CN110512004A - 一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其应用。本发明运用RT‑PCR、q‑PCR、Western Blot、划痕实验和Transwell小室模型等现代分子生物学技术。成功构建了靶向RBCK1基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰RBCK1基因后对食管癌细胞迁移能力的影响，本发明提供的试剂盒，可用于检测食管癌迁移能力，具有很好的实用性。本发明首次发现了RBCK1基因表达与食管癌细胞系迁移能力有关，食管癌细胞迁移能力在一定程度上可反映食管癌患者发生转移的可能性大小，为食管癌的治疗提供了新的思路和新的方案。

Description

一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其 应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其应用。
背景技术
食管癌是常见的消化道肿瘤，根据世界卫生组织公布的数据，食管癌在全球每年致死约40万人，列所有肿瘤中第6位，其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，其中太行山脉地区为我国食管癌高发地区。食管癌根据病理特征可分为食管鳞癌和食管腺癌。我国的食管癌患者主要以食管鳞癌为主。食管癌患者早期一般无特殊症状，当出现进行性吞咽困难、饮水呛咳、痰中带血或咯血等临床症状时，很大比例的患者已发生肿瘤细胞转移，可侵犯临近组织及器官。目前临床上治疗食管癌的方法以手术切除为主，同时配合放疗和化疗。但是这些方法的疗效并不理想，食管癌患者术后5年生存率不足15％，食管癌术后复发的一个重要原因是淋巴转移。因此研究食管癌发生、发展以及转移过程的分子机制，可为食管癌患者的治疗提供新的思路。
恶性肿瘤细胞具有高增殖能力、高迁移能力、分化程度低等特点，也是区别于正常细胞的重要特性。但是，目前关于早期食管癌细胞迁移及侵袭能力判断相关的分子标志物很少，导致早期想要判断食管癌细胞的是否迁移及侵袭很难，从而耽误病情拖延。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其应用。
本发明是这样实现的，一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物，所述分子标志物包括RBCK1基因和/或RBCK1基因的表达产物，所述RBCK1基因的序列见SEQID NO.1。
进一步，所述RBCK1基因的表达产物包括RBCK1 mRNA和/或RBCK1蛋白。
如上述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在食管癌细胞迁移和侵袭能力检测中的应用。
如上述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的试剂盒中的应用。
所述的用于检测食管癌迁移能力的试剂盒的检测方法：提取样本的RNA，使用引物试剂、RT-PCR体系试剂及q-PCR体系试剂进行实时定量PCR反应，并以RBCK1基因样本为对照，对实时定量PCR结果进行分析即可。
进一步，所述试剂盒包括RT-PCR检测试剂盒或实时定量PCR检测试剂盒或蛋白免疫检测试剂盒。
进一步，所述RT-PCR检测试剂盒和/或实时定量PCR检测试剂盒包括SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所述的扩增RBCK1基因的引物。
进一步，所述蛋白免疫检测试剂盒包括与RBCK1蛋白特异性结合的抗体。可以通过RBCK1蛋白的特异性抗体检测出RBCK1蛋白的表达量。
如上述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于治疗食管癌的药物中的应用。
进一步，所述药物包括RBCK1基因和/或其表达产物的促进剂。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
RBCK1(又被叫作HOIL-1L)是E3泛素连接酶的一种，同时也是一种转录因子。RBCK1与E3泛素连接酶HOIP(RBCK1相互作用蛋白)共同作用，修饰具有线性M1连接的多聚泛素链的特异性核因子(NF-κB)信号蛋白，而NF-κB通路在多种肿瘤中发挥重要作用。此外，RBCK1还能促进K48连接的多聚泛素链。如果人缺乏RBCK1会导致肌病、淀粉样蛋白病、感染以及与细菌感染频率增加有关的免疫缺陷。RBCK1缺陷的小鼠会发生特异性免疫缺陷。
与现有技术相比，本发明运用RT-PCR、q-PCR、Western Blot、划痕实验和Transwell小室模型等现代分子生物学技术。成功构建了靶向RBCK1基因干扰siRNA，在细胞水平研究干扰RBCK1基因后对食管癌细胞迁移能力的影响，本发明提供的试剂盒，可用于检测食管癌迁移能力，具有很好的实用性。
本发明首次发现了RBCK1基因表达与食管癌细胞系迁移能力有关，食管癌细胞迁移能力在一定程度上可反映食管癌患者发生转移的可能性大小，为食管癌的治疗提供了新的思路和新的方案。
附图说明
图1是实施例1中检测干扰siRNA在蛋白水平上对RBCK1的沉默效果；
图2是实施例2中检测干扰siRNA在mRNA水平上对RBCK1的沉默效果；
图3是实施例3中利用划痕实验检测不同组食管癌细胞系迁移能力的影响结果图；
图4是实施例3中利用划痕实验检测不同组食管癌细胞系迁移能力的影响曲线图；
图5是实施例4中利用Transwell小室模型实验检测不同组食管癌细胞系迁移能力影响结果图；
图6是实施例4中利用Transwell小室模型实验检测不同组食管癌细胞系迁移能力影响结果柱状图；
图7是实施例4中利用Transwell小室模型实验检测不同组食管癌细胞系侵袭能力影响结果图；
图8是实施例4中利用Transwell小室模型实验检测不同组食管癌细胞系侵袭能力影响结果柱状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其应用，具体如下各实施例所示。本发明中涉及的食管鳞癌细胞系：EC9706和Eca109细胞株，购于上海中科院细胞库。RBCK1抗体购自Abcam。实时定量PCR方法参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，测浓度后，按TaKaRa公司PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行反转录，按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因表达(36B4为内参)。RBCK1-siRNA的合成由sigma公司购买。转染方法按Invitrogen公司LipofectamineRNAiMAX Reagent转染试剂说明书进行，q-PCR及Western blot方法检测表达及干扰效果。细胞迁移实验Transwell(8mm孔径)小室购自Cosar公司，事先进行饥饿培养。细胞划痕实验所使用12孔板购自Cosar公司。
RBCK1基因序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1细胞培养、转染及蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞株中RBCK1蛋白的干扰效果
细胞复苏：从-80℃冰箱取出EC9706细胞，立即放入37℃水浴箱中快速融化，使细胞在最短时间内完全解冻。用75％酒精擦拭消毒冻存管表面后，转移至事先准备好的5mlEP管(已事先加入1ml RPMI1640+10％FBS)中，900rpm离心3min。弃去上清，用1ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)重悬，混匀，取5ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)加入培养瓶中，将重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃,5％CO2培养箱中培养，次日更换一次培养基，继续培养，待细胞密度80％-90％左右时，开始传代。
细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm，离心3min，弃去上清，用1ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)重悬，混匀，取5ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃,5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。
细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si RBCK1#1和si RBCK1#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RBCK1#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RBCK1#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。
Western Blot
(1)总蛋白的提取：将转染过24h的12孔板的细胞中旧培养基弃去，加入1xloadingbuffer100uL，有减过的200ul枪头将1x loading buffer与细胞充分混匀，注意每个孔力度相同，将混合液移至标记好的1.5mL离心管中，100℃金属浴中煮10min，-80℃保存备用。(2)配聚丙烯酰胺凝胶：根据蛋白分子量大小配制10％的聚丙烯酰胺凝胶。将用于配胶的1.5mm玻璃板洗干净并晾干后对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，按说明书准备配胶试剂，先加分离胶，先快后慢，避免产生气泡，加至距上端1.5cm处时加无水乙醇密封，静置20分钟后弃去无水乙醇，用离子水清洗3次后加浓缩胶至顶端，插入梳子，注意不能有气泡产生，静置10分钟左右，可进行上样。(3)上样电泳：将制备好的样本按照一定顺序，每孔加20ul，每一组实验样本周边以预染的蛋白质Marker隔开，起始电压为80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶以后，电压改为120v，约1.5h,当小分子蛋白拉开距离以后，停止电泳。(4)转膜：先将合适大小的PVDF膜至于甲醛中激活1min左右，再把PVDF膜覆盖于电泳后的凝胶上，PVDF膜和凝胶的非接触面均覆盖滤纸和海绵，至于电转槽中，恒流300mA，90min。(5)封闭：电转后，取出PVDF膜，放入现配的封闭液(含5％的脱脂牛奶的1×TBST)中，摇床上4℃过夜或室温2h。(6)封一抗：封闭结束后，配制含5％的脱脂牛奶的1×TBST稀释的一抗(抗RBCK1抗体稀释5000倍，抗GAPDH抗体稀释5000倍，各稀释2mL放离心管中)，在相应蛋白所在位置剪开，在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应一抗，摇床上4℃过夜或室温2h。(7)洗膜，孵二抗，洗二抗：取出PVDF膜，1×TBST摇床上洗3次，每次15min，将洗好的膜分别放在封抗体盒子中，配制含5％的脱脂牛奶的1×TBST稀释的二抗(二抗稀释5000倍，稀释2mL放离心管中)在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应二抗，摇床上室温1h，摇床上用1×TBST洗3次，每次10min。(8)显影：按化学发光试剂盒说明书将ECL发光液A、B液等比例混合(使用前配制)，将洗好的膜用吸水纸吸干多余的1×TBST，将膜的正面向上放置在发光板上，均匀的滴加显影液，凝胶成像系统拍照、保存。
