WO2005026351A1 - 癌化度評価方法 - Google Patents

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WO2005026351A1
WO2005026351A1 PCT/JP2004/013875 JP2004013875W WO2005026351A1 WO 2005026351 A1 WO2005026351 A1 WO 2005026351A1 JP 2004013875 W JP2004013875 W JP 2004013875W WO 2005026351 A1 WO2005026351 A1 WO 2005026351A1
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cancer
mammal
derived
cytosine
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PCT/JP2004/013875
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Toshikazu Ushijima
Atsushi Hagihara
Original Assignee
Sumitomo Chemical Company, Limited
Japan As Represented By President Of National Cancer Center
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Application filed by Sumitomo Chemical Company, Limited, Japan As Represented By President Of National Cancer Center filed Critical Sumitomo Chemical Company, Limited
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the degree of canceration of a mammal-derived specimen, and the like.
  • cancer is a disease caused by genetic abnormalities
  • the mortality rate of cancer patients is still high, and the currently available diagnostic methods and treatment methods are not always satisfactory. It is not shown. It is clinically important to detect cancer at an early stage, to select an effective treatment method for the detected cancer, and to provide aftercare, such as confirmation of the recurrence of cancer, after treatment.
  • p53-responsive gene 2 (PXN gene, MG50 gene, PRG2 gene, D2S448 gene, D2S448E gene, or KIAA0230 gene is also methylated at a significantly higher frequency than immortalized normal cell lines and normal tissue samples, and expression of p53_responsive gene 2 in cancer cell lines.
  • the level was significantly lower than that of an immortalized normal cell line, and further, it was found that the expression level of such a gene could be increased by applying a DNA methylation inhibitor to a cancer cell line. This has led to the present invention.
  • the evaluation method according to the above item 1 wherein the mammal-derived specimen is a cell;
  • the methylation frequency of a gene is determined by the presence of one or more 5'-CG-3's in the base sequence in the promoter region, untranslated region or translated region of the gene.
  • the evaluation method according to the above item 1 or 4 characterized in that it is the cytosine methylation frequency; 11.
  • the methylation frequency of a gene is the methylation frequency of cytosine in the nucleotide sequence represented by one or more 5'-CG-3 'existing in the nucleotide sequence ⁇ in the promoter region of the gene.
  • the methylation frequency of a gene is determined by the methylation frequency of cytosine in one or more nucleotide sequences represented by 5'-CG-3 'existing in the nucleotide sequence in the untranslated region or translated region of the gene.
  • the methylation frequency of the gene is the methylation frequency of cytosine in one or more nucleotide sequences represented by 5'-CG-3 'existing in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • tissue is a viscera tissue and the cancer is a hepatic cancer
  • the active ingredient includes a substance having the ability discovered by the search method described in 20 above, and is characterized in that the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • methylated p53-responsive gene 2 as a cancer marker; 25. Use according to the preceding item 24, wherein the cancer marker is a victory cancer marker; 26. A method for inhibiting metabolism, comprising a step of administering a substance that reduces the frequency of methylation of p53-responsive gene 2 to cells in the body of a mammal that can be diagnosed with cancer;
  • FIG. 1 shows human-derived immortalized (normal) ductal epithelial cell lines (HPDE-4 / E6E7 and HPDE6-E6E7 c7) and seven types of Teng carcinoma cell lines (BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa -2, genomic DNA prepared from Hs766T, PANC-1 and 3 ⁇ 4PAC) and treated with sodium bisulfite are subjected to a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) as ⁇ -type, respectively.
  • FIG. 3 is a view showing the results of analyzing a reaction solution by agarose gel electrophoresis. The names of the cells used are shown above.
  • HPDEVSssI shows DNA obtained by treating genomic DNA of HPDE-4 / E6E7 with methylase Sssl.
  • Lane U PCR reaction solution using non-methylated specific primers
  • Lane M PCR reaction solution using methylation-specific primers.
  • FIG. 2 shows genomic DM prepared from 12 samples of human knee-derived carcinoma cancer and its surrounding normal skeletal tissues [obtained by obtaining informed consent from patients] and treated with sodium bisulfite. Perform PCR as a template, and use the PCR
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of analysis by Sgel electromotive force. Casel to Casel 2 indicated the specimen. Cancer is the Ji organ cancer tissue, and Normal is the viable normal tissue around it. Lane U: PCR reaction solution using non-methylation-specific primer, Lane M: PCR reaction solution using methylation-specific primer.
  • Fig. 3 shows seven human-derived squamous cell lines (BXPc3, HPAF-IL Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1 and HPAC) and immortalized (normal) ⁇ duct epithelial cells
  • the DNA derived from the mRNA of p53-responsive gene 2 was amplified by Real Time PCR, and the amount of p53-responsive gene 2 was shown.
  • FIG. The names of the cells used are shown at the bottom of the figure.
  • the vertical axis represents the value obtained by dividing the amount of p53-responsive gene 2 by GAPDffil: gene amount.
  • Figure 4 shows a human (human) spiked with a dead (normal) Teng duct epithelial cell line (HPDE-4 / E6E7) and 5Aza-dC, a methylileidone inhibitor, at a concentration of 0.5, 0.5 M or 1.
  • Two types of viable cancer cell lines
  • FIG. 2 is a diagram showing the amount of p53-responsive gene 2 obtained by amplifying DN "A derived from mRNA of p53-responsive gene 2 by Real Time PCR in (PANC-1 and PAC).
  • the vertical axis shows the value obtained by subtracting the amount of p53-responsive gene 2 from the amount of GAPDH gene!
  • the present invention is an invention relating to the use of methyl-protected p53-responsive gene 2 as a cancer marker (for example, a visceral cancer marker).
  • Examples of the p53-responsive gene 2 used as the primary gene in the present invention include, for example, the non-coding region and the translation region (coding region) of ⁇ 53-responsive gene 2 and the 5 ′ upstream thereof. And a human-derived gene containing a promoter region located at the same position.
  • the nucleotide sequence of human p53-responsive gene 2 and the amino acid sequence encoded thereby are described in, for example, Genbank Accession No. XM_056455.
  • the exon that is responsible for the untranslated region and the chrysanthemum translated region (coding region) of p53_responsive gene 2 of human origin is located at the most 5 'upstream: C exon ( Hereafter, it will be referred to as Exon 1.
  • the base sequence of the genomic DNA containing the promoter region located 5 ′ upstream thereof are described in, for example, Genbank Accession No. AC009471.
  • the nucleotide sequence of exon 1 of p53-responsive gene 2 is represented by nucleotide numbers 114193 to 114443.
  • the p53-responsive gene 2 used in the present invention includes, in addition to the above-mentioned gene having a known nucleotide sequence, a gene naturally occurring due to a species difference, an individual difference or a difference between organs and tissues in such a nucleotide sequence. It also includes a gene having a base sequence in which a base is deleted, substituted or added by mutation.
  • cytosine In mammals, there is a phenomenon in which only cytosine is methylated among the four types of bases that make up a gene (genomic DNA). For example, in p53-responsive gene 2 derived from mammals, some cytosines of the genomic DNA of the gene are methylated. The methylation modification of the DNA is performed in the base sequence represented by 5′-CG-3 ′ (C represents cytosine, G represents guanine, and the base sequence is sometimes referred to as CpG hereinafter.) Is limited to cytosines.
  • methylation frequency refers to, for example, when the presence or absence of methylation of cytosine in CpG to be investigated is examined for a plurality of haploids, the cytosine is methylated. Of haploids.
  • an index value having a correlation with (methylation frequency) refers to, for example, the amount of the expression product of p53-responsive gene 2 (more specifically, (The amount of the transcription product of the offspring and the amount of the translation product of the gene). In the case of such an amount of the expression product, there is a negative correlation that the methylation frequency decreases with an increase in the methylation frequency.
  • Samples derived from mammals in the first step of the evaluation method of the present invention may include, for example, cancer cells such as spleen cancer cells or a tissue containing the same, and A derived from cancer cells such as Tengle cancer cells.
  • tissue containing them tissues here are in a broad sense including body fluids such as blood, plasma, serum, lymph, and serum, lymph nodes, etc.) or body secretions (urine, Biological samples such as milk).
  • body fluids such as blood, plasma, serum, lymph, and serum, lymph nodes, etc.
  • body secretions urine, Biological samples such as milk.
  • examples include a whole organ tissue (including Teng's solution) collected from a test animal.
  • biological samples may be used as samples as they are, or biological samples prepared by various operations such as separation, fractionation, and immobilization of the biological samples may be used as the samples.
  • a method for measuring the methylation frequency of p53-responsive gene 2 contained in a specimen derived from a mammal or an index value having a correlation therewith is performed, for example, as follows. Just do it.
  • a first method after contacting a DNA derived from a sample with a reagent that modifies unmethylated cytosine, the DNA is converted into a ⁇ -type, and the presence or absence of methylsin in the cytosine to be analyzed can be determined by pickling.
  • PCR can be performed using various primers to determine the amount of amplification product obtained.
  • DNA is extracted from a mammal-derived specimen using, for example, a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a conventional method, and the prepared plasma or serum is used as a sample to prepare free DNA (such as kidney cancer cells). (Including DNA derived from cancer cells), it is possible to analyze DNA derived from cancer cells such as spleen cancer cells while avoiding DNA derived from blood cells. The sensitivity for detecting a tissue or the like containing the same can be improved.
  • a primer capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed using the DNA as type I is determined.
  • the cytosine to be analyzed is contained in the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of p53-responsive gene 2. You can choose from cytosine.
  • nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of p53-responsive gene 2 is human-derived p53-
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of responsive gene 2 and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be increased.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 Genbank Accession No. ACO09471 corresponds to the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 in the base sequence described in Genbank Accession No.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 is represented by nucleotide numbers 1558 to 1808.
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, highly methylated in cancer cells such as pancreatic cancer cells (ie, hypermethylated state).
  • examples of cytosine having a high methylation frequency in lung cancer cells include, for example, base numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, and 1351 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a reagent for modifying unmethylated cytosine for example, bisulfite such as sodium bisulfite and the like can be used.
  • a reagent that specifically modifies only methylated cytosine may be used.
  • To bring the reagent that modifies unmethylated cytosine into contact with the extracted DNA for example, first denature the DNA with an alkaline solution (pH 9 to 14), and then add sodium bisulfite. Treat with bisulfite (concentration in solution: 3M final concentration, for example) at 55 ° C for about 10 to 16 hours (overnight).
  • denaturation at 95 and reaction at 50 ° C may be repeated 10-20 times.
  • unmethylated cytosine is converted to peracyl, while methylated cytosine is not converted to peracyl and remains cytosine.
  • the DNA sequence treated with bisulfite or the like was converted to type II, and the base sequence when methylated cytosine was contained [the cytosine at the methylated position (cytosine in CpG) remains cytosine.
  • cytosine in CpG There is a non-methylated cytosine (cytosine not included in CpG), which is a base sequence of peracyl] and a base sequence complementary to the base sequence. (Hereinafter also referred to as methylation-specific PCR) and the base sequence when DNA treated with bisulfite etc.
  • cytosine is type III and cytosine is not methylated (all PCR using a pair of unmethylation-specific primers selected from a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence and a nucleotide sequence in which cytosine has become peracil (hereinafter, non-methylated nucleotide sequence). Sometimes also referred to as le-specific P C R.) And performing.
  • PCR in the case of PCR using a methylidani-specific primer (the former), DNA in which the cytosine to be analyzed is methylated is amplified, while PCR using an unmethylation-specific primer is performed. In this case (the latter), DNA in which the cytosine to be analyzed is not methylated is amplified. By comparing the amounts of these amplification products, the presence or absence of methylation of the target cytosine is examined. In this way, the methylation frequency can be measured.
  • a primer considering that unmethylated cytosine is converted to peracyl and that methylated cytosine is not converted to peracyl, a base containing methylated cytosine is considered.
  • methylation-specific primers design sequence-specific PCR primers (methylation-specific primers) and PCR primers specific to unmethylated cytosine-containing base sequences (unmethylated-specific primers) .
  • a methylation-specific primer and a non-methylidani-specific primer can be prepared from each of the originally double-stranded DNA based on each strand.
  • Such a primer is preferably designed to contain cytosine in CpG near the 3 ′ end of the primer in order to increase the specificity of methyl and non-methyl.
  • one of the primers may be labeled to facilitate analysis.
  • primers for measuring the methylation frequency of p53-responsive gene 2 by methylation-specific PCR include, for example, the promoter region of p53-responsive gene 2 and the untranslated region It can be designed as described above based on a nucleotide sequence containing one or more cytosines in CpG existing in the nucleotide sequence in the translation region (coding region).
  • cytosine in CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, specifically, in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, It can be designed based on a nucleotide sequence containing one or more cytosines represented by 1351, 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 and the like. Examples of such primers are shown below.
  • reaction solution in the methylation-specific PCR for example, 50 ng of type III DNA, each primer solution of 1 Opmol / l, and 2.5 mM dNTP, 2.5 X 1X buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM CK 20 mM MgCl 2 ), and 0.2 t of heat-resistant DNA polymerase 5 U / 1 1), and sterilized ultrapure water is added to the mixture to obtain a reaction solution having a volume of 25.
  • Conditions for example, after keeping the above reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, Conditions include performing 30 to 40 cycles of incubation at 5 ° C for 30 seconds followed by 55 to 65 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds as one cycle.
  • an analysis method denaturing polyacrylamide gel electrophoresis agarose gel
  • the gel after electrophoresis is stained with DNA to detect the band of the amplification product, and the concentrations of the detected bands are compared.
  • a pre-labeled primer can be used to compare the band concentration using the label as an index.
  • PCR reaction products are monitored in real time and force kinetics analysis is performed, for example, to achieve high-precision quantification that can detect even a slight difference of about twice the gene amount.
  • Real-time PCR a possible PCR method, can be used to compare the amount of each product. Examples of a method for performing real-time PCR include a method using a probe such as a type-dependent nucleic acid polymerase probe and a method using an intercalator such as Cyber Green. Commercially available equipment and reagent kits can be used as equipment and reagents for the real-time PCR method. Such a method is also generally referred to as methylation-specific PCR, and has been reported by Herman et al.
  • DNA is extracted from a mammal-derived specimen using, for example, a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from the blood according to an ordinary method. Analyzing the free DNA (including DNA power S derived from cancer cells such as kidney cancer cells) contained in the prepared or prepared plasma or serum as a sample, DNA derived from cancer cells such as cancer cells can be analyzed, and the sensitivity of detecting cancer cells such as victory cancer cells and tissues containing the same can be improved.
  • the DNA is used as a type III, and the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of p53-responsive gene 2 is used.
  • the analysis target is obtained by performing PCR using a primer designed as described later based on the nucleotide sequence containing cytosine in the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of DNA containing cytosine is amplified, and the base sequence of the resulting amplification product is directly analyzed.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of p53-responsive gene 2 is human-derived p53-responsive.
  • the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of ive gene 2 and the promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession) ion No. AC009471 corresponds to the complementary sequence to the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 in the base sequence described in AC009471).
  • SEQ ID NO: 1 Genbank Accession
  • nucleotide sequence of exon 1 of p53-responsive gene 2 derived from human is represented by the nucleotide numbers 1558 to 1808.
  • cancer cells such as renal cancer cells show a high methyl methane frequency (ie, a hypermethylated state).
  • cytosine having a high methylation frequency S in victory cancer cells includes, for example, nucleotides 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, 1351 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. , 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 and the like.
  • Primers used in the PCR include a base sequence containing the cytosine based on the base sequence at 5, 5 upstream and 3 ′ downstream of the cytosine to be analyzed. It is good to design a primer pair capable of amplifying NA.
  • the base sequence for primer design is selected so as not to contain cytosine in the CpG to be analyzed.
