CN106337088B

CN106337088B - 一种用于检测精子生成障碍传代效应的标志性微小核糖核酸标志物及其应用

Info

Publication number: CN106337088B
Application number: CN201610908072.5A
Authority: CN
Inventors: 吴炜; 袁蓓蕾; 汤秋勤; 芮璨; 居蓉; 陈丽平; 夏彦恺; 王心如
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Hanwei Public Health Research Institute Co., Ltd
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2016-10-18
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2036-10-18
Also published as: CN106337088A

Abstract

一种用于检测精子生成障碍传代效应的标志性微小核糖核酸标志物及其应用。本发明属于生物技术及生殖医学领域，公开了一种用于检测精子生成障碍传代效应中的微小核糖核酸(microRNA，miRNA)标志物及其应用。该标志物选自rho‑miR‑1‑3p、rho‑miR‑124‑3p、rho‑miR‑190a‑5p中的多种。该标志物对监测精子生成障碍传代效应具有特异性和敏感性，为精子生成障碍传代效应的诊断监测提供一种可靠的检测依据和快速检测方法，具有重要的应用价值。

Description

一种用于检测精子生成障碍传代效应的标志性微小核糖核酸标志物及其应用

发明领域

本发明属于生物技术及生殖医学领域，涉及一种用于检测精子生成障碍传代效应中的微小核糖核酸(microRNA，miRNA)标志物及其应用。

背景技术

目前，全球约有10-15％的育龄夫妇患有生育障碍。我国由于人口基数大，新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万，因男性因素导致的不育高于50％。生精障碍已成为男性不育最常见的疾病。精子生成是一个复杂的过程，包括环境因素在内的多种因素调控和影响精子的发育与成熟，可导致生精障碍。半个世纪以来，男性的精子数量有了相当程度的下降。这提示生精障碍发生率的提高与环境的改变，尤其是日益加重的环境污染有着密切的联系。

动物实验表明，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对雄性生殖系统的生长发育及功能具有明显的干扰作用，包括精子生成障碍、睾酮合成下降、睾丸发育不全、生殖道发育异常以及性发育延迟等。DBP的暴露不仅影响亲代(F0代)大鼠，还可影响第一代(F1代)乃至第二代(F2代)的生殖和发育。传代效应是指可遗传物质从双亲传递给子代并且至少要维持3代。国际化学品安全规划署认为DBP不具有遗传毒性。因此损伤机制有可能来自于遗传外机制。表观遗传修饰对环境变化非常敏感，如果在表观遗传形成期暴露于特殊环境，有可能会导致表观遗传模式的异常，从而导致胚胎的死亡和发育不良。胚胎发育早期经历了全基因组范围的表观遗传重编程过程，当表观遗传重编程受到环境化学物的干扰时，表观遗传修饰可发生改变，从而影响其表型，甚至增加成年疾病的易感性。

若要观察到传代效应的出现，需要观察的时间较长，如何在早期就能判断由于环境改变导致的精子生成障碍是具有传代效应，还未有研究。因此，选择高特异性及敏感性的标志物，并能够确立快速、准确的实验方法，对于检测精子生成障碍的传代效应的发生具有重要的价值。

