WO2007013593A1

WO2007013593A1 - 新規遺伝子acmg1のメチル化を指標とする胃癌の診断方法

Info

Publication number: WO2007013593A1
Application number: PCT/JP2006/314993
Authority: WO
Inventors: Minoru Toyota; Takashi Tokino; Kohzoh Imai; Kimishige Akino; Yuji Hinoda; Fumio Itoh; Yasuhisa Shinomura
Original assignee: Sapporo Medical University
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2007-02-01

Abstract

　胃癌細胞株において，ACMG1遺伝子のCpGアイランドの異常メチル化が高頻度で生じておりその発現が抑制されていることが見出された。被験者から採取した検体において，ACMG1遺伝子のメチル化の頻度を測定することにより，胃癌を検出する方法が開示される。さらに，ACMG1遺伝子のメチル化の抑制または発現の促進を指標として胃癌治療薬の候補物質を選定する方法が開示される。

Description

新規遺伝子 ACMG1のメチル化を指標とする胃癌の診断方法技術分野

[0001] 本発明は， ACMG1と名付けられた新規遺伝子，これを利用した胃癌の診断方法および診断用キット，ならびに胃癌治療薬の候補物質を選定する方法に関する。

背景技術

[0002] CpGアイランドは遺伝子の中で CpGに富む領域であり，ヒト遺伝子の約 60%が遺伝子の 5 '領域に CpGアイランドを有している。生理的条件下では， X染色体の不活ィ匕やゲノムインプリンティングにお、て遺伝子のメチルイ匕が起こるが，それ以外の状況では， CpGアイランドはメチル化されていない。しかし，癌においては，しばしば CpG アイランドカ^チルイ匕され，そのメチルイ匕により遺伝子の発現が抑制されることが明ら力となってきた。本発明者らは，これまで pl6^INK4A, Eカドヘリン， hMLHlや 14- 3- 3 sig maが癌にぉ、てプロモーター領域のメチルイ匕により発現が抑制されて、ることを報告してきた。癌にぉ、てはヒトゲノムに存在する遺伝子の数％が異常メチル化により不活ィ匕されていると推定されている。したがって，メチル化などの遺伝子修飾の情報は ,新規癌抑制遺伝子を同定するためのよい分子マーカーとなりうる。また，遺伝子のメチルイ匕は，血清や便中力もも検出可能であることから，腫瘍マーカーとして，癌の早期診断や再発の予測，術後のモニタリングにおける利用が期待されている。

[0003] 本発明者らは先に，メチルイ匕している CpGアイランドだけを効率よく増幅する方法， Methylated し pG island amplincation (Mし A)法を発し 7こ (Toyota et al. Cance r Res, 59: 2307, 1999)。この方法により増幅した正常糸且織と癌糸且織由来のアンプリコンを用いてサブトラクシヨンを行うことにより，癌でのみ異常メチルイ匕している遺伝子断端を同定することが可能となった。本発明者らは， MCA法を用いて，ヒトの大腸癌において異常メチルイ匕している遺伝子断端を同定した。それらの遺伝子断片の 1 つである MINT25はヒト染色体 22ql 1に位置し，胃癌にぉ、て高率にメチル化して！/、ることが見出された（Toyota et al" Cancer Res. 59, 5438, 1999)。

[0004] 本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれか力本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。

非特許文献 l :Toyota et al, Cancer Res. 59: 2307, 1999

非特許文献 2 :Toyota et al., Cancer Res. 59: 5438, 1999

発明の開示

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは，異常メチルイ匕している遺伝子断片 MINT25の近傍に新規遺伝子 AC MG1を同定し，胃癌細胞株においてこの遺伝子の CpGアイランドの異常メチル化が高頻度で生じており， ACMG1遺伝子の発現が抑制されていることを見出して，本発明を完成させた。

[0006] すなわち，本発明は，被験者カゝら採取した検体において， ACMG1遺伝子のメチル化の頻度を測定することにより，胃癌を検出する方法を提供する。メチル化の頻度とは，測定対象となる DNAの所与の領域中に存在するジヌクレオチド CpGのシトシンのうち，メチルイ匕されているシトシンの数もしくは割合を意味する。あるいは，メチル化の頻度とは，検体力調製した DNAの集合物にぉ、て特定の位置の CpGカ^チル化されている割合を意味する。被験者力も採取した検体としては，組織試料，血液，血清または血漿を用いることができる。好ましくは，本発明の方法においては， ACM G1遺伝子のプロモーター， 5，非翻訳領域，第 1ェクソンおよび第 1イントロンを含む領域におけるメチルイ匕の頻度を測定する。特に好ましくは，本発明の方法においては， ACMG1遺伝子の上述の領域中の CpGアイランドにおけるメチルイ匕の頻度を測定する。

[0007] 別の観点においては，本発明は，被験者から採取した検体中の ACMG1遺伝子の発現量を測定することにより，胃癌を検出する方法を提供する。 ACMG1遺伝子の発現量とは， ACMG1遺伝子から転写される mRNAの量，または ACMG1蛋白質の量をいう。

