WO2005026355A1 - 癌化度評価方法 - Google Patents

癌化度評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005026355A1
WO2005026355A1 PCT/JP2004/013885 JP2004013885W WO2005026355A1 WO 2005026355 A1 WO2005026355 A1 WO 2005026355A1 JP 2004013885 W JP2004013885 W JP 2004013885W WO 2005026355 A1 WO2005026355 A1 WO 2005026355A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cytosine
dna
gene
methylation
evaluation method
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/013885
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshikazu Ushijima
Atsushi Hagihara
Original Assignee
Sumitomo Chemical Company, Limited
Japan As Represented By President Of National Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Company, Limited, Japan As Represented By President Of National Cancer Center filed Critical Sumitomo Chemical Company, Limited
Publication of WO2005026355A1 publication Critical patent/WO2005026355A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
    • C12Q2523/125—Bisulfite(s)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • G protein-coupled receptor 7 gene (hereinafter sometimes referred to as GPR7 gene) in cancer cell lines and cancer tissue specimens was found to be immortalized normally.
  • the present inventors have found that they are methylated at a significantly higher frequency than cell lines and normal tissue specimens, and have led to the present invention.
  • the methylation frequency of a gene is determined by the presence of one or more 5'-CG-3's in the base sequence in the promoter, untranslated or translated region of the gene.
  • tissue is a viscera tissue
  • cancer is a pancreatic cancer
  • the methylation frequency of the gene is the methylation frequency of cytosine in the nucleotide sequence represented by one or more 5'-CG-3 'present in the nucleotide sequence in the promoter region of the gene.
  • the methylation frequency of a gene is determined by determining the methylation of cytosine in the nucleotide sequence represented by one or more 5'-CG-3's present in the nucleotide sequence in the untranslated cut region or translated region of the gene. The evaluation method described in 1 above, wherein the evaluation frequency is
  • the methylation frequency of the gene is the methylation frequency of cytosine in one or more nucleotide sequences represented by 5'-CG-3 'existing in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Figure 1 shows human-derived immortalized (normal) ⁇ duct epithelial cells (HPDE-4 / E6E7 and PDE6-E6E7 c7) and 7 types of knee cancer cell lines (BXPc3, HPAF-I K Capan-2, Mi aPaCa -2, genomic DNA prepared from Hs766T, PANC-1 and 3 ⁇ 4PAC) and treated with sodium bisulfite were subjected to PCR, and the PCR reaction solution after PCR was analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • FIG. The names of the cells used are indicated at the top.
  • the figure described as HPDE4 / SssI shows the DNA obtained by treating the genomic DM of HPDE-4 / E6E7 with the methylase SssI. Lane U, PCR reaction using unmethylation-specific primer; Lane M, PCR reaction using methylation-specific primer ⁇ .
  • FIG. 2 shows genomic DNA prepared from 12 samples each of human-derived vicinal cancer tissue and its surrounding normal skeletal tissue [obtained by obtaining informed consent from the patient] and treated with sodium bisulfite.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of performing PCR as a template and analyzing the PCR reaction solution after PCR by agarose gel electrophoresis. Casel to Casel2 showed the specimen. Cancer indicates the viable cancer tissue, and Normal indicates the normal tissue of the surrounding viscera. Lane U, PCR reaction solution using unmethylation-specific primers; lane PCR reaction solution using methylation-specific primers. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • untranslated region and truncated region (coding region) of human G-protein-coupled receptor 7 gene Of the exons responsible for the genomic DNA, the base sequence of the genomic DNA containing the exon located at the most 5 'upstream (hereinafter referred to as exon 1) and the promoter region located at the 5' upstream is, for example, And Genbank Accession No. AC009800.
  • exon 1 the base sequence of the genomic DNA containing the exon located at the most 5 'upstream
  • the promoter region located at the 5' upstream is, for example, And Genbank Accession No. AC009800.
  • nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC009800 for example, the nucleotide sequence of exon 1 of the human G protein in-coupled receptor 7 gene is represented by nucleotide numbers 76666 to 77652.
  • the G protein-coupled receptor 7 gene used in the present invention includes, in addition to the above-mentioned gene having a known nucleotide sequence, a natural difference in the nucleotide sequence due to a species difference, an individual difference or a difference between organs and tissues of the organism. Also, a gene having a base sequence in which a base is deleted, substituted, or added due to a mutation occurring in the above is included. In mammals, there is a phenomenon in which only cytosine is methylated among the four types of bases that make up a gene (genomic DNA). For example, in a G protein-coupled receptor 7 gene derived from a mammal, a part of cytosine in the genome DNA of the gene is methylated.
  • methylation frequency refers to, for example, that the cytosine is methylated when a plurality of haploids are examined for the presence or absence of cytosine methylation in the CpG to be investigated.
  • Samples derived from mammals in the first step of the evaluation method of the present invention may include, for example, cancer cells such as victory cancer cells or tissues containing the same, and DNAs derived from cancer cells such as pancreatic cancer cells.
  • tissues containing them include blood, plasma, serum, lymph, Teng fluid, lymph nodes, etc.
  • body secretions urine And milk
  • examples include victory tissues (including bovine fluid) collected from test animals.
  • biological samples may be used directly as a sample, or biological samples prepared by various operations such as separation, fractionation, and immobilization from the biological sample may be used as the sample.
  • a method for measuring the methylation frequency of the G protein-coupled receptor 7 gene contained in a specimen derived from a mammal may be performed, for example, as follows.
  • a first method after contacting a DNA derived from a sample with a reagent that modifies unmethylated cytosine, the DNA is converted into a type II, and the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed can be identified.
  • a polymerase chain reaction hereinafter, referred to as “PCR” is performed using primers to determine the amount of amplification product obtained.
  • DNA is extracted from a mammal-derived specimen using, for example, a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from the blood according to an ordinary method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen to remove DNA (such as kidney cancer cells) contained therein.
  • DNA such as kidney cancer cells
  • DNA from cancer cells such as kidney cancer cells can be analyzed while avoiding DNA from blood cells.
  • the sensitivity for detecting a tissue or the like containing the same can be improved.
  • the extracted DNA is brought into contact with a reagent that modifies non-methyl cytocytosine, and then the DNA is used as a type ⁇ using a primer capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed. Perform PCR to determine the amount of amplification product obtained.
  • the cytosine to be analyzed is a nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the G protein-coupled receptor 7 gene. You can choose from among cytosines.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the G protein-coupled receptor 7 gene includes human-derived Gp.
  • the nucleotide sequence of a genomic DNA containing exon 1 of the protein-coupled receptor 7 gene and the promoter region located 5 ′ upstream of the exon 1 can be given, and more specifically, represented by SEQ ID NO: 1. (Corresponding to the base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 in the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene is represented by nucleotide numbers 1666 to 2652.
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a high methylation frequency (ie, hypermethyl at ion)). More specifically, cytosine having a high methylation frequency in knee cancer cells includes, for example, nucleotides 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542, 1560 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a reagent for modifying unmethylated cytosine for example, bisulfite such as sodium bisulfite can be used.
  • a reagent that specifically modifies only methylated cytosine may be used.
  • To contact the extracted feNA with a reagent that modifies unmethylated cytosine for example, first denature the DNA with an alkaline solution (pH 9 to 14), and then add sodium bisulfite. Treat at 55 ° C for about 10 to 16 hours (overnight) with bisulfite (concentration in solution: 3M final concentration, for example).
  • denaturation at 95 ° C and reaction at 50 ° C can be repeated 10-20 times.
  • unmethylated cytosine is converted to peracyl, while methylated cytosine is not converted to peracyl and remains cytosine.
  • the nucleotide sequence [cytosine at the methylated position ⁇ cytosine in CpG] is the cytosine of cytosine.
  • PCR primers (methylation-specific primers) that are specific to the base sequence that contains the DNA, and PCR primers that are specific to the base sequence containing unmethylated ⁇ cytosine (a non-methylation-specific primer) Design based on DN chains that have been chemically converted by bisulfite treatment and are no longer complementary. Therefore, based on each strand of DNA that was originally double-stranded, a methylation-specific primer and an unmethylation-specific primer can be prepared from each strand.
  • a primer is preferably designed to include cytosine in CpG near the 3 'end of the primer in order to increase the specificity of methyl and non-methyl. Also, one of the primers may be labeled to facilitate analysis.
  • primers for measuring the frequency of methylation-specific PCR of the G protein-coupled receptor 7 gene by methylation-specific PCR include, for example, the promoter region of the G protein-coupled receptor 7 gene. It can be designed as described above based on a base sequence containing one or more cytosines in CpG present in the base sequence in the untranslated region or the translated region (coding region).
  • cytosine in CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, specifically, in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542, It can be designed based on the nucleotide sequence containing one or more cytosines represented by 1560, 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620 and the like. Examples of such primers are shown below.
  • reaction solution for methylation-specific PCR for example, 50 ng of DNA to be ⁇ 3 ⁇ , each primer solution of 1 Opmol / ⁇ l to each of 11 , 2.5 mM dNTP, 2.5 1 with 10X buffer (I OODIM Tris-HCl ⁇ 8.3, 500 mM KCK 20 mM MgCl 2 ), and 5 U / 1 of heat-resistant raw DNA polymerase. 21 and mixed with sterile ultrapure water to make a liquid volume of 251 to obtain a reaction solution.
  • the amount of the obtained amplification product is narrowed down.
