CN1982477A - 测定核酸中的突变和/或大规模改变的方法及其应用 - Google Patents

测定核酸中的突变和/或大规模改变的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1982477A
CN1982477A CNA2006101657124A CN200610165712A CN1982477A CN 1982477 A CN1982477 A CN 1982477A CN A2006101657124 A CNA2006101657124 A CN A2006101657124A CN 200610165712 A CN200610165712 A CN 200610165712A CN 1982477 A CN1982477 A CN 1982477A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid fragment
sample
fragment
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006101657124A
Other languages
English (en)
Inventor
让－路易·维奥伊
克洛德·乌达耶
多米尼克·斯托帕－利奥内
热雷米·韦伯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
Original Assignee
Institut Curie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Curie filed Critical Institut Curie
Publication of CN1982477A publication Critical patent/CN1982477A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了测定核酸中的突变和/或大规模改变的方法及其应用。具体地说，本发明涉及用于检测涉及至少一个核酸片段的点突变和/或大规模改变的方法，所述方法至少包括以下步骤：提供易于含有所述核酸片段的样品和至少用作定量参照的第二核酸片段，使所述片段经受适当的条件以获得含有同源双链和可能的异源双链的产物，对所述产物实施分析方法，该分析方法适合于至少获得区分第一核酸片段的所存在双链形式的信号和关于所述第一核酸片段的相对定量数据。本发明还涉及所述方法在遗传性疾病和癌症的易感性的诊断以及在所述疾病和癌症(例如人乳腺癌)的诊断和预后中的应用。

Description

测定核酸中的突变和/或大规模改变的方法及其应用
背景技术
基因组学最近的发展已对促进人类健康和改进生物技术带来了非常大的希望。
在医学中，例如，对遗传性疾病和癌症的了解和诊断或对感染性生物的研究越来越依赖于DNA和核酸的分析。
生物技术也越来越依赖于分子遗传分析和核酸高通量分析。特别是对于法医调查、医学应用、生物技术和食品工业来说，个体间遗传差异作图变得越来越重要。
例如，检测导致异常蛋白的突变对于确定疾病的遗传来源而言可能是必须的。采用对DNA进行结构分析方法，可以在症状开始之前诊断出大量的遗传性病理状况。在癌症研究中，例如，现在正在大规模地查找被认为导致乳腺癌发展概率显著上升的BRCA1和BRCA2基因中的突变。还已知APC基因导致患结直肠癌的强易感性。对于很多可遗传的疾病，基因筛查还可以在早期进行，或者甚至在子宫中时就可以进行。目前，已经鉴定了700种遗传性疾病，其中有地中海贫血和肌病。
通过肿瘤的“遗传作图”而对获得性遗传病症(例如特别是在癌症中出现的病症)所进行的鉴定和详细分析为更有效和更个性化的治疗带来了希望。为了在药物基因组途径中找到新的治疗靶点，对突变和遗传变异性进行大规模的遗传筛查(也称为“基因分型”)对于确定疾病与基因间的相关性也是非常重要的。
遗传筛查还可以用于检测病原体，包括检定医学、食品工业、兽医学或生物恐怖应用中的特定病原性品种。例如，在食品工业中，越来越关注对起始原料或食品中的遗传修饰生物“GMO”所进行的检测。
涉及疾病机理的突变可以是点突变(单碱基取代或少量插入或一个或数十个碱基对的缺失)或染色体大重排。
因此，存在对以下方法的需求，该方法以准确、可重复和可靠的方式检测关于基因相对于非病理状态(野生型)的突变或鉴定基因的不同等位基因。
DNA分子是称为核苷酸的亚单元的线性聚合物。每个核苷酸包含共有的环状糖分子和不同的称为碱基的环状取代基中的一个，所述环状糖分子通过磷酸基团连接到邻近核苷酸的糖上。糖和碱基的组合称为核苷。在天然来源的DNA中常见的4个碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，下文分别称为A、G、C和T。个体的DNA中这些碱基的线性顺序就是其“基因组”。它包括带有用于合成蛋白的信息的编码区、用于调节基因表达的区域和其作用还未完全明了的所谓“非编码区”。
在双链DNA中，该形式为所有细胞生物的染色体中DNA所采用的形式，两条DNA链以精确的螺旋构型缠绕且碱基方向朝内，从而允许来自相对链的碱基间相互作用。两条链主要通过氢键以精确排列保持在一起，这通过特定碱基对的结构的互补性而在碱基之间得以进行。这种结构互补性由每个碱基上的取代基的化学性质和位置决定，特别是导致氢键的确切数目和取向。因此，在双链DNA中，通常是一条链上的每个A对来自相对链上的T具有相互吸引的作用力，其涉及两个氢键；而每个G与相对的C具有相互吸引的作用力，其涉及三个氢键。原则上它们确保了DNA分子得到复制，并且精确拷贝会在细胞繁殖的(有丝分裂)过程中传给子代细胞，或者当复制涉及配子体(减数分裂)时会传给个体的后代。
有时在复制过程中会发生不正确的碱基配对，这在新链进一步复制后会使双链DNA后代具有含有可遗传碱基差异的序列，所述可遗传碱基差异为例如与亲本DNA分子相比，一个或多个碱基的缺失、插入或取代。这种可遗传的变化称为基因突变，或者，在本案中更具体地为“点突变”。基因突变作图不仅包括检测含有基本上相同的(即同源的)碱基序列的DNA分子之间的序列差异，而且还包括对进行比较的分子序列的某些亚序列中的所述差异进行物理定位。DNA序列中的变异可能也会影响到非编码区。特别是诸如短串联重复(STR)或单核苷酸多态性(SNP)等高变异性可能会存在于非编码区中，并且在基因分型中是非常有用的。
对于点突变尤其是取代的检测是特别具有挑战性的，这是由于它们非常局部化，并且在很多情况下，它们的位置不能预先知道。实际上，对于很多与疾病有关的突变，突变的确切位置先前是不知道的，必须对基因的整个编码序列(通常代表数千或数万个碱基)进行彻底筛查。有时也会出现一些大规模的改变。最近的研究发现了一组由于长度在几千个碱基至数百万个碱基的特定基因组片段发生重排引起的疾病。由于重排一般涉及超过1千个碱基，基于标准PCR的技术不适合对这种突变进行检测。
目前，检测点突变最杰出的技术是测序和变性HPLC。
在“直接测序”途径中，对于每一位患者，都要对整个基因进行完全测序，这是一种有效但昂贵的方法。另外，由于存在杂合性，突变的患者序列是不“纯”的，因此对数据的解析不象常规测序那样简明。最为重要的是，这种方法费时而昂贵，这是因为对于每一位患者或个体，必须要对整个基因和侧翼区域进行完全测序以进行筛查。采用这种方法无法对基因或基因的一部分的缺失或重复进行检测。
