CN109439749B - 用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，所述标志物选自let‑7b‑3p、let‑7b‑5p、miR‑150‑3p、miR‑145‑3p、miR‑139‑3p、miR‑139‑5p、miR‑15b‑3p、miR‑125a‑5p、miR‑140‑5p、miR‑342‑3p、miR‑132‑5p和miR‑92b‑5p中的至少一种。本发明还提供用于结直肠癌诊断的试剂盒。本发明还建立了用于检测所述miRNA标志物的方法。本发明基于无创检测技术开发的结直肠癌诊断及复发监控的方法，在早期结直肠癌中具有高灵敏度及高特异性，多个miRNA标志物联合AUC最高可达0.99，具有极其优越的诊断性能。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒。
背景技术
结肠直肠癌(carcinoma of colon and rectum)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。我国结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)的发病率和死亡率均保持上升趋势。2015年中国癌症统计数据显示：我国结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5位，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万。其中，城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。多数患者发现时已属于中晚期。因此，为提升我国结直肠癌诊疗行为，改善结直肠癌患者预后，结直肠癌的早诊早治成为结直肠癌诊治的重要问题。
目前结直肠癌的诊断手段主要是内镜检查。内镜检查会给受检者带来一定的痛苦，而且有一些特定群体难以耐受(如急性腹膜炎、肠穿孔患者等)，所以能够接受及覆盖的群体有限。也有采用血液septin9甲基化检测的基于血液的无创检测手段，但其检测的灵敏度并不高；因此，亟待开发一种高灵敏度的无创结直肠癌早期检测的方法。
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs；以下囊泡均代表细胞外囊泡)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles,MVs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义，特别是其中的外泌体。
外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外环境中粒径介于30～150nm的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。而miRNA则是外泌体中含量最为丰富的核酸组分，因而外泌体miRNA具备作为结直肠癌早期诊断的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及其组合。
本发明的另一目的是提供基于所述外泌体miRNA标志物开发的用于结直肠癌诊断的试剂盒。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物选自let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p中的至少一种。
优选地，所述miRNA标志物为以下(i)～(vii)中任一个：
(i)let-7b-3p、miR-15b-3p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p或miR-92b-5p；
(ii)let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p；
(iii)let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145-3p和miR-125-5p；
(iv)miR-139-3p和miR-15b-3p；
(v)let-7b-3p和miR-15b-3p；
(vi)miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p；
(vii)let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p。
在一些优选的实施方案中，显著差异表达的miRNA分子标志物联合使用，其中较优的组合是：(1)miR-15b-3p和miR-139-3p；(2)Let-7b-3p和miR-15b-3p；(3)miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p；(4)let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p；(5)let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145-3p和miR-125-5p；(6)let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p。上述组合可为结直肠癌的诊断、预后判断、疗效检测和复发监控提供更好的依据，预示疾病风险。
本发明提供的用于结直肠癌诊断、预后判断、疗效监测及复发监控的miRNA标志物检测样本为外泌体。所述外泌体来源于血液、尿液、唾液及痰液的一种或多种。
除了外泌体，本发明的miRNA标志物同样适用于结直肠癌患者的其它组织、器官、细胞及体液。
第二方面，本发明提供用于检测所述miRNA标志物的引物，对应于各miRNA，包括逆转录引物、上游引物和通用下游引物；其中，所述逆转录引物为特异性颈环结构逆转录引物。
用于检测let-7b-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.1所示；
用于检测let-7b-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-150-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-145-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-139-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-139-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-15b-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-125a-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-140-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-342-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-132-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-92b-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.1所示。