  • an analysis method denaturing polyacrylamide gel electrophoresis agarose gel
  • the gel after electrophoresis is stained with DNA to detect the band of the amplification product, and the concentrations of the detected bands are compared.
  • a pre-labeled primer can be used to compare the band concentration using the label as an index.
  • real-time PCR is a PCR method that can be used.
  • the method for performing real-time PCR include a method using a probe such as a ⁇ ⁇ -dependent nucleic acid polymerase probe and a method using an intercalation method such as Cyber Green.
  • Commercially available devices and reagent kits can be used as devices and reagents for real-time PCR. Such a method is generally called methylation-specific PCR, and is a method reported by Herman et al.
  • DNA derived from a sample is brought into contact with a reagent that modifies unmethylated cytosine, and then the DNA containing cytosine to be analyzed is analyzed by PCR using the DNA as a ⁇ -type DNA.
  • a method of directly analyzing the base sequence of the amplification product can be mentioned.
  • DNA is extracted from a mammal-derived specimen using, for example, a commercially available DN extraction kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from the blood according to an ordinary method. Analyzes of free DNA (including DNA derived from cancer cells such as victory cancer cells) contained in the prepared or prepared plasma or serum as a sample, avoiding DNA derived from blood cells. DNA derived from cancer cells such as lung cancer cells can be analyzed, and the sensitivity of detecting cancer cells such as fan cancer cells and tissues containing the same can be improved.
  • the DNA is converted into a type III, and the promoter, untranslated or translated region of the G protein in-coupled receptor 7 gene ( Analysis by performing PCR using a primer designed as described below based on the base sequence containing cytosine in the base sequence represented by one or more CpGs present in the base sequence of the coding region) DNA containing the target cytosine is amplified, and the nucleotide sequence of the resulting amplification product is directly analyzed.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the G protein in-coupled receptor 7 gene includes human-derived nucleotide sequences.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the G protein-coupled receptor 7 gene and the promoter region located 5 ′ upstream of the gene can be given, and more specifically, represented by SEQ ID NO: 1.
  • a base sequence (corresponding to the base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 in the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene is represented by nucleotide numbers 1666 to 2652.
  • the base sequence selected for the primer design does not contain cytosine at all, it is complementary to the selected base sequence and the base sequence! 3 ⁇ 4;
  • Each of the base sequences can be directly used as the base sequence of the primer.
  • the primers should be taken into consideration that these cytosines are converted to peracil. Design. That is, a pair of primers each having a base sequence in which all cytosines are peracyl and a base sequence complementary to the base sequence are designed.
  • DNA (294 bp) having a base sequence after bi sul fite treatment of DNA having a base sequence represented by base numbers 813-1106 of SEQ ID NO: 1 Amplify.
  • the primer pair has base numbers 900, 902, 905, 922, 928, 930, 936, 957, 959, 961, 971, 971, 974, 980, 982, 989, 999, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. It can be used as a primer for examining the methylation frequency of cytosine represented by 1005, 1028, 1040, 1047, 1061, 1067 and 1070.
  • reaction conditions for example, after keeping the above-mentioned reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, the reaction solution is heated at 95 ° C for 30 seconds, then at 50 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 30 seconds. Conditions for performing 30 to 40 cycles of one cycle of heat retention are mentioned.
  • the base sequences of the obtained amplification products are compared, and the methylation frequency is measured from the comparison.
  • the extracted DNA is brought into contact with a reagent for modifying unmethylated cytosine, and then the DNA is hybridized with a probe capable of determining whether or not the cytosine to be analyzed is methylated. Then, the presence or absence of binding between the DNA and the probe is examined.
  • the cytosine to be analyzed is contained in the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the G protein in-coupled receptor 7 gene. You can choose from among cytosines.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region, or translated region (coding region) of the G protein-coupled receptor 7 gene includes human-derived Gp.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the protein-coupled receptor gene and the promoter region located 5 ′ upstream of the gene can be given. More specifically, the nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 1.
  • a base sequence (corresponding to the base sequence represented by base number 75001 ⁇ 78000 in the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of the human G protein-coupled receptor 7 gene is represented by nucleotide numbers 1666 to 2652.
  • a hypermethylation state hyperenne tliyl ation
  • examples of cytosine having a high methylation frequency in kidney cancer cells include, for example, nucleotides 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, and 1526 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. , 1542, 1560, 1564, 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620 and the like.
  • the probe used in the hybridization is converted into non-methylated cytosine-peracil based on the nucleotide sequence containing cytosine to be analyzed, and the cytosine is methylated. It is advisable to design in consideration of the fact that is not converted to peracil.
  • the DNA may be pre-amplified by performing PCR in the same manner as in the second method using DNA treated with bisulfite or the like as type II. Next, hybridization is performed between the DNA treated with bisulfite or the like or the DNA amplified in advance by the PCR and a probe capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed. By comparing the amount of DNA binding to the methylation-specific probe with the amount of DNA binding to the unmethylation-specific probe, the frequency of cytosine methylation to be analyzed can be measured.
  • the salt concentration in the washing step is selected, for example, from 50 ° C (low stringency conditions) at 2 X SSC to 50 (high stringency conditions) at 0.2 X SSC. be able to.
  • the temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C (high stringency conditions). Also, both salt concentration and temperature can be varied.
  • the amount of DNA bound to the methylation-specific probe and the amount of DNA bound to the unmethylation-specific probe are compared to determine the cytosine to be analyzed. It is possible to measure the frequency of methylation of cytosine (ie, cytosine in CpG contained in the base sequence on which the probe was designed).
  • a fourth method is to apply a restriction enzyme capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed to DNA derived from a sample, and then check for digestion by the restriction enzyme. You can also.
  • the cytosine to be analyzed is cytosine in the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the G protein-coupled receptor 7 gene. You can choose from.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region, or translated region (coding region) of the G protein-coupled receptor 7 gene includes human-derived Gp.
  • nucleotide sequence of a genomic DNA containing exon 1 of the prote in-coupled receptor 7 gene and a promoter region located 5 ′ upstream of the gene can be mentioned. More specifically, SEQ ID NO: 1 (Corresponding to the base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 in the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800). In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of exon 1 of the G protein-coupled receptor 7 gene derived from human is represented by nucleotide numbers 1666 to 2652.
  • it shows a high methylation frequency (that is, hypermethylation state) in cancer cells such as hepatic cancer cells.
  • examples of cytosine having a high methylation frequency S in kidney cancer cells include, for example, nucleotides 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, and 1542 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Digest the recognition sequence containing methylated cytosine such as the “restriction enzyme capable of distinguishing the presence or absence of cytosine methylation” (hereinafter sometimes referred to as a methylation-sensitive restriction enzyme) used in the method. And a restriction enzyme capable of digesting recognition sequences containing unmethylated cytosine.
  • the recognition sequence containing methylated cytosine such as the “restriction enzyme capable of distinguishing the presence or absence of cytosine methylation” (hereinafter sometimes referred to as a methylation-sensitive restriction enzyme) used in the method.
  • a restriction enzyme capable of digesting recognition sequences containing unmethylated cytosine.
  • DNA in which the cytosine contained in the recognition sequence is methylated the DNA is not cleaved by the action of a methylation-sensitive restriction enzyme, while the DNA in which the cytosine contained in the recognition sequence is not methylated is treated.
  • the DNA is cleaved by the action of a methylation-sensitive restriction enzyme.
  • methylidani-sensitive enzymes include, for example, HpaI I, BstUI, Narl, SacI I, and the like.
  • DNA treated with a methylation-sensitive restriction enzyme containing the cytosine to be analyzed in the recognition sequence is converted into type II, and PCR was carried out using a primer pair capable of amplifying DNA containing a recognition sequence containing cytosine to be analyzed and not containing the recognition sequence of the restriction enzyme other than the recognition sequence, and the DNA was amplified ( (Amplification product).
  • cytosine to be analyzed is methylated, an amplification product is obtained. On the other hand, if the cytosine to be analyzed is not methylated, no amplification product can be obtained.
  • the frequency of cytosine methylation to be analyzed can be measured.
  • real-time monitoring of PCR reaction products and analysis of force kinetics enable high-precision quantification that can detect, for example, a slight difference of about twice the amount of gene.
  • the amount of each product can also be compared using real-time PCR, a PCR method.
  • the methylation frequency of the G protein-coupled receptor 7 gene contained in a sample derived from a mammal is higher than that of the control (the G protein-coupled receptor 7 If it is in a methylated state), it can be determined that the degree of canceration of the sample is higher than that of the control compared to the control.
  • the term “degree of canceration” has the same meaning as generally used in the art. Specifically, for example, when a mammal-derived specimen is a cell, it means the degree of malignancy of the cell. In addition, for example, when the specimen derived from a mammal is a tissue, it means the amount of cancer cells present in the tissue.
  • primers or probes that can be used in various methods for measuring the methylation frequency of the G protein-coupled receptor or 7 gene are used as kit reagents for detecting cancer cells such as kidney cancer cells. Useful.
  • the present invention relates to a kit for detecting cancer cells such as pancreatic cancer cells containing these primers or probes as reagents, a viable cancer cell comprising these primers or probes immobilized on a carrier, etc.
  • the present invention provides a method for detecting cancer cells, and the scope of the evaluation method of the present invention is similar to that of the above-described detection kit / detection chip utilizing the substantial principle of this method. This includes use in various forms.
  • Example 1 (Confirmation test of methylation status of G protein-coupled receptor 7 gene in pancreatic cancer cell line)
  • the recovered precipitate was dissolved in TE buffer (10 mM Tris, lmM EDTA, pH 8.0), RNase A (Sigma) was added thereto to a concentration of 40 g / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. The incubated mixture was subjected to phenol-form mouth extraction. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added thereto to a concentration of 0.5N, followed by ethanol precipitation to recover a precipitate (genomic DNA). The recovered precipitate was rinsed with 70% ethanol to obtain genomic DNA.
  • TE buffer 10 mM Tris, lmM EDTA, pH 8.0
  • RNase A Sigma
  • reaction solution for PCR 25 ng of type I DNA, 20 pmol / xI of the above primer solution, 2.5 mM of each 2 mM dNTP, 10 ⁇ buffer solution (10 mM buffer) s-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 20 mM MgCl 2 ), 2 and 51, and thermophilic DNA polymerase 5 U / 1 at 0. are mixed, and sterile ultrapure water is added thereto to adjust the volume. 25 il was used.
  • unmethylation-specific primer incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 t: for 30 seconds, then at 57 for 30 seconds and further at 72 ° C.
  • PCR was carried out under the condition that 32 cycles of incubation were performed with 30 seconds as one cycle.
  • the reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, and then heated at 62 ° C for 30 seconds and then at 62 ° C for 30 seconds and further at 72 ° C.
  • PCR was performed under the condition that 32 cycles of incubation were performed with 30 seconds as one cycle.
  • the PCR reaction solution containing the amplification product was subjected to 2-agast-mouth gel electrophoresis.
  • pancreatic cancer cell lines other than PANC-1 (BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, and HPAC)
  • cytosine represented by base numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1603, 1613 and 1620 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is methylated in these adenocarcinomas. was determined to be.
  • DNA was purified from the inked liquid using Wizard DNA clean-up system (Promega). Dissolve the purified DNA in TE buffer and add sodium hydroxide to it. After being added to a degree of 0.3 M, the mixture was left at room temperature for 5 minutes. In the next stage, the precipitate (DNA) was recovered by ethanol precipitation of the left standing mixture. The collected precipitate was suspended in 20 jt of TE buffer.
  • the obtained DNA was designated as type III, and PCR was performed using the following unmethylation-specific primers U1 and U2 or methylation-specific primers Ml and M2.
  • unmethylation-specific primers U1 and U2 were used, 145 bp having the nucleotide sequence obtained by subjecting DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1478 to 1622 of SEQ ID NO: 1 to bi isul fite treatment
  • the DNA having the nucleotide sequence of base numbers 80 to I623 of SEQ ID NO: 1 was subjected to bisulfitte treatment.
  • a 144 bp DNA having the subsequent nucleotide sequence is amplified.
  • M2 5'-AACGCCCTACGAAACTCAACG-3 '(SEQ ID NO: 5) Specificity of methylation-specific primer and non-methylation-specific primer f was determined to be immortalized (normal) Teng tube epithelial cell line as described in Example 1. Genomic DNA (l) of (HPDE-4 / E6E7) and a part of it have been treated with methylase Sssl (NEB) and confirmed in genomic DNA (2).
  • PCR reaction solution 25 ng of DNA to be type II, 20 pmol / i of the above-mentioned primer solution of 11 each, 2 mM of dNTP, 10X buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3 500 mM KC1 , 20 mM MgCl 2 ) was mixed with 2-51 and heat-resistant MA polymerase 5 ⁇ / 1 was mixed with 0.21, and sterilized ultrapure water was added to make a liquid volume of 251.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＧ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　７遺伝子のメチル化頻度を測定する第一工程、及び（２）測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法等に関する。

Description

明細書
癌ィヒ度評価方法
技術分野
本発明は、 哺乳動物由来の検体の痙化度を評価する方法等に関する。 背景技術
癌が遺伝子異常を原因とする疾病であること等が次第に明らかになりつつあるが、 癌患者の死亡率は未だ高く、現在利用可能な診断方法や治療方法等が必ずしも十分に 満足できるものではないことを示している。癌を早期に発見し、発見された癌に対す る有効な治療方法を選択し、 さらに、 治療後には癌再発の有無確認等のアフターケア を行うことは、 臨床的に重要である。
そこで、癌を早期に発見するための診断方法、癌に対する治療方法の有効性の評価 、癌再発の有無確認等に適する、遺伝子異常の検出に基づいた哺乳動物由来の検体の 癌化度評価方法の開発が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 かかる状況の下、 鋭意検討した結果、癌細胞株及び癌組織検体にお いて G protein-coupled receptor 7遺伝子 （以下、 GPR7遺伝子と記すこともある。 ） が、不死化正常細胞株及び正常組織検体と比較して有意に高い頻度でメチル化されて いることを見出し、 本発明に至った。
即ち、 本発明は、
1 . 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
( 1 )哺乳動物由来の検体に含まれる G protein-coupled receptor 7遺伝子のメチル 化頻度を測定する第一工程、 及び
( 2 )測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に 基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法 （以下、 本発明評価方法と記すこともある。 ） ； 2 . 哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする前項 1記載の評価方法； 3 . 哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
4. 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該檢体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
5 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該檢体の癌ィ匕度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
6 . 組織が塍臓組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徴とする前項 5記載 の評価方法；
7 . 遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳 領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の 5' -CG- 3'で示される塩基配列中のシト シンのメチル化頻度であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
8 . 組織が勝臓組織であって、 かつ、癌が藤臓癌であることを特徴とする前項 7記載 の評価方法；
9 .遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域にある塩基配列内に存 在する一つ以上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシ卜シンのメチル化頻度である ことを特徴とする前項 1記載の評価方法；
1 0 .遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳截域又は翻訳領域にある塩基配 列内に存在する一つ以上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻 度であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
1 1 .遺伝子のメチル化頻度が、配列番号 1で示される塩基配列内に存在する一つ以 上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチ レ化頻度であることを特徴と する前項 1記載の評価方法；
1 2 . 組織が勝臓組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徴とする前項 1 1 記載の評価方法；
1 3 .癌マーカーとしての、メチル化された G protein-coupled receptor 7遺伝子の 使用；
1 4. 癌マーカ一が勝臓癌マーカーであることを特徴とする前項 1 3記載の使用； 等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト由来の不死化 （正常） 塍管上皮細胞帐 （HPDE-4/E6E7及び PDE6- E6E7 c7) 及び膝臓癌細胞株 7種 (BXPc3、 HPAF-I K Capan— 2、 Mi aPaCa-2, Hs766T、 PANC- 1及び ¾PAC)から調製され、 かつ、亜硫酸水素ナトリウム処理されたゲノム DNAをそれ ぞれ铸型として PCRを行い、 PCR後の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動で分析した 結果を示した図である。使用した細胞の名前を上部に示した。 なお、 HPDE4/Sss Iと記 載された図は、 HPDE-4/E 6E 7のゲノム DMをメチル化酵素 S s s Iで処理して得られた DNA を示す。 レーン U、 非メチル化特異的プライマ一を用いた PCRの PCR反応液； レーン M 、 メチル化特異的プライマーを用いた PCRの PCR反応^。
図 2は、 ヒト由来の勝臓癌組織及びその周辺の塍臓正常組織 [患者からィンフォー ムドコンセントを得て入手]各 1 2検体から調製され、 かつ、 亜硫酸水素ナトリウム 処理されたゲノム DNAをそれぞれ铸型として PCRを行 、 PCR後の PCR反応液をァガロー スゲル電気泳動で分析した結果を示した図である。 Ca se l〜Case l 2は、検体を示し た。 Cancerは勝臓癌組織、 Normalはその周辺の滕臓正常組織のデ一夕を示した。 レ一 ン U、 非メチル化特異的プライマーを用いた PCRの PCR反応液；レーン メチル化特異 的プライマーを用いた PCRの PCR反応液。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、 癌マ一カー （例えば、 勝臓癌マ一力一等） としての、 メチル化された G protein-coupled receptor 7遺伝子の使用等に関連する発明である。