[0008] 別の観点においては，本発明は，配列番号 3 (図 10)で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50塩基を有するオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた，配列番号 5 (図 12)で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50塩基を有するオリゴヌクレオチド，および配列番号 6 ( 図 13)で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50塩基を有するオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは， ACMG1遺伝子のメチルイ匕の頻度を測定するためのプライマーやプローブとして用いることができる。特に好ましい態様においては，本発明は，配列番号7— 26 (図14 16)で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50塩基を有するオリゴヌクレオチドを提供する。

[0009] 別の好ましい態様においては，本発明は，次の配列を有するプライマーおよびプローブを提供する。

フォワードプライマー： 5，- AGYGAGAGAGYGYGAAYGAGTT- 3，（配列番号 27) リバースプライマー： 5，- RCCRACTCCRCCRTAAC- 3，（配列番号 28)

プローブ： 5，- TGGTTCGGCGTTCGT- 3' (配列番号 29)

(式中， Y=Cまたは T, R=Aまたは G)

また別の好ましい態様においては，本発明は，配列番号 30— 39 (表 1)のいずれかで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。

[0010] 本発明はさらに，これらの本発明のオリゴヌクレオチドを含む，胃癌を検出するためのキットを提供する。

[0011] 別の観点においては，本発明は，胃癌治療薬の候補物質を選定する方法を提供する。 1つの態様においては，本発明の方法は，試験物質の存在下および非存在下にお、て哺乳動物細胞を培養し，それぞれの細胞における ACMG1遺伝子のメチル化の頻度を測定し，そして，メチル化を抑制する効果を有する試験物質を胃癌治療薬の候補物質として選定する，の各工程を含む。また別の態様においては，本発明の選定方法は，試験物質の存在下および非存在下にお!/、て哺乳動物細胞を培養し ,それぞれの細胞における ACMG1遺伝子の発現量を測定し，そして， ACMG1遺伝子の発現を促進する効果を有する試験物質を胃癌治療薬の候補物質として選定する，の各工程を含む。

[0012] さらに別の観点においては，本発明は，配列番号 2 (図 9)で示されるアミノ酸配列をコードする新規 DNAを提供する。好ましくは本発明の DNAは配列番号 1 (図 8)で示される塩基配列を有する。また別の観点においては，本発明は，配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはそのフラグメントを提供する。 ACMG1遺伝子のメチルイ匕が生じている細胞に ACMG1遺伝子を外的に導入して発現させると，細胞の増殖が抑制されることから，本発明にしたがう ACMG1遺伝子ならびに ACMG1蛋白質は，癌細胞の増殖抑制剤として作用しうると考えられる。

[0013] さらに別の態様においては，本発明は，配列番号 1で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50塩基を有するオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは， ACMG1遺伝子またはその転写産物を増幅および Zまたは検出するためのプローブおよびプライマーとして有用である。

発明の効果

[0014] 本発明は，胃癌の診断，ならびに胃癌治療薬の候補物質のスクリーニングに有用である。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]図 1は， ACMG1遺伝子の構造および CpGアイランドを示す。

[図 2]図 2は，各種細胞株における ACMG1の異常メチルイ匕の検出を示す。

[図 3]図 3は， ACMG1の発現の測定結果を示す。

[図 4]図 4は， DNMT阻害剤および HDAC阻害剤で処理した腫瘍細胞における ACMG 1遺伝子の再発現を示す。

[図 5]図 5は，臨床例における ACMG1のメチルイ匕の検出を示す。

[図 6]図 6は，異種移植片におけるメチルイ匕の解析の結果を示す。

[図 7]図 7は， ACMG1遺伝子による胃癌細胞株の増殖抑制を示す。

[図 8]図 8は， ACMG1 cDNAの塩基配列を示す。

[図 9]図 9は， ACMG1 cDNAによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

[図 10]図 10は， ACMG1遺伝子の一部の塩基配列を示す。

[図 11]図 11は，図 10に示される塩基配列に相補的な配列を示す。

[図 12]図 12は，図 10に示される配列を有する DNAを重亜硫酸塩処理したときに得られる DNAの配列を示す。

[図 13]図 13は，図 11に示される配列を有する DNAを重亜硫酸塩処理したときに得られる DNAの配列を示す。

[図 14]図 14は， GM2および GM3の塩基配列，ならびこれらの配列を有する DNAを重亜硫酸塩処理したときに得られる DNAの配列を示す。

[図 15]図 15は， GM4および GM5の塩基配列，ならびこれらの配列を有する DNAを重亜硫酸塩処理したときに得られる DNAの配列を示す。

[図 16]図 16は， GM6の塩基配列，ならびこれらの配列を有する DNAを重亜硫酸塩処理したときに得られる DNAの配列を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 本発明者らは，ヒト染色体 22qllに存在する遺伝子断片 MINT25の近傍に新規遺伝子を同定した。この遺伝子は CABIN1と 3'端のェクソンを共有することから，この遺伝子 Alternative transcript of CABIN 1 Methylated in uastnc Cancer 1 (ACM Gl)と名付けた。 ACMG1遺伝子の転写開始点力も約 1.2kb上流， 5'非翻訳領域，第 1ェクソン，および第 1イントロンの一部を含む配列を図 10 (配列番号 3)に，その相補鎖の配列を図 11 (配列番号 4)に示す。また， ACMG1の cDNAの配列を図 8 (配列番号 1)に，この配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を図 9 (配列番号 2) にそれぞれ示す。 ACMG1と遺伝子 C末端を共有する CABIN1は，蛋白質の脱リン酸化酵素であるカルシ-ュリンの活性ィ匕を抑制する蛋白として同定されたものである (Im munity, 8: 703, 1998)。 ACMG1はカルシ-ュリンと相互作用しうるドメインを有する力核移行シグナルなどを有さず， CABIN1とは異なった生理的機能を有する遺伝子であると考えられる。これまで， CABIN1と遺伝子 C末端を共有するァイソフォームの報告はない。

