对患有结直肠癌的受试者的治疗效果的试剂盒，其中包含用于检测甲基化标志物的试剂，所述甲基化标志物是选自表2、表3和表8所列标志物的一种或多种。

13.权利要求12的试剂盒，其中所述甲基化标志物是选自MBSF9、MBSF10、MBSF15、MBSR5、MBSR6、MBSR7、MBSR8、MBSR9、MBSR11、MBSR16、MBSF8、MBSR13、RD1、RD2、NPY、NDRG4、QKI的一种或多种，并且任选地，所述试剂盒包含用于检测内参基因ACTB的试剂。

14.权利要求13的试剂盒，其中所述检测甲基化标志物和内参基因的试剂包含如表4所示的序列。

15.权利要求12的试剂盒，其中所述甲基化标志物是选自RRB10、RRB13、RRB14、RRB16、RRB17_1、RRB17_2、RRB20、RRB21_4、RRB26_2、RRB2、RRB30、RRB6_1、RRB6_4和RRB6_5的一种或多种，并且任选地，所述试剂盒包含用于检测内参基因ACTB的试剂。

16.权利要求15的试剂盒，其中所述检测甲基化标志物和内参基因的试剂包含如表9、表10和表11所示的序列或与表9、表10和表11所示序列具有至少80％序列同一性的序列。

17.权利要求13或14的试剂盒，其中所述甲基化标志物是：

2)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、MBSR16、NDRG4和QKI的一种或多种；

4)选自MBSF9、MBSF8、MBSR13、QKI、RD1和RD2的一种或多种。

18.多核苷酸，其包含与选自SEQ ID NOs：1、2和9-120的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。