本発明においてマーカー遺伝子として用いられる G protein-coupl ed receptor 7 遺伝子としては、 例えば、 G protein- coupled recept or 7遺伝子の非翻訳領域 （non -coding region) 及び翻訳領域（コーディング領域） とその 5， 上流に位置するプロ モーター領域とを含むヒト由来の遺伝子をあげることができる。 ヒト由来の G prote in-coupled receptor 7遺伝子の塩基配列とそれにコードされるアミノ酸配列は、 例 えば、 Genbank Access ion No. NM— 005285等に記載されている。 また、 ヒト由来の G p rotein-coupled receptor 7遺伝子の非翻訳領域及び截 Ϊ訳領域 （コーディング領域） を担うェクソンのうち、 最も 5 ' 上流側に位置するェクソン （以下、 ェクソン 1と記 す。 ） と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩 基配列は、 例えば、 Genbank Access ion No. AC009800等に記載されている。 Genbank Access i on No. AC009800に記載される塩基配列において、 例えば、 ヒト由来の G prot e in- coupled receptor 7遺伝子のェクゾン 1の塩基配列は、 塩基番号 76666〜77652 に示されている。
本発明において利用される G protein-coupled receptor 7遺伝子には、上記の公知の 塩基配列を有する遺伝子のほか、 かかる塩基配列に、 生物の種差、個体差若しくは器 官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が 生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。 哺乳動物では、 遺伝子（ゲノム D N A ) を構成する 4種類の塩基のうち、 シトシン のみがメチル化されるという現象がある。 哺乳動物由来の、 例えば、 G protein-cou l ed receptor 7遺伝子では、 当該遺伝子のゲノム D N Aの一部のシトシンがメチル 化されている。
そして、 D NAのメチル化修飾は、 5' -CG- 3'で示される塩基配列 （Cはシトシンを 表し、 Gはグァニンを表す。 以下、 当該；^基配列を CpGと記すこともある。 ） 中のシト シンに限られる。 シトシンにおいてメチリレイ匕される部位は、 その 5位である。細胞分 裂に先立つ D N A複製に際して、 複製竄後は铸型鎖の CpG中のシトシンのみがメチル 化された状態となるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の CpG中のシト シンもメチル化される。
従って、 D NAのメチル化の状態は、 D NA複製後も、新しい 2組の D NAにその まま引き継がれることになる。 本発明評価方法の第一工程において「メチル化頻度」 とは、 例えば、 調査対象とな る CpG中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、 当 該シトシンがメチル化されているハプロィドの割合で表される。 本発明評価方法の第一工程における哺乳動物由来の検体としては、例えば、勝臓癌 細胞等の癌細胞若しくはそれを含む組織、及び、塍臓癌細胞等の癌細胞由来の D N A が含まれる可能性のある、 細胞、 それを含む組織 （ここでの組織とは、 血液、 血漿、 血清、 リンパ液、 滕液等の体液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ） 若しくは体 分泌物 （尿や乳汁等） 等の生体試料をあげることができる。具体的には、 例えば、 癌 が S萃臓癌である場合、被験動物から採取された勝臓組織（塍液を含む）等をあげるこ とができる。
これらの生体試料はそのまま検体として用いてもよく、また、 かかる生体試料から 分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いても よい。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発 明評価方法の利用が期待できる。 本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動物由来の検体に含まれる G protein-c oupled receptor 7遺伝子のメチル化頻度を測定する方法は、 例えば、 以下のように 行えばよい。 第一の方法として、検体由来の D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接 触させた後、該 D NAを铸型とし、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別 可能なプライマーを用いてポリメラーゼチェイン反応 （以下、 ： P C Rと記す。 ） を行 い、 得られる増幅産物の量を調べる方法をあげることができる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる避離 D NA (塍臓癌細 胞等の癌細胞由来の D N Aが含まれる）を分析すると、血球由来の D N Aを避けて滕 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。 次いで、抽出された D NAを、非メチルイヒシトシンを修飾する試薬と接触させた後 、該 D NAを铸型として、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプ ライマ一を用いて P C Rを行い、得られる増幅産物の量を調べる。解析対象とするシ トシンは、 G protein-coupled receptor 7遺伝子のプロモー夕一領域、非翻訳領域又 は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される 塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、 G protein-coupled receptor 7遺伝子のプロモータ一領域、非翻訳領域又 は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される 塩基配列としては、ヒト由来の G protein- coupl ed receptor 7遺伝子のェクソン 1と 、その 5 '上流に位置するプロモー夕一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列を あげることができ、 より具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Acc ess ion No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩基 配列に相当する。 ） があげられる。配列番号 1で される塩基配列においては、 ヒト 由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1 666〜2652に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示され る塩基配列中のシトシンは、例えば、勝臓癌細胞筝の癌細胞において高いメチル化頻 度 （即ち、 髙メチル化状態 （hypermethyl at ion) ) を示す。 さらに具体的には、 膝臓 癌細胞においてメチルイ匕頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示され る塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560 、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1520等で示されるシトシンをあげる ことができる。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、坷えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 (bi sul f i te) 等を用いることができる。 因みに、 原理的には、 メチル化 シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シトシンを修飾する試薬と抽出され feD N Aとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （p H9〜14) で変性した後、 亜硫酸水素ナトリウム 等の重亜硫酸塩 （b i sul f i t e) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時 間 （一晩） 程度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95°Cでの変性と、 50°Cでの 反応を 10-20回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチル化されていないシトシンは ゥラシルに変換され、 一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シトシンのままである。
次いで、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを铸型とし、 かつ、 メチル化されたシ卜シ ンが含まれる場合の塩基配列 [メチル化される位置のシトシン <CpG中のシトシン） はシトシンのままであり、 メチル化されていないシトシン （CpGに含まれないシトシ ン）はゥラシルとなった塩基配列] とかかる塩基配列に対して相 ¾的な塩基配列から それぞれ選ばれる一対めメチル化特異的プライマーを用いる PCR (以下、 メチル化特 異的 P C Rとも記すこともある。 ） と、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを鐯型とし、 かつ、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがゥラシル となつた塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列 、らそれぞれ選ばれ る一対の非メチル化特異的プライマーを用いる PCR (以下、 非メチル化特異的 P C R とも記すこともある。 ） とを行う。
上記 PCRにおいて、 メチル化特異的プライマーを用いる PCRの場合 （前者） には、 解 析対象とするシトシンがメチル化されている DNAが増幅され、 一 、 非メチル化特異 的プライマーを用いる PCRの場合 （後者） には、 解析対象とするシトシンがメチル化 されていない DNAが増幅される。 これらの増幅産物の量を比較することにより、 対象 となるシトシンのメチル化の有無を調べる。このようにしてメチリ！/化頻度を測定する ことができる。 ここで、 プライマ一としては、 メチル化を受けていないシトシンがゥラシルに変換 され、かつ、メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換さ ないことを考慮し て、 メチル化を受けているシトシンを含む塩基配列に特異的な PCRプライマー （メチ ル化特異的プライマ一） を設計し、 また、 メチル化を受けていな^シトシンを含む塩 基配列に特異的な PCRプライマー （非メチル化特異的プライマー > を設計する。 重亜 硫酸塩処理により化学的に変換され相補的ではなくなつた D N 鎖を基に設計する ことから、元来二本鎖であった D N Aのそれぞれの鎖を基に、 それぞれからメチル化 特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを作製することもできる。かかる プライマ一は、 メチル、非メチルの特異性を高めるために、 プライマーの 3'末端近傍 に CpG中のシトシンを含むように設計することが好ましい。 また、 解析を容易にする ために、 プライマ一の一方を標識してもよい。 より具体的には、 G pro tein-coupl ed receptor 7遺伝子の チル化頻度をメチル化 特異的 P C Rで測定するためのプライマーは、 例えば、 G pro te in- coupl ed recept o r 7遺伝子のプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） にあ る塩基配列内に存在する CpG中のシトシンを 1以上含む塩基妃列を基にして、 上記の ようにして設計することができる。例えば、配列番号 1で示される塩基配列中に存在 する CpG中のシトシン、 具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番 号 1480、 1482、 1485、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1 590、 1603、 1613、 1620等で示されるシトシンを 1以上含む塩基配列を基に設計する ことができる。 かかるプライマーの例を以下に示す。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TTTGTGGTGATATTGGGTT-3' (配列番号 2 )
U2： 5' -ACACCCTACAAAACTCAACA-3' (配列番号 3 )
<メチル化特異的プライマー >
Ml： 5' -CGCGGCGATATTGGGTC-3' (配列番号 4 )
M2： 5' -AACGCCCTACGAAACTCAACG-3' (配列番号 5 ) メチル化特異的 PCRにおける反応液としては、 例えば、 铸 3¾とする DNAを 50ngと、 1 Opmol/ ^ lの各プライマー溶液を各 1 1と、 2. 5mM dNTPを 4 1と、 10 X緩衝液（I OODIM Tr i s-HCl ρΗ8· 3、 500mM KCK 20mM MgCl 2 )を 2. 5 1と、 耐熱 f生 DNAポリメラーゼ 5U/ 1を 0. 2 1とを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反応液をあげ ることができる。
反応条件としては、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 9 5°Cにて 30秒間次いで 55〜65°Cにて 30秒間さらに 72 にて 30秒間を 1サイクルとする 保温を 30〜40サイクリレ行う条件があげられる。