  • primer if the nucleotide sequence selected for the design does not contain any cytosine, the selected nucleotide sequence and the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence are the same as the primer sequence of the primer. It can be.
  • the primers should be considered in consideration of the fact that these cytosines are converted to peracil. Design. That is, a pair of primers each having a base sequence in which all cytosines are peracyl and a base sequence complementary to the base sequence are designed.
  • the base sequence selected for primer design contains cytosine other than the target to be analyzed and the cytosine is cytosine in CpG, unmethylated cytosine is converted to peracil and methylated. Design primers in consideration of the fact that cytosine that has been converted is not converted to peracil.
  • the base sequence when methylated cytosine is contained [the cytosine at the methylated position (cytosine in CpG) remains cytosine, and the untilted cytosine (cytosine not in CpG) is And a pair of thiolation-specific primers selected from a base sequence complementary to the base sequence, and a base sequence when cytosine is not methylated (all cytosines are peracil And a set of unmethylation-specific primers each having a base sequence complementary to the base sequence.
  • a pair of methylation-specific primers and a pair of unmethylation-specific primers are mixed and used in equal amounts.
  • a reagent for modifying unmethylated cytosine for example, bisulfite such as sodium bisulfite and the like can be used.
  • a reagent that modifies only the methylidyl cytosine may be used.
  • the DNA is placed in an alkaline solution (pH 9 to 14), such as sodium bisulfite.
  • Treat with bisulfite concentration in solution: for example, final concentration 3M
  • denaturation at 95 ° C and reaction at 50 ° C can be repeated 10-20 times.
  • unmethylated cytosine is converted to peracyl, while methylated cytosine is not converted to peracyl and remains cytosine.
  • primers for measuring the methylation frequency of p53-responsive gene 2 by direct analysis of the nucleotide sequence include, for example, a promoter region, an untranslated region or a translated region (p53-responsive gene 2).
  • the coding sequence can be designed as described above based on a nucleotide sequence containing one or more cytosines in CpG present in the nucleotide sequence in the coding region.
  • cytosine in CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 specifically, nucleotide numbers 991, 999, 1004, 1023, 1042, 1097, 1114, and the like in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a DNA (376 bp) having a base sequence obtained by bisulfite treatment of a DNA having a base sequence represented by base numbers 967 to 1342 in SEQ ID NO: 1 is amplified.
  • the primer pair has base numbers 991, 999, 1004, 1023, 1042, 1097, 1114, 1122, 1150, 1152, 1158, 1160, 1170, 1176, 1190, 1218, 1234 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • 1243, 1258, 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319 can be used as primers for examining the frequency of cytosine methylation.
  • reaction solution in PCR examples include, for example, 25 ng of type II DNA, 1 liter of 20 pmol / 1 primer solution, 31 of 2 mM dNTP, and 10 ⁇ buffer solution (100 mM Tris). -HCl pH 8. 3, 500mM KC1, a 15 mM MgC 1 2) 2. 5 1, a thermostable DNA polymerase 5U / 1 0. 2 1 were mixed, liquid volume, and added with sterile ultrapure water The reaction solution can be raised to 25 zl. As reaction conditions, for example, the reaction solution as described above is incubated at 95 t for 10 minutes, then at 95 at 30 seconds, at 53 at 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds as one cycle. For 30 to 40 cycles.
  • the base sequences of the obtained amplification products are compared, and the methylation frequency is measured from the comparison.
  • the base at the position corresponding to the cytosine to be analyzed is cytosine or thymine (peracyl).
  • the peak area indicating cytosine detected at the position corresponding to the cytosine to be analyzed with the peak area indicating thymine (peracil) in the peak chart indicating bases in the obtained amplification product.
  • the frequency of methylation of cytosine to be analyzed can be measured.
  • a cloned DNA is prepared from a plurality of clones obtained by once cloning the amplified product obtained by PCR using Escherichia coli or the like as a host.
  • the nucleotide sequence of the DN may be analyzed.
  • the frequency of cytosine methylation to be analyzed can also be measured by determining the percentage of the sample in which the base detected at the position corresponding to the cytosine to be analyzed is cytosine in the sample to be analyzed. it can.
  • the DNA is hybridized with a probe capable of discriminating the presence or absence of methylation of cytosine to be analyzed. And a method for examining the presence or absence of probe binding.
  • NA from a mammal-derived specimen, for example, a commercially available DNA extraction kit or the like is used to extract! NA.
  • the DNA is hybridized with a probe capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed. Then, the presence or absence of binding between the DNA and the probe is examined.
  • the cytosine to be analyzed is cytosine in the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of p53-responsive gene 2. You can choose from.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of p53-responsive gene 2 is human-derived p53_responsive gene.
  • The: ⁇ base sequence of genomic DNA containing exon 1 of gene 2 and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession No. AC009471 corresponds to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 in the base sequence.).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 is represented by nucleotide numbers 1558 to 1808.
  • cytosine having a high methylation frequency in victory cancer cells for example, in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, 1351, 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 and the like.
  • unmethylated cytosine is converted to peracyl based on the base sequence containing cytosine to be analyzed, In addition, it is advisable to design in consideration that methylated cytosine is not converted to peracyl.
  • the nucleotide sequence when the methylated cytosine is contained [the cytosine at the methylated position (cytosine in CpG) remains cytosine, and the unmethylated cytosine (cytosine not included in CpG) ) Is a base sequence that became peracil] or a methylation-specific probe having a base sequence complementary to such base sequence, and a base sequence when cytosine was not methylated (all cytosines became peracil Base sequence) or a non-methylation-specific probe having a base sequence complementary to such a base sequence.
  • a probe may be used after being labeled in order to facilitate analysis of the presence or absence of a bond between the DNA and the probe.
  • the probe may be used by immobilizing it on a carrier according to a usual method.
  • a reagent for modifying unmethylated cytosine for example, bisulfite such as sodium bisulfite can be used.
  • a reagent that specifically modifies only methylated cytosine may be used.
  • the DNA is first denatured with an alkaline solution (pH 9 to 14), and then a bisulfite such as sodium bisulfite ( bisul fite) (concentration in the solution: 3M final concentration, for example), and treat at 55 ° C for about 10-16 hours (overnight).
  • a bisulfite such as sodium bisulfite ( bisul fite) (concentration in the solution: 3M final concentration, for example)
  • concentration in the solution: 3M final concentration, for example concentration in the solution: 3M final concentration, for example
  • denaturation at 95 ° C and reaction at 50 can be repeated 10-20 times.
  • unmethylated cytosine is converted to peracyl, while methylated cytosine is not converted to peracyl and remains cytosine.
  • the DNA may be pre-amplified by performing PCR in the same manner as in the second method, using DNA treated with bisulfite or the like as type II.
  • the DNA that has been treated with bisulfite or the like or the DNA that has been amplified in advance by the PCR is hybridized with a probe that can identify the presence or absence of cytosine to be analyzed. Perform an exhibition.
  • a probe for measuring the methylation frequency of p53-responsive gene 2 is, for example, in the promoter region, untranslated region or translation region (coding region) of p53-responsive gene 2.
  • cytosine in CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 specifically, nucleotide numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, 1351 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 , 1357, 1361, 1365, 1378, 1383, etc. can be designed based on the nucleotide sequence containing one or more cytosines. Examples of such probes are shown below.
  • Methylation specific ⁇ probe 5'-TCGCGTAGGTTTTAGGGTTTCGAGTTTCGAGTTTCG-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Methylation specific probe 5'-TCGCGTTTTCGAGCGTTCGTTTTGGTTATGCGGGTC-3 '(SEQ ID NO: 11) Hybridization is described, for example, in Sambrook J., Frisch EF, Mani at is T., Molecular Cloning, Second Edition. (Molecular Cloning 2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory pre ss, etc. (Cold Spring Harbor Laboratory pre ss). Hybridization is usually performed under stringent conditions.
  • stringent conditions For example, after forming a hybrid at 45: in a solution containing 6XSSC (a solution containing 1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate is 10XSSC), and then forming a hybrid at 50 ° C in 2XSSC Conditions such as washing with C (Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3. 6.3.6) can be mentioned.
  • the salt concentration in the washing step should be selected, for example, from 2 x SSC at 50 ° C (low stringency conditions) to 0.2 XSSC up to 50 ° C (high stringency conditions). I can do it.
  • the temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 t: (high stringency conditions). Also, both salt concentration and temperature can be varied.
  • the amount of DNA bound to the methylation-specific probe and the amount of DNA bound to the unmethylation-specific probe are compared to determine the cytosine to be analyzed.
  • the frequency of methylidation of cytosine ie, cytosine in CpG contained in the base sequence on which the probe was designed
  • a method may be used in which a restriction enzyme capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed is allowed to act on DNA derived from a sample, and then the presence or absence of digestion by the restriction enzyme is examined. it can.
  • DNA is extracted from a mammal-derived specimen using, for example, a DNA extraction kit or the like sold by Tf.
  • plasma or serum is prepared from the blood according to a conventional method, and the prepared plasma or serum is used as a sample to prepare free DNA (freedom cancer cells).
  • free DNA freedom cancer cells
  • Analysis of DNA derived from cancer cells such as cancer cells it is possible to analyze DNA derived from cancer cells such as kidney cells by avoiding DNA derived from blood cells. It is possible to improve the sensitivity of detecting a tissue or the like containing the same.
  • a restriction enzyme capable of discriminating the presence or absence of methylation of cytosine to be analyzed is allowed to act on the extracted DNA, and then the presence or absence of digestion by the restriction enzyme is examined.
  • the cytosine to be analyzed is a nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of p53_responsive gene 2. You can choose from the cytosines in the row.
  • nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of one region of the promoter, untranslated region or translated region (coding region) of p53-responsive gene 2 is p53-derived from human.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of responsive gene 2 and the promoter region located 5 ′ upstream thereof can be given. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession No. AC009471 corresponds to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 in the base sequence.).
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 is represented by nucleotide numbers 1558 to 1808.
  • Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, especially cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 For example, it shows a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as victory cancer cells.
  • cytosine having a high methylation frequency in victory cancer cells includes, for example, nucleotides 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, and 1351 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. , 1357, 1361, 1365, 1378, 1383 and the like.
  • the “restriction enzyme capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation” (hereinafter sometimes referred to as a methylation-sensitive restriction enzyme) used in the method refers to a recognition sequence containing a methylated cytosine. It means a restriction enzyme capable of digesting a recognition sequence containing cytosine which is not digested and which is not methylated.
  • the DNA in which the cytosine contained in the recognition sequence is methylated the DNA is not cleaved by the action of a methylation-sensitive restriction enzyme, while the DNA in which the cytosine contained in the recognition sequence is not methylated In this case, if a methylation-sensitive restriction enzyme is allowed to act, the DNA is cut.
  • methylation-sensitive enzymes include, for example, HpaII, BstUI, Narl, SacII, and the like.
  • DNA treated with a methiclation-sensitive restriction enzyme containing a cytosine to be analyzed in the recognition sequence is converted into type II, and PCR was carried out using a primer pair capable of amplifying DNA that contains a recognition sequence containing the cytosine to be analyzed, but does not contain the recognition sequence of the restriction enzyme other than the recognition sequence, and performs amplification of DNA ( (Amplification product). If the cytosine to be analyzed is methylated, an amplification product is obtained. On the other hand, if the cytosine to be analyzed is not methylated, no amplification product can be obtained.
  • the frequency of methylation of cytosine to be analyzed can be measured.
  • real-time monitoring of PCR reaction products and analysis of force kinetics enable high-precision quantification that can detect, for example, a slight difference of about twice the amount of gene.
  • the amount of each product can also be compared using real-time PCR, a PCR method.
  • the method for performing real-time PCR include a method using a probe such as a type-dependent nucleic acid polymerase probe and a method using an intercalation method such as Cyber Green.
  • the apparatus and reagents for the real-time PCR method commercially available apparatuses and reagent kits can be used.
  • cytosine represented by base numbers 1218, 1498, 1636, and 1790 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 the cytosine is included in the Nar I recognition sequence, and the cytosine is identified by the method described above.
  • the methylation frequency can be measured.
  • p53-responsive gene 2 is used for DNA subjected to a methylation-sensitive restriction enzyme containing cytosine to be analyzed in the recognition sequence.
  • a method in which the length of the hybridized DNA is determined by performing Southern hybridization using a DNA derived from E. coli and not containing the recognition sequence of the restriction enzyme as a probe.
  • cytosine to be analyzed When the cytosine to be analyzed is methylated, a longer DNA is detected than when the cytosine is not methylated. By comparing the amount of the detected long DNA with the amount of the short DNA, the frequency of cytosine methylation to be analyzed can be measured. Using the various methods described above, p53-responsive Measure the methylation frequency of gene 2. The measured methylation frequency and, for example, the methylation frequency of P53-responsive gene 2 (control) contained in a sample derived from a healthy mammal that can be diagnosed as having no cancer cells such as a viable cancer cell (control) And the degree of canceration of the specimen is determined based on the difference obtained by the comparison.
  • the degree of canceration of the sample can be determined to be higher than that of the control.
  • the term “degree of canceration” has the same meaning as generally used in the art. Specifically, for example, when a mammal-derived specimen is a cell, it means the degree of malignancy of the cell. In addition, for example, when the mammal-derived specimen is a tissue, it means the amount of cancer cells present in the tissue.
  • the expression of p53-responsive gene 2 is lower in cancer cells such as visceral cancer cells than in samples of cells or tissues derived from healthy mammals. This is because the frequency of methylation of the gene is high in cancer cells such as pancreatic cancer cells, and the gene cannot be expressed normally, and as a result, the amount of the expression product of the gene (more specifically, Transcripts and translation products).
  • an index value having a correlation with the methylation frequency (in the above case, the index value is the amount of the expression product and an index value having a negative correlation) Yes, you can measure
  • an index value for example, the amount of an expression product correlated with the methylation frequency of p53_responsive gene 2 contained in a specimen derived from a mammal is measured, and the measured methyl value is measured. Based on the difference obtained by comparing an index value (for example, the amount of an expression product) having a correlation with the activation frequency with a control, the degree of cancer of the sample can be determined.
  • p53-responsive gene 2 As a method of measuring an index value having a correlation with the methylation frequency of p53-responsive gene 2 contained in a mammal-derived specimen, for example, p53-responsive gene 2
  • a method for measuring the amount of mRNA that is a transcript of it can.
  • the measurement includes, for example, RT-PCR, Northern blotting [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)], in situ RT-: PCR [Nucleic Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)]
  • Known methods such as the in situ hybridization method and the NASBA method [Nucleic acid sequence-based amplification, nature, 350, 91-92 (1991)] may be used.
  • a sample containing mRNA which is a transcription product of p53_responsive gene 2 contained in a specimen derived from a mammal may be prepared by extracting, purifying, etc. from the specimen according to a usual method.
  • the detection probe W p53-responsive gene 2 or a part thereof (restriction enzyme cleavage of p53_responsive gene 2; (about lOObp to about lOOOObp of oligonucleotides chemically synthesized based on the base sequence of p53-responsive gene 2), and is used in hybridization with mRNA contained in the sample.
  • p53-responsive gene 2 or a part thereof restriction enzyme cleavage of p53_responsive gene 2; (about lOObp to about lOOOObp of oligonucleotides chemically synthesized based on the base sequence of p53-responsive gene 2
  • the primer used When RT-PCR is used to measure the amount of mRNA contained in the prepared sample, the primer used must be one that can specifically amplify only p53-responsive gene 2.
  • the region to be amplified and the base length are not particularly limited. Examples of such primers include the following primers (S: sense, A: antisense) and the like. Using these primers, the amount of transcripts can be measured by RT-PCR as shown in the Examples below.