本发明利用颈环引物进行逆转录不仅特异性强，同时可以增加扩增待检测核酸的扩增长度，有利于后续使用Taqman探针引物的方法来扩增目标miRNA片段。
第三方面，本发明提供用于检测所述miRNA标志物的探针，对应于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.37所示。
第四方面，本发明提供与上述miRNA配套的逆转录反应体系，所述反应体系如下：
第五方面，本发明提供与上述miRNA配套的PCR反应体系，所述反应体系如下：
其中，所述Premix Ex Taq的主要成分为TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+和Tli RNaseH(耐热性RNaseH)等。所述Primer Mix的主要成分为4uM上游引物、4uM通用下游引物及4uM探针等。优选地，所述Premix Ex Taq来自于Takara公司试剂盒RR390A。
PCR反应程序为：95℃ 10min，(95℃ 15s；55℃ 30s)15个循环不采集荧光，(95℃15s；55℃ 30s)35个循环采集荧光。
第六方面，本发明提供含有所述引物和/或所述探针的检测试剂或诊断试剂盒。
进一步地，所述诊断试剂盒中包含各miRNA标志物标准品。所述外泌体miRNA分子标志物的标准品浓度为1000copies/ul；并在使用时稀释为梯度标准品。
所述诊断试剂盒中还包含上述miRNA逆转录反应体系。
所述诊断试剂盒中还包含PCR反应体系。
本发明还提供用于结直肠癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包括检测外泌体miRNA标志物的逆转录引物、PCR引物、探针、标准品以及逆转加PCR的两步法检测体系。
本发明包括选用内参U6、外参Cel-miR-39或无需参照的miRNA进行目标miRNA的定量。其中选用参照时，目标miRNA的定量根据检测Ct值使用定量公式2ΔΔCt计算标志物的表达水平。得到目标miRNA表达水平后，使用ROC特征曲线和AUC来评估单个miRNA或联合多个miRNA检测结直肠癌的准确度。
为了筛选到与结直肠癌诊断相关的外泌体标志物，随机挑选早期结直肠癌患者和对照各15例，取血液不少于10ml并分离血浆，用经典超速离心方法分离血浆中的外泌体并提取RNA，得到的RNA分别进行miRNA建库测序。得到的数据进行生物信息学的分析，比较早期结直肠癌患者及对照中差异表达的miRNA，并与TCGA数据库(https：//cancergenome.nih.gov/)中组织的miRNA测序关联分析，筛选到来源于肿瘤的外泌体miRNA。这些来自外泌体的miRNA层面标志物可以用于结直肠癌早期诊断。
进一步地，针对其中miRNA标志物进行应用分析，具体方法如下：(1)采集待检测个体的体液样本(包括血液、尿液、痰液和唾液)；(2)分离体液中的外泌体；(3)spike外参cel-miR-39提取外泌体RNA；(4)利用两步法检测目标miRNA表达水平；(5)使用外参基因对检测目标miRNA的表达水平进行归一化；(6)将归一化后的基因表达水平代入判定模型得到输出值；(7)根据模型的输出值及判定阈值判定待测个体是否为结直肠癌。
本方法检测的个体可以为结直肠癌高危的人群、正常个体及结直肠癌术后的患者。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供了一种基于无创检测技术的结直肠癌诊断及复发监控的方法，在早期结直肠癌中具有高灵敏度及高特异性，其中3个miRNA标志物联合AUC最高可达0.99，在检测灵敏度达100％的同时具备89％的特异性，组合12个标志物组合可实现100％的灵敏度和100％的特异性，远高于现有检测方法，具有极其优越的诊断性能。为结直肠癌的诊断提供了重要依据，对于我国结直肠癌的防治具有意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例2中标准品不同稀释倍数检测结果。
图2为本发明实施例3中Let-7b-3p诊断早期结直肠癌的性能。
图3为本发明实施例3中Let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145联合诊断结直肠癌的性能。
图4为本发明实施例3中Let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145和miR-125-5p联合诊断结直肠癌的性能。
图5为本发明实施例3中miR-15b-3p诊断早期结直肠癌的性能。
图6为本发明实施例3中miR-140-5p诊断早期结直肠癌的性能。
图7为本发明实施例3中miR-342-3p诊断早期结直肠癌的性能。
图8为本发明实施例3中miR-132-5p诊断早期结直肠癌的性能。
图9为本发明实施例3中miR-92b-5p诊断早期结直肠癌的性能。
图10为本发明实施例3中let-7b-5p诊断早期结直肠癌的性能。
图11为本发明实施例3中miR-150-3p诊断早期结直肠癌的性能。
图12为本发明实施例3中miR-145-3p诊断早期结直肠癌的性能。
图13为本发明实施例3中miR-139-3p诊断早期结直肠癌的性能。
图14为本发明实施例3中miR-139-5p诊断早期结直肠癌的性能。
图15为本发明实施例3中miR-125a-5p诊断早期结直肠癌的性能。
图16为本发明实施例3中miR-15b-3p与miR-139-3p联合诊断早期结直肠癌的性能。
图17为本发明实施例3中let-7b-3p和miR-15b-3p联合诊断早期结直肠癌的性能。
图18为本发明实施例3中miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p联合诊断早期结直肠癌的性能。
图19为本发明实施例3中12个miRNA标志物联合诊断早期结直肠癌的性能。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning：a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1基于高通量测序筛选与结直肠癌相关的外泌体miRNA标志物