[0017] 胃癌の発生には， APCや K-ras, p53などの遺伝子変異が関与すると報告されているが，その頻度は低く，胃癌発症のメカニズムに関しては不明な点が多い。本発明においては， ACMG1力胃癌において異常メチルイ匕により不活ィ匕されていることが明ら力となった。 ACMG1の遺伝子機能の解析により，胃癌発症の分子機構の解明につながる可能性がある。また， ACMG1遺伝子の異常メチルイ匕は，胃癌に特異的であり ,正常組織や他の腫瘍では頻度が低いため，腫瘍マーカーとして有用であると考えられる。 ACMG1遺伝子の異常メチルイ匕を指標として，血清を用いた遺伝子診断への応用が可能であり，胃癌の早期診断や術後の再発のモニタリングへの応用が期待される。

[0018] ACMG1遺伝子のメチルイ匕を測定することにより胃癌を検出する本発明の方法は，次のようにして行うことができる。まず，被験者から DNAを含有する検体を採取し， D NAを調製する。検体としては，組織試料，血液，血清または血漿，尿，唾液，腹水，痰，糞便，脾液，胆汁液等を用いることができる。組織試料には，手術あるいは内視鏡により摘出した組織またはその一部，生検標本，臓器洗浄液などが含まれる。好ましくは，検体としては被験者の血清または臓器洗浄液を用いる。試料から DNAを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，フノール'クロロホルムによる抽出を用いることができる。ある！/、は巿販の DNA抽出試薬を用いてもょヽ

[0019] DNAのメチル化の程度や頻度を測定するためには， COBRA (Combined bisulfit e restriction analysis)法や重亜硫酸塩シークェンシング法等を用いることができる。これらの方法は， DNAを重亜硫酸塩等の非メチルイ匕シトシン修飾試薬で処理すると，メチル化されていないシトシンはゥラシルに変換されるが，メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されない，という原理に基づく。 DN Aのメチルイ匕を高感度にかつ半定量的に解析する技術として Methylight法がある。 Methylight法では、メチルイ匕特異的配列を認識するようなプライマーと TaqMan Probeを組み合わせてリアルタイム PCR法によりメチルイ匕の検出を行う。

[0020] 配列番号 3で示される ACMG1遺伝子の配列を有する二本鎖 DNAを重亜硫酸塩で処理すると，トップストランドからは図 12 (配列番号 5)に示される配列が，ボトムストランドからは図 13 (配列番号 6)に示される配列が得られる。これらの配列中， Yで表される塩基は， CpGのシトシン力メチル化されている場合には Cであり， CpGのシトシンカ^チルイ匕されていない場合には Tである。なお，シトシンを重亜硫酸塩で処理するとゥラシルが生ずるが，本明細書および図面においては，このゥラシルを T (チミン）と表す。これは， DNAの PCR増幅においてゥラシルの位置はチミンとして合成されること，および PCR増幅およびノヽイブリダィゼーシヨンにおけるオリゴヌクレオチド配列の相補性の説明に関する限り，ゥラシルはチミンと同じとして扱うことが可能であるためである。

[0021] COBRA法では，上記のように抽出した DNAを重亜硫酸塩で処理する。処理の条件としては，例えば，の DNAを 2規定の水酸ィ匕ナトリウムで 37°Cで 10分間処理した後， 3M重亜硫酸塩で 50°Cで 16時間処理する，等の条件を用いることができる。その後， DNA精製カラムなどを用いて，重亜硫酸塩を除き，エタノール沈殿後， DN Aを精製水に溶解して 80°Cにて使用時まで保存する。次に，重亜硫酸塩で処理した DNAをテンプレートとして， ACMG1遺伝子中の標的領域を増幅するよう設計されたプライマーセットを用いて PCRを行う。

[0022] 標的領域とはメチルイ匕を検出すべき領域である。好ましくは，標的領域は ACMG1 遺伝子のプロモーター， 5，非翻訳領域，第 1ェクソンおよび第 1イントロンを含む領域であり，より好ましくはこの領域中の CpGアイランドである。本発明の特に好ましい態様においては，メチル化を検出すべき領域は，図 1Bに示される GM2〜GM6である。 GM2〜GM6の塩基配列，ならびにこの配列を有する二本鎖 DNAを重亜硫酸塩で処理したときに得られる塩基配列を図 14— 16に示す。