  • real-time monitoring of PCR reaction products and force kinetic analysis can provide high-precision quantification that can detect, for example, a slight difference of about twice the amount of gene. Possible; Real-time PCR, a PCR method, can be used to compare the amounts of each product.
  • Examples of the method for performing real-time PCR include a method using a probe such as a type III-dependent nucleic acid polymerase probe and a method using an intercalator such as Cyber Green.
  • a probe such as a type III-dependent nucleic acid polymerase probe
  • an intercalator such as Cyber Green.
  • devices and reagents for the real-time PCR method commercially available devices and reagent kits can be used.
  • p53- As another method for measuring an index value having a correlation with the methylation frequency of p53_responsive gene 2 contained in a mammal-derived specimen, for example, p53- A method for measuring the amount of p53-responsive gene 2 protein, which is a translation product of responsive gene 2, can be given. For this measurement, for example, the Imunobu et al. Described in Cell Engineering Handbook, Yodosha, 207 (1992) using a specific antibody (monoclonal antibody, polyclonal antibody) against the p53-responsive gene 2 protein. A known method such as a separation method, an immunoprecipitation separation method, an indirect competitive inhibition method (ELISA method) and the like may be used.
  • ELISA method indirect competitive inhibition method
  • a specific antibody against the p53-responsive gene 2 protein can be produced according to a usual immunological method using the protein as an immunizing antigen.
  • an index value having a correlation with the methylation frequency of p53-responsive gene 2 contained in a specimen coming from a mammal is measured.
  • An index value (control) having a correlation with the methylation frequency of the sample is compared, and the degree of canceration of the specimen is determined based on a difference obtained by the comparison.
  • primers, probes, or specific antibodies that can be used in various methods for measuring the methylation frequency of p53-responsive gene 2 or an index value correlated therewith include, for example, victory cancer cells and the like. It is useful as a reagent for a kit for detecting cancer cells.
  • the present invention is carried out by kits for detecting cancer cells such as kidney cancer cells containing these primers, probes or specific antibodies as reagents, or by these primers, probes or specific antibodies. Also provided is a chip for detecting cancer cells such as kidney cancer cells immobilized on the body, and the scope of rights of the present invention evaluation method is based on the substantial principle of the method. The use in the form of such a detection kit ⁇ detection chip is also included.
  • the expression of p53-responsive gene 2 is lower in cell lines such as kidney cancer cells than in samples of cells or tissues derived from healthy mammals.
  • the amount of the expression product of the gene is increased by causing a substance that inhibits DNA methylation related to p53-responsive gene 2 to act on cancer cells such as knee cancer cells.
  • a substance that inhibits DNA methylation related to p53-responsive gene 2 to act on cancer cells such as knee cancer cells.
  • Can be. This is a substance that can compensate for a decrease in the expression level of p53-responsive gene 2 or a concomitant decrease in the function thereof in a cell line such as a pancreatic cancer cell, for example, an unmethylated (or extremely P53_responsive gene 2, an expression product of the gene, a substance capable of promoting the expression of the gene (eg, inhibits DN "A methylation of P53-responsive gene 2)
  • Substance a substance that reduces the frequency of methylation of p53_responsive gene 2)
  • the first means that it is useful for treating cancer such as knee cancer and suppressing canceration of normal tissues such as viscera.
  • canceration would be suppressed by administering a substance that reduces the methylation frequency of p53-responsive gene 2 to cells in the body of a mammal that can be diagnosed as cancer.
  • the nucleotide sequence in the promoter region or coding region of p53-responsive gene 2 is hypomethylated as in normal tissues (hypomethyl ation), increasing the expression level of mRNA, a transcript of p53-responsive gene 2, and consequently p53- The expression of p53-responsive gene 2 protein, a translation product of responsive gene 2, could be increased.
  • a cDNA comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the p53-responsive gene 2 or the p53-responsive gene 2 protein into a cancer cell such as a kidney cancer cell
  • the expression level of p53-responsive gene 2 protein in such cancer cells could be increased. That is, according to the present invention, (1) a substance having the ability to promote the expression of p53-responsive gene 2 is contained as an active ingredient, and the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. And (2) a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of p53-responsive gene 2 as an active ingredient, wherein the active ingredient is contained in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides an anticancer agent characterized by being formulated into an anticancer agent (hereinafter sometimes collectively referred to as the anticancer agent of the present invention).
  • the dosage form of the anti-healing agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a normal preparation.
  • a preparation is pharmaceutically acceptable, for example, a water-soluble solvent, a non-water-soluble solvent, a buffer, It can be produced by mixing an active ingredient with a carrier such as a solubilizer, an isotonic agent, a stabilizer and the like. If necessary, auxiliary agents such as preservatives, suspending agents and emulsifiers may be added.
  • the anticancer agent can be used in the form of a usual liquid such as a solution.
  • An effective amount of the anticancer agent of the present invention can be parenterally administered to a mammal such as a human (for example, cells in a mammal that can be diagnosed with cancer).
  • parenteral administration includes, for example, injection (subcutaneous, intravenous, topical) and the like.
  • the dosage varies depending on the age of the mammal to be administered, the sex, the body weight, the degree of the disease, the type of the anticancer agent of the present invention, the mode of administration, and the like.
  • the above-mentioned daily dose can be administered in several divided doses.
  • p53-responsive gene 2 protein (a method for introducing a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence into cells includes a gene transfer method using a viral vector and a gene transfer method using a non-viral vector ( Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Special Issue on Experimental Medicine, 12 (15) (1994), Separate Volume on Experimental Medicine, “Basic Technologies for Gene Therapy” , Youtosha (1996)).
  • the former gene transfer method includes, for example, DNA virus or RNA virus such as retrovirus, adenovirus, adenovirus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, poliovirus, simvis virus, etc.
  • DNA virus or RNA virus such as retrovirus, adenovirus, adenovirus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, poliovirus, simvis virus, etc.
  • examples include a method of incorporating and introducing DNA encoding TR4 or mutant TR4.
  • Examples of the gene transfer method using a non-viral vector include a method of directly administering an expression plasmid intramuscularly (DNA vaccine method), a ribosome method, a lipofectin method, a microinjection method, and a calcium phosphate method. Method, electro-boration method and the like.
  • methods for using a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the p53_responsive gene 2 protein as an active ingredient of a gene therapy drug as an anticancer drug include an in vivo method of directly introducing the nucleic acid into the body and a human Ex vivo method by removing specific cells from the cell, introducing the nucleic acid into the cells outside the body, and returning the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15) (1994)).
  • a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of p53-responsive gene 2 protein can be administered by an appropriate route depending on the disease, condition, and the like.
  • it can be administered by injection into mucosal cancer cells, veins, arteries, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and the like.
  • the dosage form of the gene therapy agent as the anticancer agent may be an injection, or a ribosome preparation such as a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent.
  • a preparation may be pharmaceutically acceptable.
  • the gene (vector-type or virus-type) may be added to a carrier such as a water-soluble solvent, a water-insoluble solvent, a buffer, a solubilizing agent, an isotonic agent, and a stabilizer. , Or a plasmid-type gene).
  • auxiliary agents such as preservatives, suspending agents and emulsifiers may be added.
  • the search method of the present invention is a method for searching for a substance capable of promoting the expression of p53-responsive gene 2, comprising: (1) a first step of bringing a test substance into contact with cancer cells; (2) a first step ( 1) Later, the second step of measuring the amount of the expression product of p53_responsive gene 2 contained in the cancer cells, (3) a test based on the difference obtained by comparing the measured amount of the expression product with a control
  • the method has a third step of determining the ability to promote the expression of p53-responsive gene 2 having a substance.
  • the cancer cells in the first step of the search method of the present invention are not particularly limited, and may be cancer cells isolated from a cancer tissue derived from a mammal, or may be derived from a mammal established as a cell line. It may be a cancer cell line.
  • the mammal include a human, a monkey, a mouse, a rat, a hamus, and the like.
  • spleen cancer or the like is preferably used.
  • known human Ji extract cancer cell lines such as BXPc3, HPAF-II, Capan_2, MiaPaCa-2, Hs766T, and PCK HPAC (all available from ATCC) Can be.
  • the amount of cancer cells usually sufficient if about 1 0 4 -1 0 8 cells, about 1 0 5 to 1 0 7 cells Is preferred.
  • the concentration of the test substance may be generally about 0.1 ng Zm 1 to about 100 s / m 1, and preferably about 1 ng Zm 1 to about 50 xg / m 1.
  • the time for bringing the test substance into contact with the cancer cells is usually from 1 hour to about 5 days, preferably from several hours to about 2 days. The number of times the test substance is brought into contact with the cancer cells may be one or more.
  • the environment in which the test substance is brought into contact with the cancer cells is preferably an environment that maintains the life activity of the cancer cells, and an environment in which the energy source of the cancer cells coexists.
  • the first step is performed in a medium.
  • the second step of the search method of the present invention the amount of the expression product of P53-responsive gene 2 contained in the cancer cells is measured. And a method of measuring an indicator value having a correlation with the methylation frequency of p53_responsive gene 2 contained in the sample.
  • the amount of the measured expression product and, for example, the The amount of expression product of p53-responsive gene 2 when the concentration of the test substance for bringing the test substance into contact with the cancer cells in one step was set to zero (that is, when the test substance was not brought into contact with the cancer cells) (Control) and the ability of the test substance to promote the expression of p53-responsive gene 2 is determined based on the difference obtained by the comparison.
  • the expression product of p53-responsive gene 2 contained in the cancer cells contacted with the test substance is a control (in this case, p53-responsive gene 2 contained in the cancer cells not contacted with the test substance) If the test substance is higher than that of the test substance, it can be determined that the test substance has the ability to promote the expression of p53-responsive gene 2.
  • the expression product of p53-responsive gene 2 when the cancer cell is contacted with another test substance may be used.
  • the p53_responsive gene 2 which the other test substance has in advance may be used. It is preferable that the ability to promote the expression of is known.
  • p53-responsive ive contained in a normal cell line such as a normal stomach cell line or a sample derived from a healthy mammal that can be diagnosed as having no cancerous fibroblasts such as kidney cancer cells is used. It is preferable to measure the amount of gene 2 expression product both when the test substance is brought into contact and when it is not brought into contact.
  • Example 1 01 Test for Confirming the Methylation Status of p53-responsive Gene 2 in Extracted Cancer Cell Lines
  • proteinase K (Signa) was added at 500 g / ml and sodium dodecyl sulfate to 1% (w / v), and the mixture was shaken at 55 ° C for about 16 hours. . After the completion of shaking, the mixture was subjected to phenol [saturated with 1 M Tris-HCl (pH 8.0)] ⁇ form-form extraction. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to the aqueous layer to a concentration of 0.5N, followed by ethanol precipitation to recover the precipitate.
  • the recovered precipitate was dissolved in TE buffer (10 mM Tris, ImM EDTA, H8.0), RNase A (Sigma) was added thereto to a concentration of 40 g / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. The incubated mixture was subjected to phenol / chloroform extraction. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added thereto to a concentration of 0.5N, followed by ethanol precipitation to recover a precipitate (genomic DNA). The collected precipitate was rinsed with 70% ethanol to obtain genomic DNA.
  • TE buffer 10 mM Tris, ImM EDTA, H8.0
  • RNase A Sigma
  • genomic DNA is digested with a restriction enzyme BamHI, and then Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996, and treated with sodium bisulfite. That is, genomic DNA (about 500 ng) after the restriction enzyme treatment was dissolved in distilled water to prepare a genomic DNA solution of 201, and about 11 of 6M sodium hydroxide was added thereto (to a final concentration of about 0.3 ng). M), the mixture was incubated at 37 for 15 minutes.
  • BamHI restriction enzyme
  • DNA was purified from the incubated solution using a Wizard DNA clean-up system (Promega). Purified The resulting DNA was dissolved in 501 TE buffer, and sodium hydroxide was added thereto to a final concentration of 0.3 M, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. Then, the precipitate (DNA) was recovered by ethanol precipitation of the left mixture. The collected precipitate was suspended in 201 TE buffer.
  • the obtained DNA was designated as type III, and PCR was carried out using the following unmethylation-specific primers U1 and U2 or the methylation-specific primers Ml and M2.
  • unmethylation-specific primers U1 and U2 were used, a 106 bp DNA having a base sequence obtained by subjecting a DNA having a base sequence represented by base numbers 1279 to 1384 of SEQ ID NO: 1 to biisulfite treatment was used.
  • the methylation-specific primers Ml and M2 were used, the base sequence after bisulfite treatment of DNA having the base sequence of base numbers 1281 to 1383 of SEQ ID NO: 1 was used.
  • the 103 bp DNA is amplified.
  • Genomic DNA (DNA1) was extracted, a part of which was treated with the methylating enzyme Sssl (NEB) to methylate all 5′-CG-3 ′ of genomic DM (DNA2). These DNAs 1 and 2 were also subjected to methylation-specific PCR and non-methylation-specific PCR.
  • the PCR reaction solution was 25 ng of cyclized DNA, 20 pmol / 1 of the above primer solution in each of 1 ⁇ 1, each 2 mM (11 ⁇ ?
  • the reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, and then at 62 ° C for 30 seconds.
  • the PCR was performed under the condition that 32 cycles of incubation were performed at 72 ° C for 30 seconds per cycle. In each case, after the PCR was performed, the PCR reaction solution containing the amplification product was subjected to 2 agarose gel electrophoresis.
  • the mixture was subjected to phenol [saturated with 1 M Tris-HCl (pH 8.0)] ′ and mouth-form extraction.
  • the aqueous layer was recovered, and NaCl was added to the aqueous layer to a concentration of 0.5N, followed by ethanol precipitation to recover the precipitate.
  • the collected precipitate was dissolved in TE buffer (10 mM Tris, ImM EDTA, H8.0), RNase A (Sigma) was added thereto to a concentration of 40 g / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • the incubated mixture was subjected to phenol-form mouth extraction.
  • the aqueous layer was recovered, and NaCl was added thereto to a concentration of 0.5N, followed by ethanol precipitation to recover a precipitate (genomic DNA).
  • the recovered precipitate was rinsed with 70% ethanol to obtain genomic DNA.
  • genomic DNA is digested with a restriction enzyme BamHI, and then Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996, and treated with sodium bisulfite. That is, genomic DNA (about 500 ng) after restriction enzyme treatment was dissolved in distilled water to prepare a 20 ⁇ 1 genomic DNA solution, and about 1 liter of 6 M sodium hydroxide was added thereto (final concentration: about 1 ng). 0.3M), and the mixture was kept at 37 ° C for 15 minutes.
  • BamHI restriction enzyme
  • DNA was purified from the inked liquid using Wizard DNA clean-up system (Promega). The purified DNA was dissolved in 501 TE buffer, sodium hydroxide was added thereto to a final concentration of 0.3 M, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. Then, the precipitate (DNA) was recovered by ethanol precipitation of the left standing mixture. The collected precipitate was suspended in 20 l of TE buffer.
  • the obtained DNA was designated as type III, and PCR was performed using the following unmethylation-specific primers U1 and U2 or the methylation-specific primers Ml and M2.
  • unmethylation-specific primers U1 and U2 were used, 106 bp having a base sequence obtained by subjecting a DNA having a base sequence represented by base numbers 1279 to 1384 of SEQ ID NO: 1 to bi i sulfite treatment.
  • DNA having the base sequence represented by base numbers 1281 to 1383 of SEQ ID NO: 1 was subjected to bisulfite treatment.
  • base A 103 bp DNA having the sequence is amplified.
  • the specificity of the methylation-specific primers and the unmethylation-specific primers was determined using the immortalized CE as described in Example 1). Genomic DNA (l) and tubule epithelial cell line (HPDE-4 / E6E7) This was partially treated with the methylating enzyme Sssi (NEB) and confirmed in genomic DNA (2).