“变性条件梯度中的色谱法”(DHPLC)是基于异源双链和同源双链的分离(Oefner PJ，Underhill PA，1995，Comparative DNA sequencing bydenaturing high-performance liquide chromatography(DHPLC)，Am.J.Hum.Genet.57：S：A266)。当采用PCR对包括基因位置的DNA片段进行扩增时，两类基因都得到了扩增。当对扩增的DNA进行变性并且然后缓慢复性时，可以得到4种不同类型的双链DNA，即：两条同源双链，即对应于两个初始等位基因(正常的等位基因和突变的等位基因)的DNA；和两条异源双链，即来自一个等位基因的一条链与来自另一个等位基因的(几乎)互补链混合。这些异源双链在突变位置含有错配“泡”。通过DHPLC可以查找这些错配“泡”。复性的(同源双链，以及当相关时，还有异源双链)DNA被吸附到HPLC柱上，且DNA的变性(对于异源双链来说出现稍早)导致DNA的释放和在柱的输出端的检测(例如参见Wagner，T.，Stoppa-Lyonnet，D.，Fleischmann，E.，Muhr，D.，Pages，S.，Sandberg，T.，Caux，V.，Moeslinger，R.，Langbauer，G.，Borg，A.，Oefner，P.，Genomics，1999，62，369-376)。然而，由于HPLC的顺序性(一次只能对一个样品进行分析)，因此在必须对大基因进行筛查时，DHPLC的整个过程非常长。而且，这种方法不能对大规模的改变进行检测。
用于检测点突变的其它方法例如单链构象多态性(SSCP)(Orita M，Iwahana H，Kanazawa H，Hayashi K，Sekiya T.1989，Detection ofpolymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strandconformation polymorphisms，Proc Natl Acad Sci U S A 86(8)：2766-70)、化学切割(Cotton RG，Rodrigues NR，Campbell RD，1988，Reactivity ofcytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine andosmium tetroxide and its application to the study of mutations，Proc NatlAcad Sci U S A 85(12)：4397-401)和直接测序也都不能对大重排进行检测。
对于大规模的改变，目前最杰出的技术基于多重半定量PCR。
PCR扩增可以分解为多个阶段。在第一阶段(dNTP和探针过量，DNA聚合酶活性高)中，扩增为指数级的，扩增速率接近于2n。之后扩增速率下降，新DNA的形成出现饱和，并到达平台期。为了保持PCR处于指数级部分，必须限制PCR的循环数，即，在非饱和条件下进行PCR。总而言之，DNA总含量遵循S形曲线。
如果将PCR的循环数限制在始终保持在所述S形的快速增长区域，则经过给定次数的扩增循环后，片段的最终拷贝数很大程度上取决于初始拷贝数。更具体地说，其与初始拷贝数大致呈比例。采用PCR可以同时扩增两个以上的DNA片段。这称为多重PCR。通过比较最终样品中所述两个片段的最终拷贝数，于是可以对初始DNA浓度进行相对定量。
通过比较至少两个预定峰之间的条带强度的比率，可以确定大重复或缺失的存在。实际上，普通患者具有两个正常拷贝的基因或基因的一部分，这会形成一定的比率。基因或基因的一部分发生缺失的患者只有一个正常拷贝的基因或基因的一部分，这将造成比正常患者低两倍的比率。最后，基因或基因的一部分发生重复的患者将具有3个正常拷贝的基因或基因的一部分，于是这将造成比普通患者高1.5倍的比率。如果存在基因的多个重复，该比例可大于1.5。
“多重连接依赖性探针扩增”(MLPA)(Schouten JP，McElgunn CJ，Waaijer R，Zwijnenburg D，Diepvens F，Pals G，2002，Relative quantificationof 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probeamplification，Nucleic Acids Res 30(12)：e57)是基于特异性DNA探针的半定量PCR。采用与两个相邻位点杂交的DNA探针对。一个探针具有大小依赖性序列，该序列不与DNA杂交并且取决于基因的研究部分。一个探针在其3’末端具有与PCR引物互补的特异序列。另外的探针在其5’末端具有与另一个PCR引物互补的特异序列。可以同时使用若干对探针。在探针杂交后，使用一种特殊的酶(即连接酶)以将两个相邻的探针连接。基因的一部分没有重复或缺失会导致形成两个连接的探针对。基因的一部分具有重复会导致形成三个连接的探针对。基因的一部分发生缺失会导致形成一个连接的探针对。然后采用单套引物(所有经连接的探针在其3’末端具有相同的PCR引物杂交序列，并且所有经连接的探针在其5’末端具有相同的PCR引物杂交序列)对探针进行扩增。然后采用凝胶电泳或毛细管电泳对扩增的片段进行分离，并且在同一个反应中可以对至多40个不同的DNA区域进行筛查。这种方法无法对点突变进行检测。
“短荧光片段的定量多重PCR”(QMPSF)(Casilli F，Di Rocco ZC，Gad S，Tournier I，Stoppa-Lyonnet D，Frebourg T，Tosi M，2002，Rapiddetection of novel BRCA1 rearrangements in high-risk breast-ovarian cancerfamilies using multiplex PCR of short fluorescent fragments，Hum Mutat20(3)：218-26)基于使用特异PCR引物以允许对超过10个DNA区域同时进行扩增。所有的正向引物在其3’末端都带有特异的延长序列。所有的反向引物在其5’末端都带有特异的延长序列。这些16个核苷酸的延长序列是非常罕见的序列，其不与所要研究的DNA互补。它们允许从第二个PCR循环起具有非常一致的退火温度。这些特异引物的使用减少了为获得一致的荧光峰水平而调节相对引物浓度所需付出的努力。这种方法可以对小插入和缺失进行检测。
这些方法对检测涉及整个基因的大规模改变或具有数十个至数千个碱基的正常DNA和突变DNA之间的序列差异是有效的。然而，它们没有提供有关点突变尤其是取代的信息。当怀疑患者或者更具普遍意义的生物带有突变时，先前并不知道所述突变涉及规模相对较大的突变还是局部突变。目前采用两种不同的方法来平行查找这两种类型的突变。这意味着重复付出并且费用增加。
用于检测大规模改变的其它方法，例如实时PCR或多重液相色谱法(MP/LC)(Dehainault C，Lauge A，Caux-Moncoutier V，Pages-Berhouet S，Doz F，Desjardins L，Couturier J，Gauthier-Villars M，Stoppa-Lyonnet D，Houdayer C，2004，Multiplex PCR/liquid chromatography assay for detectionof gene rearrangements：application to RB1 gene，Nucleic Acids Res32(18)：e139)也不能对单碱基取代进行检测，而且对于小插入和缺失来说也不可靠。
发明内容
因此，仍然需要简单而又非常特异的方法，该方法可以对诸如基因组DNA等核酸中象点突变和大规模改变一样不同的突变同时进行检测，并能够通过最少的操作者技能以及降低的成本量来快速、准确而容易地进行。
确切地说，本发明的目的是允许同时查找大规模突变和局部突变，从而简化和加快突变查找的努力。
更确切地说，本发明的目的是提出用于检测涉及至少一个核酸片段即所述“第一核酸片段”的点突变和/或大规模改变的方法，该方法至少包括以下步骤：
a/提供易于含有所述第一核酸片段的样品和至少第二核酸片段，所述第二核酸片段明显区别于所述第一核酸片段并用作定量参照，
b/使所述核酸片段变性，并在适合于获得含有同源双链和可能的异源双链的产物的条件下使它们退火，
c/对所述退火的产物实施分析方法，该分析方法适合于至少获得区分所述第一核酸片段的所存在双链形式的信号和通过比较所述第一核酸片段的信号强度与由所述第二参照核酸片段获得的信号强度而获得的关于所述第一核酸片段的相对定量数据，和