为了筛选到与结直肠癌诊断相关的外泌体标志物，早期结直肠癌患者和对照各15例，取血液不少于10ml并分离血浆，用于经典超速离心方法分离血浆中的外泌体并采用qiagen miRNeasy mini kit提取RNA，得到的RNA采用NEB miRNA建库试剂盒进行miRNA建库测序。得到的数据进行生物信息学的分析，比较早期结直肠癌患者及对照中差异表达的miRNA，并与TCGA中组织的miRNA测序关联分析，筛选到的来源于肿瘤的外泌体miRNA，如表1所示。这些来自外泌体的miRNA层面标志物可以用于结直肠癌早期诊断。
表1
实施例2基于荧光定量PCR平台miRNA检测体系
1、miRNA逆转录反应体系
miRNA反转录试剂、酶从TAKARA采购，标准品由上海英潍捷基合成，特异性逆转录引物由苏州泓迅合成。采用20ul的反转录体系，如下所示：
2、PCR反应体系
PCR反应混合液从TAKARA采购，上游引物、探针及通用下游引物由苏州泓迅合成，荧光定量PCR仪为ABI 7500。PCR反应体系，如下所示：
其中，所述Premix Ex Taq来自于来自于Takara公司试剂盒RR390A。所述PremixEx Taq的主要成分为TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+和Tli RNaseH(耐热性RNaseH)等。所述Primer Mix的主要成分为4uM上游引物、4uM通用下游引物及4uM探针等。
PCR反应程序为：95℃ 10min，(95℃ 15s；55℃ 30s)15个循环不采集荧光，(95℃15s；55℃ 30s)35个循环采集荧光。
其中，let-7b-5p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；let-7b-3p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；miR-150-3p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；miR-145-3p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；miR-139-3p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；miR-139-5p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列；miR-15b-3p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；miR-125a-5p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列；miR-140-5p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列；miR-342-3p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列；miR-132-5p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；miR-92b-5p的逆转录引物，具体如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列。
所述检测外泌体miRNA标志物的引物和探针包括：
用于检测let-7b-5p的引物和探针：所述let-7b-5p的上游引物具体如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列；
用于检测let-7b-3p的引物和探针：所述let-7b-3p的上游引物具体如SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.7所示的核苷酸序列；
用于检测miR-150-3p的引物和探针：所述mi-150-3p的上游引物具体如SEQ IDNo.9所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.10所示的核苷酸序列；
用于检测miR-145-3p的引物和探针：所述mi-145-3p的上游引物具体如SEQ IDNo.12所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.13所示的核苷酸序列；
用于检测miR-139-3p的引物和探针：所述mi-139-3p的上游引物具体如SEQ IDNo.15所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.16所示的核苷酸序列；
用于检测miR-139-5p的引物和探针：所述mi-139-5p的上游引物具体如SEQ IDNo.18所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.19所示的核苷酸序列；
用于检测miR-15b-3p的引物和探针：所述mi-15b-3p的上游引物具体如SEQ IDNo.21所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.22所示的核苷酸序列；
用于检测miR-125a-5p的引物和探针：所述mi-125a-5p的上游引物具体如SEQ IDNo.24所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.25所示的核苷酸序列；
用于检测miR-140-5p的引物和探针：所述mi-140-5p的上游引物具体如SEQ IDNo.27所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.28所示的核苷酸序列；
用于检测miR-342-3p的引物和探针：所述mi-342-3p的上游引物具体如SEQ IDNo.30所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.31所示的核苷酸序列；
用于检测miR-132-5p的引物和探针：所述mi-132-5p的上游引物具体如SEQ IDNo.33所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.34所示的核苷酸序列；
用于检测miR-92b-5p的引物和探针：所述mi-92b-5p的上游引物具体如SEQ IDNo.36所示的核苷酸序列，下游引物具体如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，探针如SEQ IDNo.37所示的核苷酸序列；
引物和探针序列见表2。
表2
3、miRNA两步法标准品配制及检测灵敏度
标准品原液miRNA为1000copies/ul，取10ul原液与90ul灭菌超纯水混合稀释到100copies/ul，再取10ul 100copies/ul的标准品与90ul灭菌超纯水混合稀释到10copies/ul，最后取10ul 10copies/ul的标准品与90ul灭菌超纯水缓和稀释到1copy/ul.