结果如图1所示，为Western Blot检测细胞株中干扰后的RBCK1蛋白表达水平较对照组明显减低。
实施例2实时定量PCR检测细胞株中RBCK1的mRNA干扰效果
细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm，离心3min，弃去上清，用1ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)重悬，混匀，取5ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。
细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si RBCK1#1和si RBCK1#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RBCK1#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司),在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si-RBCK1#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。
总RNA的提取：收集细胞后，参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，在该操作过程中需遵循无RNA酶操作，佩戴无菌手套和口罩。具体步骤如下：
1)需要用RL裂解液(已加入β-巯基乙醇)裂解细胞，并提前配置好70％乙醇，分开标记RL裂解液及70％乙醇以免混淆。
2)每个孔需要加入350μL配制好的RL细胞裂解液，用枪头的底部按照顺时针及逆时针方向轻轻划动，以充分裂解细胞，随即把裂解的溶液沿着侧壁缓慢滴到CS过滤柱上，并标记清楚，放入离心机中快速离心并收取滤液(2min，4℃，12000rpm)；
3)在滤液中缓慢加入70％乙醇，每孔约350μL，轻柔的混匀，混匀后的溶液转移到CR3吸附柱里，并放在对应的收集管中，再次离心(90s，4℃，12000rpm)并弃掉滤液，吸附柱重新放入收集管中；
4)沿着侧壁每个吸附柱中加入去蛋白液RW1 350μL，调整离心机转速12000rpm，温度为4℃，离心60s，弃掉滤液，吸附柱放到收集管中；
5)每个柱子中间悬空滴下DNaseⅠ工作液80μL，注意不要滴到侧壁，室温下静置15min；
6)每个柱子沿着侧壁缓慢加入去蛋白液RW1 350μL，4℃高速离心机，12000rpm离心60s，弃滤液，吸附柱重新放回收集管；
7)加入RW漂洗液500μL，静置置2min，离心并丢弃滤液(90s，4℃，12000rpm)，吸附柱放回到收集管中，重复该步骤1次，4℃高速离心机，12000rpm，离心2min，吸去滤液，打开吸附柱的盖子，静置大约4min，以便彻底清除吸附柱上的乙醇残留；
8)把晾干的吸附柱放到标好的RNase-Free 1.5ml EP管中，于每个柱子中心滴加30μL去离子水，室温放置2min后离心以便收取滤液(2min，4℃，12000rpm)，重复该步骤1次，以更多的获得RNA溶液。
紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度(单位μg/u)和纯度，用DEPC水调零，OD260/OD280在1.8-2.0之间，表明提取的RNA纯度好。
逆转录为CDA(reverse transcriptas，rt)：反应体系为:按TaKaRa公司PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行反转录：5*PrimeScript RT Master MIX：2μL，所提总RNA：1μg；加ddH2O至总体积为10μL，置于PCR仪中进行逆转录，反应体系为37℃15分钟，85℃5秒，4℃保存备用。
实时定量PCR方法按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因的表达(36B4为内参，36B4-F：5’-GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3’，见SEQ ID NO.4；36B4-R：5’-CCATCAGCACCACAGCCTTC-3’，见SEQ ID NO.5)的反应体系为：17μL SYBR，14μL去RNA酶水，1μL Forward primer(RBCK1-F:5’-TGCTCAGATGCACACCGTC-3’，见SEQ ID NO.2)，1μL Reverse primer(RBCK1-R:5’-CAAGACTGGTGGGAAGCCATA-3’，见SEQ ID NO.3)，1μLcDNA。反应程序为Holding Stage：50℃2min，95℃10min，Cycling Stage:95℃，15s，50℃，1min，Number of Cycles:40。计算CT值，结果以柱状图呈现。
结果如图2所示，为q-PCR检测细胞株中干扰后的RBCK1 mRNA表达水平较对照组明显减低。
实施例3利用划痕实验检测转染后食管癌细胞系迁移能力的影响
细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm，离心3min，弃去上清，用1ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)重悬，混匀，取5ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。
细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si RBCK1#1和si RBCK1#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si RBCK1#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si RBCK1#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。
划痕实验：12孔板转染后的细胞株待密度达100％时，用无血清RPMI1640培养基饥饿12h；小号枪头在12孔板各实验孔内划十字痕迹，创造人为伤口，以PBS洗去刮下细胞，洗3次，加1ml RPMI1640完全培养基(RPMI1640+1％FBS)，显微镜下拍照，记录划痕宽度。继续培养24、48h，显微镜下拍照(每次拍照前换新鲜1mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640+1％FBS))，记录划痕宽度，计算细胞迁移距离。
结果如图3和图4所示，RBCK1基因干扰后，EC9706细胞系的迁移能力显著下降，较对照组明显降低。
实施例4 Transwel小室观察转染前后细胞迁移和侵袭能力的改变
细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm,离心3min，弃去上清，用1mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)重悬，混匀，取5mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达80％-90％密度后，按上述传代方法将F2细胞接种到12孔板培养。
细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将si RBCK1#1和si RBCK1#2作为实验组，si-control作为对照组，取4个EP管，标记A1、B1、A2、B2，在A1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si RBCK1#1(购自sigma)，在B1中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL Lipofectamine RNAiMAX Reagent(购自Invitrogen公司)，在A2中加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)及2μL si RBCK1#2(购自sigma)，B2同B1，B液静置5分钟，将B液分别加入A液中，轻柔混匀，室温静置20分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的12孔板的培养基中，每孔100μL，放于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染后4-6h换液，继续培养24或48h后，进行转染后的其它检测步骤。
取脂质体转染后的实验组细胞、阴性对照组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化后，细胞计数后用无血清RPMI1640培养基重悬，调整细胞密度为5×105/mL。在上室加入200μL细胞悬液，细胞数为1×105个，下室为含20％胎牛血清的RPMI1640培养液500L，37℃、5％C2培养箱中孵育18h。孵育结束后，取出小室，用PBS洗两遍，棉签轻轻擦拭上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。将小室滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，每孔加入500μL结晶紫染液，染色20min，吸弃染色液，PBS洗三遍，将上室取出，用树脂胶封片，于倒置显微镜下拍照并计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野(共15个视野)，计算平均值。
Transwell侵袭实验与迁移实验不同的是：Transwell小室上室表面需要提前均匀铺上用无血清培养基：Matrigel胶＝8:1稀释过的Matrigel胶，于37℃细胞培养箱2-3小时使胶体凝固，模拟血管基底膜。
结果如图5和图6所示：RBCK1基因干扰后，EC9706细胞系的迁移能力显著下降，较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)
如图7和图8所示：RBCK1基因干扰后，EC9706细胞系的侵袭能力显著下降，较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 新乡医学院
郑州大学第一附属医院
<120> 一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24090
<212> DNA
<213> RBCK1(RBCK1)
<400> 1
ccccgcctgc ggcccagctc cttcccgcgg ctctgcgatg cggcccgcag ggtgacccgg 60
gcgggagtcc ggggacccgc gatcagcccc ggaggacggg gtggggtcgc cccaaacagg 120
agcgccggga ccgctgggac cccgcactcg gcgtccgccg ccgccgggta gccgggcagt 180
ggaggtcccg gatgaggcga caatttttcc ggccccccct cccagtcccg ccccacttcc 240
ggggccgcca ctttcacttt ctcttccgcc gaagccgctc cccttgcgaa gaactggggc 300
ctcccgggag gagagagggc tttgccttga aacccgggac gccaggggcg ctcccgcaag 360
tgggggtcct ccgggacttg gaacgccccg gctgggtggt gtccgggcgt cctttccccg 420
cttcttccca cctcggctgg tcccgtttcc tcctgcgccc agtgcggacc tgtctcggcg 480
cccgctgccc tctcaccgcc ccacgcagga tcccggcctg gtcaccgggc agtgtgatgc 540
ttcccgactg ccgcggggac agcgaggcac acacagggct tgggccgcgc cggaggccac 600
acggcctggc tgagttgctc ctggtctccc gcctctccca ggcgacccgg aggtagcatt 660
tcccaggagg cacggtcccc cccaggggga tgggcacagc cacgccagat ggacgagaag 720
accaagaaag gtgggcacag gctggaggtg gctggggaac ttccggtggg aagtgggccc 780
cgcaggacct ggccttgccc ctggccagaa gggccttgga gagggggctt tagcctgccc 840
tccctctacc ctcctcccca tcagtttcct cctttggtac ctgctggctt ccagagccat 900
cttggggccc tgagaactcc ttgggctggc tctgtgctga gatggggcta ggggactcgc 960
agaggacaca gggcattgaa cttggagacc tcctgggctg gtgggagaca gacgtcagtt 1020
gacctgagaa gcaggggtac ttgcctcttc tcttgtcccc tgcacctagg gttgtagaac 1080
ggaagtcagt cactgccttg ctggaaaccc tcccatgccc ctctgtgttc tccaaacaaa 1140
acccagaggc cctgggtggc ccacaggata tctgtcctca gtcaccccgc catgctcact 1200
ctactggagc cccactggct tccttcggtt ctcatccaac cattttttgg ccaaggccct 1260
tactcttcct tccacctgga ccactcttcc ccactggagc ttgacacgtg cagcttctcc 1320
tccttcaggt cttagcttca gtgttacccc ctcccagagg cctcccctgg tctccttaac 1380
ctgtttattt ccctgccagc aaggatcgca atctgacttt tttttttttt cttgttaaac 1440
ttgttcattg tctccccact gggcagggag atccataagg agaggggccc tgtttataaa 1500
tctctgtggg attccagttc ctgggacagt gggtggcaca cagtagaagc tcaataactg 1560
cttgttggat aaatgaatag aaatatgagg gaccctggga atgggaagga caaacaacca 1620
aatgagccta gtgtgaggag gagtggggaa tattagagaa cccctcccgg agaaagggac 1680
ttttagtctg ggtgctgaag gatacgtagg agttcaccag gaagacagag aaagcagcac 1740
acacaaagga tcgcctcctt tcctacccca ttactctcag ctcctgaaaa taaaccctgt 1800
gctaactggc tcctgctgta ctggctttca gcagaggaaa tggccctgag cctcacccga 1860
gcagtggcgg gcggggatga acaggtggca atgaagtgtg ccatctggct ggcagagcaa 1920
cgggtgcccc tgagtgtgca actgaagcct gaggtctccc caacgcagga catcaggtga 1980
ggagtgcatg gctggcctga acccaaggga cagcaggaca ggatattctt gcctgtagaa 2040
cagttcttcc taatggcacg ttctggcttc aggaggcctg gcttctaacc ctagttatgt 2100
cattaatcaa ctgtgaaata cagagcaggt cacttcacct ctcagtgtgt cctcatttta 2160
aaaatcagac cgtaacagta gctatctcat agggttgtta ggaggtgtac tgtattagga 2220
tgttaggcct tatacaacag aagaaaacgg aacagtgacg taaacaaatt tgatggcagg 2280
gagtccagat agggaggttc tgctcccgac agtcctcaga ggctcatatt gtttctctca 2340
ccattctgcc attcattccc agattcctca tggtgcaaaa tggccattcc agctccatcc 2400
agccatcaca tcacaggagg aagggaagaa agacacccct ccacactctt ctaaagagca 2460
tagctcaaaa attgtacaca cttcttccgt taattcctgt ggaccagaac tgattcccac 2520
agctacagtt cagcttgagg ggagactgta tagccaagat attcagctag aattcagggg 2580
ttcgcttggt aagggaaggg aagagaatgg atactgtcgg tctgtgctcc aggagactta 2640
aactcaatgc tgaaacactt tgcacaatgc ctggcgtgtt atgcactcaa taataaacat 2700
tagtgtctat cgttattttt tgactgcttt ttcattactg gatagtaagg caatagtttt 2760
atggtttctg atttttggtt ctcttggtgg gtcccatttg gtttttctta aaacagtttt 2820
atttatttat ttatccttac agttcgacca tttaaagtat acagttcaat ggcttttagt 2880
atattcaagg ttgtgcaacc attgccacaa tcaattttag aacattttca tcatcctgta 2940
aagaaacctg gtactcatta gcagccagtc ctcatctctc taccttttcc ctaactcccc 3000
aaccttaggc aaccactaat ctacttttta tctctaggga tctaccttct ggaaattcca 3060
tataagttga atcatgcaat atgtggcctt ttgtatctgg cttctttcac ttaggatcgt 3120
tttcgagatt catccatgtt gtagcatgtc taacaacttc attccccttt ttttttttga 3180
catggggtct cttgtctagg ttgaagtgca gtggtgccat catcgctcac tacagcctca 3240
acttcctgga ttcaagcagt cctcctgcct tggcctccca ggtagctggg actactggca 3300
tgtaccacca cacccggcta attttttttt tctttgagat gggagtctca ctctgtcccc 3360
caggctggag tgcagtggcg cgatctcagc tcactgcaag ctccacctcc caggttcacg 3420
ccattctcct gcctcagctt cccgagtagc tgggactaca ggcgcccgcc accacgccca 3480
gctaattttt tgtattttta gtagagacgg ggtttcgccg tgttaaccag gatggtctcc 3540
atctcctgac ctcgtgatcc gcccgcctat gcctcccaat gtgctgggac tacaggcgtg 3600
agccaccaca cccagccaca cctggctaat ttttagaaag tctgtagaga taaggtcttg 3660
ctttgttgtc tgggctggtc ttgaacttct ggcttaagca gtcttcccac ctcagcctct 3720
caaagtgctg ggattacagg tgtgagccac catgcccaac cagaacttta ttccttttta 3780
ttgccaaata ataatctatt gtatagacat atctcattat ctttactcat taaatcagtt 3840
gatggacatt tgggtgtttc tattttttgg ctattataaa caatgctgcc gtgaacattt 3900
gtgtccaact ttttgtgtgg acacgttttc atttctcttg gatacacact agcagtggaa 3960
ttgctgggtc atacagtaac tctatgttac tttttgaaga aatgccagac agttttccaa 4020
agtggctgca ccattttaca ttcccaccag catatatgag ggttctagtt tctccacatc 4080
atctctaata cttgttgttg tttatctttt tgattatagc catcctagta agtttgaaga 4140
ggtatctcac tgtggttttg atttgcaatt tcctaaccat ttgatgacaa atgatgttaa 4200
gcatcttttc atgcacatat tttctttgga ggtttgccta ttcaggtctt ttgcccattt 4260
taaaattggg tttatctttt tttttttttg agatggagtc tcgctctgtc acccaagcag 4320
gagtgcaatg gtgcaatctc ggctcactgc aacctccgcc tcccaggttc aagtgattct 4380
cctgccccag cctcctgagt agctggatta caggtgccca ccactacact ggctaatttt 4440
tgtattttta gtagagacgg gtcttaccat gttggccagg ctggtcttga actcctgacc 4500
tcaggtgatc cacccacctt ggcctttcca aagtgttggg attacaggca tgagccactg 4560
cacccggctg ggtttatgtt tttatattga gttgtaggag tactttattc attttagcta 4620
gaagtacttt attcatttta gcttatcagc tacatgattt gcaaaaattt tctctcattc 4680
tgtggattgt cttctcactt tgttgatggt atcctttgaa ccacaaaagt tttaaatttt 4740
gatgatgtcc agttagtcta tgttttattt tgttgtttgt gcttttggtg tcatatctaa 4800
gaaatcgttg cctcatccaa ggtcatgaag atttacctct atattttctt ctaaagattt 4860
tatggtttta gctcttacat ttaggtcttt ggtccatttt gatttaattt ttatataagg 4920
tgtgaggtaa gggtccagct tcattctttt gcacgtggat attgagttgt gccggcacta 4980
tttgttaagg ctgttttcct ctgtttaatc atcttaaccc tttttggaaa ttaattgacc 5040
ataaatgtga gtgcttattt ctggactctc atttctatac cattgaacta taatatatat 5100
ctgcccttac gccagtacca cactaattac tatagcttca tagtatttga aatcaggaaa 5160
tacaagttct ccaacttttg ttctttttca atattgtttt ggttattgca agtctcttga 5220
atttccatat aaattttacg atcagcttgt ctgtttctgc aaaaaaaaaa caacaacaac 5280
tgggaatttt ggtagggatt tcattgaatc tgtagatcat tggccacttg attttaaaca 5340
aaatattgag atatctactt cttgaaatga ttgcttgaga cagtacctgt gtactccttg 5400
ctatgaaaaa tgaggaagtt aacatactca tcttccacct ttccttttcc ttactttttt 5460
tgttgaagta tcattgtgga cactttccca gttgacttcc acttgatccc ctgaattaac 5520
taactggcac tggcgtttcc tttgtaaaat gtacaatgtc agccaccatc ttgctactaa 5580
agtgtggcct gtggaccaca acatgggggg aatctcaggt ctcacctcag acttgctggg 5640
tcagaacctg agttttgaga ggctctgggc aaccggcacc tctcagacct gctgttgggt 5700
tctcatcgat ggacccgatg cttcctagca aatgatacct gttgtatgtg ttattggtaa 5760
taacatagtt tacttagcta ttacattaat taataaaaca tgagcgctga aagagttgtt 5820
tctgtgaaaa taagctgatt gctttaaaaa gataagagac aaatcaccaa aaaaaaaaaa 5880
aaaaaagatt aacacttttg ggtgagacag tagtaaggaa atacagtaaa aatccagaag 5940
ggctctgtgc tctgatgctt caggagtgtg tctaagttct tgctcgcttt aaagaagctg 6000
ctactagaaa ttatagatca tgattatcga tgtggttcat acaaaaaaaa aaaagaaaaa 6060
tccctgggaa actccaatga gcaggtataa actcacgctg ggcatggcgg ctcagcactt 6120
tggaaggctc aggcaggaga atggcttgaa ctcgagttta agaccagcct gggcaacata 6180
gtgagacctt gtctctgcaa aaaataaaaa aaattagcca ggctgggtgg cacacacctg 6240
tagtcccagc tatttgagag gctgagatga gaggattatt agaccctggg tggttgaggt 6300
tgcagtgagc catgatcatg cctgagtgac aaggtgaaac cctgtctcaa agaaagaaag 6360
agagaaaagc cattggctgt acacctagag actggccagt gaatatgcat ttatagtatg 6420
taagttaaaa ttaagtgttt aagctttgtc tgcagctgtt tttgtgattc tctgctgttc 6480
accagcgatc ctgatgtcac attggatgag agagctccag ctgtattttt ttgttgatag 6540
tgttaagatt atagctttaa aaaattttgt tttctaacat aattaaggcc tttatgcttt 6600
gcctctaggt tgattctaaa agtgtaacac tactagaaag gatttatagt attttgatta 6660
tggaaatatt attcactata gaataactag tgcagttgaa accatatgca cttttatgtt 6720
tcaaaaccct tattgctgga agaacatttt ggggttaaga tccagtcctt ttcatttttt 6780
acttttcttc tattctcctg tatcagactc atctattttt gtttttcaag aacttttcac 6840
gtggaaaatg tggtaaactt ttagagtctt tgcatgttta aaaatttcta tattttgctc 6900
tgtcaattca ttgatagttg actgggtatt caaattgttt acctgaagaa ttttgagagc 6960
attttctgga ctgcttttaa ataaatttca gatattattt tatccttaaa tactttagta 7020
tgtgtcttca aaaaattagg acttggcggg gcacgatgga tgatgcttgt aatcctagca 7080
ctttgggagg ctgaggcagg tggactgctt gaacccatga gttcaaaacc agcctgggca 7140
acatagtgaa accttgtctc tacaaaacat tagctaggca tggtggtgcg cccatctagt 7200
cccagctacc caggaggctg aggtgggagg gtcacctcag tccaggagat tgaagctgca 7260
gtgagccaag atcatgccac tacactccat cctgggtgac agaagtgaga ccctgtctca 7320
aaaaaaacaa aaacaaacaa aacccctcaa tactattatc acaccttaga aaaggaataa 7380
gaattcctta aaatccgcta atgccctgtt tatattcaca ttttcctatt tcattagtgc 7440
tttttacaat tggtttcttc aaatcaggag ccaaacaaga tctacatgta gcatttctta 7500
ctatgtctta agtccctttt actctcctct atttttatgc cactagtttt ttttttaaga 7560
aacctggtct tttgacctct agaattttcc ccatattctg gatctatcca ttacctcttc 7620
atggtatgta ttagaccact ctagcattgc tacaaagaaa tatctgagac tgggtaattt 7680
gtaaagaaaa gaggtttaat tgactcagtt ctgcaggtgg tgtaggaagc atggtcctga 7740
catttgcttg gcttctgggg aggcctcagt gaacttttac tgaagcggga gcaggcactt 7800
cacatggtga gagagggagc aagagagaga gttggtgggg aggtgccaca ctttacaaca 7860
gccagatctc acgaggactc actatggcga gaagtcacta cagtgagcgc agcaccaggc 7920
tgtgagggag ctgcccctat gacccaaaca cctcccacca ggcctcacct tcaacactga 7980
ggattacagt tcaaggtaag atttgggcag ggacaaatac ccagactatc atggtgtcat 8040
ttactatctc ccgtttttcc tgtaactggt agttagagat aaagtttcaa ttagtcagca 8100
gtcacttttt tttttttttt ttttgagaca gagtttcact ctgttgccca ggctggagtg 8160
cggtggcgca atcttggctc actgcacggt ccgcctcccg ggttcacacc attctcctgc 8220
ctcaatctcc tgagtagctg ggactacagg cgcccgccac cgtgcctggc taattttttt 8280
ttttgtattt ttagtagaga cgggttttca ccgtgttagc caggatggtc tcgatctcct 8340
gacctcgtga tccacccacc tcggcctccc aaagtgctgg gattcagcag tcacttttaa 8400
tgtgcaggaa ctcttcctca ttttttggtt gcttcatgcc tttccttgct ttctgaatgc 8460
agtgttttcc caaatctctc tgaaggtact agttagactt cactgttgct tattgttcca 8520
taccctaaat gatctctgtt tcctttgggg tcggttctgt tttttcatct tttcatgctt 8580
ttgattttcc aaacatgttg gaggatcctc aagaaagtta aaaccacttt ctctggaata 8640
ataccatgta gatttaaatc ctgcctctgg ctgaacacag tggcttactc ctgtaatccc 8700
acttcgggag gccaaggcag gaggatcact tgaggccaag agttcaagac cagctttggc 8760
aacatagtga gaccctgtct ctacaaaaac ttaaaaaatt agccaggcat ggtggcatga 8820
gcctgtggtc ccagctactt gggaggctga gatgggaaga gcccaggagg ttgatactgc 8880
agtgagccaa ggtagcacta ctgcactcca gcctgggcca cagaaagaga gcctgtgtct 8940
taaaattaaa tcaagacata caaatgaatc ctgcctctaa cagttattag ttgcttagtt 9000
tggcagagtc actggaacct atctgtgcct cacattttta tctgtaaaac agggatacag 9060
cagtacctgt ctgatgggtt ggttgagagg attaaatgag ttaatacaca tgaagtgcat 9120
taaatagtct tagcacgtag ttaacaacaa cttctggtgg tttcactaag gagcagggga 9180
gagaagacag aagaggttgg agaggtcagg gaggtgccag atcatggagg ccctcgtgtg 9240
ctgccacgag ttgattctaa gagtagcgtg gagccattgg aggggcctaa ctggtgggtt 9300
ctaataaagg aagaagcatg ggtggggcct accccagact ggggtttgtg tgtgtgtgtg 9360
tgtgtgtgtg tgtgcatggc catgtgcctg tgtgcaaata tgtacatgtc tgtagccggt 9420
ggctgaggct ggacccctgg ccagagccca tgctgagccc ctgctgttct ctgcaggctg 9480
tgggtgagcg tggaggatgc tcagatgcac accgtcacca tctggctcac agtgcgccct 9540
gatatgacag tggcgtctct caaggacatg gtgagtgagg aggcggaggg cgacactggg 9600
gtgaaggctc tccctttcac tcctgcttcc tctctctcct ctggccctcc cttcccactc 9660
tccctctctt tgcccccacc aggtttttct ggactatggc ttcccaccag tcttgcagca 9720
gtgggtgatt gggcagcggc tggcacgaga ccaggagacc ctgcactccc atggggtgcg 9780
gcagaatggg gacagtgcct acctctatct gctgtcagcc cgcaacacct ccctcaaccc 9840
tcaggagctg cagcgggagc ggcagctgcg gatgctggaa ggtgaggctc tgccctgagc 9900
accgccggac ccagcggggg ccctggactc acttgagggc atagggcaag caggggcaga 9960
gcccctgggt ttttagtcag ggactcaccc agaggaccct atccaagtgg ggaagagagg 10020
acctaagaca catgggaggg agcatttcag ggacccatca tgagaacagc tggcacgggg 10080
aggggtggac tccgtccagg ctccggcatt cccagctgtg tgaccttggg caaggttgct 10140
cctatctgct gcccagtttg ctaaaatcat aaattgggta tgacagtgat cgtgataact 10200
agtgtttatt cttaattttt aacttctgaa atgtttcaga cctacagaaa agttgctaaa 10260
ttttacaaag tagtacataa agaattccca tgtacctttc atgtgggttt taccacatgt 10320
gctttctttt tttttttgag acggagtctc gctctgtcgc ccaggctgga gtgcagtggc 10380
acaatctcgg ctcactgcaa gctccgactc ccgggttcac gccattctcc tgcctcagcc 10440
tccggagtag ctgggactac aggcgcccgc caccacgccc ggctaatttt ttatattttt 10500
agtagagacg gggtttcacc gtgttagcca ggatggtctc gatctcctga ctttgtgatc 10560
cgcccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccaccac gcccaaccca 10620
catttgcttt cttttatcat tctctttcta tataaaatta ttttttttct gaaccatttt 10680
gagagtaagt tgcagacatg atgtctcttt cccctaaata attcagtgtg catttccttg 10740
aaaagaaagg tcattttctt acattactgg gtataacaat ccaactcagg aaactaacgc 10800
tgatacagta ctggtatcca gtctacagat cttactcaga ttttaccagt tgtcccacta 10860
ttgtcattta tagcaaaaga cttggcattc tgctgtcatg tctcagtccc tttcaaagag 10920
tccaggccag tttctttttt ttggcggggg ttgggggctg atgtttcctc cggagtggat 10980
caagtcactg ttttggcagg accgcctcag cggtgctctt gggtccctct tggtgcatcc 11040
ttcaggaggc acggaagggc tggtgttgtg ctgggttttg aagctcaaag gacatagaag 11100
catttatcgg tggaataggg accctgaccc tgggggagcc aggatgccca cttggccaga 11160
tggaagctgg aggtaccccc agggaggagg gagaggatag ggggagggtc tgcctggctg 11220
gctcagggag acccaccccc atgggtgtgg accaagtggg ccgcgtggaa ccaccaccct 11280
ttaaccctcc tccacagatc tgggcttcaa ggacctcacg ctgcagccgc ggggccctct 11340
ggagccaggc cccccaaagc ccggggtccc ccaggaaccc ggacgggggc agccagatgc 11400
agtgcctgag cccccaccgg taagctgtcc ttggcctcag tatcctcttc tgtgcccctc 11460
ccttgcctca ccctgcccag tcgggctcac agcaccctct gctcccaggt gggctggcag 11520
tgccccgggt gcaccttcat caacaagccc acgcggcctg gctgtgagat gtgctgccgg 11580
gcgcgccccg aggcctacca ggtccccgcc tcataccagc ccgacgagga ggagcgagcg 11640
cgcctggcgg gcgaggagga ggcgctgcgt cagtaccagc aggtgggcgg gaaagtccct 11700
ggacagacac ctgcagaccg cacgggggag gtgtaggcca ggaagggaga cacctgcgca 11760
ctgccgcgcc tctccgttac tgccttgccc ctcccaacca tgctgctggc agtgaccctg 11820
cacctggctg tgaccctgca cctggctgtg acctgccctc tctcaaaggt caccctgtgg 11880
ctgagacccg ctccctggct gtggcgcaca tccaggttca catgccccac tcccacgtgg 11940
gctgtggctc catccccagc tttgacacac cacacgagta tggctggcca tgaccccagc 12000
accctagcca tgaccccagc accctagcca tgaccacacc tcagctcgga cctcaccccc 12060
acccgtctgt gacctaagcc tgctccacct cgccgtgacc tcaccctgga ctctcctact 12120
cctgacctct tccctctcgg gctgggccca cccctgactt cctgagagcc tggcctggac 12180
cctcgctgcg ccctaggggg atgacccccg accccggtcc tacgccttag ccctaccccg 12240
cccccatcgt gacacacgca ctaatgacac agacattgat ccccgagtgc tccccattct 12300
gatctcaccc ctggccccac ctgcattccc cttggacccg gtgctgcccc tggccacccc 12360
actcctgttc ccgtctcagc tcctcggctt cgtcacttcc ccacccctga cgttgagtgg 12420
ctccaccagc cctggcccgg gccctgccct gctacctgac tcaccactca gaccccggcc 12480
cccttcctta ccttgctgcc attgctgtct cacctggcgc cttccgtggc tacctggccg 12540
gcctcccctc ccttggcttc cccacctcca cctggcctca ctcccagccc cgcccctccc 12600
aacctgcctg ctcctgccca tcccccaccc cccacccccc atcccccagc cccaccccca 12660
tcccccaccc ccgtccccca tcccccatcc ctactggctc ccagctttgc ctgtggctgg 12720
tctgacccag ccctgaccac gccccctggc ccttccccct tcggggtctg acccgccccc 12780
gaggccctga cccgccccgt ggccccgccc cgtgtgccca gcggaagcag cagcagcagg 12840
aggggaacta cctgcagcac gtccagctgg accagaggag cctggtgctg aacacggagc 12900
ccgccgagtg ccccgtgtgc tactcggtgc tggcgcccgg cgaggccgtg gtgctgcgtg 12960
agtgtctgca caccttctgc aggtgcggcc cccagtccca cccccggcaa tgcagcttaa 13020
tcaaagccgc caattacgca gggctggacg tgggtggggc cctgtgctct gatacctcat 13080
tggacgcccg cgaaaaccta cgaggtaggc tccgtctccc catgttgcgg acgaggaacc 13140
tgagggaaag agaggcccag cgccttaccc caggcccacg gctcatgaga gaagcagcct 13200
agacgtgagc gcaggcgtgg ggggagactc ccttcccctc tacctttcgc cgcccgggct 13260
cctgcagcca cgctgctctc agcctcgctg tgggcatctg ccagtttctg agtctcctgt 13320
catggccccc ccacccctga atgtggggaa cacagacccg ctcaccacag cggacccttg 13380
tggagccgcc cctgggtgac aggctccgtg cctgcctcct gcagcttaca ttccagcaga 13440
gaggctgatg agaatcggat aatcgctggt tgatgtcttt gtgaattgtg tcaaatgcta 13500
catacagtac attaagagac aacaggagtc cttcccagag agggtggtct ggaagcttcc 13560
aaggaggtag ccccagagca gggaccggaa ggcctgctgt aggtgtgggg tgtgggcctg 13620
gcctgttgga ggagactgag gaggtctctt ggtggctgga gcagagggat gaagggggta 13680
atcagagcag gatagagagg tgttgggtac gtgagcagca gtgaggagtt gggatttgtt 13740
ctgggtagga tgggagtcac tggggagaca tggctgctgt tctgagatag actctagggg 13800
ccagatggat gcagggagcc cagcgaggag gctcctggag tcacccaggt gggggatgtg 13860
gggcctggac cagagaatca gagcggcagt atggaggcag ggtggaggcc ttggtgatgg 13920
gttggtgaga gggatgggaa ggaaggagat attgaggaga agtccacctg gggtgactga 13980
gtgaggcccc tggggtcagg ccttgccatg tgagggatgg agtccccagt gaagggggtt 14040
cctatgatcc taactctttt cccctcccct cccctaggga gtgcctgcag ggcaccatcc 14100
gcaacagcca ggaggcggag gtctcctgcc ccttcattga caacacctac tcgtgctcgg 14160
gcaagctgct ggagagggag atcaaggcgg taaggcctca gggtgggaga cataccccaa 14220
gtcccaactc ctaaggaact gggccctgag caggcagcag acatctttct tttctttctt 14280
tttttttttt ggagatgggg tctcactatg ttgtccaagc tggtctcaaa ctcctgggct 14340
taagcgatca ttcatcctca gccccccaga catttttcaa gagctttgtc catgtggggt 14400
gttgagaccc caagcagaaa aagaattgag gggagtagct agtcaagaaa ccacatctat 14460
gaaggaagga cagcagagtt gttaagaatc agggactcgg ctgggcgtgg cagctcacac 14520
ctgtaatccc agcactttgg gaggatgaag tgggcagatt gcttgaaccc atgagttcca 14580
gaccaacctg ggcaacatgg caaaaaatat tcaaaaaata gccaggcgcg ggggcatgcg 14640
cctgtagtcc tagctacttg ggtggggtct gggatgagtg ggctgaggtg ggaggattgc 14700
ttgagcctag gaagtaaggt tgcagtgagc tgtgattgtg ccactgcact ccagcctggg 14760
caacagagtg agaccttgcc tcaaaaaaag aaaaaaaaaa ttagtcaggg aactctggag 14820
cctggtggcc tgggtgtgtg accacaagtc agatatttaa cctctctatg cctctatctc 14880
atctctgtta gagtcagagt tacagcttct atttccagga ttgcaaagat tacagtagag 14940
gatatgtgta tagaattcat agtagtacat ccaggcgcag tggctcattc ctgtaatccc 15000
agcgctttgg gaggccaagg cgggtggatc acctgaggtc gggaattcga gatcagcctg 15060
actaacatgg agaaacccca tctctactaa aaatagaaaa ttagccgggt gtggtggcgc 15120
atgcctgtaa tcccagctac tcaggaggct gaggcagggg aatcgcttga accccggagg 15180
cggaggttgt ggtgaactga gatcgcgcca ttgcactcca gcctgggcaa ccagagcgaa 15240
actccgtctg aaaatatata tatatatatt tagagtagtg cttgtcacat agtaagcctt 15300
tgttgttgtt agcgcttact gtgtaacaaa tcactgcagg ctcaaaacaa cagtcattta 15360
ttcagctcat aaatctgcaa gttaggacag ttggccctct gtatctgtgg gtaccacact 15420
ggagaattca gcaacggtgg atagaacata ttcttacaaa aaaaattaca ataaaaaaca 15480
aatttaaaaa acaatacagc ataaactatt tgtataacat ttatgttata ttaggtatta 15540
taaataatct acagatgatt taaagtgtat gggaggatgt tggtaggttg tatgcaaata 15600
ctgcactatt ttatataagg ggtttgagca tccatggatt tgggtatctg caggggtctt 15660
ggaaccaatt ctctggatac cgagggatga ctataatttg ggctggactt acctggatgg 15720
ttcttctggt ctgggcaggg cctcgctgat ttcacctggg cctggctggt gggtcagccg 15780
cggtggcctg gtttataatg gtctcatctg tgatgactgg gatgactggg gcctccttcc 15840
acttcaatgt ctcacccacc agcaggctgc ccgggccttc tcatgtcatg gtggtctcaa 15900
ggttccaaga gcagccatgg ggagccccag tgcatgtgta ctttctaagt ctgctcattt 15960
ctcacttgac actgtcccat tggccaaagc aagtcccatg ctcaagcaca gagtccattg 16020
ggaagggacc acccaaaagt gtggaatcgg ggagacagaa acaaattgga gtcaccactc 16080
cgccagtctg tcacagcgtt atgtgtgtct gcatacgtgt gtgcttgccg ctggcgctct 16140
tcatgaattc gttagcaggt tctctgcctg gctgctggtg atctcgagca agttgtttcc 16200
cttctgtggg actccatttc cttatctgaa aagtggacag ttgggcttga ttcatggttt 16260
tcaaactgct gggaaatgac cttcccagac ttgggcactg tgggttccca ggccaaaaca 16320
tggcagccga ggcccaaatg ggagatcccc acaaaacaca tacacagacc tcctctttat 16380
ttctgtcccc cctgcctctc tcctatgccc ctatttctcc tgagaatgct cccaacttca 16440
ccaagtgttt atggagccca agaggttctg cccctgggga aaagggggag gcagaagagg 16500
tagaactttg ggagttcaca gctctgatat caggagcagc cccatttttc tctgttgtct 16560
ctgggtggtt gctgaggctc cttcgctctg gcctggagag acctcatgac cagtcattcc 16620
atatgtcccc agcacccata gccatttgct tagaggtttc cctgtggagt ccaccccagc 16680
caaggggcat tatgctgggg ccaggttcat gccaaagggc tgcatgaact tccctggagc 16740
ccactggagt tgatgtgagt ctcagaaaat ggtcaagtgt gacagagaga aggaggcagg 16800
gatcagccaa gtaatgtagt ggaggttgtt tttacaaaaa cagaaaaata tgcctcacca 16860
catagaacca gagcagaaat cagagagaaa atcacccaca aacccaggaa atcctccaat 16920
tgcattttat cttatttcct tcagtatctc tgggcaaatt tttttttttt ttcctttttg 16980
agatgaagtc tcactctgtc atccaggctg gagtgcaatg gcgcgatctc agcccactgc 17040
aagctccgcc tcccgggttc acgccattct cctgcctcag cctcccaagt agctgggact 17100
agaggcgcac accgccatgc ccagctaatt tttgtatttt cagtacagac gagttttcac 17160
catgttggcc aggctggtct tgaactcctg acctcaggtg atccacccac ctcggcctcc 17220
caaagtgcta ggattacagg cgtgagccac cgtgcccagc cagatatgat tttttaagtc 17280
aactttactt aagtatactt tgcacacaat aaaatgtact cattgtaagt atgcagtcag 17340
gtaaatttta acaaatgtaa ctctcgtaac caccaaccac tgttacatat aacataggca 17400
tgatttctgc ctcattgtaa ccagcatgga tacaatcgct ttagcttttg ttattttgct 17460
atagaatttt tctaaagatt attacaaatc tcaatagcac atatactgtt tatacctctt 17520
agttctagtt tctcagtttg taatactcct tcaaggaatg ttttgcatgg tgtattcttt 17580
tttttttttt tttttgagac gaagtctcac tctgttgcct aagctggagt acattggtgt 17640
gatcttggct cactgcaacc tccacctccc gggttcaaac gattctcctg cctcagcctc 17700
ccgagtagct gggactacag gcagatgcca ccacacccag ctaatttttg tatttttagt 17760
agagatgggg tttcactatg ttggccaagc tagtcttaaa ctcctgacct cgtgatgcgc 17820
ccgcctcggc ctcccagagt gttcagatta caggcgtgat ccatcattcc tggctggtgc 17880
atcttatata ttattttctt gggataaagt taaagaagtg ggatgggtac caaagggtca 17940
gaaaagtttg ggatggttga aacgttattg ccacattgct ttctcagtgc tacgtactag 18000
cttactagtt tgtttaattt ttatttttta tttttgcggg tacatagttg gtgtatatat 18060
ttctggggta catgaaatac tttgatacag gcatgcaatg cgtaataatc acatcatgga 18120
gaatggggaa tccatcccct caagcattta tcctttgtgt tacagacaat ccagttaacc 18180
tctcttagtt attataaaat gtacaattaa attattggct acagtctgtt gtgctatcaa 18240
atactaggtc ttactctatt tttttgtacc aatttgccat ccccactccc ctgccacgcc 18300
tcactaccct ttgcagcctc tggtaagcat ccttttactg tctgtcctca ttagttcagt 18360
tgtttcgatt tttagcacct gcaaataagt gagaacatgt aatgtttgtt tgtctgtgcc 18420
tggcttattt catttaacat aatgacctcc agttcttcca tgttgctgta aatggcagga 18480
ttgcattctt ttttgtggcc gaatagtact ccattgtata tatgtgccac gttttcttta 18540
taggatacta gtttaatcat gtctttccca acattgctta ttatttatgt tcttttcttt 18600
attgtgagaa aatagacata acatttacca ttttaaccag tttttagtat acagttcagt 18660
ggcattaagt acattcacac tgttgtgcaa ccatcaccac catccacctc cagaactttt 18720
agaaattccc cccactttct ttcactttct ttttactttt cttttccttt tttttttttt 18780
tttttttttt tttttagcta ggatttcatt ctgtcaccca ggttggagtg cagtgcatca 18840
gtcatggctc actgcatcct tgaccttctg ggctcaagcg atcctcacaa cccagcctcc 18900
caagcagctg ggactacagg tgtgagcacc acacctggtt attttatttt ttaaaaaaat 18960
tttttggtag agatgaggtc tcactgtatt tctcaggctg gtctgaaact cttggcctca 19020
aggaatcctc ctgccttgac tgacctccca aagtgctggg attacaagtg taagccacca 19080
cacctggcct aaaatccact ctttgaatgg agtttttcaa cactatgagg attacatgaa 19140
gaaaagagcc tggggctggg ttggagtttc tgggctgggg gctttctgga gggtatttag 19200
tggtcaaggg tcatatgtca ggtgttctga atcctgagca gcaaggacat ggtgtgttgg 19260
cagctcctga cccctgagga ttaccagcga tttctagacc tgggcatctc cattgctgaa 19320
aaccgcagtg ccttcagcta ccattgcaag accccagatt gcaagggatg gtgcttcttt 19380
gaggatgatg tcaatgagtt cacctgccct gtgtgtttcc acgtcaactg cctgctctgc 19440
aaggtggggc ctgcagggac tccccccacc tagtcactgt catcttgcct ggagctcacc 19500
acactgcagt gcgtgttctc ctgggaaggg agctgtgaca ctggcctgct ggtcatgact 19560
tagagctaca tgtcagtggg agagtgtggc ttgagcctga actgagccct ggccccacag 19620
acggagtccc agccccagcc ccagatggag cctcaaacct aggcagccct ggttcacaat 19680
ggagccccga ccctgggcca gtctgacccc agtcacagac tgaatcccag tcccacattg 19740
agccctgatc ccatccaagt ccatagactt ggcctctgac caaacctgac cctgcacttg 19800
tcacttaagg tggtcccata ttcagctcag accctgaacc gagctctgac cctggcttct 19860
gactgaatct gtgacagact aaggcctgac cctggcccta taccacgtct ccacccgtgt 19920
cctcaactga gtgctgaccc caaacctaga cagccctacc tgatccttcc cccaggcctg 19980
tccccgccgc ttcatctcaa aagttgaagg tgaggagccg gtaaacaggt ctggagcctg 20040
gtctcagact cagcctgagc aagctcagtc tggggtcatt gggcctgtaa ccccgggcag 20100
gcccttgtta gggatgcagg gtctcaccct aggggtataa gggatttctg tgcccatcag 20160
aacttaaata agctgggtgt ggcagcacat gtcagtggtc ccagctactc aggaggctga 20220
ggtatatttt gctgttagca tatgtgatga ccttgacttc acctccctgg cgccaatatc 20280
ctcttctgta aaatggctta tgcattacaa agtgaggtcc tgccagtgac tacacctaga 20340
ggcattaagt gcctttgtgg actcctgccc tgcacctcac ctctcccagc ttcttaaccc 20400
cctgaggaac cttcttacct tgagtccctc acccgctaca ggccatccat gagcagatga 20460
actgcaagga gtatcaggag gacctggccc tgcgggctca gaacgatgtg gctgcccggc 20520
agacgacaga gatgctgaag gtgaggctgg gacagggccg aggcctaggg attttaagtt 20580
ctgggatcca ggtgggggct gggggcttcc cagtaagggc tgtgctcaca catccctgga 20640
ggctctgacc tcccttctgg ctgtcactcc catccggagg tgggacttag gccgaatggt 20700
catgtcagga agagcgtctg ggtggagggt ggagaccaca ggaatgaaga gggggttgct 20760
ggatggagcc tggcctggca gagccacaca ggagagactc cacagctcta gagggtcacc 20820
accttctccc tgccatgggg aggggccagg ctgggtgact gccccagccc cgccccaggg 20880
ccagcacctg ccccactcca ggtgatgctg cagcagggcg aggccatgcg ctgcccccag 20940
tgccagatcg tggtacagaa gaaggacggc tgcgactgga tccgctgcac cgtctgccac 21000