d/将步骤c)中获得的相对定量数据与预测的其中不存在大规模改变的第一核酸片段的相对定量数据对照进行比较。
如果第一核酸片段以至少两种具有不同序列的形式存在于所述样品中，则就可能会在步骤b)获得所述可能的异源双链。
在第一实施方式中，根据本发明的方法可以包括至少附加步骤e)，该步骤e)涉及对从步骤c)中获得的第一核酸片段的信号的形状进行分析。
所述附加分析步骤可以通过将来自第一核酸片段的信号形状和通过对相当于所述第一核酸片段的非突变形式的所述第一核酸片段形式施加步骤a)至c)所获得的信号形状进行比较来实施。
根据一个实施方式，所述第一核酸片段和所述第二参照核酸片段可以通过对含有DNA的样品使用限制性酶而获得。
在另一个实施方式中，所述第一核酸片段和所述第二参照核酸片段可以通过核酸扩增方法获得。核酸扩增方法可以是例如NASBA、滚环扩增(RCA)或聚合链式反应(PCR)。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及诊断癌症易感性的方法，该方法包括根据本发明的方法。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及诊断癌症的方法，该方法包括根据本发明的方法。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及诊断遗传性疾病的方法，该方法包括根据本发明的方法。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及发现新的治疗靶点或者筛查疗法效力的方法，该方法包括根据本发明的方法。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及发现用于疾病或病理状况的新的生物标记的方法，该方法包括根据本发明的方法。
定义
根据本发明：
-“核酸”的表述旨在包括任何合成的或天然的DNA、RNA、诸如PNA(肽核酸)、LNA、巯化DNA等核酸类似物，等等。
-“核酸片段”的表述是指包含(包括在内地)在两个预定侧翼序列之间的一段核酸。通常，本发明中的核酸片段的长度可为50bp～50000bp，优选为100bp～1000bp。如果核酸片段A包含在相同的两条侧翼序列之间，那么就说核酸片段A“相当”于核酸片段B，但是核酸片段A可以具有与核酸片段B相同或不同的序列。
-“侧翼序列”的表述是指生物或个体的基因组上的一对序列，其确定了该基因组中的序列的两侧。可以在本发明中使用的最常见的侧翼序列可以是一对引物序列。更具体地说，侧翼序列可以是具有预定序列、能够与单链核酸杂交并且在存在核苷酸和聚合酶时放入能够在所述单链核酸上启动复制的寡核苷酸。侧翼序列对的另一个例子可以由DNA分子上两个不同且连续的限制位点的序列给出，在所述限制位点，限制酶会对DNA进行切割。使用限制酶作为侧翼序列(与PCR引物对相对)可以具有避免需要扩增DNA的优势，
-“引物序列对”的表述是指能够与DNA的两条互补链杂交并通过聚合酶链式反应引起扩增的一对引物序列，
-“信号”一词是指对应于分布图数据中的一个核酸片段的峰或所有的峰，所述分布图数据获自对由本发明所述方法的步骤c)、d)和/或e)获得的退火产物实施的分析方法，
-“信号强度”的表述是指对应于给定的峰或信号的物质的量的定量测定，
-“核酸扩增”的表述是指能够在样品中产生包含在两个预定序列之间的至少一个核酸片段的多个拷贝的任何方法。优选在最终产物中产生的拷贝数目为样品中初始存在的拷贝数目的函数。
-“第一核酸片段”一词是指样品中的多个核酸片段中的任意一个，人们在查找关于其的突变。因此采用“第一”作为一般表述来区分对其查找所述突变的片段与同一样品中用作参照的“第二”核酸片段，
-“相当于第一核酸片段的非突变形式的形式”的表述旨在包括所述第一核酸片段的任意非突变的野生型形式，包括具有多态性(即在本发明的意义(即涉及疾病机理)中没有任何突变)的形式。
附图说明
图1显示实施例1获得的不同峰的面积测定的毛细管到毛细管重复性。
图2显示实施例2中在5个连续运行操作(run)上的不同峰的平均归一化面积测定的连续运行重复性。
图3显示对应于实施例3中所述的M1BC1-A和M1BC1-B的分离的两个叠加电泳图。
图4显示对应于实施例4中所述的M1BC1-A和M1BC1-C的分离的两个叠加电泳图。
图5显示实施例5中所述的片段M1BC1-A、M1BC1-B和M1BC1-C的归一化面积的分散情况。
具体实施方式
本发明的方法由于可以在单个运行操作中以及对相同的第一核酸片段进行两种不同的分析，因而是特别有利的。
此外，本发明不限于在单个运行操作中在单个第一核酸片段上查找点突变和大规模改变。
其可在单个运行操作的分离方法中应用于包含数个“第一核酸片段”的样品。
实际上，根据本发明的方法可以有效地应用于检测涉及多于1个，特别是多于2个，尤其是多于5个，更特别的是在大量不同的核酸片段(属于相同基因或不同基因的称为“第一核酸片段”)的点突变和/或大规模改变。
因此，本发明可以提供通过分析方法的一步单一分离步骤之后，在若干个核酸片段上进行所述查找的有利可能性。本发明的这种有利实施方式在下文中称为“多重化”。
在本发明中，当一个样品中存在数个“第一”核酸片段时，这些核酸片段必须是可以区分的。
如上所述，两种分析中的一种分析可以涉及点突变的检测。
更具体地说，样品中导致异源双链的不同等位基因的存在可以用于确定点突变存在的目的中。这可以是识别在形成异源双链的片段上存在包括单一取代在内的突变的方法。这意味着样品可以含有同时为突变形式和非突变形式的核酸片段。
例如，如果获得样品的生物体为杂合子，并包含至少一个拷贝的突变基因和至少一个拷贝的相应正常基因，则可以在退火过程中自然形成异源双链，而无需添加任何其它的核酸。这种情况是非常普遍的，并且可以响应例如对于所查找的突变来说患者是杂合的所有情况，这如同作为例子(非排他性地)举出的BRCA1或BRCA2基因上的突变(容易患乳腺癌)的情况所发生的那样。
如果待筛查的生物体、组织、或者更普遍意义上的生物材料为突变的杂合子，则通过向样品中加入已知在所考虑的片段中没有突变的参照核酸，仍然可以获得作为突变标志的异源双链。在这种情况中，优选对对应于加入到样品中的非突变参照片段的核酸的量进行调节，以使得非突变参照片段的拷贝数为所考虑的片段的拷贝数的0.1倍～10倍，优选0.5倍～2倍，进而更优选等于所考虑的片段的拷贝数。
值得注意的是，相对于例如直接测序或DHPLC，本发明的一个优点是对正常核酸和突变核酸的浓度差异的敏感性较低。因此增加了程序的鲁棒性。通常，本发明方法可以检测浓度低至10％以下或者高至90％以上的突变片段的存在。
有利的是，通过分析步骤c)中获得的第一核酸片段的信号的形状，也可以检测点突变的存在。
更具体地说，所述分析可以通过比较由所述第一核酸片段所得的信号的形状和相当于所述第一核酸片段的非突变形式的第一片段形式所获得的信号的形状来进行，并且如下文更精确地公开那样，所述第一核酸片段的非突变形式已经在类似的分析条件中获得。
在一个优选的实施方式中，通过在相同运行操作中将具有不同长度的片段组合，可以实现多重化。由于同源双链和异源双链通常具有相近的迁移率，因此通过混合相互间的具有足够尺寸差异并且足以与第二参照核酸片段区分开的第一核酸片段，可以在单个运行操作中分离和鉴定同源双链和异源双链的多个组合。
涉及例如缺失和/或重复等大规模改变的检测的其它方法基于定量分析方法和第一核酸片段和参照核酸片段的组合分析应用，所述参照核酸片段也称为第二核酸片段并且明显区别于第一核酸片段。这一方法包括：首先，通过参考所述参照核酸片段来评估有关第一核酸片段的定量数据；其次，比较所获得的相对定量数据和在相同的分析条件下针对其中不存在涉及所述第一核酸片段的大规模突变的第一核酸片段所预期的定量数据。
对于参照核酸片段，该片段必须区别于欲分析的第一核酸片段。