  • reaction solution for PCR 25 ng of type II DNA, 1 liter of the above primer solution of 20 pmol / 1, 2.51 of each 2 mM dNTP, 2.51 of 10X buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8. 3 and, 500mM KC1, 20mM MgCl 2) to 2.5 1, a thermostable DNA polymerase 5U / 1 0. 2 1 were mixed, and 25 1 of liquid volume, and added with sterile ultrapure water What was used was used. If the above-mentioned unmethylated specific primer is used, incubate the reaction solution at 95 ° C for 30 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 59 ° C for 30 seconds, and further at 72 for 30 seconds.
  • PCR was carried out under the condition that 32 cycles of one cycle of incubation were performed.
  • the reaction solution is kept at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 62 ° C for 30 seconds. Further, PCR was carried out under the condition that 32 cycles of incubation were performed at 72 for 30 seconds as one cycle.
  • the PCR reaction solution containing the amplification product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis.
  • the mixture was centrifuged (4, 15,000 xg, 15 minutes) to recover the supernatant.
  • the collected supernatant was suspended by adding 0.5 ml of isopropanol, and then centrifuged (4, 15,000 xg, 15 minutes) to collect the precipitate (RNA) by HI.
  • the collected precipitate was rinsed with 75% ethanol, and then dissolved in DEPC (getyl pyro force monoponate) treated water.
  • RNA was used as type ⁇ using Superscript (Invitrogen) according to the protocol attached to the enzyme.
  • DNA was synthesized. Real-time PCR using the synthesized cDNA as type III and the following p53-responsive gene 2 S and p53_responsive gene 2 A as a primer pair, derived from p53-responsive gene 2 mRNA DNA was amplified.
  • the Glyceraldehyde 3-phos phate dehydrogenase (GAPDH) gene was DNA from mRNA was amplified.
  • p53-responsive gene 2 S: 5 '-GCCGCAGACCTCCATCC-3, (SEQ ID NO: 12) p53-responsive gene 2 A: 5'- GCAATGTGTTCAAGTTCCTCAGC-3' (SEQ ID NO: 13) GAPDH S: 5 '-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3' (SEQ ID NO: 13) (Number 14)
  • GAPDH A 5'-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • the PCR reaction solution was 50 ng of type I cDNA, two of the above-mentioned primer solutions of lOpmol / 1, each with 41 mM of 2.5 mM dNTP, 5 mM dUTP, and 10XSYBR Green PCR Buffer. 5 ⁇ 1, 25 mM MgCl 2 6 l, heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 U / 1, AmpEraseUNG 0.51, and sterile ultrapure water. A ratio of 50/1 was used.
  • Real Time PCR was performed using iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories).
  • FIGS. Human-derived immortalized (normal) ⁇ ductal epithelial cell lines (HPD E-4 / E6E7 and D3 ⁇ 4PDE6-E6E7c7) are derived from p53-responsive gene 2 mRNA! ) While DNA was detected, the DNA was not detected in any of the seven murine gut cancer cell lines. That is, expression of p53-responsive gene 2 was confirmed in human immortalized (normal) ⁇ duct epithelial cell lines (HPDE-4 / E6E7 and PDE6-E6E7c7), whereas ⁇ ⁇ ⁇ No expression of p53-responsive gene 2 was observed in any of the species.
  • DNA derived from p53-responsive gene 2 mRNA was detected.
  • the DNA derived from the mRNA of the GAPDH gene was used for immortalized (normal) ⁇ duct epithelial cell lines (HPDE-4 / E6E7 and HPDE6-E6E7c7), and for victory cancer cells cultured in the absence of 5Aza-dC.
  • the same was detected in both strains PANC-1 and HPAC, or in the case of PANC-1 and ⁇ PAC cultured in the presence of 0.5 M or IM5Aza-dC.
  • a method for evaluating the degree of canceration of a specimen derived from a mammal can be provided. Sequence listing free text
  • Oligonucleotide primers designed for PCR SEQ ID NO: 15 are designed for PCR SEQ ID NO: 15

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Abstract

本発明は、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、（１）哺乳動物由来の検体に含まれるｐ５３−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　２のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び（２）測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法等に関する。

Description

明細書
癌化度評価方法
技術分野
本発明は、 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等に関する。 背景技術
癌が遺伝子異常を原因とする疾病であること等が次第に明らかになりつつあるが、 癌患者の死亡率は未だ高く、現在利用可能な診断方法や治療方法等が必ずしも十分に' 満足できるものではないことを示している。癌を早期に発見し、発見された癌に対す る有効な治療方法を選択し、 さらに、治療後には癌再発の有無確認等のアフターケア を行うことは、 臨床的に重要である。
そこで、癌を早期に発見するための診断方法、癌に対する治療方法の有効性の評価、 癌再発の有無確認等に適する、遺伝子異常の検出に基づいた哺乳動物由来の検体の癌 化度評価方法の開発が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 かかる状況の下、鋭意検討した結果、癌細胞株及び癌組織検体にお いて p53- respons ive gene 2 (PXN遺伝子、 MG50遺伝子、 PRG2遺伝子、 D2S448遺伝子、 D2S448E遺伝子、 又は、 KIAA0230遺伝子と記すこともある。 ） が、 不死化正常細胞株 及び正常組織検体と比較して有意に高い頻度でメチル化されていること、そして、癌 細胞株においては、 p53_respons ive gene 2の発現レベルが不死化正常細胞株と比較 して有意に低いことを見出し、 さらに、癌細胞株に D NAメチル化阻害剤を作用させ ることにより、かかる遺伝子の発現レベルを増加させ得ることを見出し、本発明に至 つた。
即ち、 本発明は、
1 . 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
( 1 ) 哺乳動物由来の検体に含まれる p53- respons ive gene 2のメチル化頻度又はそ れに相関関係がある指標値を測定する第一工程、 及び ( 2 )測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比 較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程 を有することを特徴とする評価方法 （以下、 本発明評価方法と記すこともある。 ） ； 2 . 哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする前項 1記載の評価方法； 3 . 哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
4. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
( 1 ) 哺乳動物由来の検体に含まれる p53- respons ive gene 2のメチル化頻度を測」定 する第一工程、 及び
( 2 )測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に 基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
5 . 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由架の 細胞の悪性度であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
6 . 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする前項 4記載の評価方法；
7 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由架の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
8 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項 4記載の評価方法； 9 . 組織が勝臓組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徵とする前項 8言己載 の評価方法；
1 0 . 遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又ま翻 訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシ トシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項 1又は 4記載の評価方法； 1 1 . 組織が塍臓組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徴とする前項 1 0 記載の評価方法；
1 2 .遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモータ一領域にある塩基配列 ¾に 存在する一つ以上の 5' - CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であ ることを特徴とする前項 1又は 4記載の評価方法；
13.遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配 列内に存在する一つ以上の 5'- CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻 度であることを特徴とする前項 1又は 4記載の評価方法；
14.遺伝子のメチル化頻度が、配列番号 1で示される塩基配列内に存在する一つ以 上の 5 ' -CG-3 'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴と する前項 1記載の評価方法；
15. 組織が勝臓組織であって、かつ、癌が塍臓癌であることを特徴とする前項 14 記載の評価方法；
16. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1) 哺乳動物由来の検体に含まれる p53-responsive gene 2のメチル化頻度に相関 関係がある指標値を測定する第一工程、 及び
(2)測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比較するこ とにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
17. p53 - responsive gene 2のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、 p53-resp onsive gene 2の発現産物の量であることを特徵とする前項 16記載の評価方法； 1 8. p53- responsive gene 2の発現産物の量が、 当該遺伝子の転写産物の量であるこ とを特徴とする前項 17記載の評価方法；
19. p53- responsive gene 2の発現産物の量が、 当該遺伝子の翻訳産物の量である ことを特徴とする前項 17記載の評価方法；
20. p53- responsive gene 2の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であつ て、
(1) 癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
(2) 第一工程 （1) 後に、 前記癌細胞に含まれる p53- responsive gene 2の発現産 物量を測定する第二工程、
( 3 )測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき 被験物質が有する p53-responsive gene 2の発現を促進する能力を半 ϋ定する第三工程 を有することを特徴とする探索方法 （以下、 本発明探索方法と記すこともある。 ） ； 2 1 . 癌細胞が勝 II蔵癌細胞であることを特徴とする前項 2 0記載の探索方法； 2 2 .有効成分として、前項 2 0の探索方法により見出された能力を有する物賢を含 み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする 抗癌剤： 2 3 . 有効成分として、 p53-respons ive gene 2タンパクのアミノ酸配列を コードする塩基配列を有する核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中 に製剤化されてなることを特徴とする拚癌剤；
2 4. 癌マーカ一としての、 メチル化された p53- respons ive gene 2の使用； 2 5 . 癌マーカ一が勝臓癌マーカーであることを特徴とする前項 2 4記載の使用； 2 6 .癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、 p53- responsive gene 2のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする瘙化抑 制方法；
2 7 . 癌が塍臓癌であることを特徴とする前項 2 6記載の癌化抑制方法；
等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト由来の不死ィ匕 （正常） 塍管上皮細胞株 （HPDE-4/E6E7及び HPDE6- E6E7 c7) 及び滕臓癌細胞株 7種 （BXPc3、 HPAF- I I、 Capan-2, MiaPaCa- 2、 Hs766T、 PANC- 1及び ¾PAC)から調製され、 かつ、亜硫酸水素ナトリウム処理されたゲノム DNAをそれ ぞれ铸型としてポリメラーゼチェイン反応 （以下、 P C Rと記す。 ） を行い、 PCR後 の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した図である。 使用した 細胞の名前を上部に示した。 なお、 HPDEVSss Iと記載された図は、 HPDE- 4/E6E7のゲ ノム DNAをメチル化酵素 Ssslで処理して得られた DNAを示す。 レーン U：非メチルイ匕特 異的プライマーを用いた PCRの PCR反応液、 レーン M :メチル化特異的プライマーを用 いた PCRの PCR反応液。
図 2は、 ヒト由来の膝臓癌組織及びその周辺の塍臓正常組織 [患者からィンフォー ムドコンセントを得て入手]各 1 2検体から調製され、 かつ、亜硫酸水素ナトリウム 処理されたゲノム DMをそれぞれ铸型として PCRを行い、 PCR後の PCR反応液をァガ口一 スゲル電気 ¾動で分析した結果を示した図である。 Casel〜Casel 2は、 検体を示した 。 Cancerは Ji 臓癌組織、 Normalはその周辺の勝臓正常組織である。 レーン U：非メチ ル化特異的プライマーを用いた PCRの PCR反応液、 レーン M :メチル化特異的プライマ 一を用いた PCRの PCR反応液。
図 3は、 ヒト由来の塍臓癌細胞株 7種 （BXPc3、 HPAF-I L Capan- 2、 Mi aP aCa- 2、 H s766T、 PANC - 1及び HPAC) 及び不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 （HPDE- 4/E6E 7及び HPD E6-E6E7c7) において p53- respons ive gene 2の mRNAに由来する DNAを Real T ime PCR で増幅して静られた p53- respons ive gene 2の量を示した図である。 使用した細胞の 名前を図の最下部に示した。縦軸は、 p53- respons ive gene 2の量を GAPDffil:伝子量で 除した値を す。
図 4は、 死化 （正常） 滕管上皮細胞株 （HPDE- 4/E6E7) 、 及び、 メチリレイ匕阻害剤 である 5Aza-dCを、 0、 0. 5 M又は 1 の濃度で添加したヒト由来の勝臓癌細胞株 2種
(PANC-1及 ¾PAC) において、 p53-respons ive gene 2の mRNAに由来する DN"Aを Real Time PCRで増幅して得られた p53- respons ive gene 2の量を示した図である。 使用し た細胞の名前を図の最下部に示した。 縦軸は、 p53- respons ive gene 2の量を GAPDH 遺伝子量で！^した値を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に本 明を詳細に説明する。
本発明は、 癌マーカー （例えば、 勝臓癌マーカー等） としての、 メチル ί匕された p 53- respons ive gene 2の使用等に関連する発明である。
本発明においてマ一力一遺伝子として用いられる p53- respons ive gene 2としては 、 例えば、 ρ53- respons ive gene 2の非翻訳領域 (non-coding region) 及び翻訳領域 (コーディング領域） とその 5 '上流に位置するプロモーター領域とを含むヒト由来 の遺伝子をあげることができる。 ヒト由来の p53-respons ive gene 2の塩基配列とそ れにコードされるアミノ酸配列は、例えば、 Genbank Access ion No. XM_056455等に記 載されている。 また、 ヒト由来の p53_respons ive gene 2の非翻訳領域及び菊訳領域 (コーディング領域） を担うェクソンのうち、 最も 5 ' 上流側に位置する: Cクソン （ 以下、 ェクソン 1と記す。 ） と、 その 5 ' 上流に位置するプロモータ一領域とが含ま れるゲノム D N Aの塩基配列は、 例えば、 Genbank Access i on No. AC009471等に記載 されている。 Genbank Access ion No. AC009471に記載される塩基配列において、 例え ば、 p53 - respons ive gene 2のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 114193〜114443に 示されている。 本発明において利用される p53- respons ive gene 2には、 上記の公知 の塩基配列を有する遺伝子のほか、 かかる塩基配列に、 生物の種差、個体差若しくは 器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加 が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
哺乳動物では、 遺伝子（ゲノム D NA) を構成する 4種類の塩基のうち、 シトシン のみがメチル化されるという現象がある。 哺乳動物由来の、 例えば、 p53- respons iv e gene 2では、 当該遺伝子のゲノム D NAの一部のシトシンがメチルイ匕されている。 そして、 D N Aのメチル化修飾は、 5' -CG-3'で示される塩基配列 （Cはシトシンを表 し、 Gはグァニンを表す。 以下、 当該塩基配列を CpGと記すこともある。 ） 中のシトシ ンに限られる。
シトシンにおいてメチル化される部位は、その 5位である。細胞分裂に先立つ D NA 複製に際して、 複製直後は铸型鎖の CpG中のシトシンのみがメチル化された状態とな るが、 メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の CpG中のシトシンぁメチル化さ れる。従って、 D N Aのメチル化の状態は、 D NA複製後も、 新しい 2組の D NAに そのまま引き継がれることになる。 本発明評価方法の第一工程において 「メチル化頻度」 とは、 例えば、調査対象とな る CpG中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、 当 該シトシンがメチル化されているハプロイドの割合で表される。