かかる PCRを行った後、 得られた増幅産物の量を比絞する。 例えば、 メチル化特異 的プライマーを用いた P C Rと非メチル化特異的プライマーを用いた P C Rで得ら れた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法（変性ポリアクリルアミド ゲル電気泳動ゃァガロースゲル電気泳動）である場合こは、電気泳動後のゲルを D N A染色して増幅産物のバンドを検出し、検出されたバンドの濃度を比較する。 ここで D N A染色の代わりに予め標識されたプライマーを使用してその標識を指標として バンドの濃度を比較することもできる。 また、 定量を必要とする塲合には、 PCR反応 産物をリアルタイムでモニタリングし力イネティックス分析を行うことにより、例え ば、遺伝子量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が 可能な PCR法であるリアルタイム PCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することも できる。 リアルタイム PCRを行う方法としては、 例え ^ 錡型依存性核酸ポリメラーゼ プローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインタ一カレー夕一 を用いる方法等が挙げられる。 リアルタイム PCR法の fこめの装置及び試薬としては、 市販の装置及び試薬キットを利用することができる。 このような方法は、 一般にメチル化特異的 P C Rとち呼ばれ、 Hermanら（Herman e t al .， Pro Nat l . Acad. Sc i USA, 93, 9821-9826, 1996)等により報告されてい る方法であって、シトシンと 5-メチルシトシンとの化学的性質の違いを利用する方法 である。 第二の方法として、検体由来の D N Aを非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触 させた後、該 D NAを铸型として解析対象とするシトシンを含む D NAを P C Rで増 幅し、 得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する方法をあげることができる。 まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D N 抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (勝臓癌細 胞等の癌細胞由来の D NAが含まれる）を分析すると、血球由来の D NAを避けて滕 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、塍扇癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAを、非メチルイ匕シトシンを修飾する試薬と接触させた後 、該 D NAを铸型として、 G prote in-coupled receptor 7遺伝子のプロモーター領域 、 非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列中のシトシンを含む塩基配列を基にして後述するように設計 されるプライマ一を用いて P C Rを行うことにより、解析対象とするシトシンを含む D NAを増幅し、 得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する。
ここで、 G prote in-coupl ed receptor 7遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又 は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される 塩基配列としては、ヒト由来の G pro tein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1と 、その 5 '上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列を あげることができ、 より具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Acc ess ion No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩基 配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト 由来の G protein-coupl ed receptor 7遺伝子のェクソン 1の 基配列は、 塩基番号 1 666〜 2652に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示され る塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密 に存在する領域中に存在する CpG中のシトシンは、 例えば、 I萃臓癌細胞等の癌細胞に おいて高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyperme thyl at i on) ) を示す。 さ らに具体的には、勝臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシ シンとしては、例えば 、 配列番号 1で示される塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 151 3、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等で示さ れるシトシンをあげることができる。 当該 P C Rに用いられるプライマーとしては、解析対象とするシトシンの 5，上流 の塩基配列と 3 '下流の塩基配列を基にして当該シトシンを含む塩基配列を有する D NAを増幅可能なプライマー対を設計するとよレ^プライマー設計のための塩基配列 は、 解析対象とする CpG中のシトシンを含まないように選定する。 そして、 プライマ 一設計のために選定された塩基配列が、 シトシンを全く含まない場合には、選定され た塩基配列及びかかる塩基配列に対して相補！ ¾；な塩基配列をそれぞれそのままブラ イマ一の塩基配列とすることができる。また、プライマ一設計のために選定された塩 基配列が解析対象以外のシトシンを含むが当 シトシンは CpG中のシトシンでない場 合には、これらシトシンがゥラシルに変換されることを考慮してプライマーを設計す る。即ち、全てのシトシンがゥラシルとなった塩基配列とかかる塩基配列に対して相 補的な塩基配列をそれぞれ有する一対のプライマーを設計する。 さらに、プライマ一 設計のために選定された塩基配列が解析対象以外のシトシンを含み当該シトシンは C pG中のシトシンである場合には、メチル化を受けていないシトシンがゥラシルに変換 され、かつ、 メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換されないことを考慮し てプライマーを設計する。即ち、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列 [メチル化される位置のシトシン （CpG中のシ卜シン） はシトシンのままであり、 メ チル化されていないシトシン （CpGに含まれないシトシン） はゥラシルとなった塩基 配列]とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選定された一対のメ チル化特異的プライマーと、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全て のシトシンがゥラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配 列をそれぞれ有する一対の非メチル化特異的プライマーとを設計する。 この場合、上 記の P C Rには、メチル化特異的プライマー対と非メチル化特異的プライマー対とを 等量ずつ混合して用いる。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 （bi sul f i te) 等を用いることがでぎる。 因みに、 原理的には、 メチル化 シトシンのみを修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シトシンを修飾する試薬と抽出された D NAとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （p H9〜14) 中で亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫 酸塩 （b i sul f i t e) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時間 （一晩） 程度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95°Cでの変性と、 での反応を 10- 20回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチル化されていないシトシンはゥラシルに 変換され、一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変渙されず、 シトシンの ままである。
次いで、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを錶型とし、 力つ、 上述するように設計さ れるプライマーを用いる PCRを行う。 得られた増幅産物の塩基酉 S列を比較し当該比較 からメチル化頻度を測定することができる。 より具体的には、 G pro t ein- coup l ed receptor 7遺伝子のメチル化頻度を塩基配列 の直接的解析で測定するためのプライマーは、 例えば、 G pro te in-coupl ed recepto r 7遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） にあ る塩基配列内に存在する CpG中のシトシンを 1以上含む塩基配列を基にして、 上記の ようにして設計することができる。例えば、配列番号 1で示される塩基配列中に存在 する CpG中のシトシン、 具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番 号 900、 902、 905、 922、 928、 930、 936、 957、 959、 961、 971、 974、 980、 982、 989 、 999、 1005、 1028、 1040、 1047、 1061、 1067及び 1070で示される 1以上のシトシン を解析対象として設計することができる。例えば、以下に示すプライマー B 1及び B 2を用いると、 配列番号 1の塩基番号 813〜1 106で示される塩基配列を有する D N A の b i sul f i t e処理後の塩基配列を有する D NA (294bp)が増幅ざれる。該プライマー 対は、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 900、 90 2、 905、 922、 928、 9 30、 936、 957、 959、 961、 971、 974、 980、 982、 989、 999、 1005、 1028、 1040、 104 7、 1061、 1067及び 1070で示されるシトシンのメチル化頻度を調べるためのプライマ —として用いることができる。
<プライマー >
B1： 5' -ATTGGGATGGAAGAAAGGAATT-3' (配列番号 6 )
B2： 5' -AATCTACCTTTCCTAAAACTATC-3 ' (配列番号 Ί ) PCRにおける反応液としては、例えば、铸型とする DNAを 25ngと、 20pmol/ lの各プ ライマー溶液を各 1 1と、 2mM dNTPを 3 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tr i s-HCl pH 8. 3 、 500mM KC1、 15mM MgCl2 )を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ 5U/ 1を 0. 2 1とを 混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反応液をあげることができる 。 反応条件としては、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次いで 50°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保 温を 30〜40サイクル行う条件があげられる。
かかる PCRを行った後、 得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル 化頻度を測定する。
即ち、当該増幅産物の塩基配列を直接的に解析することにより、解析対象とするシ トシンに相当する位置の塩基がシトシンであるかチミン（ゥラシル）であるかを判定 する。得られた増幅産物における塩基を示すピークのチャートにおいて、解析対象と するシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミン（ゥ ラシル）を示すピークの面積とを比較することにより、 解析対象となるシトシンのメ チル化の頻度を測定することができる。また、塩基配列を直接的に解析する方法とし て、 P C Rで得られた増幅産物を一旦大腸菌等を宿主としてクロ一ニングして得られ た複数のクローンから、それぞれクローニングされた D NAを調製し、 当該 D NAの 塩基配列を解析してもよい。解析される試料のうちの解析対象とするシトシンに相当 する位置に検出された塩基がシトシンである試料の割合を求めることにより、解析対 象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することもできる。 第三の方法として、検体由来の D NAを非メチルイ匕シトシンを修飾する試薬と接触 させた後、該 D NAと、解析対象とするシトシンのメチリ! /化の有無を識別可能なプロ 一ブとをハイブリダィゼーションさせ、プローブの結合の有無を調べる方法をあげる こともできる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。 血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (降臓癌細 胞等の癌細胞由来の D N Aが含まれる） を分析すると、血球由来の D N Aを避けて滕 臓癌細胞等の癌細胞由'来の D N Aを解析することができ、降臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後 、該 D N Aと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を讖別可能なプローブとを ハイブリダィゼーシヨンさせ、 前記 D N Aと当該プローブとの結合の有無を調べる。 解析対象とするシトシンは、 G prote in-coupled receptor 7遣伝子のプロモーター領 域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上 の CpGで示される塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、 G protein-coupl ed receptor 7遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又 は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される 塩基配列としては、ヒト由来の G protein-coupl ed receptor マ遺伝子のェクソン 1と 、その 5 '上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列を あげることができ、 より具体的には、 配列番号 1で示される ½基配列 （Genbank Acc ess ion No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001 ^78000で示される塩基 配列に相当する。） があげられる。配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト 由来の G protein-coupl ed receptor 7遺伝子のェクソン 1の 基配列は、 塩基番号 1 666〜2652に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示され る塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密 に存在する領域中に存在する CpG中のシトシンは、 例えば、 J 臓癌細胞等の癌細胞に おいて高いメチル化頻度 （即ち、 髙メチル化状態 （hypenne tliyl at i on) ) を示す。 さ らに具体的には、塍臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシ卜シンとしては、例えば 、 配列番号 1で示される塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 151 3、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等で示さ れるシトシンをあげることができる。 当該八ィブリダイゼ一シヨンに用いられるプロ一ブは、解析^ f象とするシトシンを 含む塩基配列を基にして、 メチル化を受けていないシトシン ゥラシルに変換され、 かつ、メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換されな ことを考慮して設計 するとよい。
即ち、 メチルイ匕されたシトシンが含まれる場合の塩基配列 [メチル化される位置の シトシン （CpG中のシトシン） はシトシンのままであり、 メチスレ化されていないシト シン （CpGに含まれないシトシン） はゥラシルとなった塩基配列] 又はかかる塩基配 列に対して相補的な塩基配列を有するメチル化特異的プローブと、シトシンがメチル 化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがゥラシルとなった塩基配列）又は 力 ^かる塩基配列に対して ffi補的な塩基配列を有する非メチルイ匕特異的プローブを設 計する。 尚、 このようなプローブは、 D NAとプローブとの結合の有無についての解 析を容易にするために標識してから用いてもよい。またプローブを通常の方法に準じ て担体上に固定して用いてもよいが、 この場合には、哺乳動物由来の検体から抽出さ れた D NAを予め標識しておくとよい。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 (bisul f i te) 等を用いることができる。 因みに、 原理的には、 メチル化 シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シトシンを修飾する試薬と抽出された D N Aとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （pH9~14) で変性した後、 亜硫酸水素ナトリウム 等の重亜硫酸塩 （bisul f i te) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時 間 （一晩） 程度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95 での変性と、 50°Cでの 反応を 10- 20回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチル化されていないシトシンは ゥラシルに変換され、 一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シ卜シンのままである。
必要に応じて、重亜硫酸塩等で処理された D N Aを铸型として第二の方法と同様に P C Rを行うことにより当該 D NAを予め増幅させておいてもよい。 次いで、重亜硫酸塩等で処理された DN A又は前記 PC Rで予め増幅された DN A と、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとのハイブリダ ィゼーシヨンを行う。メチル化特異的プローブと結合する DNAの量と、非メチル化 特異的プローブと結合する DNAの量とを比較することにより、解析対象となるシト シンのメチル化の頻度を測定することができる。 より具体的には、 G protein-coupled receptor 7遺伝子のメチル化頻度を測定する ためのプローブは、例えば、 G protein-coupled receptor 7遺伝子のプロモーター領 域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） にある塩基配列内に存在する CpG 中のシトシンを 1以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することがで きる。 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpG中のシトシン、 具体 的には、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 1472、 1480、 1482、 1485 、 1496、 1513、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1 620等で示されるシトシンを 1以上含む塩基配列を基に設計することができる。 かか るプローブの例を以下に示す。
<セッ卜 1>
非メチル化特異的プローブ： 5' -TTGTGAGTTTGTGGTGATA.TTGGGTTG-3' (配列番号 8 ) メチル化特異的プローブ ： 5' -TCGTGAGTTCGCGGCGATA.TTGGGTCG-3 ' (配列番号 9 ) <セット 2>
非メチル化特異的プローブ： 5'- TGTTGAGTTTTGTAGGGT&TT- 3' (配列番号 10) メチル化特異的プローブ ： 5'_CGTTGAGTTTCGTAGGGC&TT- 3' (配列番号 11) ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 Sambrook J., Frisch E. F.， Maniatis T. 著、 モレキュラークロ一ニング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition) 、 コ一ルド スプリング ハーバ一 ラボラトリー発行 （Cold Spring Harbor Laboratory pre ss)等に記載される通常の方法に準じて行うことがでさる。ハイブリダィゼーシヨン は、通常ストリンジェントな条件下に行われる。 ここで「ストリンジェントな条件下 」 とは、 例えば、 6 XSSC (1. 5M NaCl、 0. 1 5W クェン酸三ナトリウムを含 む溶液を 1 0 X SSCとする） を含む溶液中で 4 5 °Cにてハイブリッドを形成させた後 、 2 X SSCで 5 0 °Cにて洗浄するような条件 （Molecular Biol ogy, John Wi ley & Son s, N. Y. (1989) , 6. 3.卜 6. 3. 6)等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩 濃度は、 例えば、 2 X SSCで 5 0 °Cの条件 （低ストリンジエンシーな条件） から 0 . 2 X SSCで 5 0 までの条件 （高ストリンジエンシーな条件） から選択することがで きる。 洗浄ステップにおける温度は、 例えば、 室温 （低スト リンジエンシーな条件） から 6 5 °C (高ストリンジエンシーな条件） から選択することができる。 また、 塩濃 度と温度との両方を変えることもできる。
かかるハイプリダイゼ一シヨンを行った後、メチル化特異的プローブと結合した D NAの量と、非メチル化特異的プローブと結合した D NAの量とを比較することによ り、解析対象となるシトシン（即ち、 プローブの設計の基となった塩基配列に含まれ る CpG中のシトシン） のメチル化の頻度を測定することがでぎる。 第四の方法として、検体由来の D NAに、解析対象とするシトシンのメチル化の有 無を識別可能な制限酵素を作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる方 法をあげることもできる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (降臓癌細 胞等の癌細胞由来の D NAが含まれる）を分析すると、血球白来の D NAを避けて塍 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAに、解析対象とするシトシンの チル化の有無を識別可 能な制限酵素を作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる。解析対象と するシトシンは、 G protein-coupled receptor 7遺伝子のプロモーター領域、非翻訳 領域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示 される塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。 ここで、 G protein-coupl ed receptor 7遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又 は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される 塩基配列としては、ヒト由来の G prote in-coupl ed recept or 7遺伝子のェクソン 1と 、その 5 '上流に位置するプロモータ一領域とが含 れるゲノム D NAの塩基配列を あげることができ、 より具体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Acc ess ion No. AC009800に記載される塩基配列の塩基番号 75001〜78000で示される塩基 配列に相当する。） があげられる。配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト 由来の G protein-coupled receptor 7遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 1 666〜2652に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示され る塩基配列中のシトシン、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密 に存在する領域中に存在する CpG中のシトシンは、 えば、 滕臓癌細胞等の癌細胞に おいて高いメチル化頻度 （即ち、 髙メチル化状態 （hypermethyl at i on) ) を示す。 さ らに具体的には、塍臓癌細胞においてメチル化頻度 S高いシトシンとしては、例えば 、 配列番号 1で示される塩基配列において、 塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 151 3、 1526、 1542、 1560、 1564、 1568、 1570、 1580、 1590、 1603、 1613、 1620等で示さ れるシトシンをぁげることができる。 当該方法で用いられる「シトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素」 （以下 、 メチル化感受性制限酵素と記すこともある。 ) とほ、 メチル化されたシトシンを含 む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化するこ とのできる制限酵素を意味する。認識配列に含まれるシトシンがメチル化されている DNAの場合、 メチル化感受性制限酵素を作用させても当該 DNAは切断されず、 一方、 認 識配列に含まれるシトシンがメチル化されていない DNAの場合、 メチル化感受性制限 酵素を作用させれば当該 DNAは切断される。 メチルイ匕感受性酵素の具体的な例として は、 例えば、 HpaI I、 Bs tUI, Narl、 SacI I等をあげることができる。 当該制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、例えば、解析対象とするシ トシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させた D N Aを铸型とし、解 析対象とするシトシンが含まれる認識配列を含み、当該認言载配列以外には前記制限酵 素の認識配列を含まない D N Aを増幅可能なプライマー対を用いて P C Rを行い、 D NAの増幅（増幅産物） の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とする シトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とす るシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。 このようにし て、増幅された D NAの量を比較することにより、解析対 となるシトシンのメチル 化の頻度を測定することができる。 定量を必要とする場合には、 PCR反応産物をリア ルタイムでモニタリングし力イネティックス分析を行うことにより、例えば、遺伝子 量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が可能な PCR 法であるリアルタイム PCRを用いて、 それぞれの産物の量を比較することもできる。 リアルタイム PCRを行う方法としては、 鍀型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプ ローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターガレーターを用いる方法等 が挙げられる。 リアルタイム PCR法のための装置及び試薬としては、 市販の装置及び 試薬キット等を利用することができる。
例えば、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 694、 1374、 1382、 1754 、 1766、 1859、 2221で示されるシトシンの場合には、 当察シトシンは Nar Iの認、識配 列に含まれており、上記方法により当該シトシンのメチル化頻度を測定することがで さる。 また、 当該制限酵素による消化の有無を調べる他の方法としては、 例えば、解析対 象とするシトシンを認識配列に含むメチル化感受性制限摩素を作用させた D N Aに 対して、 G protein-coupled receptor 7遺伝子に由来し、 ^つ、 当該制限酵素の認識 配列を含まない D N Aをプローブとしたサザンハイブリ夕'ィゼーシヨンを行い、ハイ ブリダィズした D N Aの長さを調べる方法をあげることもできる。解析対象とするシ トシンがメチル化されている場合には、当該シトシンがメチル化されていない場合よ りも長い D N Aが検出される。検出された長い D N Aの量と短い D N Aの量とを比較 することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる 以上のような各種方法を用いて、 哺乳動物由来の検体【こ含まれる G pro tein-coupl ed receptor 7遺伝子のメチル化頻度を測定する。 測定されたメチル化頻度と、 例え ば、塍臓癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含 まれる G protein-coupled receptor 7遺伝子のメチル化頻度 （対照） とを比較して、 当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。例えば、哺乳動 物由来の検体に含まれる G protein-coupled receptor 7遺伝子のメチル化頻度が対 照と比較して高ければ (G protein-coupl ed receptor 7愛伝子が対照と比較の上で高 メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比乾の上で高いと判定すること ができる。