根据一个实施方式，第二核酸片段和一些或所有的第一核酸片段可以至少在它们各自的长度上具有区别。特别是它们的区别可以是至少1个碱基，尤其是至少3个碱基，尤其是至少5个碱基，尤其是至少10个碱基，尤其是至少15个碱基，尤其是至少20个碱基，尤其是至少30个碱基，进而尤其是至少100个碱基。
在所有情况中，第一核酸片段和第二核酸片段在样品中必须可以区分。通常，如果分析方法是电泳，则片段大小差异因子必须为10bp～100bp，优选为20bp～100bp。然而，如果分析方法是质谱法，则由于该方法具有较高的分辨率，片段大小差异因子为2bp～100bp可以是足够的。
如后文所详述，当进行多重化时，所述第一核酸片段之间的差异可以采用类似的长度差异。
由于技术人员所理解的技术原因，长度差异可以不超过1000个碱基。
根据第二实施方式，第二核酸片段和一些或所有的第一核酸片段可以通过至少独特的标记而使它们相互之间能够区分开。所述标记可以是荧光标记或者同位素标记，并且可以是例如荧光标记或同位素标记的引物。
在一个实施方式(该实施方式可以与前述实施方式组合)中，可以使用例如采用不同荧光标记引物的PCR，通过制备携带有具有不同波长荧光的标签的不同样品来进行多重化。可以在单个反应中对不同样品进行扩增，并且可以在单个电泳运行操作中对该混合物进行分析。设计用于DNA测序或片段分析的诸如ABI310、3100、3700或Amersham“Megabace”等多个毛细管电泳机器可以对具有不同荧光发射波长的产物进行同时分析。
如果分析方法为色谱法，也可以使用不同荧光标签。如果分析方法为质谱法，可以使用通过不同同位素的标签进行标记。
当然，可以将所提出的用于区分第一核酸片段和第二核酸片段的前述实施方式(即通过相应长度或独特标记)组合。
第二参照核酸片段可以天然存在于样品中，尤其是存在于容易含有欲分析的第一核酸片段的生物样品中。当然，为了符合将其区别于欲分析的片段的前述要求，可以对其进行选择。
根据一个实施方式，第二参照核酸片段和第一核酸片段可以来自两个不同的基因。
根据一个实施方式，第二参照核酸片段和第一核酸片段可以来自相同的基因。
根据另一个实施方式，可以将参照核酸片段加入到易于含有所述第一核酸片段的样品中。在这种情况中，可以相对于样品中存在的核酸总量将其以预定量加入。
例如，为了便于定量比较来自所述第一核酸片段的信号和来自所述第二参照核酸片段的信号，可以优选这两种信号没有差异过大的幅度。例如，可以适当地使来自第二核酸参照片段的信号可以是来自所考虑的所述第一核酸的信号的0.1倍～10倍，优选为0.5倍～2倍。为了实现这一方面，可以例如通过在264nm的光密度，测定初始样品中核酸总量的总浓度c(例如为g/l)。
对于作为单拷贝而存在于基因组中的序列(对于编码序列，通常是这种情况)，每升样品中的所述序列的拷贝数可以等于总核酸浓度c除以该生物体基因组的总分子量。于是可以容易地提供相当浓度的第二参照核酸片段。进行如此操作的一个特别简单方式是，可以通过与所述第一核酸片段进行共扩增来提供第二参照核酸片段，已知该第二核酸片段没有遗传改变。
使用这样的第二参照核酸片段，可以获得存在于分析样品中的第一核酸片段的第一相对定量数据。通过比较所述第一相对定量数据和相对定量数据对照，可以获得关于所分析的第一核酸片段可能存在大规模改变的结论，所述相对定量数据对照是针对在代表用于分析相应第一核酸片段的步骤a)至d)中的选定条件的分析条件下没有存在大规模改变的第一核酸片段而获得的。
可以通过在对照样品即含有其中不存在大规模改变的第一核酸片段的对照样品和相同的第二参照核酸片段上只重复至少步骤a)至d)而与待分析样品的相对定量数据同时获得或不同时获得所述相对定量数据对照。所述对照分析可以与样品分析同时进行，但是这并不是必须的。
实际上，本发明的重要优点可以在于，在不同的实验之间，可以重复获得相对于第二参照核酸片段内标(与相对于所述第一核酸的浓度比率存在于样品中)的相对定量数据。
因此，可以在分开的运行操作中获得相对定量数据对照，条件是在所述分开的运行操作中所分析的样品同时含有第一核酸片段和第二参照核酸片段，并且所述第一核酸片段和所述第二核酸片段的浓度比率在待分析样品和对照样品中相同。
相对定量数据对照可以通过严格再现应用于分析相应样品的步骤a)至d)中所限定的本发明方法的条件来获得。然而，也可以由等价条件或不同条件获得，其前提是根据所述等价条件或不同条件使应用于分析相应样品的步骤a)至d)中所限定的方法的条件可以得以外推。
在一个实施方式中，相对数据对照可以是来自所述第一核酸片段的信号的强度与来自所述第二参照核酸片段的信号的强度的比率。
通常，在相同的样品中，对于数个第一核酸片段可以使用一个单个第二核酸片段作为参照。
然而，在一些情况中，可以使用数个第二核酸片段。
另外，在一些情况中，“第一”核酸片段可以用作其它第一核酸片段的参照，前提是用作参照的所述第一核酸片段不易包括大规模改变，或者，存在与野生型相同的拷贝数。
例如在类似条件下分离来自不同患者的多个样品时，可以获得该具体实施方式，这是由于在群体中一个特定突变的发生概率非常低。于是，样品之间的信号强度间大多数定量比率是不变的，并且罕见的异常可以容易地被鉴定为大规模突变的标志。
通常，本发明方法可以在浓度低至1％或者高至99％的突变片段中检测到大规模改变的存在。
分析方法
在根据本发明的方法中使用的分析方法可以是能够区分两条双链DNA分子的任何方法，作为它们长度的函数，作为它们构象的函数，或者优选同时作为长度函数和构象函数。
根据一个实施方式，适合本发明的分离分析方法可以是电泳法、色谱法或质谱法。
电泳由于在大小和构象辨别中其使用方便、具有定量特性并且分辨率高，因而其是本发明特别适合的方法。
“芯片实验室”中的分离(也称为微流体系统)也是非常有潜力的。
然而，分析方法也可以是质谱(MS)法。在Laken SJ，Jackson PE，Kinzler KW，Vogelstein B，Strickland PT，Groopman JD，Friesen MD的Genotyping by mass spectrometric analysis of short DNA fragments.NatBiotechnol 16(13)：1352-6(1998)中已经提出通过质谱法进行点突变的检测。但是没有提出通过MS进行点突变和大规模改变的联合测定。如果将MS用作分析方法，可以有利地使用比色谱法或电泳法更小的核酸片段，通常为30bp～500bp，更优选为50bp～250bp。
在本发明的一个优选的实施方式中，分析方法可以是电泳分析，尤其是包括使用分离介质的电泳分析。
更具体地说，可以通过毛细管电泳或多毛细管电泳(例如在微通道中)对具有错配的核酸，尤其是异源双链进行检测。
可以在非变性条件下进行本发明方法的步骤c)的分析方法。
对于毛细管电泳或在微通道中的多毛细管电泳，本发明会特别有利，其原因如下。
其可以显著改进电泳分析的灵敏度，尤其是对于难以检测的诸如取代等错配。
其可以使分离明显快于测序法。
其可以采用不同的方式进行多重化，因而进一步增加了通量。
称为“电泳异源双链分析”的方法(EHDA)通过在非变性条件下直接测定由异源双链对中出现的错配有关的“变性泡”或“环”引起的迁移率上的差异。
当在非变性条件下通过电泳对样品进行分离时，异源双链分子上的局部“错配泡”的存在会造成双链的柔性几何学差异，这会造成相对于同源双链的迁移率差异。如果欲分析的核酸片段存在正常的双链片段和突变片段(即，如果对于相应的DNA片段，用以提取DNA的生物体是杂合子)，电泳图中就会出现峰的多重性(2～4个)。在本发明的意义上，这些不同的峰对应于相同的片段，即它们被相同的侧翼序列所限定。
EHDA方法的功效主要取决于检测因存在错配泡所造成的迁移速度的微小差异的能力。
可以使用不同类型的电泳(平板凝胶电泳、毛细管电泳、多毛细管电泳或多通道电泳)。对于高通量自动化筛查，多毛细管电泳可以尤为有利。
在一个实施方式中，通过在同一运行操作中组合具有不同长度的片段，可以实现多重化。由于同源双链和异源双链通常具有相近的迁移率，通过混合大小具有足够差异的片段，可以在单个运行操作中对同源双链和异源双链的数个组合进行分离和鉴定。通常，片段的大小差异因素必须为10bp～100bp，优选为20bp～100bp。