accgagatct gctgggtcac caagggccca cgctggggcc ctggggtgag tctttgctcg 21060
tggtggtgtg gagagggtgc ccttgtgggc tttgccttag aggagggctg ggaaaactac 21120
agcccatggg ccatatccaa cccagcacct gaatttgtac agctcccgag gtaagaattt 21180
tttttttttt ttttgaaacg gagtttcact cttgttgccc aggctggagt gcaatagcac 21240
aatctcagct cactgcaacc tctgccttcc gggttcaagc aattctcctg cctcagcctc 21300
ccaagtagct gggattacag gcatgcgcca ccacgcccgg ctagttttgt atttttagga 21360
gagacggggt ttctccatgt tggtcagact ggtctcaaat tcccgaccgc aggtgatcca 21420
cctgcctcgg cctcccaaag tgctaggatt acaggcgtga gccaccgggc cgcaagaatg 21480
ttctttacat ctttaaatgg ttgaaaaaat accagaagat gactattttg tgacgtgaaa 21540
attacatgaa atccacgttt cagtgtccgt aggtaaagtg ctttggagca cagccgtgtt 21600
cattcattca catgttggct gtggttgctt ttacactaca gaggcagagg ccgtatggct 21660
gcccggccca aaatgactgg ccctttgcag aaaaggtttg cccactcctg ccctagagga 21720
cagcaagtaa aggttcgatc tggagtcaga ggtggattgg cccctggctc tggcacatac 21780
tgactgtgtg attaggctgc ctgccactca cctctgtcag ccccatttcc tctgtgaaat 21840
ggagatgata gctgggctta tctcaggctt gttgtcagaa tcaagtggaa aaattgcaag 21900
agaagtgctt agagagcctg tcacttggtg agcacccttg cagatggtag ctgtcgttat 21960
taggggtgtg ctctggaatt gggggcctgt tgctacgttc aggtagactt tcagacaggt 22020
ggaggcagag gaaactgccc tctcgcatgc tgacatgtct agaatatgca gagtggtcag 22080
atcctctccc tggcctgttc ccggatctag gcgtgggtag actgagtgct gtgggagccc 22140
agaaaaggcc tcagtgactc tccatcaggt agctgaggct gaccaggcca ttcttgcagg 22200
aggacctgca gaggcaaagg cccggggtgg gagagcgctc ggctgtgggg gcagtctctg 22260
cactgcgctg acattctctt ctcttcctcc catcctctag ggcccaggag acaccagcgg 22320
gggctgccgc tgcagggtaa atgggattcc ttgccaccca agctgtcaga actgccactg 22380
agctaaagat ggtggggcca catgctgacc cagccccaca tccacattct gttagaatgt 22440
agctcaggga gcttcgtgga cggccttgct tgctgtagcg ttgtaggggc cctgcctgca 22500
ctgcggttgt ccacggtcac atctgcccca gtgcctttgt ccttcccttg gggcttgccg 22560
gccagacttc tctcccctgc ggctcccacc tctgcctgac cccagcctta aacatagccc 22620
ctggccagag gccttgctgg gtggagcctc tgtgtgactc catactcctc ccaccacaac 22680
actcatctgt caaacaccaa gcactctcag cctccccgcc ttcagctgtc agctttctgg 22740
ggctaacttc tctgcctttg tggttggagg cctgaggcct cttggaactc ttgctaacct 22800
gttcagagcc aggaaggaga ctgcacagtt ttgaaagcac agcccgtcag gtccggctct 22860
gcgtctccct ctctgcagcc tgtgtaagct attataatta aaatggtttt ccgggaaggg 22920
atgagtgtga tgtccttgag aggaaatgaa tgtcctggcc tgggactcta cacacaggca 22980
ggatcctgag gtctctggga actgcatcag aaagttgact tgtcagtcca tctgtggtag 23040
aatgaggctg tgactgagca ctgggacctt tctaccagat gtggacccca tgcccagcct 23100
caggggcaag gatgctcttg ggtcaccgtc agccaggaca ggtggagtgt gcagtgtgtc 23160
aagtctgcag agaaggatgg gcttaggggc gggaggggaa gtcttgccac tcctgctccc 23220
ttttgacctc tcagcaggca tctagggttg gcaggtagat agttcaagaa ggaacgaagc 23280
tgctgcagtt gaggggtggg gttgtccatc ctattttctc gtctcaagca agatggcaca 23340
gtatcgattc agcagtattt actagaaccc actctgtgct ggtcggaggt tactaagaca 23400
gggtcctggg atgttcattc tctaagtctt tcctccgctc tgtgacccac cctccttccc 23460
cttttgagat ctggtatttg atgcccaaca cattgtccac gctgtgacgt gaccatcatc 23520
atagcaggca gagggcgcct ctgctgctga aggcctgtga ttttgtgggg aagggcctgt 23580
tctagcaact ggaaaggcac tgccacctgc cgttggatgc caggactcaa gagctggccc 23640
cagtcactgt gcgcagagct gtctgagaat gtgtgagtgg actgggtcct tcggcactgc 23700
ctgcattggc tcagggcagt caaccgtcgc agaggatgag gggcacactc aggcagcctc 23760
cccggccctg gaggcagaaa ggcccaggca gaaccactga ctgggaggaa acagaaaaag 23820
cagaggagag ccaggctgca ggcgtgtgga tgggaccagc tcaggcagac gctgtctcat 23880
acccactctc ccctctcttg ccagggcctg gcctggtgtc tctcaggagc ctgggcatga 23940
gacaaaagca gagattgttc tcttgtggta ccacaggctg taaccagtcc acccagtgtt 24000
gttttagaaa tttaaatcgg ttgcccatct ttttaaattg gcaacatcgt ttaccacatt 24060
aaaatctaga tgccctgctt ctcttgaaaa 24090
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(RBCK1-F)
<400> 2
tgctcagatg cacaccgtc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(RBCK1-R)
<400> 3
caagactggt gggaagccat a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(36B4-F)
<400> 4
ggcgacctgg aagtccaact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(36B4-R)
<400> 5
ccatcagcac cacagccttc 20

Claims (9)

1.一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物，其特征在于：所述分子标志物包括RBCK1基因和/或RBCK1基因的表达产物，所述RBCK1基因的序列见SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物，其特征在于：所述RBCK1基因的表达产物包括RBCK1 mRNA和/或RBCK1蛋白。
3.如权利要求1或2任一所述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在食管癌细胞迁移和侵袭能力检测中的应用。
4.如权利要求1或2任一所述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒包括RT-PCR检测试剂盒或实时定量PCR检测试剂盒或蛋白免疫检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的试剂盒中的应用，其特征在于：所述RT-PCR检测试剂盒和/或实时定量PCR检测试剂盒包括SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所述的扩增RBCK1基因的引物。
7.根据权利要求5所述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的试剂盒中的应用，其特征在于：所述蛋白免疫检测试剂盒包括与RBCK1蛋白特异性结合的抗体。
8.如权利要求1或2任一所述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于治疗食管癌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物在制备用于治疗食管癌的药物中的应用，其特征在于：所述药物包括RBCK1基因和/或其表达产物的促进剂。
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