两步法检测miRNA标准品结果如下图1所示(每个样品重复3次)，其中横坐标表示标准品原液稀释倍数分别为1，10，100和1000倍。
标准品不同稀释倍数检测结果如图1所示。
实施例3基于miRNA两步法检测体系的结直肠癌早期诊断检测试剂盒效果评估
1、样本采集
收集经医院确诊的早期(I期和II期)结直肠癌患者，结直肠良性病人、健康人等对照样本的血液10ml，并分离成血浆。
2、外泌体RNA提取
采用Qiagen公司商业化ExoEasy试剂盒或公司自主开发的Exocolumn进行血浆外泌体分离，分离后的外泌体用Qiagen miReasy mini kit试剂盒提取外泌体中的miRNA，并利用Agilent 2100检测RNA浓度和质量，记录RNA浓度。
3、miRNA两步法检测体系
采用实施例1中基于PCR平台miRNA的两步法检测体系，对早期结直肠癌病人50例和50例对照样本(健康人和良性病变)的血浆外泌体miRNA进行检测，检测目标miRNA的Ct值，根据Ct值和相对定量公式计算相对表达量。
4、结直肠癌队列1外泌体miRNA检测结果
(1)临床样本Let-7b-3p检测结果
如图2所示，对早期结直肠癌病人50例和50例对照样本(健康人和良性病变)的血浆外泌体，检测Let-7b-3p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明联合标志物与早期结直肠癌显著相关。AUC＝0.793，具有较好的诊断能力。
(2)临床样本Let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p联合检测结果
如图3所示，对早期结直肠癌病人50例和50例对照样本(健康人和良性病变)的血浆外泌体，检测Let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明联合标志物与早期结直肠癌显著相关。AUC＝0.927，具有显著的诊断能力。
(3)临床样本Let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145-3p和miR-125-5p联合检测结果
如图4所示，对早期结直肠癌病人50例和50例对照样本(健康人和良性病变)的血浆外泌体，检测Let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145-3p和miR-125-5p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明联合标志物与早期结直肠癌显著相关。AUC＝0.935，具有显著的诊断能力。
5、结直肠癌队列2外泌体miRNA检测结果
为了验证其他更多的miRNA，在另外一组22例早期结直肠癌患者和20例对照样本进行了验证，其效能评估如下：
(1)miR-15b-3p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-125a-5p分别单独检测性能
检测miR-15b-3p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-125a-5p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明上述miRNA均与早期结直肠癌显著相关。AUC均在0.7以上，ROC曲线如图5-图15所示。
(2)miR-139-3p与miR-15b-3p联合检测的性能
检测miR-15b-3p和miR-139-3p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明miR-15b-3p和miR-139-3p的组合与早期结直肠癌显著相关，AUC为0.98，在保证灵敏度为100％的情况下，特异性达89％，ROC曲线如图16所示。
(3)let-7b-3p与miR-15b-3p联合检测的性能
检测let-7b-3p和miR-15b-3p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明let-7b-3p和miR-15b-3p组合与早期结直肠癌显著相关，AUC为0.91，可实现95％的检测灵敏度，81％的特异性，ROC曲线如图17所示。
(4)miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p联合检测的性能
检测miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p组合与早期结直肠癌显著相关，AUC为0.99，在保证灵敏度为100％的情况下，特异性达89％，ROC曲线如图18所示。
(5)let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p联合检测的性能
检测let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p的Ct值，根据Ct值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量。对检测结果采用R语言进行t检测分析P≤0.05，说明该组合与早期结直肠癌显著相关，AUC为1，特异性与灵敏度均为100％，ROC曲线如图19所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京恩泽康泰生物科技有限公司 首都医科大学附属北京友谊医院
<120> 用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒
<130> KHP181115890.4
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagtgcagg gtccga 16
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaccac 50
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accgtgaggt agtaggttgt 20
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 7
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<211> 50
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<212> DNA
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<400> 12
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<211> 50
<212> DNA
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactagagc 50
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccgacgaatc attatttgct 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
attcgcactg gatacgacta gagct 25
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcacag 50
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtccctgag accctttaac 20
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
attcgcactg gatacgactc acagg 25
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacca 50
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
accgcagtgg ttttacccta 20
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
attcgcactg gatacgacct acca 24
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacgggt 50
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgtctcacac agaaatcgc 19
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
attcgcactg gatacgacac gggt 24
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagtaac 50
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgaccgtggc tttcgatt 18
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
attcgcactg gatacgacag taacaa 26
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccactgc 50
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agggacggga cgcggt 16
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
attcgcactg gatacgacca ctgc 24
Claims (9)
1.用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物为let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p。
2.用于检测权利要求1所述miRNA标志物的引物，其特征在于，对应于各miRNA，包括逆转录引物、上游引物和通用下游引物；
其中，用于检测let-7b-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-145-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.1所示；
用于检测miR-139-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.1所示。
3.用于检测权利要求1所述miRNA标志物的探针，其特征在于，对应于let-7b-3p、miR-145-3p和miR-139-3p，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.16所示。
4.miRNA逆转录反应体系，其特征在于，所述反应体系如下：
其中，所述逆转录引物同权利要求2中所述。
5.PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系如下：
其中，所述Premix Ex Taq的主要成分为：TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+和耐热性RnaseH；所述Primer Mix的主要成分为4μM上游引物、4μM通用下游引物及4μM探针，其中Primer Mix中的上游引物和通用下游引物同权利要求2中所述，探针同权利要求3中所述。
6.含有权利要求2所述引物和/或权利要求3所述探针的检测试剂或诊断试剂盒。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中包含各miRNA标志物标准品。
8.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中包含权利要求4所述miRNA逆转录反应体系。
9.根据权利要求6-8任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中包含权利要求5所述PCR反应体系。
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