[0023] PCRに用いるプライマーは，配列番号 3— 6 (図 10— 13)で示される ACMG1遺伝子の配列および重亜硫酸塩処理後の配列に基づ!/、て，容易に設計することができる。プライマーは，メチルイ匕されている可能性のあるシトシンを含まないように設計してもよく，あるいはメチル化されている可能性のあるシトシンについて，シトシンとゥラシルの、ずれにもハイブリダィズするように，適切な配列の混合物として設計してもよ!/、。好ましいプライマーの例としては，例えば，配列番号 30— 39 (表 1)の配列を有するプライマーのセットが挙げられる。オリゴヌクレオチドは，例えば汎用の DNA合成装置（例えば， Applied Biosystems社製 Model 394)を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは，当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれを用いて合成してもよい。

[0024] 次に， PCR増幅産物を制限酵素により切断する。制限酵素は，目的とする CpGのシトシンカチルイ匕されている場合 (シトシン）にのみ切断するか，あるいはメチルイ匕されていない場合 (ゥラシル Zチミン）にのみ切断するよう選択する。切断産物を電気泳動で分析することにより，標的カ^チルイ匕されている力否力，および Zまたはメチル化の頻度を判定することができる。

[0025] 一例として， GM2領域におけるメチルイ匕を検出する手順を説明する。 GM2領域の塩基配列は図 14において配列番号 7 (トップストランド）および配列番号 9 (ボトムストランド）として示されており， CpGの位置には下線が施されている。上述のようにして精製した DNAを重亜硫酸塩で処理すると，トップストランドは配列番号 8で示される配列に，ボトムストランドは配列番号 10で示される配列に，それぞれ変換される。これらの配列中， Yで表される塩基は， CpGのシトシンカ^チル化されている場合には C であり，メチル化されていない場合には T(U)である。これらのいずれの場合にもハイブリダィズするように設計されたプライマーを用いて， GM2領域を PCR増幅することができる。例えば，表 1の配列番号 30および 31で示される配列のプライマーセットを用いることができる。次に， PCR増幅産物を制限酵素 Nrulにより切断する。 Nrulは，配列 5'—TCGCGA—3'を認識して二本鎖 DNAを切断するため， CpGのシトシンカチルイ匕されてヽる場合には切断が生じ，メチル化されてヽなヽ場合には切断が生じない。したがって，切断産物を電気泳動で分析することにより，メチルイ匕されているか否か，ある、はメチルイ匕されて、る割合を判定することができる。

[0026] 重亜硫酸塩シークェンシング法では，上述の COBRA法と同様にして標的を含む領域を PCR増幅させ，次に PCR増幅産物の塩基配列を直接シークェンシングして解析する。

[0027] あるいは，重亜硫酸塩処理とハイブリダィゼーシヨンとを組み合わせてメチルイ匕を検出することもできる。すなわち，上述の COBRA法と同様にして標的を含む領域を PC R増幅させ，次に標的領域中の塩基配列と相補的であるように設計したメチルイ匕特異的プローブおよび Zまたは非メチル化特異的プローブと PCR増幅産物とをハイブリダィズさせる。メチル化特異的プローブとは，調べるべき特定の CpGのシトシンがメチル化されている場合（シトシン）にのみハイブリダィズするプローブであり，非メチル化特異的プローブとは，目的とする CpGのシトシンカ^チルイ匕されて、な、場合 (ゥラシル Zチミン）にのみハイブリダィズするプローブである。 PCR増幅産物とこれらのプローブとの間にハイブリダィゼーシヨンが生ずるか否力，またはハイブリダィゼーシヨンが生じた割合を調べることにより，調べるべき CpGのシトシン力メチルイ匕されているか否か，またはメチルイ匕の頻度を判定することができる。このような方法に用いることができるプライマーおよびプローブの好ましい一例は以下のとおりである。

フォワードプライマー: 5， -AGYGAGAGAGYGYGAAYGAGTT-3，（配列番号 27) リバースプライマー: 5， -RCCRACTCCRCCRTAAC-3，（配列番号 28)

プローブ: 5 ' - TGGTTCGGCGTTCGT- 3 ' (配列番号 29)

(式中， Y=Cまたは T, R=Aまたは G)

[0028] DNAのメチルイ匕の頻度を測定する別の方法として，メチルイ匕特異的 PCRを利用することができる。この方法では，上記のように抽出した DNAを重亜硫酸塩で処理した後，これをテンプレートとして，メチルイ匕特異的プライマーを用いる PCRと非メチルイ匕特異的プライマーを用いる PCRとを別々に行う。メチル化特異的プライマーとは， AC MGl遺伝子中の目的とする CpGのシトシンカチルイ匕されている場合 (シトシン）にのみハイブリダィズするよう設計されたプライマーであり，非メチルイ匕特異的プライマーとは，目的とする CpGのシトシンカチルイ匕されて、な、場合 (ゥラシル Zチミン）にのみハイブリダィズするよう設計されたプライマーである。このようなプライマーは，配列番号 5および 6で示される配列に基づ、て， Yで示される塩基または相補鎖における対応する塩基を適切に選択することにより，容易に設計することができる。これらのプライマーを用いて PCRを行うことにより， ACMG1遺伝子中の目的とする CpGのシトシン力メチルイ匕されている場合にはメチルイ匕特異的プライマーから PCR増幅産物が得られ，メチル化されて、な、場合には非メチルイ匕特異的プライマーカゝら PCR増幅産物が得られる。これらの増幅産物の量をゲル電気泳動などの手段により測定して比較することにより， ACMG1遺伝子中の目的とする領域中の DNAのメチル化の頻度を判定することができる。