ここで 「癌化度」 とは、 一般に当該分野において使用される意味と同様であって、 具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を 意味し、 また、例えば、 哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における 癌細胞の存在量等を意味している。 本発明評価方法における、 G protein- coupl ed recept or 7遺伝子のメチル化頻度を 測定するための各種方法で使用し得るプライマー又はプローブは、塍臓癌細胞等の癌 細胞の検出用キツトの試薬として有用である。本発明は、 これらプライマー又はプロ 一ブ等を試薬として含有する膳臓癌細胞等の癌細胞の検出用キットゃ、これらプライ マー又はプローブ等が担体上に固定化されてなる勝臓癌細胞等の癌細胞の検出用チ ップも提供しており、本発明評価方法の権利範囲は、当^方法の実質的な原理を利用 してなる前記のような検出用キットゃ検出用チップのような形態での使用も含むも のである。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの ではない。 実施例 1 (塍臓癌細胞株における G protein-coupled receptor 7遺伝子のメチル化 状態の確認試験）
ヒト由来の脬臓癥細胞株 7種 [BXPc3、 HPAF - II、 Capan - 2、 MiaPaCa- 2、 Hs766T、 PA NC - 1及び ¾PAC (全て ATCC製） ] を ATCC (American Type Culture Collection) のカタ ログに記載された、それぞれの細胞株のための専用培地でサブコンフルェントになる まで培養した後、 各々約 lxlO7細胞を集めた。 一般的な不死化の方法 〔Am. J. Patho 1., 148,1763-1770 (1996) 〕 によって得られた不死 ί匕 （正常） 塍管上皮細胞株 2種 (HPDE- 4/Ε6Ε7及び ¾PDE6- E6E7c7) [これらは、 Dr.Tsao (Ontario Cancer Institute and Department of Pathology, Unversity of Toronto) により、 保存 '管理され、 当該研究者から譲受可能である]を、終濃度で 50U/mL( ペニシリン、 及び、終濃度で 5 Oug/mLのストレフ卜マイシンを加えた Keratinocyte— SFM， liquid (Invi trogen社製 ) を培地として、 サブコンフルェントになるまで培養した後、 各々約 lxlO7細胞を集 めた。 集められた細胞に、 SEDTAバッファー [10mM Tr is-HCl (pH8.0) , lOmM EDTA (p H8.0) 、 lOOmM NaCl] を 10倍容量加えた後、 これをホモジナイズした。 得られた混 合物に、 proteinase K (Sigma) を 500 g/ml、 ドデシリレ硫酸ナトリウムを l%(w/v)に なるように加えた後、 これを 55 で約 16時間振とうした。振とう終了後、 当該混合物 をフエノール [1M Tris- HCKPH8.0)にて飽和] ·クロ口ホルム抽出処理した。水層を 回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈澱することによ り沈澱を回収した。 回収された沈澱を TEバッファー （lOmM Tris, lmM EDTA, pH 8.0 ) に溶解し、 これに 40 g/mlになるように RNase A (Sigma) を加えて 37°Cで 1時間ィ ンキュペートした。インキュベートされた混合物をフエノール ·クロ口ホルム抽出処 理した。水層を回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈 澱することにより沈澱（ゲノム DNA) を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールで リンスしてゲノム D N Aを得た。
得られたゲノム DNAを、 制限酵素 BamHIにて消化後、 Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素 トリウム処理した。 即ち、 制 限酵素処理後のゲノム D N A (約 500ng)を蒸留水に溶 して 20 1のゲノム D N A溶 液を調製し、 これに 6M7K酸化ナトリウムを約 1 1カロえた後（終濃度約 0. 3M) 、 当該混 合物を 37°Cで 15分間保温した。 この混合物に、 0. 6mMヒドロキノン（Sigma)を終濃度 0 . 5mM、 亜硫酸水素ナトリウム（Sigma)を終濃度 3. 1Mになるように加えた後、 これを 95 °C30秒間、 次いで 5(T で 15分間を 1サイクルとする保温を 15サイクル行った。 保温さ れた液から Wizard DNA clean-up sys tenKPromega) ¾用いて DNAを精製した。精製され た DNAを 50 1の TEバッファーに溶解し、これに水酸ィ匕ナトリゥムを終濃度 0. 3Mになる ように加えた後、 当該混合物を室温で 5分間放置した。 次いで、 放置された混合物を エタノール沈澱することにより沈澱 (DNA) を回収した。 回収された沈澱を 20 lの T Eバッファーに懸濁した。 得られた DNAを鐽型とし、 以下に示す非メチル化特異的プライマー U1と U2、 又は、 メチル化特異的プライマー Mlと M2を用いて PCRを行つた。 非メチル化特異的プライマ 一 U1と U2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番号 1478〜1622で示される塩基配 列を有する D N Aを b i isul f i te処理した後の塩基酉己列を有する 5bpの DNAが増幅さ れ、一方、 メチル化特異的プライマー Mlと M2とを使月した場合には、 配列番号 1の塩 基番号 1480〜1623で示される塩基配列を有する D ivT Aを bi sul f i te処理した後の塩基 配列を有する 144bpの DNAが増幅される。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TTTGTGGTGATATTGGGTT -3' (配列番号 2 )
U2： 5' -ACACCCTACAAAACTCAACA-3' (配列番号 3 )
<メチル化特異的プライマー >
Ml： 5' -CGCGGCGATATTGGGTC-3' (配列番号 4 )
M2： 5' -AACGCCCTACGAAACTCAACG-3' (配列番号 5 )
メチル化特異的プライマ一および非メチル化特 的プライマーに、特異性があるこ とを確認するため、 まず、 不死化 （正常） 滕管上皮細胞株 （HPDE- 4/E6E7) から通常 の方法でゲノム DNA(DNAl)を抽出し、 この一部をメデル化酵素 Sss l (NEB社） により処 理しゲノム DNAの 5' - CG- 3' 全てをメチル化した (DN 2)。これら DNA1および DNA2につい ても、 メチル化特異的 PCRおよび非メチル化特異的 P CRを行った。 PCRの反応液としては、錶型とする DNAを 25ngと、 20pmo l/ x Iの上記プライマ一溶液 を各 と、 each 2mM dNTPを 2. 5 ^ 1と、 10 X緩衝液（l OOmM Tr i s-HC l pH8. 3、 500mM KC1、 20mM MgCl 2 )を 2· 5 1と、 而 f熱性 DNAポリメラーゼ 5U/ 1を 0. とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 i lとしたものを用いた。 上記の非メチル化特異 的プライマ一を使用した場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 t:にて 30秒間次いで 57 にて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温 を 32サイクル行う条件で P C Rを行った。 また、上記のメチル化特異的プライマーを 使用した場合には、 当該反応液を、 95 にて 10分間保温した後、 にて 30秒間次レ で 62°Cにて 30秒間さらに 72 °Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 32サイクル行う 条件で P C Rを行った。 いずれの場合も、 P C Rを行った後、増幅産物を含む P C R の反応液を 2 ァガ口一スゲル電気 動に供した。
その結果を図 1に示した。 ヒト甶来の不死化 （正常） 滕管上皮細胞株 (HPDE-4/E6E 7及 tJ¾PDE6- E6E7c) の場合において、 非メチル化特異的プライマ一を使用した場合（ レーン U)には増幅された DNAのバンドが認められ、 メチル化特異的プライマーを使用 した場合（レーン M) には増幅された DNAのバンドが検出されなかった。従って、 ヒ卜 由来の不死化（正常） 睦管上皮細胞株（HPDE- 4/E6E7及び HPDE6- E6E7c) の場合にお て、 少なくとも、 配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 1480、 1482、 1485、 149 6、 1603、 1613及び 1620でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていないと判断 された。 また、 PANC-1以外の塍臓癌細胞株 6種 （BXPc3、 HPAF- I I、 Capan- 2、 Mi aPaCa -2、 Hs766T及び HPAC) の場合において、 非メチル化特異的プライマーを使用した場合 (レーン U)には増幅された DMのバンドが検出されず、 メチル化特異的プライマーを 使用した場合（レーン M) には増幅された DNAのバンドが認められた。従って、 当該条 件においては、 これら勝臓癌細胞珠については、配列番号 1で示される塩基配列の塩 基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 1603、 1613及び 1620でそれぞれ示されるシトシンは メチル化されていると判断された。 PANC-1については、非メチル化プライマ一を使用 した場合（レーン U)、 メチル化プライマーを使用した場合（レーン M)共に DNAのバンド が認められた。 従つて PANC- 1につレ ^ては配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 1 480、 1482、 1485、 1496、 1603、 1613及び 1620でそれぞれ示されるシトシンは癌化す ることにより一部メチル化されたものと判断された。 実施例 2 (塍臓癌組織における G protein-coupled receptor 7遺伝子のメチル化状: 態の確認試験）
ヒト由来の滕臓癌組織及びその周辺の塍臓正常組織 [患者からインフォームドコン セントを得て入手] 各 12検#： (Casel〜Casel2) に、 SEDTAバッファ一 [10mM Tris - HCl(pH8.0), lOmM EDTA (ρΗδ.Ο) 、 lOOmM NaCl] を 10倍容量加えた後、 これをホモ ジナイズした。 得られた混合物に、 proteinase K (Sigma) を 500 zg/ml、 ドデシル硫 酸ナトリウムを l%(w/v)になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris - HCKPII8.0)にて飽和] 'クロロホ ルム抽出処理した。水層を回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これをェ 夕ノール沈澱することにより沈澱を回収した。 回収された沈澱を TEバッファー （lOm M Tris, ImM EDTA, H 8.0) に溶解し、 これに 40 g/mlになるように RNase A (Sigm a)を加えて 37 :で 1時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフエノ —ル.クロ口ホルム抽出処理した。水層を回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加え た後、 これをエタノール沈澱することにより沈澱 （ゲノム DNA) を回収した。 回収さ れた沈澱を 70%エタノールでリンスしてゲノム D N Aを得た。
得られたゲノム DNAを、 制限酵素 BamHIにて消化後、 Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。 即ち、 制 限酵素処理後のゲノム DNA (約 500ng)を蒸留水に溶解して 20^1のゲノム DNA溶 液を調製し、 これに 6M水酸化ナトリウムを約 1 l加えた後（終濃度約 0.3M) 、 当該混 合物を 37Tで 15分間保温した。 この混合物に、 0.6m ヒドロキノン（Sigma)を終濃度 0 .5mM、 亜硫酸水素ナトリウム（Sigma)を終濃度 3.1Mになるように加えた後、 これを 95 °C30秒間、 次いで 50°Cで 15分間を 1サイクルとする保温を 15サイクル行った。 インキ ュペートされた液から Wizard DNA clean-up systei Promega)を用いて DNAを精製し た。精製された DNAを の TEバッファーに溶解し、 これに水酸化ナトリウムを終濃 度 0. 3Mになるように加えた後、 当該混合物を室温で 5分間放置した。 次レ ^で、 放置さ れた混合物をエタノール沈澱することにより沈澱 (DNA) を回収した。 回収された沈 澱を 20 jt の TEバッファ一に懸濁した。 得られた DNAを铸型とし、 以下に示す非メチル化特異的プライマー U1と U2、 又は、 メチル化特異的ブラィマ一 Mlと M2を用いて PCRを行つた。 非メチル化特異的プライマ 一 U1と U2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番号 1478〜1622で示される塩基配 列を有する D NAを bi isul f i t e処理した後の塩基配列を有する 145bpの DNAが増幅さ れ、一方、 メチル化特異的プライマ一 Mlと M2とを使用した場合には、配列番号 1の塩 基番号 80〜I623で示される塩基配列を有する D N Aを bisul f i te処理した後の塩基 配列を有する 144bpの DNAが増幅される。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TTTGTGGTGATATTGGGTT-3' (配列番号 2 )
U2： 5' -ACACCCTACAAAACTCAACA-3' (配列番号 3 )
<メチル化特異的プライマー >
Ml： 5' -CGCGGCGATATTGGGTC-3' (配列番号 4 )
M2： 5' -AACGCCCTACGAAACTCAACG-3' (配列番号 5 ) メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーの特異 f生は、実施例 1に記載の通り、 不死化 （正常） 滕管上皮細胞株 (HPDE-4/E6E7) のゲノム DNA(l)お よび、 この一部をメチル化酵素 Sssl (NEB社） により処理しゲノム DNA(2)において確 認済みである。
PCRの反応液としては、铸型とする DNAを 25ngと、 20pmol/ i 1の上記プライマー溶液 を各 1 1と、 each 2mM dNTPを と、 10 X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH8. 3 500mM KC1、 20mM MgCl2)を 2 - 5 1と、 耐熱性 MAポリメラーゼ 5ϋ/ 1を 0. 2 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1としたものを用いた。 上記の非メチル化特異 的プライマーを使用した場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 にて 30秒間次いで 57 にて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温 を 32サイクル行う条件で P C Rを行った。また、上記のメチル化特異的プライマーを 使用した場合には、 当該反応液を、 95 にて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 62°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクリレとする保温を 32サイクル行う 条件で P C Rを行った。 いずれの場合も、 P C Rを行った後、 増幅産物を含む P C R の反応液を 2% ァガロースゲル電気泳動に供した。