通过进行不同样品的多次顺次注入，可以实现多重化。其原理与分离不同大小片段的原理相同：其可以利用以下事实，即，与例如测序不同的是，单个片段的电泳分析可只利用电泳所提供的分离窗的非常有限的部分，因此可以适当地改变起始时间而在单个运行操作中对数个样品进行分离。
在另一个实施方式中，可以在本发明所描述的组合物的存在下，通过DGGE对异源双链片段进行分离，或者在同种类型的组合物的存在下，通过DHPLC对异源双链片段进行分离。
分离介质
可以将不同类型的分离介质或基质用于根据本发明的分离。
实际上，可以使用能够根据大小对核酸进行分离的任何基质或分离介质。对于平板凝胶电泳，最有用的基质可以是聚丙烯酰胺凝胶，但是可以使用其它基质，例如以下以非穷尽方式列举的例子：琼脂糖或者在例如Andrews，A.T.，1986，的Electrophoresis：Theory，Techniques andBiochemical and Clinical Applications，(Clarenton，Oxford)；Righetti，P.G.，1989，J.of Biochem.Biophys.Methods 19，1-20中综述的其它基质。
根据一个实施方式，适用于本发明的分离介质可以是缠结聚合物溶液。
对于毛细管电泳，可以使用所有的分离介质。所述介质的非穷尽性例子在以下文献中引用：Barbier V，Viovy JL.，2003，Advanced polymers forDNA separation，Curr Opin Biotechnol 14(1)：51-7；Righetti，P.G.和C.Gelfi.1997，Analysis of Nucleic Acids by Capillary Electrophoresis，C.Heller编，Chromatographia，CE系列1，(Vieweg，Wiesbaden)，255-271页。
同时，可以使用一些具有筛分性质的一些非聚合物基质或分离介质(参见例如Rill，R.，T.Liu，B.R.Locke和D.H.Van Winkle，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1534-1539)。
对于分离性能，并因而对于本发明的最优操作，然而可能重要的是具有对大小差异有最高区别能力的基质，同时具有对异源双链和同源双链的最高区别能力的基质是优先选择的。
根据一个实施方式，根据本发明的分离介质可以包含丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺或丙烯酰胺衍生物的交联或非交联聚合物。
基于在例如授予Madabhushi等的US5,567,292所述的PDMA(聚二甲基丙烯酰胺)的筛分基质特别是在本发明范围内令人感兴趣的。
例如，方便用于本发明的聚合物可以包括但不限于N，N-二取代的聚丙烯酰胺、N-单取代的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮等。聚丙烯酰胺的示例性取代基包括C1～C12烷基；卤素取代的C1～C12烷基；甲氧基取代的C1～C12烷基；羟基取代的C1～C12烷基等。
本领域技术人员公知的线性丙烯酰胺可以是用于DNA电泳的筛分聚合物。
根据一个实施方式，适于本发明的分离介质可以包含丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的嵌段共聚物。
所述聚合物可以是具有丙烯酰胺骨架和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)侧链的嵌段共聚物，或者更常见的情况是，例如在Barbier等的法国专利申请00/0856中所引用的那些嵌段共聚物类型等嵌段共聚物类型。
根据本发明方法的步骤e)的分析方法可以有利地在非变性条件中应用。
然而，在本发明的分离介质中，可以包括诸如变性剂等附加组分，例如用于防止多核苷酸中形成双链或二级结构的变性剂。
变性剂可以包括甲酰胺(例如1％～90％)、脲(例如0.1M～8M)、市售或非市售的诸如吡咯烷酮等内酰胺，等等。它们在电泳中的使用指南可以在公知的分子生物学参考书，例如在Sambrook等的MolecularCloning：A Laboratory Manual第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，纽约，1989)中找到。
核苷酸碱基-配对化合物
根据一个实施方式，根据本发明的分离介质还可以包含至少一种能够与尤其是参与错配的核苷酸发生特定碱基配对相互作用的化合物。
所述化合物可以含有一个单碱基配对单元，“碱基配对单元”是指能够与碱基A、T、G、U或C之一发生一个碱基配对相互作用的分子基团。
所述化合物可以单独使用，或者与一种或多种能够与参与异源双链错配的核酸的碱基发生特定碱基配对相互作用的其它化合物混合使用。
根据一个实施方式，所述化合物可以以相对于分离介质为至少1g/l，优选为至少10g/l，最优选为至少25g/l的组合浓度使用，所述分离介质用于使所述一种或多种化合物与欲分析突变的核酸接触。
对于“组合浓度”应该将其理解为所述化合物的总浓度，例如，在使用多种类型的化合物的情况中，组合浓度为每种化合物的浓度的总和。所述化合物的浓度以相对于含有欲分析的核酸的介质的总体积来表示。
根据一个实施方式，所述化合物可以选自由具有长度为少于5个核苷酸，优选少于3个核苷酸，更优选为少于2个核苷酸的寡核苷酸、核苷、碱基或它们的混合物组成的组。
所述化合物的非限制性例子为：
-碱基，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T)，
-具有各种取代基的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，所述取代基尤其是具有对负责未取代的碱基中的碱基配对相互作用的氨基和OH没有影响的取代基，
-与碱基A、T、G、C、U形成的核苷，
-与碱基A、T、G、C、U形成的核苷酸，
-寡核苷酸类似物和各种具有取代基的寡核苷酸，和
-它们的混合物。
根据一个实施方式，所述化合物可以在核苷，即腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和胸苷以及它们的混合物中选择。
例如，根据本发明的方法可以有利地使用胞苷和胸苷，或者胞苷和腺苷，或者鸟苷和胸苷，或者鸟苷和腺苷，但是不使用例如胸苷和腺苷，或者胞苷和鸟苷。
信号
如上所述，可以通过比较从待分析的第一核酸片段、第二参照核酸片段、不存在涉及所述第一核酸片段的大规模突变的第一核酸片段形式、以及相当于所述第一核酸片段的非突变形式的第一核酸片段形式发出的信号的强度和/或形状而进行分析。
信号形状可以通过信号峰数量、信号宽度、或者信号峰数量和信号的宽度来表征。没有突变的片段通常形成单峰。通过比较片段的信号形状和对照样品的信号形状，可以确定突变的存在与否。形状差异可以是峰数量的差异(峰的最大数应该为4，对应于两条同源双链和两条异源双链)。还可以将峰拖肩或峰变宽认为是突变存在的标志。通过操作者的目测或者通过使用特定的曲线分析软件可确定这种形状差异(使用曲线分析软件例如Peakfit、OriginPro(Originlab)或者Igor(Wavemetrics)可以容易地进行峰多重性和峰变宽的比较)。
然而，优选采用以下专门的自动化软件进行分析，所述自动化软件能够以完全自动的方式对信号中的峰数量、信号变宽进行分析，并且可以将结果，尤其是样品信号宽度和参照信号的信号宽度的比率，与预定的值进行比较。
相反，可以通过比较信号的经归一化的峰强度(或面积)与不具有任何大规模改变的对照样品的信号的相应经归一化的峰强度(或面积)来检测大规模改变的存在。可以通过存在于多重体(multiplex)中的内标(来自不同于感兴趣的基因的DNA区域的片段)的峰强度(或面积)或者通过在分离过程中样品中存在的感兴趣的基因的其它片段的峰强度(或面积)来对峰强度(或面积)进行归一化。
比第一核酸片段对照的峰强度(或面积)大至少1.2倍，优选至少1.35倍的峰强度(或面积)可以作为存在重复的标志。
为非突变的第一核酸片段对照的峰强度(或面积)的0.5(±0.3)倍，至多为0.8倍，优选至多0.7倍的峰强度(或面积)可以作为存在缺失的标志。
可以通过操作者的目测或者使用特定的曲线分析软件来确定这些峰强度(或面积)差异。
“峰强度或信号强度”是指物质的量对应于给定峰或信号的定量测定。测定峰强度的典型方法是测定相对于基线的最大高度或者信号后的积分面积。
特别是如果信号含有多个峰时，优选采用积分面积来测定强度。
在本发明中，可以使用不同的常用数据处理方法，以提高信号幅度和信号形状分析的可靠性。所述方法可以非穷尽地包括基线扣除法、降噪法、以预定峰形对峰进行拟合的方法和假峰消除法等。
点突变
根据本发明，可检测的点突变包括缺失突变、插入突变和其中出现不正确的碱基配对的取代突变。缺失突变和插入突变由于其影响遗传密码翻译为蛋白质，因此也称为“移码”突变。
如果在双链形式中配对的核酸的两条同源链之间的差异由单核苷酸差异或小插入或缺失组成，那么可以形成错配的双链。根据本发明的方法可对检测错配的双链特别有效。
更具体地说，根据本发明的方法可对于筛查具有与以下基因有关的的核酸序列的DNA片段特别有用，在所述基因上，点突变已经与或推测与疾病或增加的疾病易感性有关。所述疾病可以是不同类型的癌症、遗传性疾病或增加的疾病易感性，例如作为例子的地中海贫血、心血管疾病、肌病、癌症和更普遍的遗传性遗传疾病。与基因有关的、在人群中流行的所述疾病的非穷尽名单在下表中作为例子给出。该名单绝不应认为是对本发明范围的限定，在此提出只是为了明确本发明在人类健康中的应用范围是非常广大的，并且随遗传学的进步而不断扩大。
与增加的癌症疾病易感性有关的基因(其诊断可以构成本发明应用的优选范围)的非限制性名单
易感性   有关的推测突变基因     突变携带者在普通人群中的频率 突变携带者在癌症患者中的频率
乳房、卵巢   BRCA1、BRCA2     1/500 1/30
结肠、内膜(endometer)(HNPCC综合征)   hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2、TGFβ     1/500 1/20
黑素瘤   CDKN2A、CDK4     1/500 1/20
肾   c-MET     1/5000～10000 1/20
胃(HNPCC除外)   CDH1     1/10000～20000 1/100～200
结肠   APC     1/8000 1/100
错构瘤病
VHL   VHL     1/40000
NF2   NF2     1/30000
Peutz-Jegherz   LKB1     1/50000～100000
格林综合征   PTCH     1/50000～100000
Cowden、Banayan-Zonana综合征   PTEN     1/50000～100000
NF1   NF1     1/3000
Bourneville硬化   TSC1、TSC2     1/10000～15000
多发性内分泌腺瘤
I型   MEN1     1/30000～40000
II型   Ret     1/30000～40000 1/10～20
卡奈综合征   PRKAR1A     1/50000～80000
DNA断裂有关的疾病
共济失调-毛细血管扩张症   ATM     1/40000～300000
范康尼病   6个有关基因     1/350000
Bloom病   BLM     1/1000000
着色性干皮病   8个有关基因     1/500000～1000000
维尔纳病(Werner disease)   WRN     1/300000～1000000
特别是，根据本发明的方法对人类乳腺癌易感基因(BRCA)例如BRCA1和BRCA2等的突变筛查特别有用。
根据本发明的方法可以检测野生型BRCA1或BRCA2基因座的改变。此外，该方法可以通过检测野生型BRCA1或BRCA2基因座并由此确定在BRCA1或BRCA2基因座缺乏对癌症的易感性来进行。
大规模改变
根据本发明，该术语旨在包括比点突变大的突变，影响到多个碱基对，其可以在于缺失或重复。
特别是，有些大规模改变可能由于复制系统在重复DNA区域“打滑”而导致大小不同的插入或缺失来引起。
本发明通常对大规模改变的检测特别有用，所述大规模改变可能导致基因组上存在核酸片段的数个可扩增拷贝，或者相反，导致核酸片段扩增的缺失。所述大规模改变通常可以涉及非常多样的核酸长度，有时小到10bp或者几十个kb，但是更为普遍的是数百bp或数千个bp。
如例如，大规模改变的范围可从10bp至10kbp，或者至20kbp、30kbp或40kbp，例如，其范围可从100bp至10kbp，或者例如从200bp至5000bp，或者例如从500bp至1000bp。
如例如，大规模改变的范围可从100bp至1000bp。
有时它们甚至可涉及整个基因，因此包括几个Mbp。
核酸扩增方法
根据一个实施方式，根据本发明的方法可以包括附加步骤，所述步骤f)：至少包括在非饱和条件下进行第一核酸片段和第二参照核酸片段的扩增，更具体地说是半定量扩增，所述步骤f)在步骤b)之前进行。
最常见的核酸扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)，并且该方法可能是用于实施本发明的附加步骤f)的优选方法。
可以使用任意的线性或对数扩增方法，包括但不限于连接酶链式反应、聚合酶链式反应(PCR、RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应))和诸如滚环扩增(RCA)或基于核酸序列的扩增(NASBA)等技术。
聚合酶链式反应(PCR、RT-PCR)可以特别方便地用于本发明。
扩增可以在非饱和扩增条件下进行。
在本发明中，“非饱和扩增条件”的表述是指选择扩增循环数，或者更普遍的是扩增条件，使得扩增产物中的核酸片段的最终拷贝数以显著而可重复的方式取决于样品中的初始拷贝数。如果扩增方法为PCR，要特别选择循环数而使之在“指数区域”内，其中最终拷贝数大致成如下比例：
C最终＝C初始×2n
其中n为PCR循环数，C最终和C初始分别为给定核酸片段的最终拷贝数和初始拷贝数。
扩增也可以在“线性区域”内进行，这对应于围绕扩增曲线(拷贝数相对于循环数)的S形状的拐点的区域。
对于给定的样品，本领域技术人员知道如何确定以下条件的不同方式，所述条件适合于满足使最终拷贝数取决于初始拷贝数的条件。
对于给定大小的基因组，确定所述条件的简单方式可以是对样品进行稀释，以使在初始样品具有给定的核酸浓度。
例如，如以下实施例将更详细描述的那样，对于人类诊断，并因而对于包括人类基因组DNA的样品，100ng的初始DNA量是适合的。对于所述浓度，25个PCR循环数是适合的。
如果样品中的DNA量不同于如上所述，也可以根据这一规律通过简单的公式来进行推断。
通常，可以采用以下公式：
n最优的＝2500/x
其中x为样品中的DNA量，以ng表示。
这一公式对于10μl的体积是有效的。对于不同扩增条件的不同的样品体积、不同的基因组，本领域的技术人员可以确定不同的等价公式。
例如，所述更普遍的方法可能在于：在定量PCR装置(例如Applera的Light Cycler)中进行第一实例扩增，并通过这种方式确定对应于扩增曲线的拐点的循环数“ni”。
PCR或RT-PCR循环的扩增次数可以为ni-7至ni+2，并优选为ni-3至ni+1，ni为对应于扩增曲线的拐点的循环数。
根据一个实施方式，PCR或RT-PCR可包括的扩增次数为22～27。
在DNA扩增结束时，可以在例如象通过缓慢冷却等方便条件中使所扩增的核酸复性，以在样品中存在具有对应于不同等位基因的不同序列的片段时有助于异源双链的形成。