また本発明評価方法の第一工程において「（メチル化頻度） に相関関係がある指標値 」 とは、 例えば、 p53- respons ive gene 2の発現産物の量 （より具体的には、 当該遺 伝子の転写産物の量や、 当該遺伝子の翻訳産物の量）等をあげることができる。 この ような発現産物の量の場合には、上記メチル化頻度が高くなればそれに伴い減少する ような負の相関関係が存在する。 本発明評価方法の第一工程における哺乳動物由来の検体としては、例えば、脾臓癌 細胞等の癌細胞若しくはそれを含む組織、及び、滕臓癌細胞等の癌細胞由来の A が含まれる可能性のある、 細胞、 それを含む組織 （ここでの組織とは、 血液、 血漿、 血清、 リンパ液、 塍液等の体液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ）若しくは体 分泌物 （尿や乳汁等） 等の生体試料をあげることができる。 具体的には、 例えば、、 癌 が塍臓癌である場合、被験動物から採取された膳臓組織（滕液を含む）等をあげるこ とができる。
これらの生体試料はそのまま検体として用いてもよく、 また、かかる生体試料力、ら 分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いても よい。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発 明評価方法の利用が期待できる。 本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動物由来の検体に含まれる p53-respons ive gene 2のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する方法は、例え ば、 以下のように行えばよい。 第一の方法として、検体由来の D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接 触させた後、該 D NAを錶型とし、解析対象とするシトシンのメチルイ匕の有無を讖別 可能なプライマーを用いて P C Rを行い、得られる増幅産物の量を調べる方法をあげ ることができる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて； D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (塍臓癌細 胞等の癌細胞由来の D N Aが含まれる）を分析すると、血球由来の D N Aを避けて萃 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、脬臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と狻触させた後 、該 D NAを铸型として、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプ ライマ一を用いて P C Rを行い、得られる増幅産物の量を調べる。解析 ォ象とするシ トシンは、 p53-respons ive gene 2のプロモーター領域、 非翻訳領域又 tま翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列中の シトシンの中から選ぶことができる。
ここで、 p53- respons ive gene 2のプロモーター領域、 非翻訳領域又ま翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列とし ては、 ヒト由来の p53- respons ive gene 2のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置する プロモータ一領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげること力 でき、より具 体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Access ion No. ACO09471に記載 される塩基配列の塩基番号 113501〜116000で示される塩基配列の相捕旳配列に相当 する。 ) があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の p53 -respons ive gene 2のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 1558〜1808に示されている 。 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン は、 例えば、 膳臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、 高メチル化状 態 (hypermethylat ion) ) を示す。 さらに具体的には、 滕臓癌細胞においてメチル化 頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される塩基配列において、塩 基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 1357、 1361、 1365、 137 8、 1383等で示されるシトシンをあげることができる。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 (bi sul f i te) 等を用いることができる。 因みに、 原理的には、 メチル化 シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シトシンを修飾する試薬と抽出された D NAとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （p H9〜14) で変性した後、 亜硫酸水素ナトリウム 等の重亜硫酸塩 (b i sul f i te) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時 間 （一晩） 程度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95 での変性と、 50°Cでの 反応を 10- 20回繰り返すことも 来る。 この場合、 メチル化されていないシトシンは ゥラシルに変換され、 一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シトシンのままである。
次いで、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを铸型とし、 かつ、 メチル化されたシトシ ンが含まれる場合の塩基配列 [メチル化される位置のシトシン （CpG中のシトシン） はシトシンのままであり、 メチ レ化されていないシトシン （CpGに含まれないシトシ ン）はゥラシルとなった塩基配列] とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列から それぞれ選ばれる一対のメチルイ匕特異的プライマ一を用いる PCR (以下、 メチル化特 異的 P C Rとも記すこともある。 ） と、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを铸型とし、 かつ、 シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列 (全てのシトシンがゥラシル となつた塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれ る一対の非メチル化特異的プライマーを用いる PCR (以下、 非メチル化特異的 P C R とも記すこともある。 ) とを行う。
上記 PCRにおいて、 メチルイ匕特異的プライマ一を用いる PCRの場合（前者） には、 解 析対象とするシトシンがメチル化されている DNAが増幅され、 一方、 非メチル化特異 的プライマーを用いる PCRの場合 （後者） には、 解析対象とするシトシンがメチル化 されていない DNAが増幅される。 これらの増幅産物の量を比較することにより、 対象 となるシトシンのメチル化の有無を調べる。このようにしてメチル化頻度を測定する ことができる。 ここで、プライマーとしては、 メチル化を受けていないシトシンがゥラシルに変換 され、かつ、メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換されないことを考慮し て、 メチル化を受けているシトシンを含む塩基配列に特異的な PCRプライマー （メチ ル化特異的プライマー） を設計し、 また、 メチル化を受けていないシトシンを含む塩 基配列に特異的な PCRプライマー （非メチル化特異的プライマー） を設計する。 重亜 硫酸塩処理により化学的に変換され相補的ではなくなつた D N A鎖を基に設計する ことカら、元来二本鎖であった D N Aのそれぞれの鎖を基に、それぞれからメチル化 特異的プライマ一と非メチルイ匕特異的プライマ一とを作製することもできる。かかる プライマーは、 メチル、 非メチルの特異性を高めるために、 プライマーの 3'末端近傍 に CpG中のシトシンを含むように設計することが好ましい。 また、 解析を容易にする ために、 プライマ一の一方を標識してもよい。 より具体的に fま、 p53- respons ive gene 2のメチル化頻度をメチル化特異的 P C R で測定するためのプライマ一は、 例えば、 p53- respons ive gene 2のプロモーター領 域、 非翻訳領域ヌは翻訳領域 （コーディング領域） にある塩基配列内に存在する CpG 中のシトシンを 1以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することがで きる。 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpG中のシトシン、 具体 的には、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308 、 1315、 1319、 1 349、 1351、 1357、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンを 1以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプライマーの例を以下に示 す。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TTTTGTGTAGGTTTTAGGGTTTT-3' (配列番号 2 )
U2： 5' -CAACCCACATAACCAAAACA-3' (配列番号 3 )
<メチル化特異的プライマ一 >
Ml： 5' -TCGCGTAGGTTTTAGGGTTTC-3' (配列番号 4 )
M2： 5' -GACCCGCA.TAACCAAAACG-3 ' (配列番号 5 ) メチル化特異的 PCRにおける反応液としては、 例えば、 鐽型とする DNAを 50ngと、 1 Opmo l/ lの各プライマー溶液を各 l lと、 2. 5mM dNTPを と、 10 X緩衝液（l OOmM Tr i s-HCl pH8. 3, 500mM C K 20mM MgCl2 )を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ 5U/ 1を 0 · 2 t 1とを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を 25 とした反応液をあげ ることができる。
反応条件としてま、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 9 5°Cにて 30秒間次いで 55〜65°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする 保温を 30〜40サイクル行う条件があげられる。
力、かる PCRを行った後、 得られた増幅産物の量を比較する。 例えば、 メチル化特異 的プライマーを用いた P C Rと非メチル化特異的プライマーを用いた P C Rで得ら れた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法（変性ポリアクリルアミド ゲル電気泳動ゃァガロースゲル電気泳動）である場合には、電気泳動後のゲルを D N A染色して増幅産物のバンドを検出し、検出されたバンドの濃度を比較する。 ここで D N A染色の代わりに予め標識されたプライマーを使用してその標識を指標として バンドの濃度を比較することもできる。 また、 定量を必要とする場合には、 PCR反応 産物をリアルタイムでモニタリングし力イネティックス分析を行うことにより、例え ば、遺伝子量に関して 2倍程度のほんの僅かな差異をも検出できる高精度の定量が可 能な PCR法であるリアルタイム PCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもで きる。 リアルタイム PCRを行う方法としては、 例えば铸型依存性核酸ポリ ラーゼプ ローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターカレーターを 用いる方法等が挙げられる。 リアルタイム PCR法のための装置及び試薬としては、 巿 販の装置及び試薬キットを利用することができる。 このような方法は、 一般にメチル化特異的 P C Rとも呼ばれ、 Hermanら（Herman e t al .， Proc. Nat l . Acad. Sc i USA, 93, 9821-9826, 1996)等により報告されてい る方法であつて、シトシンと 5-メチルシトシンとの化学的性質の違いを利用する方法 である。 第二の方法として、検体由来の D NAを非メチルイ匕シトシンを修飾する試薬と接触 させた後、該 D NAを铸型として解析対象とするシトシンを含む D N Aを P C Rで増 幅し、 得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する方法をあげることができる。 まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D N A抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D N A (脬臓癌細 胞等の癌細胞由来の D N A力 S含まれる） を分析すると、血球由来の D N Aを避けて鹧 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後 、 該 D N Aを錶型として、 p53- respons ive gene 2のプロモーター領域、 非翻訳領域 又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示され る塩基配列中のシトシンを含む塩基配列を基にして後述するように設計されるブラ イマ一を用いて P C Rを行うことにより、解析対象とするシトシンを含む D N Aを増 幅し、 得られる増幅産物の 基配列を直接的に解析する。
ここで、 p53- respons ive gene 2のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列とし ては、 ヒト由来の p53-respons ive gene 2のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置する プロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、より具 体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Access ion No. AC009471に記載 される塩基配列の塩基番号 1 13501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当 する。 ） があげられる。 配冽番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の p53 -respons ive gene 2のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 1558〜1808に示されている 。 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン 、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密に存在する領域中に存在 する CpG中のシトシンは、 何えば、 塍臓癌細胞等の癌細胞において高いメチルイヒ頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌 細胞においてメチル化頻度力 S高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される 塩基配列において、 塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 1 357、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンをあげることができる。 当該 P C Rに用いられるプライマーとしては、解析対象とするシトシンの 5，上流 の塩基配列と 3 '下流の塩基配列を基にして当該シトシンを含む塩基配列を有する D N Aを増幅可能なプライマー対を設計するとよい。プライマー設計のための塩基配列 は、 解析対象とする CpG中のシトシンを含まないように選定する。 そして、 プライマ —設計のために選定された塩基配列が、 シトシンを全く含まない場合には、選定され た塩基配列及びかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれそのままブラ イマ一の塩基配列とすることができる。また、 プライマー設計のために選定された塩 基配列が解析対象以外のシトシンを含むが当該シトシンは CpG中のシトシンでない場 合には、これらシトシンがゥラシルに変換されることを考慮してプライマ一を設計す る。即ち、全てのシトシンがゥラシルとなった塩基配列とかかる塩基配列に対して相 補的な塩基配列をそれぞれ有する一対のプライマーを設計する。さらに、 プライマー 設計のために選定された塩基配列が解析対象以外のシトシンを含み当該シトシンは C pG中のシトシンである場合には、メチル化を受けていないシトシンがゥラシルに変換 され、かつ、メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換されないことを考慮し てプライマーを設計する。即ち、 メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列 [メチル化される位置のシトシン (CpG中のシトシン) はシトシンのままであり、 チル化されていないシトシン （CpGに含まれないシトシン） はゥラシルとなった塩基 配列]とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選定された一対の チル化特異的プライマーと、 シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全て のシトシンがゥラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基記 列をそれぞれ有する一 ¾の非メチル化特異的プライマーとを設計する。 この場合、上 記の P C Rには、メチレ化特異的プライマ一対と非メチル化特異的プライマ一対とを 等量ずつ混合して用いる。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 (b i sul f i t e) 等を用いることができる。 因みに、 原理的には、 メチルイ匕 シトシンのみを修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シトシンを修飾する試薬と抽出された D N Aとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （p H9〜14) 中で亜硫酸水素ナトリウム等の重亜疵 酸塩 (bisulfite) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜 6時間 （一晩） 程度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95°Cでの変性と、 50°Cでの反応を 10 - 20回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチル化されていないシトシンはゥラシルに 変換され、一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シトシンの ままである。
次いで、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを铸型とし、 かつ、 上述するように設計さ れるプライマーを用いる PCRを佇う。 得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較 からメチル化頻度を測定することができる。 より具体的には、 p53- respons ive gene 2のメチル化頻度を塩基配列の直接的解析 で測定するためのプライマーは、 例えば、 p53- responsive gene 2のプロモーター領 域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） にある塩基配列内に存在する CpG 中のシトシンを 1以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することがで きる。 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpG中のシトシン、 具体 的には、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 991、 999、 1004、 1023、 1 042、 1097、 1114、 1122、 1150、 1152、 1158、 1160、 1170、 1176、 1190、 1218、 1234 、 1243, 1258、 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319等で示される 1以上のシトシン を解析対象として設計することができる。例えば、以下に示すプライマ一 B 1及び B 2を用いると、 配列番号 1の塩基番号 967〜1342で示される塩基配列を有する DNA の bisulfite処理後の塩基配列を有する DNA (376bp) が増幅される。該プライマー 対は、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 991、 999、 1004、 1023、 104 2、 1097、 1114、 1122、 1150、 1152、 1158、 1160、 1170、 1176、 1190、 1218、 1234、 1 243、 1258、 1282, 1284、 1301、 1308、 1315, 1319で示されるシトシンのメチル化頻 度を調べるためのプライマーとして用いることができる。
<プライマー >
B1： 5' -AGAGAGTAGGTGGTTGATAG-3' (配列番号 6 )
B2： 5' -AACATTAACACCCCTAATTCTA-3' (配列番号 7 ) PCRにおける反応液としては、 例えば、铸型とする DNAを 25ngと、 20pmo l/ 1の备プ ライマー溶液を各 1 lと、 2mM dNTPを 3 1と、 10 X緩衝液（l OOmM Tr i s-HCl pH 8. 3 、 500mM KC1、 15mM MgC 12 )を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ 5U/ 1を 0. 2 1とを 混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 z lとした反応液をあげることができる 。 反応条件としては、 例えば、 前記のような反応液を、 95tにて 10分間保温した後、 95 にて 30秒間次いで 53 にて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保 温を 30〜40サイクル行う条件があげられる。