[0029] 以上のような各種の方法を用いて，検体に含まれる ACMG1遺伝子のメチルイ匕の頻度を測定し，次に，これを健常人に由来する検体に含まれる ACMG1遺伝子のメチル化の頻度と比較することにより，検体における胃癌細胞の存在を検出することができる。

[0030] 本発明の別の態様においては， ACMG1遺伝子の発現量を測定することにより胃癌を検出する方法は，次のようにして行うことができる。 ACMG1遺伝子の発現量として A CMG1遺伝子カゝら転写される mRNAの量を測定する場合には，検体から RNAを抽出し，例えば， RT— PCR法，ノザンブロット法等の方法を用いて ACMG1 mRNAを定量する。試料から RNAを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており ,例えば，グァ-ジンイソチオシァネートおよびフエノール'クロ口ホルム抽出を用いることができる。 ACMG1遺伝子の発現量として ACMG1蛋白質の量を測定する場合には， ACMG1蛋白質に対する特異的抗体を用いて，ウェスタンブロット法， ELISA 法，免疫沈降法等の方法により測定することができる。 ACMG1蛋白質に対する特異的抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法により，配列番号 2で示されるァミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドを用いて哺乳動物を免疫することにより容易に得ることができる。

[0031] 別の観点においては，本発明は，胃癌治療薬の候補物質を選定する方法を提供する。後述の実施例において示されるように，本発明においては，メチルイ匕によって ACMG1の発現が抑制されている胃癌細胞株に ACMG1遺伝子を外的に導入することにより，コロニーフォーメーションアツセィにて細胞増殖が抑制されたこと，およびメチルイ匕阻害剤およびヒストン脱ァセチルイ匕阻害剤の存在下では ACMG1の遺伝子発現が回復したことが見出された。すなわち， ACMG1は癌抑制遺伝子としての機能を有することが示唆された。したがって， ACMG1遺伝子のメチルイ匕を抑制してその発現を促進しうる物質，または他のいずれかの方法により ACMG1遺伝子の発現を促進しうる物質は，胃癌の予防および治療に有用であることが期待される。

[0032] 1つの態様においては，本発明の選定方法は，試験物質の存在下および非存在下にお、て哺乳動物細胞を培養し，それぞれの細胞における ACMG1遺伝子のメチル化の頻度を測定し，そして，メチル化を抑制する効果を有する試験物質を胃癌治療薬の候補物質として選定する，の各工程を含む。また別の態様においては，本発明の選定方法は，試験物質の存在下および非存在下において哺乳動物細胞を培養し，それぞれの細胞における ACMG1遺伝子の発現量を測定し，そして， ACMG1 遺伝子の発現を促進する効果を有する試験物質を胃癌治療薬の候補物質として選定する，の各工程を含む。本発明の方法において用いられる哺乳動物細胞としては ,哺乳動物由来の癌組織力分離された細胞またはその初代培養物を用いてもよく ,榭立された細胞株を用いてもよい。

[0033] ACMG1遺伝子のメチルイ匕が生じている細胞に ACMG1遺伝子を外的に導入して発現させると，細胞の増殖が抑制されることから，本発明にしたがう ACMG1遺伝子ならびに ACMG1蛋白質は，癌細胞の増殖抑制剤として有用であると考えられる。したがつて，本発明のさらに別の観点においては，配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする新規 DNAおよび配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはそのフラグメントが提供される。これらの DNA,蛋白質またはそのフラグメントは，胃癌の予防および治療に有用であると考えられる。

[0034] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2005— 220779号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

[0035] 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例 1

[0036] 新規遣伝子 ACMG1の同定

本発明者らは先に， MCA法により大腸癌において異常にメチルイ匕している DNA断片を検出した。その 1つである ΜΙΝΤ25は胃癌において高率にメチルイ匕していることが報告されて、る。この ΜΙΝΤ25の近傍に BLASTプログラムによるホモロジ一検索にて， Tリンパ球におけるカルシ-ュリンの内因性の阻害剤である CABIN1と， 1つの ESTを同定した。また GENSCANを使うことにより，この ESTの部位に 1つの新しい遺伝子を同定した。この遺伝子は CABIN1と 3'端のェクソンを共有することより，この遺伝子を厶 lternative transcript of L.ABIN1 Methylated in Gastric Cancer 1 、 CMGl)と名付けた。図 1Aに ACMG1遺伝子の一部の構造を示す。その遺伝子配列は図 10 ( 配列番号 3)に示される。縦線はェクソンを示す。上段は Cabinl,下段は ACMG1を示す。この 2つの遺伝子のうち， MINT25を 5'端に持ち，転写活性に影響を与えうる遺伝子は ACMG1であった。よって ACMG1力胃癌においてメチル化によって発現が抑制されていることが示唆された。図 1Bは， ACMG1の CpGアイランドの模式図を示す。 MINT25は ACMGlの Exon 1に位置する。縦線は CpGサイトを，矢印は転写開始点を示す。

実施例 2

[0037] 各糠細朐株における ACMG1の異常メチル化の枪出

各種細胞株 (胃癌細胞株： SNU638, HSC39, HSC40, HSC41, HSC42, HSC43 , HSC44, HSC45, MKN7, MKN28, MKN45, MKN74, JRST, KatoIII, NUGC3 , 大腸癌細胞株: Caco2, RKO, SW48, HCT116, DLD- 1, LoVo, HT29, SW4 80)より DNAを抽出し， COBRA法を用いて ACMG1上流に存在する CpGアイランドのメチルイ匕にっ、て調べた。 CpGアイランドに GM2〜GM6までプライマーを 6つ設定し検討した。各プライマーの位置は図 1Bに，それぞれの配列は以下の表に示される。

[0038] [表 1]

o80voovOOOO-£ Ή ε -£JbvIDW---

メチル化の解析は，重亜硫酸塩- PCR法を用いた。簡単には， DNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理後， PCRを行レ、，メチルイ匕している CpG部位のみを切断する制限酵素により PCR増幅産物を消化後，ァガロースにて電気泳動を行った。画像解析装置（ Atto, Lane and Spot Analayzer)にて，メチノレイ匕ァレノレの比率を定量した。

[0040] 図 2Aにメチルイ匕検出の結果を示す。上段に胃癌細胞株，下段に %メチルイ匕を示す。 Mはメチル化しているアレルを示す。左に使用したプライマーを示す。 ACMG1の異常メチル化は GM2,GM4,GM5に限局する細胞株 (17例中 14例， 82%)と GM2〜GM6の全てに及ぶ細胞株の二種類に分類された（図 2A)。

[0041] 次に， ACMG1の個々の CpGのメチル化の状態を調べるために， GM2領域がメチル化して!/、る胃癌細胞株 MKN7および MKN28につ!/、て，重亜硫酸塩シークェンシング法にて個々の CpGサイトのメチル化について解析した。図 2Bに結果の一部を示す。 Mはメチルして!/、る CpGサイトを示す。 PCRにより増幅した領域には 22の CpGサイトが含まれており， COBRA法でメチル化を認めた胃癌細胞株 MKN7および MKN28において，解析した領域全体に高密度のメチル化を認めた。以上の結果から， GM2がメチル化して!/、ると， CpGアイランドの広!、範囲にわたりメチル化して!/、ることが示唆された。

[0042] 大腸癌細胞株と血液造血器腫瘍細胞株について，転写開始点を含む GM2におけるメチルイ匕の状態を COBRA法にて検出した。大腸癌では 8例中 1例（13%) ,血液造血器腫瘍では 12例中 2例（17%)とメチルイ匕の頻度は胃癌と比べてかなり低い値だつた（図 2C)。このことから， ACMG1は胃癌において高頻度にメチル化していることが分かった。

実施例 3

[0043] ACMG1の発現の測定

ACMG1の異常メチルイ匕が遺伝子の発現抑制と相関する力検討する目的で， RT-P CRにより， GM2がメチル化して!/、な!/、細胞株とメチル化して!/、る細胞株における AC MG1の発現を解析した。腫瘍細胞株および患者カゝら採取した胃癌組織力ゝら RNAを抽出し，逆転写酵素を用いて cDNAを作成した。得られた cDNAを用いて， RT- PCR法およびリアルタイム PCR法により遺伝子発現の解析を行った。ネガティブコントロールとして，逆転写反応を行わずに調整したサンプル (RT-)で同時に PCR反応を行った。結果を図 3Aに示す。 ACMG1遺伝子は， COBRA法により GM2のメチル化が認められない細胞株（MKN74, NUGC4, HSC41, LoVo, HT29, SW480)で発現を認めた。 GM2でメチル化を認める細胞株（JRST, HSC39, HSC40, HSC42, HSC43, HSC4 4, HSC45, MKN28)においては， ACMG1の発現は抑制されていた。比較的弱いメチル化を認める細胞株, KatoIIIでは発現の減弱を認めた。これらの結果から， ACMG 1の転写開始点を含む GM2にメチル化があると，発現が抑制されることが示唆された

[0044] 各胃癌細胞株について，メチル化パターンと ACMG1遺伝子発現との相関を調べた。胃癌細胞株は ACMG1の GM2〜GM6各領域におけるメチル化パターンにより， 2つのグループに分けることができた。 1つは CpGアイランドの辺縁の GM3,GM6のメチルィ匕を認めるが， CpGアイランドの中心部の GM2,GM4,GM5がメチル化していないもの（ group 1),もう 1つは，解析した全領域力 Sメチルイ匕しているもの (group2)である（図 3B)。各グループにおける各プライマー設定部位の %メチルイ匕の平均値をサークルに示す。上段に各プライマー設定部位を示す。 ACMG1の発現の状態を右に示す。 groupl は ACMG1の発現を認め， group2は ACMG1の発現は認められなかった。このことより , ACMG1の発現には， GM2, GM4, GM5つまり CpGアイランドの中心部のメチル化が関与して!/、ることが示唆された。

実施例 4

[0045] DNMT阻害剤および HDAC阻害剤で処理した腫瘍細胞における ACMG1遣伝子の再懇

ACMG1遺伝子の発現の抑制における DNAメチルイ匕の役割をさらに検討する目的で，メチル化により発現が消失している胃癌細胞株 HSC44と HSC45を， DNAメチル化 (DNMT)阻害剤である 5-ァザ- dCと，ヒストン脱ァセチル化（HDAC)阻害剤である TS Aにて処理し，遺伝子の再発現を認めるかどうかを調べた。結果を図 4に示す。左が HSC44,右が HSC45を示す。図 4Bの縦軸は，ァセチル化ヒストンの量を input (内因性のコントロール)で補正した値を示す。 ₅-ァザ- dC 0.2 Mでは再発現および TSA処理ではほとんど発現を認めなかったが， 5-ァザ -dC 0.2 μ Μと TSAを組み合わせると ,強く再発現を認めた。また 5-ァザ -dC 2.0 /z Mにて処理すると，強い再発現を認めた。以上より ACMG1は， DNAメチルイ匕により発現が抑制されていることが示唆された（図 4)。

実施例 5

[0046] 臨床例における ACMG1のメチル化についての枪討

胃癌およびその他の癌の臨床組織検体から， DNAを調製し，重亜硫酸塩- PCR法を用いて， ACMG1の発現消失と最もよく相関すると考えられる GM2領域のメチルイ匕について検討した。その結果，胃癌床例 77例中 52例（68%) ,大腸癌症例 50例中 5 例（10%) ,急性リンパ球性白血病 10症例例中 1例（10%) ,卵巣癌症例 12例中 1例（8 %) ,頭頸部癌症例 24例中 2例（8%)メチルイ匕を認め，他の腫瘍に較べ，胃癌において高率に ACMG1のメチルイ匕が認められた。また，胃癌周辺の正常胃粘膜については， 1例もメチルイ匕は認められな力つた。検出の一例を図 5Aに示す。 Tは胃癌組織， Nは癌周辺の正常胃粘膜を示す。 Mはメチルイ匕して、るアレルを示す。

[0047] また，細胞株においては，胃癌では 15/19 (79%) ,大腸癌では 1/8 (13%) ,血液造血液腫瘍では 2/12(17%), 胃癌とはいずれも有意水準 1%で，有意差を認めた。初代組織培養では，胃癌では， 52/77 (68%) ,大腸癌では 5/50 (10%) , ALL 1/10 (10% )，卵巣癌では 1/12 (8%) ,頭頸部癌では 2/24 (8%)であり，有意水準 1%で，いずれも有意差を認めた。このように， ACMG1は，細胞株においても初代組織培養においても，胃癌においてのみ，高率にメチルイ匕しており，胃癌との関与が考えられた。

[0048] 次に，重亜硫酸塩シークェンシング法により，胃癌臨床例における転写開始点周囲の，個々の CpGサイトのメチル化について解析した。 GM2領域力メチル化している臨床例 6T,8Tおよびその周囲の正常粘膜 6N,8Nにおけるメチルイ匕について検討した。結果を図 5Bに示す。シークェンスした領域には 10の CpGサイトのメチル化が存在した。 Mはメチル化している CpGサイトを Uはメチル化していない CpGサイトを示す。すなわち， COBRA法にてメチル化を認めた症例では解析した全ての CpGサイトにお!、てメチルイ匕を認めることが示された。一方隣接非癌組織においては全ての CpGサイトがメチルイ匕していなかった。

[0049] 以上の結果から， ACMG1のメチルイ匕は，他の組織由来の腫瘍と比べ胃癌において高頻度であり，胃癌周囲の正常胃粘膜で 1例もメチルイ匕していないことより，癌特異的にメチルイ匕する遺伝子であることが示唆された。すなわち， ACMG1のメチルイ匕は腫瘍マーカーとして有用であると考えられる。

実施例 6

[0050] 虽糠移槭片におけるメチル化の解析

ヒト胃癌手術材料をヌードマウスに移植し，異種移植片を作製した。移植約 2週間後に移植片を採取し， DNAおよび RNAの抽出を行った。胃癌異種移植片 15例について， COBRA法を用いて ACMG1の GM2におけるメチル化を調べた（図 6A)。 Mはメチルイ匕しているアレルを示す。下段に %メチルイ匕を示す。 15例中 7例 (47%)と高率にメチル化を認めた。また，リアルタイム PCRを用いて， ACMG1の発現量について定量的に解析した。結果を図 6Bに示す。

[0051] メチル化が認められないサンプルでは ACMG1が発現しており，メチル化が認められるサンプルでは ACMG1は発現していなかった。また部分的にメチル化しているものは，弱い発現を認めた。したがって，メチルイ匕の割合と発現量とは関連があると考えられた。

実施例 7

[0052] ACMG1遣伝子による胃癌細朐株の増殖抑制についての検討

ACMG1遺伝子による細胞増殖抑制について検討するために，胃癌細胞株に ACM G1遺伝子を外的に導入して発現させ，その効果を調べた。 ACMGのベクターとしては，サイトメガロウィルスのプロモーターにり発現制御を受け，ネオマイシン (G418)に而性の遺伝子をもつ pcDNA3.1ベクター (invitrogen)に ACMG 1 cDNAを導入した pcDN A3.1-ACMG1を用いた。このベクターを， ACMG1がメチル化にて発現が抑制されていると考えられる細胞株 HSC44と HSC45にトランスフォーメーションした。コントロールとしては， pcDNA3.1ベクターだけをトランスフォーメーションしたものを使用した。トランスフォーメーション 6時間後，細胞を 8倍に希釈し, 24時間後 400 g/mlの G418を含む培地において 14日間培養した。その後メタノールで固定し， 0.25%クリスタルバイォレットにて染色し，コロニー数を NIH Imageソフトウェアにて定量した。

[0053] コントロールである pcDNA3.1のみトランスフォーメーションしたものに比べて， ACM Gl cDNAを導入した場合，コロニーの増殖が抑制された（図 7A)。コントロールを 10 0としたときの相対的なコロニー数は， HSC44では 30%, HSC45では 35%と著明に増殖が抑制されて、た（図 7B)。以上より ACMG1が細胞増殖抑制能を有することが示唆された。

実施例 8

[0054] rfnj胄用いた ACMG1遣伝早の虽常メチル化の檢出

ACMG1の異常が胃癌に高頻度であること，また異常メチルイ匕が腫瘍特異的であること力，胃癌患者力も採取した血清を用いて， ACMG1の異常メチルイ匕の検出を行つた。血清における ACMG1の異常メチル化は ACMG1が異常メチル化している胃癌症例 20例中 15例に認め，高い検出率を示した。一方， ACMG1が異常メチルイ匕していない胃癌症例 12例では一例もメチルイ匕を認めず，高い特異性を示した。このことから , ACMG1のメチルイ匕を測定することにより，血清を用いて胃癌の診断が可能であることが示された。

実施例 9

[0055] 胃洗浄液を用いた ACMG1遣伝子の異常メチル化の枪出

ACMG1遺伝子の異常メチルイ匕を胃洗浄液力も検出する目的で，胃洗浄液力も DN Aを調製し，重亜硫酸塩処理して，メチライト (methylight)法によりメチルイ匕の検出を行った。 ACMG1の異常メチルイ匕は，胃癌症例 16例力も得た胃癌組織中 12例で認められ，そのうち 9例では胃洗浄液においてもメチルイ匕が認められた (感度 75%)。胃癌組織中でメチルイ匕が認められなカゝつた 4例では，胃洗浄液におけるメチルイ匕は 1例も認めな力つた (特異度 100%)。以上の結果から，胃洗浄液からの ACMG1のメチルイ匕検出は，胃切除後の残胃癌の診断や再発の予測に有用と考えられた。

産業上の利用可能性

[0056] 本発明は，胃癌の診断および胃癌治療薬の候補物質のスクリーニングに有用である。

Claims

請求の範囲

[I] 被験者力も採取した検体において， ACMG1遺伝子のメチルイ匕の頻度を測定することにより，胃癌を検出する方法。

[2] 被験者から採取した検体中の ACMG1遺伝子の発現量を測定することにより，胃癌を検出する方法。

[3] 被験者力も採取した検体が，組織試料，血液，血清または血漿である，請求項 1または 2に記載の方法。

[4] 配列番号 3で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50 塩基を有するオリゴヌクレオチド。

[5] 配列番号 5で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50 塩基を有するオリゴヌクレオチド。

[6] 配列番号 6で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50 塩基を有するオリゴヌクレオチド。

[7] 配列番号 7— 26で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6

50塩基を有するオリゴヌクレオチド。

[8] 配列番号 27— 29のヽずれかで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。

[9] 配列番号 30— 39のヽずれかで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。

[10] 請求項 4 9のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む，胃癌を検出するためのやット。

[II] 胃癌治療薬の候補物質を選定する方法であって，試験物質の存在下および非存在下にお、て哺乳動物細胞を培養し，それぞれの細胞における ACMG1遺伝子のメチル化の頻度を測定し，そして，メチル化を抑制する効果を有する試験物質を胃癌治療薬の候補物質として選定する，の各工程を含む方法。

[12] 胃癌治療薬の候補物質を選定する方法であって，試験物質の存在下および非存在、て哺乳動物細胞を培養し，それぞれの細胞における ACMG1遺伝子の発現量を測定し，そして， ACMG1遺伝子の発現を促進する効果を有する試験物質を胃癌治療薬の候補物質として選定する，の各工程を含む方法。

[13] 配列番号 2で示されるアミノ酸配列をコードする DNA。

[14] 配列番号 1で示される塩基配列を有する請求項 13記載の DNA。

[15] 請求項 13または 14に記載の DNAを含む，癌細胞の増殖抑制剤。

[16] 配列番号 1で示される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の連続する 6— 50 塩基を有するオリゴヌクレオチド。

[17] 配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはそのフラグメント。