JP2023508774A - 核酸ライブラリーの構築方法、およびその移植前胚染色体構造異常分析における使用 - Google Patents
核酸ライブラリーの構築方法、およびその移植前胚染色体構造異常分析における使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
ターゲットヒトサンプルのゲノムDNAを取得するステップと、
第1のエンドヌクレアーゼと第2のエンドヌクレアーゼの組合せを用いて前記ゲノムDNAを切断して高密度酵素切断産物を得るステップであって、前記第1のエンドヌクレアーゼと第2のエンドヌクレアーゼの組合せは、ヒトゲノム上の平均1Mbセグメント当たり、2000~5000の酵素切断部位を提供し、且つヒトゲノムの消化断片の両端に2~5ntの付着末端を生成することができるものであるステップと、
前記酵素切断産物とシーケンシングリンカーを連結して、連結産物を得るステップであって、前記シーケンシングリンカーは、前記第1のエンドヌクレアーゼの切断による付着末端と相補性の第1のリンカーと、前記第2のエンドヌクレアーゼの切断による付着末端と相補性の第2のリンカーと、を含むステップと、
前記連結産物から200bp~400bpの断片を選別して取得するステップと、
最後に、ハイスループットシーケンシングプラットホーム汎用プライマーを用いてPCR増幅を行って、シーケンシングライブラリーを得るステップと
を含む、核酸ライブラリーの構築方法。
染色体とは、細胞核を構成する基本的な物質であり、遺伝子の担体である。染色体構造異常とは、染色体または染色分体が断裂-再交換または互換メカニズムによって染色体異常(chromosome aberration)および染色分体異常(chromatid aberration)を発生することを指す。染色体相互転座は、最もよく見られる染色体構造異常であり、主に非相同染色体同士が互いに染色体断片を交換することを指す。
染色体均衡型転座保有者のいる家族(チップ検出結果により確認されたもの)を1組動員し、当該家族は補助生殖を受けた。家族情報を表3に示す。均衡型転座保有者、妻、および保有者へと均衡型転座が遺伝した親の末梢血サンプル(合計3つの血液サンプル)をそれぞれ5mL回収し、EDTA抗凝固採血チューブに保存した。同時に、当該夫婦の5つの胚生検サンプルの全ゲノム増幅後の生成物を取得した。家族ゲノムDNAは、全血抽出キットで抽出した。本発明に係る方法により、胚移植前染色体均衡型転座分析を行った。
胚サンプルに対してQIAGEN REPLI-g Single Cell KitまたはTaKaRa PicoPLEX Single Cell WGA kitで全ゲノム増幅を行った。500ngのDNAを用意して水を17μLまで添加した。表4に応じて酵素切断混合液Mix1を調製し、3μLの酵素切断混合液Mix1をサンプル添加し、ガンで均一に通気して混合し、短時間の遠心分離に付した。
本実施例は、華大のシーケンシングプラットホームの2つのリンカーを採用した。
リンカー1:5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTCATG-3’および5’-AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTC-3’
リンカー2:5’-GATCAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3’および5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’
水を100μLまで添加した後、AMPure XP磁気ビーズを60μL添加し、ガンで均一に通気して混合した。室温で5分間置いて、マグネットスタンドに置いた。液体が透明になったら、上澄みを新たなEPチューブに移し、AMPure XP磁気ビーズを20μL添加した。室温で5分間置いて、マグネットスタンドに置いた。液体が透明になったら、上澄みを除去した。200μLの80%アルコールで洗浄した。室温で乾燥させた後、22μLのLow TEで溶出した。
2μLのサンプルを抽出してQubit濃度測定を行った。
10ngの選別した断片に対してPCR増幅を行い、ライブラリーを得た。表10に応じてPCR反応混合液Mix4を調製した。
PCRプライマー:F: 5’-GAACGACATGGCTACGA-3’
R: 5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG(barcode) TTGTCTTCCTAAGACCGC-3’