かかる PCRを行った後、 得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル 化頻度を測定する。
即ち、当該増幅産物の塩基配列を直接的に解析することにより、解析対象とするシ トシンに相当する位置の塩基がシトシンであるかチミン（ゥラシル）であるかを半 [J定 する。得られた増幅産物における塩基を示すピークのチャートにおいて、解析対象と するシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミン（ゥ ラシル）を示すピークの面積とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメ チル化の頻度を測定することができる。 また、塩基配列を直接的に解析する方法とし て、 P C Rで得られた饍幅産物を一旦大腸菌等を宿主としてクローニングして得られ た複数のクローンから、 それぞれクローニングされた D N Aを調製し、当該 D N の 塩基配列を解析してもよい。解析される試料のうちの解析対象とするシトシンに栢当 する位置に検出された塩基がシトシンである試料の割合を求めることにより、解析対 象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することもできる。 第三の方法として、換体由来の D N Aを非メチルイ匕シトシンを修飾する試薬と揍触 させた後、該 D N Aと、 解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプロ 一ブとをハイブリダィゼ一ションさせ、プローブの結合の有無を調べる方法をあげ、る こともできる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D N A抽出用キット等を用いて!） N Aを抽出する。
血液を検体として用レ る場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (脬臓癌細 胞等の癌細胞由来の D NAが含まれる）を分析すると、血球由来の D NAを避けて塍 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAを、非メチル化シ卜シンを修飾する試薬と接触させた後 、該 D N Aと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとを ハイブリダイゼーシヨンさせ、 前記 D N Aと当該プローブとの結合の有無を調べる。 解析対象とするシトシンは、 p53- respons ive gene 2のプロモーター領域、 非翻訳領 域又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示さ れる塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、 p53- respons ive gene 2のプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列とし ては、 ヒト由来の p53_respons ive gene 2のエケソン 1と、 その 5 ' 上流に位置する プロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの:^基配列をあげることができ、より具 体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AC009471に記載 される塩基配列の塩基番号 113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当 する。 ） があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の p53 -respons ive gene 2のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 1558〜1808に示されている 。 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン 、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密に存在する領域中に存在 する CpG中のシトシンは、 例えば、 JJ萃臓癌細胞寧の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 髙メチル化状態 (hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌 細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される 塩基配列において、 塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 1 357、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンをあげることができる。 当該八ィブリダイゼーシヨンに用いられるプロ一ブは、解析対象とするシトシンを 含む塩基配列を基にして、 メチル化を受けていないシトシンがゥラシルに変換され、 かつ、メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換されないことを考慮して設計 するとよい。
即ち、 メチルイ匕されたシトシンが含まれる場合の塩基配列 [メチル化される位置のシ トシン （CpG中のシトシン） はシトシンのままであり、 メチル化されていないシトシ ン （CpGに含まれないシトシン） はゥラシルとなった塩基配列] 又はかかる塩基配列 に対して相補的な塩基配列を有するメチル化特異的プローブと、シトシンがメチル化 されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがゥラシルとなった塩基配列）又はか かる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する非メチル化特異的プローブを設計 する。 尚、 このようなプローブは、 D NAとプローブとの結合の有無についての解析 を容易にするために標識してから用いてもよい。またプローブを通常の方法に準じて 担体上に固定して用いてもよいが、 この場合には、哺乳動物由来の検体から抽出され た D NAを予め標識しておくとよい。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 （bisul f i te) 等を用いることができる。 因みに、 原理的には、 メチル化 シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シトシンを修飾する試薬と抽出された D NAとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （p H9〜14) で変性した後、 亜硫酸水素ナトリウム 等の重亜硫酸塩 (bisul f i te) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時 間 （一晩） 程度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95°Cでの変性と、 50ででの 反応を 10-20回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチルイ匕されていないシトシンは ゥラシルに変換され、 一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シ卜シンのままである。
必要に応じて、重亜硫酸塩等で処理された D N Aを铸型として第二の方法と同様に P C Rを行うことにより当該 D N Aを予め増幅させておいてもよい。
次いで、重亜硫酸塩等で処理された D NA又は前記 P C Rで予め増幅された D NA と、解析対象とするシトシンのメヂル化の有無を識別可能なプローブとのハイブリダ ィゼーシヨンを行う。メチル化特異的プローブと結合する D NAの量と、非メチリレ化 特異的プローブと結合する D N Aの量とを比較することにより、解析対象となるシト シンのメチル ί匕の頻度を測定することができる。 より具体的には、 p53- respons ive gene 2のメチル化頻度を測定するためのプロ一 ブは、 例えば、 p53- respons ive gene 2のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻 領 域 （コーディング領域） にある塩基配列内に存在する CpG中のシトシンを 1以上含む 塩基配列を基にして、 上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号 1 で示される塩基配列中に存在する CpG中のシトシン、 具体的には、 配列番号 1で さ れる塩基配列において塩基番号 1282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351 、 1357、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンを 1以上含む塩基配列を基に 設計すること力 Sできる。 かかるプローブの例を以下に示す。
<セッ卜 1 >
非メチル化特異的プローブ： 5' -TTGTGTAGGTTTTAGGGTTTTGAGTTTTGAGTTTTG-3' (配列番 号 8 )
メチル化特異 β勺プローブ ： 5' -TCGCGTAGGTTTTAGGGTTTCGAGTTTCGAGTTTCG- 3' (配列番 号 9 )
<セッ卜 2 >
非メチル化特異的プローブ： 5' -TTGTGTTTTTGAGTGTTTGTTTTGGTTATGTGGGTT-3' (配列番 号 10)
メチル化特異旳プローブ ： 5' - TCGCGTTTTCGAGCGTTCGTTTTGGTTATGCGGGTC- 3' (配列番 号 11) ハイプリダイゼーシヨンは、 例えば、 Sambrook J. , Fr i sch E. F.， Mani at i s T. 著、 モレキュラークロ一ニング第 2版 （Molecular Cloning 2nd edi t ion) 、 コー レド スプリング ハーバー ラボラトリー発行 （Cold Spring Harbor Laboratory pre ss)等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。ハイブリダィゼーシヨン は、通常ストリンジェントな条件下に行われる。 ここで「ストリンジェントな条件下 」 とは、 例えば、 6XSSC (1. 5M NaCl、 0. 15M クェン酸三ナトリウムを含 む溶液を 10 XSSCとする） を含む溶液中で 45 :にてハイプリッドを形成させた後 、 2XSSCで 50°Cにて洗浄するような条件 (Molecular Biology, John Wiley & Son s, N. Y. (1989)， 6.3.卜 6.3.6)等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩 濃度は、 例えば、 2 X SSCで 50 °Cの条件 （低ストリンジエンシーな条件） から 0. 2 XSSCで 50°Cまでの条件 （高ストリンジエンシーな条件） から選択することがで きる。 洗浄ステップにおける温度は、 例えば、 室温 (低ストリンジエンシーな条件) から 65t: (高ストリンジエンシーな条件） から選択することができる。 また、 塩濃 度と温度との両方を変えることもできる。
かかるハイブリダィゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合した D N Aの量と、非メチル化特異的プローブと結合した DN Aの量とを比較することによ り、解析対象となるシトシン（即ち、 プローブの設計の基となった塩基配列に含まれ る CpG中のシトシン） のメチルイ匕の頻度を ϋ定することができる。 第四の方法として、検体由来の DNAに、 解析対象とするシトシンのメチル化の有 無を識別可能な制限酵素を作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる方 法をあげることもできる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、 Tf?販の DNA抽出用キット等を用いて DN Aを抽出する。
血液を検体と.して用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 DNA (勝臓癌細 胞等の癌細胞由来の DN Aが含まれる）を分析すると、血球由来の DNAを避けて塍 臓癍細胞等の癌細胞由来の DNAを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された DNAに、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可 能な制限酵素を作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる。解析対象と するシトシンは、 p53_responsive gene 2のプロモー夕一領域、 非翻訳領域又は翻訳 領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配 列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、 p53-respons ive gene 2のプロモータ一領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （ コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列とし ては、 ヒト由来の p53- respons ive gene 2のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置する プロモーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、より具 体的には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Access i on No. AC009471に記載 される塩基配列の塩基番号 113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当 する。 ） があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の p53 -respons ive gene 2のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 1558〜1808に示されている 。 配列番号 1で示される塩基酉己列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン 、 とりわけ配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密に存在する領域中に存在 する CpG中のシトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 (即ち、 高メチル化状態 （hyp ermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌 細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される 塩基配列において、 塩基番号 1 282、 1284、 1301、 1308、 1315、 1319、 1349、 1351、 1 357、 1361、 1365、 1378、 1383等で示されるシトシンをあげることができる。 当該方法で用いられる「シ卜シンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素」 （以下 、 メチル化感受性制限酵素と記すこともある。 ） とは、 メチル化されたシトシンを含 む認識配列を消化せず、メチリレ化されていないシトシンを含む認識配列を消化するこ とのできる制限酵素を意味する。認識配列に含まれるシトシンがメチルイ匕されている DNAの塲合、 メチル化感受性制限酵素を作用させても当該 DNAは切断されず、 一方、認 識配列に含まれるシトシンがメチル化されていない DNAの場合、 メチル化感受性制限 酵素を作用させれば当該 DNA¾:切断される。 メチル化感受性酵素の具体的な例として は、 例えば、 HpaI I、 Bs tUI、 Nar l、 Sac I I等をあげることができる。 当該制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、例えば、解析対象とするシ トシンを認識配列に含むメチクレ化感受性制限酵素を作用させた D N Aを铸型とし、解 析対象とするシトシンが含まれる認識配列を含み、当該認識配列以外には前記制限酵 素の認識配列を含まない D NT Aを増幅可能なプライマー対を用いて P C Rを行い、 D NAの増幅（増幅産物） の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とする シトシンがメチル化されている場合には、 増幅産物が得られる。一方、解析対象とす るシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。 このようにし て、増幅された D NAの量を 較することにより、解析対象となるシトシンのメチル 化の頻度を測定することができる。 定量を必要とする場合には、 PCR反応産物をリア ルタイムでモニタリングし力イネティックス分析を行うことにより、例えば、遺伝子 量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が可能な PCR 法であるリアルタイム PCRを用いて、 それぞれの産物の量を比較することもできる。 リアルタイム PCRを行う方法としては、 例えば铸型依存性核酸ポリメラーゼプローブ 等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインタ一カレー夕一を用いる 方法等が挙げられる。 リアルタイム PCR法のための装置及び試薬としては、 市販の装 置及び試薬キット等を利用することができる。
例えば、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 1218、 1498、 1636、 179 0で示されるシトシンの場合こは、 当該シトシンは Nar Iの認識配列に含まれており、 上記方法により当該シトシンのメチル化頻度を測定することができる。 また、 当該制限酵素による消化の有無を調べる他の方法としては、例えば、解析対 象とするシトシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させた D N Aに 対して、 p53- respons ive gene 2に由来し、 かつ、 当該制限酵素の認識配列を含まな い D N Aをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズし た D N Aの長さを調べる方法をあげることもできる。解析対象とするシトシンがメチ ル化されている場合には、当該シトシンがメチル化されていない場合よりも長い D N Aが検出される。検出された長い D NAの量と短い D NAの量とを比較することによ り、 解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。 以上のような各種方法を用いて、 哺乳動物由来の検体に含まれる p53-respons ive gene 2のメチル化頻度を測定する。測定されたメチル化頻度と、 例えば、勝臓癌細胞 等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれる P53- res pons ive gene 2のメチル化頻度（対照） とを比較して、 当該比較により得られる差異 に基づき前記検体の癌化度を判定する。 例えば、 哺乳動物由来の検体に含まれる p53 -respons ive gene 2のメチル化頻度力対照と比較して高ければ （p53-respons ive ge ne 2が対照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比較 の上で高いと判定することができる。
ここで 「癌化度」 とは、 一般に当該分野において使用される意味と同様であって、 具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を 意味し、 また、 例えば、哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における 癌細胞の存在量等を意味している。 p53- respons ive gene 2の発現は、 健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体にお いてよりも勝臓癌細胞等の癌細胞において低い。 これは、膳臓癌細胞等の癌細胞にお いて当該遺伝子のメチル化頻度が高いために、当該遺伝子が正常に発現できずその結 果として当該遺伝子の発現産物の量 （より具体的には、転写産物の量や翻訳産物の量 ) が減少する。 このように本発明評価方法等では、 メチル化頻度の代わりに、 それに 相関関係がある指標値（上記の場合 ίこは、発現産物の量であって、負の相関関係があ る指標値である。 ） を測定してもよレ^
つまり、 本発明評価方法では、 哺乳動物由来の検体に含まれる p53_respons ive ge ne 2のメチル化頻度に相関関係がある指標値 （例えば、 発現産物の量） を測定し、 測 定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値（例えば、発現産物の量） と対照 とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌ィ匕度を判定することが できる。 本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動物由来の検体に含まれる p53-respons ive gene 2のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法としては、例えば 、 p53- respons ive gene 2の転写産物である mRNAの量を測定する方法をあげることが できる。 当該測定には、 例えば、 RT—PCR法、 ノザンブロット法 [Molecular Clonin g, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 〕 、 in situ RT—： PCR法 [Nucleic Acids Res. , 21, 3159-3166 (1993) 〕 、 in situハイブリダィゼーシヨン法、 NASBA法 [Nuc leic acid sequence-based ampli f ication, nature, 350, 91— 92 (1991) 〕 等の公知 な方法を用いればよい。
哺乳動物由来の検体に含まれる p53_responsive gene 2の転写産物である mRNAを含 む試料は、 通常の方法に準じて当該検体から抽出、 精製等により調製すればよい。 調製された試料中に含まれる mRNFAの量を測定するためにノザンプロット法が用い られる場合には、 検出用プローブ W:p53- responsive gene 2又はその一部 （p53_resp onsive gene 2の制限酵素切断、 p53- responsive gene 2の塩基配列に基づき化学合成 された約 lOObp〜約 lOOObp程度のすリゴヌクレオチド等） を含むものであればよく、 前記試料中に含まれる mRNAとのハイブリダィゼーシヨンにおいて用いられる検出条 件下に検出可能な特異性を与えるちのであれば特に制限はない。