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的小非编码单链RNA分子，它存在于大多数真核细胞内，多位于基因组非编码区域，在进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节。对其功能研究也日益增多，发现它与动物的许多正常生理活动相关，这些生理活动包括细胞凋亡、组织分化、个体的发育、能量代谢等关，同时也与许多疾病例如代谢性疾病、生殖系统甚至是肿瘤的发生及发展都存在着紧密的关联。近些年来，对miRNA在精子发生中的调控机制研究也有了一些重要的结果，且这种调控作用贯穿于精子生成的整个过程中。miR-19a、miR-19b、miR-221和miR-222能够维持精原细胞处于分化状态，在原始生殖细胞增殖中起调控作用的；miR-203和miR-34b-5p主要在精子发生的晚期阶段表达，对精子生成的后期阶段发挥调控作用；miR-24能调控精子在减数分裂时期的分裂的过程；miR-17-5p能够使生精细胞的凋亡减少，利于精子的正常生成。miRNA主要的调控方式是由成熟的miRNAs组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，通过miRNA的种子序列与其碱基互补配对结合，将沉默复合体定位在靶mRNA上，并根据互补程度的不同导致沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，进而产生抑制作用。miRNA在宫内EDCs暴露引起疾病传代效应中也起重要调控作用。近年来的研究发现，miR-23b和miR-21可以作为一种表观遗传信息的载体，将乙烯菌核利导致的原生殖细胞异常及生殖细胞分化的异常传递给后代，从而影响后代成年期疾病的发病风险。miRNA还能够通过生殖系的传递，从而影响HPA轴的表型以及下丘脑的重塑。这些所识别出的miRNA，能针对特定的mRNA进行作用，为父系RNA的传递以及对表观遗传的作用研究提供思路。在受到DBP的暴露刺激之后，所造成的雄性生精障碍传代效应过程中，一部分miRNA的表达改变可持续多代。因此，筛选特异性miRNA作为检测标志物，建立基于该标志物的检测方法意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测精子生成障碍传代效应的标志性microRNA标志物

本发明的另一个目的是提供上述microRNA标志物的引物。

本发明还有一个目的是提供含有上述microRNA标志物或其引物的应用。

本发明再有一个目的是提供含有上述microRNA标志物或其引物的精子生成障碍传代效应的诊断或监测试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种用于检测生精障碍传代效应的microRNA标志物，选自rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p中的至少两种。

作为一种优选技术方案，所述的microRNA标志物由rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p和rho-miR-190a-5p组成。

上述的microRNA标志物，其中rho-miR-1-3p的序列为SEQ ID No.1，rho-miR-124-3p的序列为SEQ ID No.2，rho-miR-190a-5p的序列为SEQ ID No.3。

上述的microRNA标志物的引物，其中rho-miR-1-3p的上游引物为SEQ ID No.4，下游引物为SEQ ID No.5；rho-miR-124-3p的上游引物为SEQ ID No.6，下游引物为SEQ IDNo.7；rho-miR-190a-5p的上游引物为SEQ ID No.8，下游引物为SEQ ID No.9。

所述的microRNA标志物或其引物在制备精子生成障碍传代效应中的诊断或监测试剂或试剂盒中的应用。所述试剂或试剂盒是指能够测定这些microRNA标志物在睾丸中表达量的试剂。

一种精子生成障碍传代效应的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述microRNA标志物(rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p)的引物。

所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，以及SEQ ID No.8和SEQ ID No.9)中的至少两对，优选为含有上述引物的三对。进一步优选的，该试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11)。

试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。

本发明采用精子生成障碍传代效应的评价的标志物的优越性在于：

(1)miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、易于检测，且定量精确，将大大提高诊断及监测的敏感性和特异性，为其他疾病表型传代效应生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的miRNA标志物可用于精子生成障碍传代效应的评估和动态监测，可避免长时间的实验，可反复检测，且易于动态监测，对于各种物质的生殖毒性传代效应的评价提供新的思路。

(3)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选数百种miRNAs，应用Real-time PCR等方法再进行二次验证，采用分层评分系统对结果进行标化，保证了该miRNA生物标志物和诊断监测试剂盒的可靠性。

附图说明

图1在F1至F3代，精子计数(CASA分析结果)。

图2rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p和rho-miR-190a-5p三个miRNAs在精子生成传代效应组与对照组中的表达水平。

图3以rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p这三个miRNAs作为标志物时对照组和处理组进行区分的ROC曲线(ROC曲线下面积为0.886)。

具体实施方式

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序(SOP)，在大鼠孕期E8-14天给予DBP处理，收集F1-F3代的睾丸组织，并采用了RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array、Real-time PCR(TaqMan探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。

研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、大鼠传代效应模型建立及基础数据收集

1.以大鼠为动物模型，在其孕8-14天通过灌胃暴露于DBP，对照给予玉米油，得到F1代，不同窝的相互交配之后得到F2，F3代。除了孕期暴露，后代均不再暴露于DBP。

2.雄性大鼠在成年时期90-180天，安乐死之后取睾丸组织，取左侧附睾，切碎放入37℃M199培养液的孵育5分钟，使精子完全游到液面。双侧睾丸组织立即放入液氮中，2小时后转入-80℃冰柜，待到使用时取出。

3.通过计算机辅助精液分析系统(CASA,HamiltonThorne Biosciences)，检测精子浓度、精子活动力、精子运动性和前向性参数等精子质量指标。7项CASA参数包括：鞭打频率(BCF,Hz)，精子头侧摆幅度(ALH,μm)，曲线速度(VCL,μm/s)，平均路径速度(VAP,μm/s)，直线速度(VSL,μm/s)，直线性(LIN,％)，前向性(STR,％)。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测两次。所有观察计数均在不清楚样本背景的情况下自动完成以避免偏倚。

二、TaqMan miRNA array筛选

1.制备cDNA样品：

a)取100mg的F3代睾丸样本；

b)加800μl的TRIzol，振荡混匀，冰上静置5分钟；

c)加入160μl的三氯甲烷震荡混匀，静置5分钟，4℃，12000转离心15分钟，取上清；

d)加入与上清等体积的预冷后的异丙醇，过夜；

e)12000转离心20分钟得到的沉淀即为RNA；

f)用75％的乙醇洗涤一遍，得到RNA；

g)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl loop环的反转录引物(URP，见表1)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；经过前处理的精浆，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。

表1 miRNAs的引物序列

按下表所示配制反转录体系：

2.将PCR管反复颠倒混匀简短离心后，冰上放置5分钟。

3.将PCR管放入PCR仪进行反转录，反应条件如下表所示：

反转录产物稀释十倍后，保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。

4.逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：

预扩增的反应条件如下表所示：

降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃冰箱以用于下一步的Real-time PCR反应。

5.将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-time PCR。

预扩增产物进行Real-time PCR按下表所示配制反应体系：

考虑到吸液损失而放量12.5％。

6.检测并比较对照组、处理组F3代睾丸样本中miRNAs表达谱的差异，筛选出有4倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果，选定其中7条成为候选并进行进一步在F3代以及F1代的睾丸组织中验证，具体为：rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-125a-3p、rho-miR-190a-5p、rho-miR-190b-5p、rho-miR-206-3p和rho-miR-542-3p。

三、Real-time PCR方法验证睾丸miRNAs表达量

1.设计3条目标miRNAs的引物：运用Stem-loop PCR方法设计引物。

2.加入荧光染料进行Real-time PCR反应。检测并比较对照组、处理组睾丸组织中miRNAs表达量的差异(处理和对照各12个样本)。

经验证有3条确认在F1代和F3代均具有显著差异，分别是：rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p(图2)。

因此，最终确认为存在差异表达的精子生成异常传代效应的miRNA包括rho-miR-1-3p(SEQ ID No.1)、rho-miR-124-3p(SEQ ID No.2)、rho-miR-190a-5p(SEQ ID No.3)具体引物见表1。其中，SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3在处理组中的表达水平都显著低于对照组。采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3这3个构成的组合可以将对照组、处理组区分开。虽然这3条单独也可以分开两组，但如果只用1条，可能会有重合，而如果同时使用3条，即使1条差异不大，但另外2条表达差异都很大，就可以将其带入评分高的组，即可诊断具有精子生成异常传代效应。

当对rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p这三个标志物的表达水平进行分层评分，能够对精子生成障碍的程度进行评估，表述为精子生成障碍程度，积分越高，发生精子生成障碍的风险越高。