反応が完了した後、短時間の遠心分離に付した。AMPure XP磁気ビーズを50μL添加し、ガンで均一に通気して混合した。室温で5分間置いて、マグネットスタンドに置いた。液体が透明になったら、上澄みを除去した。200μLの80%アルコールによる洗浄を1回繰り返し、室温で磁気ビーズを乾燥させ、40μLのLow TEで磁気ビーズを再懸濁し、DNAを溶出した。
2μLのサンプルを抽出してQubit濃度測定を行った。
次世代シーケンシングのために、リンカーのタイプに応じてプラットホームを選択した。本実施例では、華大のシーケンシングプラットホームでシーケンシングを行った。
シーケンシングによるシーケンシングデータのデータ分析を行い、参照ゲノムとの比較を行った。バリエーションの同定を通じてデータからSNPサイトを得た。遺伝マップを構築することにより、胚染色体の構造に異常があるか否かを判断して、均衡型転座保有者胚または正常な胚を区別する。
5M以上の欠失を検出することができると共に、指定の均衡型転座家族のうちの(ロシュ転座と相互転座)胚の遺伝の情況を検出することができる。
図3~7は、それぞれ5個の胚サンプルのPGT-A検出結果である。図8は、各胚の8番染色体の均衡型転座分析結果である。男性の母親を参照サンプルとして、マップにおけるハプロタイプ分析は、左から右の順に、男性、女性、参照サンプル(男性の母親)、5481101E胚、5481102E胚、5481103E胚、5481104E胚および5481105E胚である。図9は、各胚の14番染色体上の均衡型転座の分析結果である。男性の母親を参照サンプルとして、マップにおけるハプロタイプ分析は、左から右の順に、男性、女性、参照サンプル(男性の母親)、5481101E胚、5481102E胚、5481103E胚、5481104E胚および5481105E胚である。
染色体異数性を有する細胞株サンプル(5細胞)の詳細を表12に示した。MDA法による全ゲノム増幅を行った。
本比較例1では、SNP-アレイチップ(Karyomapping遺伝子チップ)技術を用いて実施例1の胚サンプルを検出した。
本実施例における方法は、エンドヌクレアーゼの組合せがそれぞれBfaIとTaqI、またはMboIとMspIであること以外は、実施例1と基本的に同様である。同様にデータ量が低い場合に十分なSNPサイトおよびindelサイトを取得することができ、遺伝マップを構築することにより、胚染色体の構造に異常があるか否かを判定して、均衡型転座保有者胚であるか、または正常な胚であるかを区別する。
本比較例2は、NspIとTaqIの組合せを用いてゲノムDNAに対して酵素切断を行う以外、他のステップは実施例1と同様である。
ターゲットヒトサンプルのゲノムDNAを取得するステップと、
第1のエンドヌクレアーゼと第2のエンドヌクレアーゼの組合せを用いて前記ゲノムDNAを切断して高密度酵素切断産物を得るステップであって、前記第1のエンドヌクレアーゼと第2のエンドヌクレアーゼの組合せは、ヒトゲノム上の平均1Mbセグメント当たり、2000~5000の酵素切断部位を提供し、且つヒトゲノムの消化断片の両端に2~5ntの付着末端を生成することができるものであるステップと、
前記酵素切断産物とシーケンシングリンカーを連結して、連結産物を得るステップであって、前記シーケンシングリンカーは、前記第1のエンドヌクレアーゼの切断による付着末端と相補性の第1のリンカーと、前記第2のエンドヌクレアーゼの切断による付着末端と相補性の第2のリンカーと、を含むステップと、
前記連結産物から200bp~400bpの断片を選別して取得するステップと、
最後に、ハイスループットシーケンシングプラットホーム汎用プライマーを用いてPCR増幅を行って、シーケンシングライブラリーを得るステップと
を含む、核酸ライブラリーの構築方法。
染色体とは、細胞核を構成する基本的な物質であり、遺伝子の担体である。染色体構造異常とは、染色体または染色分体が断裂-再交換または互換メカニズムによって染色体異常(chromosome aberration)および染色分体異常(chromatid aberration)を発生することを指す。染色体相互転座は、最もよく見られる染色体構造異常であり、主に非相同染色体同士が互いに染色体断片を交換することを指す。
染色体均衡型転座保有者のいる家族(チップ検出結果により確認されたもの)を1組動員し、当該家族は補助生殖を受けた。家族情報を表3に示す。均衡型転座保有者、妻、および保有者へと均衡型転座が遺伝した親の末梢血サンプル(合計3つの血液サンプル)をそれぞれ5mL回収し、EDTA抗凝固採血チューブに保存した。同時に、当該夫婦の5つの胚生検サンプルの全ゲノム増幅後の生成物を取得した。家族ゲノムDNAは、全血抽出キットで抽出した。本発明に係る方法により、胚移植前染色体均衡型転座分析を行った。
胚サンプルに対してQIAGEN REPLI-g Single Cell KitまたはTaKaRa PicoPLEX Single Cell WGA kitで全ゲノム増幅を行った。500ngのDNAを用意して水を17μLまで添加した。表4に応じて酵素切断混合液Mix1を調製し、3μLの酵素切断混合液Mix1をサンプル添加し、ガンで均一に通気して混合し、短時間の遠心分離に付した。
本実施例は、華大のシーケンシングプラットホームの2つのリンカーを採用した。
リンカー1:5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTCATG-3’および5’-AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTC-3’
リンカー2:5’-GATCAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3’および5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’
水を100μLまで添加した後、AMPure XP磁気ビーズを60μL添加し、ガンで均一に通気して混合した。室温で5分間置いて、マグネットスタンドに置いた。液体が透明になったら、上澄みを新たなEPチューブに移し、AMPure XP磁気ビーズを20μL添加した。室温で5分間置いて、マグネットスタンドに置いた。液体が透明になったら、上澄みを除去した。200μLの80%アルコールで洗浄した。室温で乾燥させた後、22μLのLow TEで溶出した。
2μLのサンプルを抽出してQubit濃度測定を行った。
10ngの選別した断片に対してPCR増幅を行い、ライブラリーを得た。表10に応じてPCR反応混合液Mix4を調製した。
PCRプライマー:F: 5’-GAACGACATGGCTACGA-3’
R: 5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG(barcode) TTGTCTTCCTAAGACCGC-3’
反応が完了した後、短時間の遠心分離に付した。AMPure XP磁気ビーズを50μL添加し、ガンで均一に通気して混合した。室温で5分間置いて、マグネットスタンドに置いた。液体が透明になったら、上澄みを除去した。200μLの80%アルコールによる洗浄を1回繰り返し、室温で磁気ビーズを乾燥させ、40μLのLow TEで磁気ビーズを再懸濁し、DNAを溶出した。
2μLのサンプルを抽出してQubit濃度測定を行った。
次世代シーケンシングのために、リンカーのタイプに応じてプラットホームを選択した。本実施例では、華大のシーケンシングプラットホームでシーケンシングを行った。
シーケンシングによるシーケンシングデータのデータ分析を行い、参照ゲノムとの比較を行った。バリエーションの同定を通じてデータからSNPサイトを得た。遺伝マップを構築することにより、胚染色体の構造に異常があるか否かを判断して、均衡型転座保有者胚または正常な胚を区別する。
5M以上の欠失を検出することができると共に、指定の均衡型転座家族のうちの(ロシュ転座と相互転座)胚の遺伝の情況を検出することができる。
図3~7は、それぞれ5個の胚サンプルのPGT-A検出結果である。図8は、各胚の8番染色体の均衡型転座分析結果である。男性の母親を参照サンプルとして、マップにおけるハプロタイプ分析は、左から右の順に、男性、女性、参照サンプル(男性の母親)、5481101E胚、5481102E胚、5481103E胚、5481104E胚および5481105E胚である。図9は、各胚の14番染色体上の均衡型転座の分析結果である。男性の母親を参照サンプルとして、マップにおけるハプロタイプ分析は、左から右の順に、男性、女性、参照サンプル(男性の母親)、5481101E胚、5481102E胚、5481103E胚、5481104E胚および5481105E胚である。
染色体異数性を有する細胞株サンプル(5細胞)の詳細を表12に示した。MDA法による全ゲノム増幅を行った。
本比較例1では、SNP-アレイチップ(Karyomapping遺伝子チップ)技術を用いて実施例1の胚サンプルを検出した。
本実施例における方法は、エンドヌクレアーゼの組合せがそれぞれBfaIとTaqI、またはMboIとMspIであること以外は、実施例1と基本的に同様である。同様にデータ量が低い場合に十分なSNPサイトおよびindelサイトを取得することができ、遺伝マップを構築することにより、胚染色体の構造に異常があるか否かを判定して、均衡型転座保有者胚であるか、または正常な胚であるかを区別する。
本比較例2は、NspIとTaqIの組合せを用いてゲノムDNAに対して酵素切断を行う以外、他のステップは実施例1と同様である。
配列番号2: リンカー
配列番号3: リンカー
配列番号4: リンカー
配列番号5: プライマー
配列番号6: プライマー
Claims (11)
- 標的となるヒトに由来するサンプルからゲノムDNAを取得するステップと、
第1のエンドヌクレアーゼと第2のエンドヌクレアーゼの組合せを用いて前記ゲノムDNAを切断して高密度酵素切断産物を得るステップであって、前記第1のエンドヌクレアーゼと第2のエンドヌクレアーゼの組合せは、ヒトゲノム上の平均1Mbセグメント当たり、2000~5000の酵素切断部位を生成し、酵素切断断片の両端に2~5ntの付着末端を生成することができるステップと、
前記酵素の切断産物とシーケンシングリンカーを連結して、連結産物を得るステップであって、前記シーケンシングリンカーは、前記第1のエンドヌクレアーゼの切断による付着末端と相補性の第1のリンカーと、前記第2のエンドヌクレアーゼの切断による付着末端と相補性の第2のリンカーと、を含むステップと、
前記連結産物から200bp~400bpの断片を選別して取得するステップと、
最後に、ハイスループットシーケンシングプラットホーム汎用プライマーを用いてPCR増幅を行って、シーケンシングライブラリーを得るステップと
を含む、ことを特徴とする核酸ライブラリーの構築方法。 - 前記第1のエンドヌクレアーゼと第2のエンドヌクレアーゼの組合せは、MboIとNspI、BfaIとTaqI、またはMboIとMspIである、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 前記第1のリンカーの配列は、配列番号1および配列番号2に示され、前記第2のリンカーの配列は、配列番号3および配列番号4に示されている、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 前記ハイスループットシーケンシングプラットホーム汎用プライマーは、前記第1のリンカーと相補性の上流プライマーと、前記第2のリンカーと相補性であり、且つbarcode配列を有する下流プライマーと、を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 前記上流プライマーの配列は、配列番号5に示され、前記下流プライマーの配列は、配列番号6に示されている、ことを特徴とする請求項4に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 前記切断するステップにおいて、前記第1のエンドヌクレアーゼと前記第2のエンドヌクレアーゼの体積比が1:(0.8~1.2)である、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 磁気ビーズ分取の方法を用いて前記連結産物から200bp~400bpの断片を選別して取得する、ことを特徴とする請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 前記ゲノムDNAを取得するステップは、卵割期または胚盤胞期まで発育した胚から細胞を取得し、細胞におけるDNAを全ゲノム増幅するステップを含む、ことを特徴とする請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 前記シーケンシングライブラリーの濃度を測定するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸ライブラリーの構築方法。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の核酸ライブラリーの構築方法を用いて、胚サンプルおよび前記胚サンプルのうちの少なくとも1種の親のシーケンシングライブラリーを構築した後、シーケンシングを行い、シーケンシング結果に基づいて前記胚サンプルの染色体を分析するステップを含む、簡略化ゲノムシーケンシングに基づく移植前胚染色体構造異常分析方法。
- 前記分析するステップは、具体的に、染色体構造異常の分析、および染色体異数性異常の分析を含む、ことを特徴とする請求項10に記載の移植前胚染色体構造異常分析方法。
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