また調製された試料中に含まれる mRNAの量を測定するために RT—PCR法が用いられ る場合には、 使用されるプライマーは、 p53-responsive gene 2のみを特異的に増幅 できるものであればよく、その増幅する領域や塩基長等には特に制限はない。かかる プライマーとしては、 例えば、 以 に示すプライマー （S:sense、 A:antisense) 等を あげることができる。 これらのプライマ一を用いて後述の実施例に示すようにして R T-PCR法による転写産物の量を測定することもできる。定量を必要とする場合には、 P CR反応産物をリアルタイムでモニタリングし力イネティックス分析を行うことによ り、例えば、遺伝子量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度 の定量が可能な； PCR法であるリアルタイム PCRを用いて、それぞれの産物の量を比較す ることもできる。 リアルタイム PCRを行う方法としては、 例えば、 铸型依存性核酸ポ リメラーゼプロ一ブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインター カレ一ターを用いる方法等が挙げられる。 リアルタイム PCR法のための装置及び試薬 としては、 市販の装置及び試薬キット等を利用することができる。
S:5' -GCCGCAGACCTCCATCC-3' (配歹 ϋ番号 12)
Α:5' -GCAATGTGTTCAAGTTCCTCAGC-3' (配列番号 13) また本発明評俩方法の第一工程において、 喵乳動物由来の検体に含まれる p53_res pons ive gene 2のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する他の方法として は、例えば、 p53- respons ive gene 2の翻訳産物である p53- respons ive gene 2タンパ ク質の量を測定する方法をあげることができる。 当該測定には、 例えば、 p53- respo ns ive gene 2タンパク質に対する特異的抗体（モノクロナル抗体、ポリクロナル抗体 ) を用いた、 細胞工学ハンドブック、 羊土社、 207 (1992)等に記載されるィムノブ口 ット法、 免疫沈降による分離法、 間接競合阻害法 (ELISA法） 等の公知な方法を用い ればよい。
因みに、 p53- respons ive gene 2タンパク質に対する特異的抗体は、 当該タンパク 質を免疫抗原として用いる通常の免疫学的な方法に準じて製造することができる。 以上のような各種方法を用いて、 哺乳動物お来の検体に含まれる p53-respons ive gene 2のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する。測定されたメチル化頻度 に相関関係がある指標値と、例えば、 S萃臓癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得 る健常な哺乳動物由来の検体に含まれる P53 - respons ive gene 2のメチル化頻度に相 関関係がある指標値（対照） とを比較して、 当該比較により得られる差異に基づき前 記検体の癌化度を判定する。 仮に、 哺乳動物由来の検体に含まれる p53-respons ive gene 2のメチルイ匕頻度に正の相関関係がある i 標値が対照と比較して高ければ又は 負の相関関係がある指標値が対照と比較して低ければ （p53- respons ive gene 2が対 照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高 いと判定することができる。 本発明評価方法における、 p53- respons ive gene 2のメチル化頻度又はそれに相関 関係がある指標値を測定するための各種方法で使用し得るプライマー、プローブ又は 特異的抗体は、勝臓癌細胞等の癌細胞の検出用キットの試薬として有用である。本発 明は、 これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等を試薬として含有する塍臓癌細 胞等の癌細胞の検出用キットや、 これらプライマー、 プローブ又は特異的抗体等が担 体上に固定化されてなる脖臓癌細胞等の癌細胞の検出用チップも提供しており、本発 明評価方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出 用キットゃ検出用チップのような形態での使用も含むものである。 p53- respons ive gene 2の発現は、 健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体にお いてよりも塍臓癌細胞等の搭細胞において低い。一方、後述の実施例でも示すように 、 p53- respons ive gene 2に係る D N Aメチル化を阻害する物質を膝臓癌細胞等の癌 細胞に作用させることにより、当該遺伝子の発現産物の量を増加させることができる 。 これは、 勝臓癌細胞等の搭細胞における p53- respons ive gene 2の発現レベルの低 下又はそれに伴う機能低下を補うことのできる物質一例えば、 非メチル化（又は、極 で認められるようなメチルイ匕異常を起こしていない） p53_respons ive gene 2、 当該 遺伝子の発現産物、 当該遺伝子の発現を促進する能力を有する物質 （例えば、 P53 - r espons ive gene 2に係る D N" Aメチル化を阻害する物質、 p53_respons ive gene 2の メチル化頻度を低下させる物質） 一等は、膝臓癌等の癌の治療や、勝臓等正常組織の 癌化抑制に有用であることを意味している。
例えば、 p53-respons ive gene 2のメチル化頻度を低下させる物質を癌であると診 断されうる哺乳動物の体内にある細胞に投与することにより癌化は抑制されるだろ ラ。
また例えば、 p53_respons ive gene 2に係る D NAメチル化を阻害する物質を滕臓癥 細胞等の癌細胞に提供することにより、 p53- respons ive gene 2のプロモーター領域 又はコ一ディング領域にある塩基配列中に存在する CpG中のシトシンを正常組織と同 様に低メチル化状態 (hypome thyl at i on) とし、 p53- respons ive gene 2の転写産物で ある mRNAの発現量を増大させ、 ひいては p53- respons ive gene 2の翻訳産物である p5 3 - respons ive gene 2タンパク質の発現量を増大させることができるだろう。 また例 えば、 p53- respons ive gene 2又は p53- respons ive gene 2タンパク質のアミノ酸配列 をコ一ドする塩基配列からなる cDNAを滕臓癌細胞等の癌細胞に導入することにより、 勝臓癌細胞等の癌細胞における p53-respons ive gene 2タンパク質の発現量を増大さ せることができるだろう。 つまり、 本発明では、 （1 ) 有効成分として、 p53- respons ive gene 2の発現を促 進する能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化 されてなることを特徴とする抗癌剤や、 （2 ) 有効成分として、 p53- respons ive ge ne 2タンパクのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を含み、当該有効成 分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤も提供 している （以下総じて、 本発明抗癌剤と記すこともある。 ） 。 本発明抗癒剤の剤型としては通常の製剤であれば特に制限はないが、このような製 剤は、 薬学的に許容される、 例えば、 水溶性溶剤、 非水溶性溶剤、 緩衝剤、 溶解補助 剤、等張剤、安定剤等の担体に有効成分を配合することにより製造することができる 。 必要に応じて、 防腐剤、 懸濁化剤、 乳化剤等の補助剤を添加してもよい。 また、 非 経口的に投与する場合 （一般的には注射等が好ましい。 ） には、 当該抗癌剤を溶液等 の通常の液剤の形態で使用することができる。
本発明抗癌剤は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物（例えば、癌であると 診断されうる哺乳動物の体内にある細胞） に対し投与することができる。例えば、 非 経口的に投与する方法としては、 例えば、 注射 （皮下、 静脈内、 局所） 等を挙げるこ とができる。
投与量は、 投与される哺乳動物の年令、 性 ' J、 体重、 疾患の程度、 本発明抗癌剤の 種類、 投与形態等によって異なるが、通常は、 患者細胞において有効成分が細胞内で 有効に働くような濃度レベルと等しい細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与す ればよい。また、前記の 1日の投与量を 1回 は数回に分けて投与することができる
ここで、 p53- respons ive gene 2タンパク ( アミノ酸配列をコードする塩基配列を 有する核酸を細胞に導入する方法としては、ウィルスベクターを利用した遺伝子導入 方法、 非ウィルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法 （日経サイエンス， 1994年 4 月号， 20-45頁、 実験医学増刊， 12 (15) (1994)、 実験医学別冊 「遺伝子治療の基礎技術 」 ，羊土社 （1996) ) 等の方法をあげることができる。
前者の遺伝子導入方法としては、 例えば、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデ ノ闋連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスウィルス、 ポリ ォウィルス、シンビスウィルス等の D NAウィルス又は R NAウィルスに、 T R 4又 は変異 T R 4をコードする D N Aを組み込んで導入する方法等があげられる。また非 ウィルス性べクタ一を利用した遺伝子導人方法としては、例えば、発現プラスミドを 直接筋肉内に投与する方法（D NAワクチン法） 、 リボソーム法、 リポフエクチン法 、 マイクロインジェクション法、 リン酸カ レシゥム法、 エレクトロボレ一シヨン法等 があげられる。
また、 p53_respons ive gene 2タンパクのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有 する核酸を抗癌剤としての遺伝子治療剤の有効成分として利用する方法としては、当 該核酸を直接体内に導入する in vivo法、 ヒトから特定な細胞を取り出し体外で当該 核酸を当該細胞に導入し、 その細胞を体內に戻す ex vivo法 （日経サイエンス， 1994 年 4月号， 20-45頁、 月刊薬事， 36 (1)，23-48 (1994) 、 実験医学増刊， 12 (15) (1994) ) 等 をあげることができる。
前者の in vivo法の場合には、 p53- respons ive gene 2タンパクのアミノ酸配列をコ —ドする塩基配列を有する核酸が疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与さ れ得る。 例えば、 睦臓癌細胞、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉内等に注射により投与 することができる。
前記抗癌剤としての遺伝子治療剤の剤型としては、 注射剤、他には懸濁剤、 凍結剤 、 遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤とすることもできる。 このような製剤は、 薬学的に許容される、 例えば、 水溶性溶剤、 非水溶性溶剤、 緩衝剤、 溶解補助剤、 等 張剤、 安定剤等の担体に前記遺伝子（ベクタ一型もしくはウィルス型、 又はプラスミ ド型の前記遺伝子の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要 に応じて、 防腐剤、 懸濁化剤、 乳化剤等の補助剤を添加してもよい。 また、 非経口的 に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。 ) には、 当該抗癌剤を溶液等の通常 の液剤の形態で使用することができる。 本発明探索方法は、 p53- respons ive gene 2の発現を促進する能力を有する物質の 探索方法であって、 （1 ) 癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、 （2 ) 第一工程 ( 1 ) 後に、 前記癌細胞に含まれる p53_respons ive gene 2の発現産物量を測定する 第二工程、 （3 )測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差 異に基づき被験物質力有する p53- respons ive gene 2の発現を促進する能力を判定す る第三工程を有する。
本発明探索方法の第一工程における癌細胞としては、特に制限はなく、哺乳動物由 来の癌組織から分離された癌細胞であってもよいし、またセルラインとして確立され た哺乳動物由来の癌細胞株であってもよい。 前記哺乳動物としては、 例えば、 ヒト、 サル、 マウス、 ラッ卜、 ハムス夕一等をあげることができる。 癌の種別としては、 萃 臓癌等が好ましくあけ、られる。 具体的には、 例えば、 BXPc3、 HPAF-I I, Capan_2、 M i aPaCa- 2、 Hs766T、 P C-K HPAC (全て ATCCから入手可能） 等の公知なヒト由来の Ji萃 臓癌細胞株をあげることができる。
本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための、癌細胞 の量としては、 通常約 1 0 4 〜 1 0 8細胞あればよく、 約 1 0 5 〜 1 0 7細胞が好ま しい。 また被験物質の濃度としては、 通常約 0 . 1 n g Zm 1〜約 1 0 0 s/m 1 であればよく、約 1 n g Zm 1〜約 5 0 x g /m 1が好ましい。癌細胞に被験物質を 接触させる時間は、通常 1時間以上 5日程度であり、好ましくは数時間から 2日程度 である。癌細胞に被験物質を接触させる回数は、一回であってもよいし、複数回であ つてもよい。
癌細胞に被験物質を接触させる環境としては、癌細胞の生命活動を維持させるよう な環境が好ましく、何えば、 当該癌細胞のエネルギー源が共存するような環境をあげ ることができる。 具体的には、 培地中で第一工程が行なわれることが好都合である。 本発明探索方法の第二工程において癌細胞に含まれる P53- respons ive gene 2の発 現産物量を測定する ίこは、 前述にある 「本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動 物由来の検体に含まれる p53_respons ive gene 2のメチル化頻度に相関関係がある指 標値を測定する方法」 等に準じて測定すればよい。
本発明探索方法の第二工程において測定された発現産物の量と対照とを比較する ことにより得られる差異に基づき被験物質が有する p53- respons ive gene 2の発現を 促進する能力を判定するには、 前述のよ に、 測定された発現産物量と、 例えば、 本 発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための被験物質の 濃度をゼロとした場合 （即ち、 癌細胞に被験物質を接触させてない場合） での p53-r espons ive gene 2の発現産物量（対照） とを比較して、 当該比較により得られる差異 に基づき被験物質が有する p53-respons ive gene 2の発現を促進する能力を判定する 。 仮に、 被験物質を接触させた癌細胞に含まれる p53- respons ive gene 2の発現産物 量が対照 （この場合には、 被験物質を接触させていない癌細胞に含まれる p53- respo ns ive gene 2の発現産物量） と比較して高ければ、 当該被験物質は p53-respons ive gene 2の発現を促進する能力を有すると判定することができる。もちろん対照として 、 癌細胞に他の被験物質を接触させた際の p53- respons ive gene 2の発現産物量を用 いてもよく、 この場合には、 予め当該他の被験物質が有する p53_respons ive gene 2 の発現を促進する能力が判っていること力好ましい。
このようにして、 p53- respons ive gene 2の発現を促進する能力を有する物質を探 索することが可能である。 尚、 バックグランド又はコントロールとして、正常胃細胞 株等の正常細胞株や、塍臓癌細胞等の癌糸田胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動 物由来の検体に含まれる p53- respons ive gene 2の発現産物量を、 被験物質を接触さ せた場合及び接触させない場合の両者において測定することが好ましい。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの ではない。 実施例 1 01萃臓癌細胞株における p53- r espons ive gene 2のメチル化状態の確認試 験）
ヒト由来の塍臓癌細胞株 7種 [BXPc3、 HPAF - I I、 Capan-2, Mi aPaCa-2, Hs766T、 PA NC - 1及 PAC (全て ATCC製) ] を ATCC (Amer i can Type Cul ture Co l lec t ion) のカタ ログに記載された、それぞれの細胞株の めの専用培地でサブコンフルェントになる まで培養した後、 各々約 IxlO7細胞を集めた。 一般的な不死化の方法 〔Am. J. Patho 1., 148,1763-1770 (1996) 〕 によって得られた不死化 (正常) 滕管上皮細胞株 2種 (HPDE- 4/E6E7及び HPDE6- E6E7c7) [これらは、 Dr.Tsao (Ontario Cancer Institute and Department of Pathology, Unversity of Toronto) により、 保存 ·管理され、 当該研究者から譲受可能である]を、 終濃度で 50U/mLのぺニシリン、 及び、 終濃度で 5 Oug/mLのストレプトマイシンを加えた Keratinocyte— SFM， liquid (Invitrogen社製 ) を培地として、 サブコンフルェントになるまで培養した後、 各々約 IxlO7細胞を集 めた。 集められた細胞に、 SEDTAバッファー [10mM Tris-HCl (pH8.0) , lOmM EDTA (p H8.0) 、 lOOmM NaCl] を 10倍容量加えた後、 これをホモジナイズした。 得られた混 合物に、 proteinase K (Signa) を 500 g/ml、 ドデシル硫酸ナトリウムを l%(w/v)に なるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。振とう終了後、 当該混合物 をフエノール [1M Tris- HCl(pH8.0)にて飽和] ·クロ口ホルム抽出処理した。 水層を 回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈澱することによ り沈澱を回収した。 回収された沈澱を TEバッファー （lOmM Tris、 ImM EDTA、 H 8.0 ) に溶解し、 これに 40 g/mlになるように RNase A (Sigma) を加えて 37°Cで 1時間ィ ンキュペートした。インキュベートされた混合物をフエノール ·クロロホルム抽出処 理した。水層を回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈 澱することにより沈澱（ゲノム DNA) を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールで リンスしてゲノム DN Aを得た。
得られたゲノム DNAを、 制限酵素 BamHIにて消化後、 Clark et al.， Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al.， Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93， 98 21-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。 即ち、 制 限酵素処理後のゲノム DNA (約 500ng)を蒸留水に溶解して 20 1のゲノム DNA溶 液を調製し、 これに 6M水酸化ナトリウムを約 1 1加えた後（終濃度約 0.3M) 、 当該混 合物を 37 で 15分間保温した。 この混合物に、 0.6mMヒドロキノン（Sigma)を終濃度 0 .5mM、 亜硫酸水素ナトリゥム（Sigma)を終濃度 3.1Mになるように加えた後、 これを 95 °C30秒間、 次いで 50°Cで 15分間を 1サイクルとする保温を 15サイクル行った。 保温さ れた液から Wizard DNA clean-up system(Promega)を用いて DNAを精製した。精製され た DNAを 50 1の TEバッファーに溶解し、これに水酸化ナトリゥムを終濃度 0.3Mになる ように加えた後、 当該混合物を室温で 5分 Γ曰放置した。 次いで、 放置された混合物を エタノール沈澱することにより沈澱 (DNA) を回収した。 回収された沈澱を 20 1の T Eバッファーに懸濁した。 得られた DNAを铸型とし、 以下に示す非メチル化特異的プライマ一 U1と U2、 又は、 メチル化特異的プライマー Mlと M2を用いて； PCRを行った。 非メチル化特異的プライマ 一 U1と U2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番号 1279〜1384で示される塩基配 列を有する DNAを biisulfite処理した後の塩基配列を有する 106bpの DNAが増幅さ れ、 一方、 メチル化特異的プライマー Mlと M2とを使用した場合には、配列番号 1の塩 基番号 1281〜1383で示される塩基配列を有する DN Aを bisulfite処理した後の塩基 配列を有する 103bpの DNAが増幅される。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TTTTGTGTAGGTTTTAGGGTTTT -3' (配冽番号 2)
U2： 5' -CAACCCACATAACCAAAACA-3' (配列番号 3 )
<メチル化特異的プライマ一 >
Ml： 5' -TCGCGTAGGTTTTAGGGTTTC-3' (配列番号 4)
M2： 5' -GACCCGCATAACCAAAACG-3' (配列番号 5 )
メチル化特異的プライマ一および非メチリレ化特異的プライマーに、特異性があるこ とを確認するため、 まず、 不死化 （正常） 月萃管上皮細胞株 (HPDE-4/E6E7) から通常 の方法でゲノム DNA(DNAl)を抽出し、 この一部をメチル化酵素 Sssl (NEB社） により処 理しゲノム DMの 5'- CG-3' 全てをメチル化した（DNA2)。これら DNA1および ΪΝΑ2につい ても、 メチル化特異的 PCRおよび非メチルイ匕特異的 PCRを行つた。 PCRの反応液としては、鐃型とする DNAを 25ngと、 20pmol/ 1の上記プライマー溶液 を各 1^1と、 each 2mM (11^?を2.5^1と、 10 X緩衝液（ΙΟΟηιΜ Tris-HCl pH8.3、 500mM KC1、 20mM MgCl2)を 2.5 zlと、 耐熱性 DNA リメラ一ゼ 5U/ 1を 0.2 i 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1としたものを用いた。 上記の非メチル化特異 的プライマ一を使用した場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 59 にて 30秒間さらに 72 にて 30秒間を 1サイクルとする保温 を 32サイクル行う条件で P C Rを行った。また、上記のメチル化特異的プライマーを 使用した場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 62°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 32サイクル行う 条件で P C Rを行った。 いずれの場合も、 P C Rを行った後、 増幅産物を含む P C R の反応液を 2 ァガロースゲル電気泳動に供した。