その結果を図 2に示した。 ヒト由来の正常勝臓組織 12検体 （Case l〜Casel 2の Nor mal) の場合において、 非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーン U) には 増幅された DNAのバンドが認められ、 メチル化特異 S勺プライマ一を使用した場合 （レ ーン Μ) には増幅された DNAのバンドが検出されなかった。従って、 ヒト由来の正常塍 臓組織の場合において、 少なくとも、 配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 148 0、 1482、 1485、 1496、 1603、 1613及び 1620でそれぞれ示されるシトシンはメチル化 されていないと判断された。
塍臓癌組織 12検体中 10検体で、非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レー ン U) に増幅された DNAのバンドに加え、 メチル化特異的プライマーを使用した場合 (レーン Μ) にも増幅された DNAのバンドが認められた。 従って、 当該条件において は、少なくとも配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 1480、 1482、 1485、 1496、 1603、 1613及び 1620でそれぞれ示されるシトシン fま、 組織の一部が癌化することに よりメチル化されたものと判断された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 哺乳動物由来の検体の瘟化度を評価する方法等が提供可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 2
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 4
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー 酉己列番号 5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 酉 S列番号 6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 爾己列番号 7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 8
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド 酉己列番号 9
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド 酉己列番号 1 0
プロ一ブのために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 1 1
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド

Claims

請求の範囲
1 . 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
( 1 )哺乳動物由来の検体に含まれる G protein-coupled receptor 7遺伝子のメチル 化頻度を測定する第一工程、 及び
( 2 )測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に 基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。
2 . 哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
3 . 哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
4. 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
5 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
6 . 組織が勝臓組織であって、 かつ、癌が J3萃臓癌であることを特徴とする請求項 5記 載の評価方法。
7 .遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモー夕一領域、非翻訳領域又は翻訳 領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の 5' - CG- 3'で示される塩基配列中のシト シンのメチル f匕頻度であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
8 . 組織が勝職組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徴とする請求項 7記 載の評価方法。
9 .遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモーター領域にある塩基配列内に存 在する一つ以上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度である ことを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
1 0 .遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配 列内に存在する一つ以上の 5 ' -CG-3 'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻 度であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
1 1 .遺伝子のメチル化頻度が、配列番号 1で示される塩基配列内に存在する一つ以 上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴と する請求項 1記載の評価方法。
1 2 . 組織が塍臓組織であって、 かつ、癌が辉臓癌であることを特徴とする請求項 1 1記載の評価方法。
1 3 .癌マーカーとしての、 メチル化された G protein-coupled receptor 7遺伝子の 使用。
1 4. 癌マーカーが J3萃臓癌マーカーであることを特徴とする請求項 1 3記載の使用。
PCT/JP2004/013885 2003-09-16 2004-09-15 癌化度評価方法 WO2005026355A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-322825 2003-09-16
JP2003322825A JP5116938B2 (ja) 2003-09-16 2003-09-16 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005026355A1 true WO2005026355A1 (ja) 2005-03-24

Family

ID=34308684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/013885 WO2005026355A1 (ja) 2003-09-16 2004-09-15 癌化度評価方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5116938B2 (ja)
WO (1) WO2005026355A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140127691A1 (en) 2011-06-29 2014-05-08 Kagoshima University Method for diagnosing type of pancreatic tumor

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002018632A2 (de) * 2000-09-01 2002-03-07 Epigenomics Ag Verfahren zur bestimmung des methylierungsgrades von bestimmten cytosinen in genomischer dna im sequenzkontext 5'-cpg-3'
WO2002022644A1 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the gpr7 gene

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002018632A2 (de) * 2000-09-01 2002-03-07 Epigenomics Ag Verfahren zur bestimmung des methylierungsgrades von bestimmten cytosinen in genomischer dna im sequenzkontext 5'-cpg-3'
WO2002022644A1 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the gpr7 gene

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ESTELLER M. ET AL.: "A gene hypermethylation profile of human cancer", CANCER RES., vol. 61, no. 8, 2001, pages 3225 - 3229, XP002982950 *
GERDES B. ET AL.: "p16 ink4alpha alterations in chronic pancreatitis-indicator for high-risk lesions for pancreatic cancer", SURGERY, vol. 129, no. 4, 2001, pages 490 - 497, XP002982951 *
JANSEN M. ET AL.: "Aberrant methylation of the 5' CpG island of TSLC1 is common in pancreatic ductal adenocarcinoma and is first manifest in high-grade PanlNs", CANCER BIOL. THER., vol. 1, no. 3, 2002, pages 293 - 296, XP002982949 *
O'DOWD B.F. ET AL.: "The cloning and chromosomal mapping of two novel human opioid-somatostatin-like receptor genes, GPR7 and GPR8, expressed in discrete areas of the brain", GENOMICS, vol. 28, no. 1, 1995, pages 84 - 91, XP000960658 *
UEKI T. ET AL.: "Hypermethylation of mutiple genes in pancreatic adenocarcinoma", CANCER RES., vol. 60, no. 7, 2000, pages 1835 - 1839, XP001026187 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP5116938B2 (ja) 2013-01-09
JP2005087048A (ja) 2005-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110872631B (zh) Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
US20230212685A1 (en) Methylated markers for colorectal cancer
CN106687600B (zh) 用于甲基化分析的方法
JP5258760B2 (ja) メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法
EP2272974A1 (en) Method for determination of dna methylation
KR101735075B1 (ko) Dmr를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법
CN113493835A (zh) 通过检测bcan基因区域的甲基化状态筛查大肠瘤的方法和试剂盒
JP5602355B2 (ja) 癌患者の外科的手術後の治療選択方法及び予後診断
WO2008038833A1 (fr) procÉdÉ de dÉtermination de la mÉthylation de l&#39;adn
US20100009376A1 (en) Method for measuring dna methylation
JP5116939B2 (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
KR101683086B1 (ko) 유전자의 발현량 및 메틸화 프로필을 활용한 돼지의 산자수 예측방법
WO2005026355A1 (ja) 癌化度評価方法
US20090209432A1 (en) Detecting targets using nucleic acids having both a variable region and a conserved region
WO2005026354A1 (ja) 癌化度評価方法
JP5116936B2 (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
WO2023104136A1 (zh) 甲状腺癌良恶性结节诊断的甲基化标志物及其应用
WO2007013593A1 (ja) 新規遺伝子acmg1のメチル化を指標とする胃癌の診断方法
JP5116937B2 (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
US20110045463A1 (en) Method for measuring dna methylation
WO2005026351A1 (ja) 癌化度評価方法
JP2013074837A (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
WO2008078834A1 (ja) Ｄｎａメチル化測定方法
JP2003144157A (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
WO2004018668A1 (ja) ヒト由来の検体の癌化度を評価する方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GM HR HU ID IL IN IS KE KG KP KR LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC YU ZA ZM

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG MD RU TJ TM AT BE BG CH CY DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase