CN110438128B - 利用CRISPR/Cas9系统敲除猪CCAR1基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9系统敲除猪CCAR1基因的方法。本发明提供特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA、包含该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体、利用该载体进行猪CCAR1基因敲除的方法以及猪CCAR1基因的检测方法。本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够实现较高的猪CCAR1基因敲除效率，显著提高了CCAR1基因敲除细胞和CCAR1基因敲除猪的构建效率，为猪CCAR1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

Description

利用CRISPR/Cas9系统敲除猪CCAR1基因的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体，以及利用该载体进行猪CCAR1基因敲除的方法和猪CCAR1基因敲除的检测方法。
背景技术
CCAR1(细胞周期和凋亡调节因子1，ccar1)是一种具有多个非重叠的凋亡复合体结构的环核丝氨酸和酪氨酸磷酸化蛋白。人CCAR1位于10号染色体长臂(10q21～10q22)，相应的mRNA约为3.5kb，编码1150个氨基酸(aa)，相对分子量为130kDa。该基因在许多物种中都有表达，包括小鼠、大鼠、狗、黑猩猩、家禽、蜜蜂等。
目前，CCAR1基因的研究主要集中在小鼠中，在猪等哺乳动物的研究比较少。通过利用CRISPR/Cas9系统敲除猪CCAR1基因，在体外和体内研究猪CCAR1基因的功能，对于研究CCAR1基因在猪发育过程中的功能及其发挥作用的机制具有重要意义。
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑的比较前沿的方法。以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列疾病(例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病)的基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景。开发高效的猪CCAR1基因的CRISPR/Cas9系统敲除方法对于提高猪CCAR1基因敲除效率和CCAR1基因敲除细胞或动物的构建效率具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供利用CRISPR/Cas9系统高效敲除猪CCAR1基因的方法以及猪CCAR1基因敲除的高效检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA，其靶向猪CCAR1基因的第101位至第120位的序列。
本发明通过大量筛选发现采用猪CCAR1基因上的第101位至第120位的序列作为靶标序列，具有较高的打靶效率和敲除效率。
针对上述猪CCAR1基因上的靶标序列，本发明设计了特异的sgRNA，并进一步发现采用如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列对应的sgRNA能够实现较高的打靶效率和CCAR1基因敲除效率。
作为优选，所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：sgRNA-3：5’-GAAGCTCTGGTCGTCGCGAC-3’。
第二方面，本发明提供含有所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
作为本发明的优选实施方式，所述CRISPR/Cas9基因敲除载体为连接有所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的pHS-CR054载体。
第三方面，本发明还提供所述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA与pHS-CR054载体连接，得到所述CRISPR/Cas9基因敲除载体。
作为优选，所述构建方法包括以下步骤：
(1)用BsmBI酶切载体pHS-CR054，得到线性化载体；
(2)带BsmBI酶切位点的sgRNA序列的片段退火，形成含有BsmBI酶切位点粘性末端的片段；
(3)将步骤(2)得到的退火产物与步骤(1)得到的线性化载体连接，构建连接有所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的pHS-CR054载体。
进一步优选地，上述步骤(1)中，酶切的反应体系如下：载体pHS-CR054 500ng，限制性内切酶BsmBI 1μL，NEB 3.1Buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。酶切的反应程序如下：55℃，60min；80℃，20min。
进一步优选地，上述步骤(2)中，退火的反应体系如下：PNK buffer2μL，上游序列100μM，下游序列100μM，ddH2O补齐至20μL。退火的反应程序如下：95℃，5min；95℃到25℃缓慢冷却，每分钟降2℃。
进一步优选地，上述步骤(3)中，连接的反应体系如下：退火产物1μL，酶切产物1μL，T4DNA Ligase 1μL，10×buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。连接的反应程序如下：16℃过夜。
第四方面，本发明还提供所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA或包含所述sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体在猪CCAR1基因敲除中的应用。
第五方面，本发明提供一种制备CCAR1基因敲除细胞的方法，其包括：将含有所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞，敲除CCAR1基因。
上述将所述CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞可通过转染等常规生物学方法实现。
上述制备CCAR1基因敲除细胞的方法，将含有所述特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞后，可采用PCR等常规方法筛选阳性细胞。
本发明利用上述制备CCAR1基因敲除细胞的方法获得了CCAR1基因敲除的猪细胞。
第六方面，本发明提供一种制备CCAR1基因敲除猪的方法，其为利用所述CRISPR/Cas9基因敲除载体实现猪CCAR1基因的敲除。
第六方面，本发明提供检测猪CCAR1基因表达水平的特异性引物对，其序列如SEQID NO.4-5所示。
第七方面，本发明提供一种检测猪CCAR1基因表达水平的方法，其包括如下步骤：
(1)提取待测细胞总RNA，反转录成cDNA；
(2)以步骤(2)的cDNA为模板，利用如SEQ ID NO.4-5所示的特异性引物对、荧光定量PCR(qPCR)扩增CCAR1基因，检测CCAR1基因的表达水平。
作为优选，上述步骤(2)中，所述荧光定量PCR扩增以18S rDNA作为内参基因。
进一步优选地，18S rDNA的荧光定量PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.6-7所示。
作为优选，上述步骤(2)中，所述qPCR的反应体系如下：2×GoTaq qPCR MasterMix 10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。
所述qPCR的反应程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃30min，60℃15s制作熔解曲线。
作为优选，上述步骤(2)中，对qPCR实时监测得到的扩增曲线和熔解曲线进行分析。以对照组作为外参(设置外参的目的在于消除不同批次的试验误差)计算CCAR1基因的表达量。采用独立样本T检验分析比较CCAR1基因在不同处理中表达差异，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。所有统计分析采用SPSSversion 20.0软件完成。
本发明的有益效果至少包括：
本发明利用CRISPR/Cas9敲除系统进行猪CCAR1基因的敲除。通过猪CCAR1基因靶位点的特异选择以及针对该靶位点的sgRNA的特异设计，获得了可高效打靶猪CCAR1基因的sgRNA，显著提高了CRISPR/Cas9敲除载体的打靶效率，进而显著提高了猪CCAR1基因的敲除效率。经实验验证，本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够实现较高的猪CCAR1基因敲除效率，显著提高了CCAR1基因敲除细胞和CCAR1基因敲除猪的构建效率。
本发明提供的检测猪CCAR1基因表达水平的特异性引物能够快速、准确地对猪CCAR1基因的表达水平进行定量分析。
本发明提供的猪CCAR1基因的敲除方法和猪CCAR1基因表达水平的检测方法具有很强的实用性，为猪CCAR1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中pHS-CR054载体的图谱；图中标出了BsmBI酶切位点的位置，在3058bp和3741bp处有两个BsmBI酶切位点。
图2为本发明实施例2中含有3个特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体插入的带BsmBI酶切位点的sgRNA序列的测序结果；其中，SG1为含有sgRNA-1的CRISPR/Cas9基因敲除载体，SG2为含有sgRNA-2的CRISPR/Cas9基因敲除载体，SG3为含有sgRNA-3的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
图3为本发明实施例3中转染PK15细胞的显微镜观察结果图；其中，NC为空载体，SG1、SG2和SG3分别为携带sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的载体的转染细胞。
图4为本发明实施例3中转染48h后CCAR1基因的mRNA表达量检测结果；其中，NC为空载体，SG1、SG2和SG3分别为携带sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的pHS-CR054载体；*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。
图5为本发明实施例3中转染48h后CCAR1蛋白的Western blotting检测结果；其中，NC为空载体，SG1、SG2和SG3分别为携带sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的pHS-CR054载体；*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明通过从数据库中下载猪CCAR1基因的核苷酸序列，基于对猪CCAR1基因序列的分析，根据CRISPR/Cas9识别靶位点的设计原理，进行猪CCAR1基因的靶位点的筛选和针对该靶位点的sgRNA的设计和筛选，最终筛选获得了敲除效率最高的sgRNA-3(如SEQ IDNO.3所示)，并构建了含有该sgRNA的CRISPR/Cas9敲除载体，实现了猪CCAR1基因的高效敲除。以下实施例中以本发明设计的针对不同靶位点的大量候选sgRNA中的3条为例进行效果说明。
实施例1 特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的获得
sgRNA-1靶向猪CCAR1基因的第75位至第94位的序列，sgRNA-2靶向猪CCAR1基因第80位至第99位的序列，sgRNA-3靶向猪CCAR1基因第101位至第120位的序列。sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的编码基因序列如下：
SEQ ID NO.1：sgRNA-1：5’-AAATGGCTTCGGTCTTATCC-3’；
SEQ ID NO.2：sgRNA-2：5’-GCTTCGGTCTTATCCGGGAC-3’；
SEQ ID NO.3：sgRNA-3：5’-GAAGCTCTGGTCGTCGCGAC-3’。
为便于后续与载体连接，在sgRNA的两端添加BsmBI酶切位点序列，得到的双链DNA序列如表1所示。
表1 3个sgRNA对应的双链DNA序列
Figure BDA0002172611520000071
实施例2 含有特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建
本实施例提供含有特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法。
含有特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法包括如下步骤：
1、线性化载体的构建
复苏并扩大培养携带有pHS-CR054载体的菌株(pHS-CR054载体图谱如图1所示，购自北京合生基因科技有限公司)，按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书，进行质粒提取。
提取产物用限制性内切酶BsmBI进行酶切，酶切的反应体系为：限制性内切酶BsmBI 1μL，pHS-CR054载体质粒500ng，NEB 3.1Buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。酶切的反应程序为：55℃酶切1h，80℃失活20min。
2、sgRNA序列的退火
将如表1所示的3对携带BsmBI酶切位点的sgRNA序列的片段分别进行退火，形成含有BsmBI酶切位点粘性末端的片段。退火的反应体系如下：PNK buffer 2μL，上游序列100μM，下游序列100μM，ddH2O补齐至20μL。退火的反应程序如下：95℃，5min，95℃到25℃缓慢冷却，每分钟降2℃。
3、连接
将步骤2中得到的sgRNA退火产物与步骤1得到的线性化载体pHS-CR054连接。连接反应体系如下：退火产物1μL，酶切产物1μL，T4DNA Ligase 1μL，10×buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL，连接反应程序如下：16℃过夜。
4、转化
取步骤3中的连接产物5μL加入刚解冻的50μL DH5α感受态细胞里，混匀，冰浴30min后，42℃热激45s，立即放冰上静置2min，加入950μL于37℃预热的LB液体培养基，37℃震荡培养45min，将菌液低速离心2-3min，倒掉部分上清液，剩余上清液用枪头吹打沉淀，取100μL菌液涂于氨苄抗生素的平板中，于37℃恒温培养箱中正放1h后，倒置培养12h。
5、筛选阳性菌落并进行测序鉴定
挑取步骤4中培养得到的单个菌落，进行菌落PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测。合格的菌落进行摇菌，将1mL菌液送华大基因公司测序测序引物序列如下：CAGGAAGAGGGCCTATTTCCC。对测序正确的菌液样品进行保菌和质粒提取。将测序正确的分别含有3个sgRNA的pHS-CR054载体分别命名为SG1(含有sgRNA-1的pHS-CR054载体)、SG2(含有sgRNA-2的pHS-CR054载体)、SG3(含有sgRNA-3的pHS-CR054载体)，其测序结果如图2所示。
实施例3 猪CCAR1基因的敲除和检测
本实施例提供利用实施例2构建的含有特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体SG1、SG2和SG3进行猪CCAR1基因的敲除的方法以及猪CCAR1基因表达水平的检测方法。
1、猪CCAR1基因的敲除
(1)细胞培养与收集
使用完全培养基复苏PK15细胞，传代3次后，待细胞进入对数生长期进行转染。转染前一天，将5×105～8×105个细胞接种至6孔板，并在每孔中加入2mL无抗生素培养基，当细胞密度达到60％-80％时进行转染。
(2)转染
按照Lipofectamine 2000说明的要求，将实施例2构建的含有特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体SG1、SG2和SG3用Lipofectamine 2000进行转染，48h后收集细胞；以NC质粒(空质粒)作为对照。转染PK15细胞的显微镜观察结果如图3所示。
2、猪CCAR1基因表达水平的qPCR检测
对步骤1得到的阳性细胞进行qPCR检测，具体包括如下步骤：
(1)细胞RNA提取及cDNA合成
采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒提取待测细胞的总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总RNA浓度通过NanoDrop 1000微量紫外分光光度计测定。
(2)引物设计
根据NCBI公布的猪CCAR1基因mRNA序列(GenBank:EU822301.1)设计可检测猪CCAR1基因敲除的引物对，经筛选得到能够实现高效的猪CCAR1基因检测的一对引物CCAR1-1。引物对CCAR1-1的序列如下：
上游引物，CCAR1-1F：5′-AGAGATTCGCTACCATCGCC-3′；
下游引物，CCAR1-1R：5′-AAGGCAATGCCAAACATCCG-3′；
以18S rDNA作为内参基因，根据NCBI公布的18S rDNA基因序列设计引物对18S。
引物对18S的序列如下：
上游引物，18S-F：5′-ATGCCAGAGTCTCGTTCGTTAT-3′；
下游引物，18S-R：5′-CGGACAGGATTGACAGATTGAT-3′。
(3)qPCR扩增
以上述步骤(1)中得到的细胞cDNA为模板，利用步骤(2)的引物对CCAR1-1和引物对18S进行qPCR扩增。
qPCR的反应体系为：GoTaq qPCR Master Mix(2×)10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。qPCR反应体系的配制采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个去RNA酶的1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到荧光定量PCR专用的8联管中，然后分别加入模板cDNA，再瞬时离心后进行荧光定量PCR扩增，整个操作过程尽量避光。