表2 三条miRNAs得分并求和

注：每个miRNA按表达量的按高中低分为三个等级0、1、2，最低的0分，最高的2分，3条miRNA综合可以得分为0～6分，对rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p进行评分，进一步求得总得分，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这三个miRNAs低表达对精子生成状态的评估能力。ROC分析结果显示，rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p以88.6％的AUC(ROC曲线下面积)将正常对照组和DBP处理过的精子生成障碍组分开(图3)。而精子生成障碍传代组绝大多数得分很低(表达量都低)，而正常对照组绝大多数得分很高。

针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组，得低分的归入精子生成障碍传代组，得高分的归入对照组；比较而言，≥4算高分，≤3算低分)，对F3代结果验证，结果显示通过3个miRNA检测评分，F1代睾丸当中的miRNA的异常表达提示精子生成障碍可能传递给F3代，得到相同的精子生成障碍的表型。提示这几种miRNA可作为评估精子生成障碍传代效应风险的标志物。

四、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于精子生成障碍传代效应的动态监测的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定睾丸中稳定存在且可检测的成熟rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p的引物和工具。诊断试剂盒包括一批特异miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液等试剂。

该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于RT-PCR、Real-time PCR技术。首先通过miRNA芯片和Real-time PCR方法确定在F1以及F3代均发生改变的miRNA，作为预测是否发生精子生成障碍传代效应的指标。此试剂盒包括一批特异miRNA引物(表1)：rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p和U6的正反向引物，相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl₂、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要检测F1代的睾丸组织的miRNA标志物的变化趋势，通过该变化趋势能够简便的预测出精子生成障碍传代效应发生的可能性。

具体试剂盒组成如下：

引物是以下三对引物中三对：SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9各10μM 0.25μl。

试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×Eva Green，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。

试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(表1)。

或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl 10μM对应反向引物，10μl TaqMan通用PCR混合液，6.6μl H₂O。

试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于microRNA含量检测的相应试剂。

本发明人通过比较F1、F3代的精子生成障碍与正常对照的睾丸中差异miRNA，发现睾丸中存在可用于评估是否具有精子生成障碍传代效应的miRNA，提示具有较好的灵敏度。对其实际效果进行了验证，在F1代睾丸组织中检测到异常表达的miRNA，即在F3代睾丸组织中也能同时检测到这一组microRNA的异常表达，因此确定具有识别精子生成障碍传代效应的作用。在此过程中这一组microRNA的表达量均显著区别于正常对照组，因而提出了精子生成障碍传代效应的提示microRNA标志物组合，以及该microRNA标志物或其引物在制备诊断或监测试剂中的应用，研制出可便于诊断、监测试剂盒。

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Claims

1.microRNA标志物在制备大鼠精子生成障碍传代效应的诊断或监测试剂或试剂盒中的应用，该microRNA标志物选自rno-miR-1-3p、rno-miR-124-3p、rno-miR-190a-5p中的至少两种；rno-miR-1-3p的序列为SEQ ID No.1，rno-miR-124-3p的序列为SEQ ID No.2，rno-miR-190a-5p的序列为SEQ ID No.3。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该microRNA标志物由rno-miR-1-3p、rno-miR-124-3p和rno-miR-190a-5p组成。

3.microRNA标志物的引物在制备大鼠精子生成障碍传代效应的诊断或监测试剂或试剂盒中的应用，所述的microRNA标志物选自rno-miR-1-3p、rno-miR-124-3p、rno-miR-190a-5p中的至少两种，其中，

rno-miR-1-3p的上游引物为SEQ ID No.4，下游引物为SEQ ID No.5；

rno-miR-124-3p的上游引物为SEQ ID No.6，下游引物为SEQ ID No.7；

rno-miR-190a-5p的上游引物为SEQ ID No.8，下游引物为SEQ ID No.9。