その結果を図 2に示した。 ヒト由来の不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 (HPDE-4/E6 E7及ぴ PDE6_E6E7c) の場合において、 非メチリレ化特異的プライマーを使用した場合 (レーン U)には増幅された DNAのバンドが認められ、 メチル化特異的プライマーを使 用した場合（レーン M) には増幅された DNAのバンドが検出されなかった。従って、 ヒ ト由来の不死化（正常） 滕管と皮細胞株 （HPDE- 4/E6E7及び HPDE6- E6E7c) の場合にお いて、 少なくとも、 配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 1282、 1284、 1301、 1 た。 また、 膝臓癌細胞株 7種 （BXPc3、 HPAF- I I、 Ca an-2, Mi aPaCa- 2、 Hs766T、 PAN C - 1及 0¾PAC) の場合において、 非メチル化特異的プライマ一を使用した場合 （レー ン U)には増幅された DNAのバンドが検出されず、 メチル化特異的プライマーを使用し た場合（レーン M) には増幅された DNAのバンドが認められた。従って、 当該条件にお いては、 配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 1282、 1284、 1301、 1365、 1378 及び 1383でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていると判断された。 実施例 2 (膝臓癌組織にお^"る p53- respons ive gene 2のメチル化状態の確認試験 )
ヒト由来の脖臓癌組織及びその周辺の勝臓正常組織 [患者からインフォームドコン セントを得て入手] 各 1 2検体 （Case :！〜 Case 1 2 ) に、 SEDTAバッファー [10mM T r is-HCl (pH8. 0)、 10mM EDTA (pH8. 0) 、 l OOmM NaCl ] を 1 0倍容量加えた後、 これを ホモジナイズした。 得られた混合物に、 prote inase K (Sigma) を 500 g/ml、 ドデシ ル硫酸ナトリゥムを l% (w/v)になるように加えた後、 これを 55 Cで約 16時間振とうし た。 振とう終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tris-HCl(pH8.0)にて飽和] 'クロ 口ホルム抽出処理した。水層を回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これ をエタノール沈澱することにより沈澱を回収した。回収された沈澱を TEバッファ一（ lOmM Tris、 ImM EDTA、 H 8.0) に溶解し、 これに 40 g/mlになるように RNase A (S igma) を加えて 37°Cで 1時間インキュベートした。 インキュベートされた混合物をフ エノ一ル'クロ口ホルム抽出処理した。水層を回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう 加えた後、 これをエタノール沈澱することにより沈澱 （ゲノム DNA) を回収した。 回 収された沈澱を 70%エタノールでリンスしてゲノム DN Aを得た。
得られたゲノム DNAを、 制限酵素 BamHIにて消化後、 Clark et al.， Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al.， Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。 即ち、 制 限酵素処理後のゲノム D N A (約 500ng)を蒸留水に溶解して 20 ^ 1のゲノム D N A溶 液を調製し、 これに 6M水酸化ナトリウムを約 1 l加えた後（終濃度約 0.3M) 、 当該混 合物を 37°Cで 15分間保温した。 この混合物に、 0.6mMヒドロキノン（Sigma)を終濃度 0 .5mM、 亜硫酸水素ナトリウム（Sigma)を終濃度 3.1Mになるように加えた後、 これを 95 °C30秒間、 次いで 50でで 15分間を 1サイクルとする保温を 15サイクル行った。 インキ ュペートされた液から Wizard DNA clean-up syst em (Pr omega)を用いて DNAを精製し た。精製された DNAを 50 1の TEバッファーに溶解し、 これに水酸化ナトリウムを終濃 度 0.3Mになるように加えた後、 当該混合物を室温で 5分間放置した。 次いで、 放置さ れた混合物をエタノール沈澱することにより沈澱 (DNA) を回収した。 回収された沈 澱を 20 lの TEバッファ一に懸濁した。 得られた DNAを铸型とし、 以下に示す非メチル化特異的プライマー U1と U2、 又は、 メチル化特異的プライマー Mlと M2を用いて PCRを行つた。 非メチル化特異的プライマ 一 U1と U2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番号 1279〜1384で示される塩基配 列を有する D N Aを bi i sulfit e処理した後の塩基配列を有する 106bpの DNAが増幅さ れ、 一方、 メチルイ匕特異的プライマー Mlと M2とを使用した場合には、 配列番号 1の塩 基番号 1281〜1383で示される塩基配列を有する DN Aを bisulfite処理した後の塩基 配列を有する 103bpの DNAが増幅される。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TTTTGTGTAGGTTTTAGGGTTTT-3 ' (配列番号 2 )
U2： 5' -CAACCCACATAACCAAAACA-3' (配列番号 3 )
<メチル化特異的プライマー >
Ml： 5' -TCGCGTAGGTTTTAGGGTTTC-3' (配列番号 4 )
M2： 5' -GACCCGCATAACCAAAACG-3' (配列番号 5 )
メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーの特異性は、実施例 1に記載の通り、 不死化 CE常） 塍管上皮細胞株 (HPDE-4/E6E7) のゲノム DNA(l)お よび、 この.一部をメチル化酵素 Ss si (NEB社） により処理しゲノム DNA (2)において確 認済みである。
PCRの反応液としては、铸型とする DNAを 25ngと、 20pmol/ 1の上記プライマ一溶液 を各 1 lと、 each 2mM dNTPを 2. 5 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tri s-HCl pH8. 3、 500mM KC1、 20mM MgCl2)を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ 5U/ 1を 0. 2 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1としたものを用いた。 上記の非メチル化特異 的プライマーを使用した場合には、 当該反応液を、 にて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 59°Cにて 30秒間さらに 72 にて 30秒間を 1サイクルとする保温 を 32サイクル行う条件で P C Rを行った。 また、上記のメチル化特異的プライマ一を 使用した場合には、 当該反 液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 62°Cにて 30秒間さらに 72 にて 30秒間を 1サイクルとする保温を 32サイクル行う 条件で P C Rを行った。 いずれの場合も、 P C Rを行った後、増幅産物を含む P C R の反応液を 2% ァガロースゲル電気泳動に供した。
その結果を図 2に示した。 ヒト由来の正常勝臓組織 1 2検体では、非メチル化特異 的プライマーを使用した場合 （レーン U) には増幅された DNAのバンドが認められ、 メ チル化特異的プライマーを俊用した場合（レーン M)には増幅された DNAのバンドが検 出されなかった。従って、 ヒ ト由来の正常 Ji萃臓組織の場合において、 少なくとも、 配 列番号 1で示される塩基配歹 (Jの塩基番号 1282、 1284、 1301、 1365、 1378及び 1383でそ れぞれ示されるシトシンはメチル化されていないと判断された。勝臓癌組織 1 2検体 中 7検体で、 非メチル化特異的プライマ一を使用した場合（レーン U) に増幅された D NAのパンドに加え、 メチル化特異的プライマーを使用した場合 （レーン M) にも増幅 された DNAのバンドが認められた。 従って、 当該条件においては、 少なくとも配列番 号 1で示される塩基配列の塩基番号 1282、 1284. 1301、 1365、 1378及び 1383でそれぞ れ示されるシトシンは、組織の一部が癌化することによりメチル化されたものと判断 された。 実施例 3 (勝臓癌細胞株における p53-respoas ive gene 2の発現状態の確認試験と 当該遺伝子の発現に対するメチル化阻害剤の効果）
ヒト由来の滕臓癌細胞株 7種 (BXPc3, HPAF - I I、 Capan-2, Mi aPaCa - 2、 Hs766T、 P ANC- 1及び HPAC) 及び不死化 （正常） 縢管上皮細胞株 （HPDE-4/E6E7及 ¾PDE6-E6E7c 7) を専用培地で 70%コンフルェントになるまで培養した後、 各々の細胞を集めた。集 められた各々の細胞（約 l OOmg湿重量） を lmlの IS0GEN溶液（二ツボンジーン） を混合 してホモジナイズ後、 これに 0. 2mlのクロ口ホルムを加えて懸濁した。 懸濁後、 当該 混合物を遠心分離 （4 、 15000xg、 15分間）することにより、 上清を回収した。 回収 された上清に 0. 5mlのイソプロパノールを加えて懸濁した後、 遠心分離 （4 、 15000 xg、 15分間） することにより、 沈澱 (RNA) を HI収した。 回収された沈澱を 75%ェタノ ールでリンスした後、 DEPC (ジェチルピロ力一ポネート） 処理水に溶解した。
また、 ヒト由来の勝臓癌細胞株 2種 0^じ-1及ぴ 0 を約 6x 105細胞/ 10cmプレ ートの密度で接種し、 専用培地を用いて培養した。 接種後 1日目に、 メチル化阻害剤 である 5- aza - 2' - deoxycyt idine (S igma製) (以下、 5Aza-dCと記す。 ) を 0. 5 z M又は 1 Mの濃度となるよう培地に添加した。 5Aza- dCの添加から 24時間後に、 5Aza- dCが添 加されていない上記の培地に交換し、 培養を継読した。 次いで、 接種後 3日目に、 同 様に 5Aza- dCを培地に添加した。 接種後 4日目 ίこ細胞を回収し、 回収された細胞から 上記と同様な方法で RNAを抽出 ·回収した。
このようにして得られた RNA 3 gを DNasel (Ambi on) で処理した後、 これを铸型と し Superscr ipt l l (Invi t rogen)を用いて当該酵素に添付されたプロトコールに従い c DNAを合成した。合成された cDNAを铸型として、かつ、 以下に示した p53- responsive gene 2 Sと p53_responsive gene 2 Aとをプライマー対として用いた Real Time PCR を行うことにより、 p53- responsive gene 2の mRNAに由来する DNAを増幅した。 この際 、 コントロールとして、 上記の cDNAを铸型として、 かつ、 以下に示した GAPDH Sと GA PDH Aとをプライマー対として用いた PCRを行うことにより、 Glyceraldehyde 3 - phos phate dehydrogenase (GAPDH) 遺伝子の mRNAに由来する DNAを増幅した。
くプライマ一 (S:sense、 A:antisense) >
p53 - responsive gene 2 S:5' - GCCGCAGACCTCCATCC- 3， （配列番号 12) p53- responsive gene 2 A: 5'- GCAATGTGTTCAAGTTCCTCAGC-3' (配列番号 13) GAPDH S: 5' -AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3' (配列番号 14)
GAPDH A: 5' -AGGGGTCATTGATGGCAACA-3' (配列番号 15)
PCRの反応液としては、 铸型とする cDNAを 50ngと、 lOpmol/ 1の上記プライマ一溶 液 2種を各 と、 each 2.5mM dNTPを 4 1と、 5mM dUTPを と、 10XSYBR Gree n PCR Bufferを 5〃 1、 25mM MgCl2を 6 l、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ （AmpliTaq Gold ) 5 U/ 1を 1、 AmpEraseUNGを 0.5 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液 量を 50 /1としたものを用いた。 Real Time PCRは、 i Cycler Thermal Cycler (Bio- R ad Laboratories)を用いて実施した。 p53_responsive gene 2および GAPDH遺伝子の m RNAに由来する DNAを増幅する場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間、 59°Cにて 30秒間、 72 にて 30秒間を 1サイクルとして Real Time P CRを行い、 p53- responsive gene 2および GAPDH遺伝子を定量した。
その結果を図 3及び 4に示した。 ヒト由来の不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 （HPD E - 4/E6E7及 D¾PDE6- E6E7c7)の場合には、 p53- responsive gene 2の mRNAに由来する！) NAが検出されたのに対し、 睦臓癌細胞株 7種のいずれの場合においても、 当該 DNAは 検出されなかった。 即ち、 ヒト由来の不死化 （正常） 脬管上皮細胞株 （HPDE-4/E6E7 及ぴ¾PDE6- E6E7c7) では、 p53- responsive gene 2の発現が確認されたのに対し、 塍 臓癌細胞株 7種のいずれにおいても、 p53- responsive gene 2の発現が認められなか つた。 0. 5 M又は 1 M 5Aza- dCの存在下に培養された PANC- 1及び ¾PACの場合には、 p53 - r e spons ive gene 2の mRNAに由来する DNAが検出された。尚、 GAPDH遺伝子の mRNAに由来 する DNAは、 不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 （HPDE- 4/E6E7及び HPDE6- E6E7c7) の場合 及び 5Aza- dC非存在下に培養された勝臓癌細胞株 PANC-1及び HPACの場合又は、 0. 5 M 又は I M 5Aza- dC存在下に培養された PANC- 1及び ¾PACの場合のいずれにおいても同 様に検出された。
艮卩ち、 勝臓癌細胞株 PANC-1及び ¾PACの場合には、 メチル化 |5且害剤の存在下に p53- res pons ive gene 2の発現が認められた。
以上の結果から、 fl萃臓癌細胞株における上記シトシンのメチル化は、 メチル化阻害 剤により阻害され、 かつ、 メチル化阻害剤の存在下で p53- respons ive gene 2が発現 することが明らかとなった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等が提供可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 2
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
酉己列番号 4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
酉己列番号 5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 6
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマ一
酉己列番号 7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 8
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 9
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 1 0
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 1 1
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド 配列番号 1 2
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 1 3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 1 4
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 1 5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一

Claims

請求の範囲
1 . 哺乳動物由来の検体の瘾化度を評価する方法であって、
( 1 ) 哺乳動物由来の検体に含まれる p53_respons ive gene 2のメチル化頻度又はそ れに相関関係がある指標値を測定する第一工程、 及び
( 2 )測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比 較することにより得られる差異 基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程 . を有することを特徴とする評価方法。
2 . 哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
3 . 哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
4. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
( 1 ) 哺乳動物由来の検体に含まれる p53- respons ive gene 2のメチル化頻度を測定 する第一工程、 及び
( 2 )測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に 基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。
5 . 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
6 . 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする請求項 4記載の評価方法。
7 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
8 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌ィ匕度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項 4記載の評価方法。
9 . 組織が勝臓組織であって、 かつ、癌が塍臓癌であることを特徴とする請求項 8記 載の評価方法。
1 0 . 遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻 訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の 5 ' -CG-3 'で示される塩基配列中のシ トシンのメチル化頻度であることを特徵とする請求項 1又は 4記載の評価方法。
1 1 . 組織が降臓組織であって、 かつ、癌が塍臓癌であることを特徴とする請求項 1 0記載の評価方法。
1 2 .遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモータ一領域にある塩基配列内に 存在する一つ以上の 5' - CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であ ることを特徴とする請求項 1又は 4記載の評価方法。
1 3 .遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配 列内に存在する一つ以上の 5 ' -CG-3 'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻 度であることを特徴とする請求項 1又は 4記載の評価方法。
1 4.遺伝子のメチル化頻度が、配列番号 1で示される塩基配列内に存在する一つ以 上の 5' -CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴と する請求項 1記載の評価方法。
1 5 . 組織が JI萃臓組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徴とする請求項 1 4記載の評価方法。
16. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1) 哺乳動物甶来の検体に含まれる p53-responsive gene 2のメチル化頻度に相関 関係がある指標値を測定する第一工程、 及び
(2)測定されんこ前記メチル化頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比較するこ ' とにより得られる差異に基づき前記検体の癌ィヒ度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。
17. p53- responsive gene 2のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、 53-resp onsive gene 2の究現産物の量であることを特徴とする請求項 16記載の評価方法。
18. p53-responsive gene 2の発現産物の量が、 当該遺伝子の転写産物の量である ことを特徴とする請求項 17記載の評価方法。
19. p53-responsive gene 2の発現産物の量が、 当該遺伝子の翻訳産物の量である ことを特徴とする請求項 17記載の評価方法。
20. p53- responsive gene 2の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であつ て、 、
(1) 癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
(2) 第一工程 （1) 後に、 前記癌細胞に含まれる p53- responsive gene 2の発現産 物量を測定する第二工程、
( 3 )測定された究現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき 被験物質が有する P53- responsive gene 2の発現を促進する能力を判定する第三工程 を有することを特徴とする探索方法。
21. 癌細胞が B萃臓癌細胞であることを特徴とする請求項 20記載の探索方法。
22.有効成分として、請求項 20の探索方法により見出された能力を有する物質を 含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とす る抗癌剤。
2 3 . 有効成分として、 p53_respons ive gene 2タンパクのアミノ酸配列をコードす る塩基配列を有する核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化 されてなることを特徴とする抗癌剤。
2 4 . 懣マーカーとしての、 メチル化された p53-respons ive gene 2の使用。
2 5 . 癌マーカ一が勝臓癌マーカーであることを特徴とする請求項 2 4記載の使用。
2 6 .癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、 p53- respons ive gene 2のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする癌化抑 制方法。
2 7 . 癌が勝臓癌であることを特徴とする請求項 2 6記載の癌化抑制方法。
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