qPCR的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃30min，60℃15s制作熔解曲线。
(4)qPCR的数据分析
对qPCR结果的扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果表明，各基因扩增曲线均呈“S”形且到达平台期，说明为有效扩增；且各基因的熔解曲线峰值单一，说明扩增产物特异、无引物二聚体及其他非特异性扩增，可以进行后续结果的分析。根据不同处理组的CT值，以NC质粒(空质粒)的对照组作为外参(设置外参是为消除不同批次试验误差)采用相对定量方法计算猪CCAR1基因敲除的
Figure BDA0002172611520000102
Figure BDA0002172611520000103
(5)作图
根据相对定量的计算结果，利用SPSS version 20.0软件进行差异显著性检验，并通过GraphPad Prism 5作图，结果如图4所示，图中个体重复数为3，qPCR加样技术重复为4。结果显示，与对照组相比，敲除CCAR1基因使其转录水平显著下调；在3条sgRNA介导的猪CCAR1基因敲除中，sgRNA-3介导的敲除细胞中的CCAR1基因的转录水平最低，表明sgRNA-3具有优异的猪CCAR1基因敲除效率，能够实现猪CCAR1基因的高效敲除。
3、猪CCAR1基因表达水平的Western blotting检测
采用Western blotting进一步验证猪CCAR1基因表达水平，具体方法如下：
提取敲除组和相应空白对照组细胞的总蛋白，取200ng蛋白上样，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。再经过转膜、封闭、孵育一抗和二抗后使用LICOR仪器曝光，再使用仪器自带软件Image Studio计算分析条带光密度值。结果如图5所示，在3条sgRNA介导的猪CCAR1基因敲除中，sgRNA-3介导的敲除细胞中的CCAR1基因的表达水平最低，表明sgRNA-3具有优异的猪CCAR1基因敲除效率，能够实现猪CCAR1基因的高效敲除。
综述所述，利用本发明提供的特异型靶向猪CCAR1基因的sgRNA(SEQ ID NO.3)以及含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体能够实现高效的猪CCAR1基因敲除；同时利用本发明提供的猪CCAR1基因的特异性引物能够实现CCAR1基因表达水平的快速准确检测；本发明为猪CCAR1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 利用CRISPR/Cas9系统敲除猪CCAR1基因的方法
<130> KHP191113498.7
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaatggcttc ggtcttatcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttcggtct tatccgggac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagctctgg tcgtcgcgac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagattcgc taccatcgcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggcaatgc caaacatccg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgccagagt ctcgttcgtt at 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggacaggat tgacagattg at 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accgaaatgg cttcggtctt atcc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacggataa gaccgaagcc attt 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accggcttcg gtcttatccg ggac 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaacgtcccg gataagaccg aagc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accggaagct ctggtcgtcg cgac 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaacgtcgcg acgaccagag cttc 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggaagagg gcctatttcc c 21

Claims (3)

1.一种特异性靶向猪CCAR1基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体，其特征在于，其为连接有特异性靶向猪CCAR1基因的sgRNA的编码基因的pHS-CR054载体，所述sgRNA靶向猪CCAR1基因的第101位至第120位的序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体在猪CCAR1基因敲除中的应用。
3.一种制备CCAR1基因敲除细胞的方法，其特征在于，将权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞，敲除CCAR1基因。
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