所述条件可以基本上在于在约90℃以上的温度对样品进行加热，并将该样品缓慢冷却(通常以1℃/min的级数)。例如，如在实施例中所述，可以使用以1℃/min降低温度。
样品
含有待分析的核酸片段的样品可以是合成的或天然的样品，或者来自生物技术的样品。在一个优选的实施方式中，样品为来自患者的样品。
具体地说，本发明不受特别限制地包括含有核酸片段的所有生物样品。更具体地说，根据本发明的生物样品可以来自细胞、组织、器官、固定或非固定的手术或活检样本如骨髓抽吸物，或包括生物流体例如诸如全血、血清、血浆、脑脊髓液、尿、淋巴液以及呼吸道、肠道和生殖-尿道的各种外分泌液、眼泪、唾液、乳汁等体液、白细胞、以及细胞培养上清液。样品来源可以是动物(优选为哺乳动物，更优选为人类)、植物、病毒、细菌、原生动物或真菌。样品可以是真核的、原核的或非细胞的样品。可以对包含在生物样品中，尤其是当来自组织、器官、生物流体或活检物时的细胞进行培养，以增加可获得的细胞的数目。样品可以含有单一类型的细胞或者混合类型的细胞。细胞、组织和样本可以来自正常个体或者患有疾病或失调的患者。所述疾病或失调可以是例如癌症、神经变性病、炎症、心血管疾病、免疫失调、诸如肥胖症等体重失调等。任何特定细胞、细胞类型、病理细胞、在发育或病程的特定状态的细胞都在本发明所考虑的范围之内。
根据本发明的方法对于与或推测与特定点突变和/或大规模改变有关的疾病的易感性的诊断或所述疾病的诊断或预后特别有用。
本发明还涉及根据本发明的方法在遗传性疾病或癌症的易感性的诊断或者所述疾病或癌症的诊断或预后中的应用。
本发明还涉及所述方法在治疗所述疾病中的应用。
特别是，相关疾病可以包括目前与或推断与特定点突变有关的很多癌症，例如黑素瘤、眼部黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状细胞癌、以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌症等。
以非限定式阐述本发明的方式提供以下给出的附图和实施例。
实施例
用于分离的所有片段都列在表1中。取代类型、片段大小、引物序列和多重组成显示在下表中。
    外显子     突变   片段大小   正向引物序列   反向引物序列  多重体
    52120161962211.51962211.51962211.5 c.2430T＞C/Leu771Leu缺失3-16缺失3-16重复18-19c.2430T＞C/Leu771Leu   290365412472268334433519268334433519268334433519   aatatctaaaagtagtattccaacgcagttatatagtttcttatctttataatctcagcctcccaaagtttgtttttgtagtgaagattctagaaggacctctcctctgtcatagaggttttctactgttgctggtggcaaattgacttaaaatccatactttcccagagctgaagtaaggacctctcctctgtcatagaggttttctactgttgctggtggcaaattgacttaaaatccatactttcccagagctgaagtaaggacctctcctctgtcatagaggttttctactgttgctggtggcaaattgacttaaaatccatactttcccagagctgaagt   tgtatgaaacaaactcccacatcccttttgagaaatgcagcaaaaagaataccctagatactaaatgcttaaccataatgcacttaaaatgtgcattgttaaggaaagtgcagaactaaaattaacctagactcagttctcaaatccttacccatggcgctttgaaaccttgaattgtgcattgttaaggaaagtgcagaactaaaattaacctagactcagttctcaaatccttacccatggcgctttgaaaccttgaattgtgcattgttaaggaaagtgcagaactaaaattaacctagactcagttctcaaatccttacccatggcgctttgaaaccttgaat  M25BC2M25BC2M25BC2M25BC2M1BC1-AM1BC1-AM1BC1-AM1BC1-AM1BC1-BM1BC1-BM1BC1-BM1BC1-BM1BC1-CM1BC1-CM1BC1-CM1BC1-C
根据以下程序进行PCR：
用于突变筛查的样品在50μL反应体积中产生，所述反应体积含有100ng的基因组DNA、0.06单位/μL的Taq聚合酶(Amplitaq gold，Appliedbiosystems)、4mM MgCl2、800μM dNTP和1×缓冲液(AppliedBiosystems)。对寡核苷酸的浓度进行调节，以使包含在多重体中的所有片段都具有一致的强度。
PCR程序在Icycler thermocycler(Biorad)中进行，并由以下步骤组成：96℃×15min的第一变性步骤，接着是25个循环的96℃变性30s、58℃退火30s和72℃延长30s。然后在96℃将PCR产物变性5分钟，然后通过以1℃/分钟用71分钟将样品温度从96℃降低到25℃而逐渐再退火。
所有实验都是在配有内径为50μm、有效长度为50cm的毛细管的ABI3100(Applied Biosystems，Foster city，USA)中进行。分离基质由溶解于Tris(50mM)、Taps(50mM)、EDTA(2mM)缓冲液中的5％(g/100mL)的聚(丙烯酰胺-g-聚(二甲基丙烯酰胺))组成。向基质中加入2.5％的胸苷和2.5％的胞苷。温度恒定在30℃。最后采用SYBRgreen I(Molecular probes)以1×进行DNA检测。
聚(丙烯酰胺-g-聚(二甲基丙烯酰胺))的特性如下：共聚物分子量为2377000Da，聚二甲基丙烯酰胺接枝分子量为50000Da，而聚二甲基丙烯酰胺接枝质量密度为9.7％。
根据WO02/01218中公开的制备方法制备液体分离介质的共聚物。它们具有良好的筛分性质，并具有表面活性。
实施例1
使用具有SYBRgreen I的毛细管电泳进行DNA浓度的半定量测定 -毛细管到毛细管的差异性
本实验采用多重体M25BC2进行。多重体M25BC2由大小不同的(290bp、365bp、412bp和472bp)的4个片段组成，这4个片段分别对应于BRCA2基因的外显子5、21、20和16。
在2kV进行20秒的注射。在同一毛细管阵列，同一运行操作中进行分离。
图1显示实施例1获得的不同峰的面积测定的毛细管到毛细管的重复性。用第二个片段(外显子21)的面积对所有的峰面积进行归一化。观察到的最大差异是10％量级，这与大重排缺失完美相容。实际上，代表重复的标志会引起幅度增加至少50％，而缺失将会引起幅度减少约50％。由于误差线为10％量级，因此这些数据显示在分析中没有假阳性或假阴性的危险性。
实施例2
使用具有SYBRgreen I的毛细管电泳对DNA浓度进行半定量测定 -连续运行的差异性
本组实验采用多重体M25BC2进行。多重体M25BC2由大小不同(290bp、365bp、412bp和472bp)的4个片段组成，这4个片段分别对应于BRCA2基因的外显子5、21、20和16。
在2kV进行20秒的注射。连续进行分离。进行5次注射。
图2显示实施例2中在5个连续运行操作上的不同峰的平均归一化面积测定的连续运行重复性。用第二个片段(外显子21)的面积对峰面积进行归一化。从连续运行的平均归一化面积非常具有重复性。误差线对应于标准偏差。这同样显示对于大规模突变的假阳性是非常不大可能的。
实施例3
对一名患者的大缺失和不同患者的取代同时进行检测
本实验采用多重体M1BC1进行。多重体M1BC1由大小不同(268bp、334bp、433bp和519bp)的4个片段组成，这4个片段分别对应于BRCA1基因的不同外显子(分别为外显子19、外显子6、外显子22和外显子11.5)。
多重体M1BC1-A对应于没有染色体大重排但在外显子11.5中具有单碱基取代的患者。
多重体M1BC1-B对应于外显子3至外显子16大缺失的患者。
可以看出，对应于M1BC1-B的外显子6和外显子11.5的峰比M1BC1-A的峰小约2倍。这表明，M1BC1-B中的外显子6和11.5缺失了。还可以看出，M1BC1-A的外显子11.5具有两个峰，而M1BC1-B的外显子11.5具有单个峰。这表明M1BC1-A的外显子11.5中存在小的变异。对该片段进行测序，揭示了单碱基取代(c.2430T＞C/Leu771Leu)。
图3显示对应于实施例3中所述的M1BC1-A和M1BC1-B的分离的两个叠加电泳图。
实施例4
对一名患者中的大重复和单碱基取代同时进行检测
本实验采用多重体M1BC1进行。多重体M1BC1由大小不同(268bp、334bp、433bp和519bp)的4个片段组成，这4个片段对应于BRCA1基因的不同外显子(分别为外显子19、外显子6、外显子22和外显子11.5)。
多重体M1BC1-A对应于没有染色体大重排但在外显子11.5中具有单碱基取代的患者。
多重体M1BC1-C对应于具有外显子18和19的大重复和外显子11.5中的单碱基取代的患者。
如以上实施例一样，可以观察到对应于单碱基取代的M1BC1-A的外显子11.5的双峰。
M1BC1-C的第一峰比M1BC1-A的第一峰高约1.5倍，这表明M1BC1-C中的外显子19具有重复。在M1BC1-C的外显子11.5中存在在M1BC1-A中所观察到的相同双峰，表明存在单碱基取代。
图4显示对应于实施例4中所述的M1BC1-A和M1BC1-C的分离的两个叠加的电泳图。
实施例5
用于检测M1BC1-B和M1BC1-C中存在的大重排的归一化面积的分 散情况
利用M1BC1-A进行6次分离，利用M1BC1-B进行9次分离，以及利用M1BC1-C进行10次分离。用在任意一个多重体中都不存在任何类型突变的第3个峰(外显子22)对峰面积进行归一化。
对应于与非突变片段相比具有2倍的峰面积差异的缺失可以得到很好的鉴定(M1BC1-B的外显子6和外显子11.5)。对应于与非突变片段相比具有1.5倍的峰面积差异的重复表现为与作为例子的外显子19的非突变片段具有非常小的重叠。
图5显示实施例5中所述的片段M1BC1-A、M1BC1-B和M1BC1-C的归一化面积的分散情况。

Claims (30)

1.一种用于检测涉及至少一个核酸片段即所述“第一核酸片段”的点突变和/或大规模改变的方法，该方法至少包括以下步骤：
a/提供易于含有所述第一核酸片段的样品和至少第二核酸片段，所述第二核酸片段明显区别于所述第一核酸片段并用作定量参照，
b/使所述核酸片段变性，并在适合于获得含有同源双链和可能的异源双链的产物的条件下使它们退火，
c/对所述退火的产物实施分析方法，该分析方法适合于至少获得区分所述第一核酸片段的所存在双链形式的信号和通过比较所述第一核酸片段的信号强度与由所述第二参照核酸片段获得的信号强度而获得的关于所述第一核酸片段的相对定量数据，和
d/将步骤c)中获得的相对定量数据与预测的其中不存在大规模改变的第一核酸片段的相对定量数据对照进行比较。
2.如权利要求1所述的方法，该方法包括附加步骤e)，该附加步骤e)包括对从步骤c)中所获得的第一核酸片段的信号的形状进行分析。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述附加步骤e)通过将来自第一核酸片段的信号形状和通过对相当于所述第一核酸片段的非突变形式的所述第一核酸片段形式施加步骤a)至c)所获得的信号形状进行比较来实施。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，所述样品包含多于1个的第一核酸片段，特别是包含多于2个的第一核酸片段，更特别是包含多于5个的第一核酸片段。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中至少一些或所有所述第一核酸片段与第二核酸片段至少在它们各自长度上相互不同。
6.如权利要求5所述的方法，其中不同长度片段之间的长度差异为至少1个碱基，特别是至少3个碱基，特别是至少5个碱基，特别是至少10个碱基，特别是至少15个碱基，特别是至少20个碱基，更特别是至少30个碱基。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中通过至少独特的标记使一些或所有的第一核酸片段和第二核酸片段相互区分。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第二参照核酸片段天然存在于易于含有所述第一核酸片段的样品中。
9.如前述权利要求所述的方法，其中所述第二参照核酸片段和所述第一核酸片段来自两个不同的基因。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第二参照核酸片段和所述第一核酸片段来自相同的基因。
11.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中将第二参照核酸片段以相对于易于含有所述第一核酸片段的样品中存在的核酸总量的预定量加入到所述样品中。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，该方法进一步包括附加步骤f)，该附加步骤f)至少包括在非饱和条件下对第一核酸片段和第二参照核酸片段进行扩增，更特别是半定量扩增，所述步骤f)在步骤b)之前进行。
13.如权利要求12所述的方法，其中步骤b)通过PCR或RT-PCR进行。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述PCR或RT-PCR包括的扩增循环数为22～27。
15.如权利要求12或14所述的方法，其中所述PCR或RT-PCR包括的扩增循环数为ni-7至ni+2，优选为ni-3至ni+1，所述ni为对应于扩增曲线的拐点的循环数。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述步骤f)通过滚环扩增或NASBA进行。
17.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述步骤c)在非变性条件中进行。
18.如前述任一项权利要求所述的方法，其中分离分析方法在电泳法、色谱法或质谱法中选择。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述分离分析方法为毛细管电泳或多毛细管电泳。
20.如前述权利要求所述的方法，其中所述电泳分析包括使用分离介质。
21.如前述权利要求所述的方法，其中所述分离介质是缠结聚合物溶液。
22.如权利要求18或19所述的方法，其中所述分离介质包含丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺或丙烯酰胺衍生物的交联或非交联聚合物。
23.如权利要求20～22中任一项所述的方法，其中所述分离介质包含丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的嵌段共聚物。
24.如权利要求20～23中任一项所述的方法，其中所述分离介质还包含至少一种能够与核苷酸A、T、G、C中的一个发生特定碱基配对相互作用的化合物，该化合物在所述分离介质中的浓度为至少1g/l。
25.如前述任一项权利要求所述的方法，其中步骤c)、d)和/或e)通过自动化软件进行。
26.一种诊断癌症易感性的方法，该方法包括权利要求1～25中任一项所定义的方法。
27.一种诊断癌症的方法，该方法包括权利要求1～25中任一项所定义的方法。
28.一种诊断遗传性疾病的方法，该方法包括权利要求1～25中任一项所定义的方法。
29.一种发现新的治疗靶点或者筛查疗法效力的方法，该方法包括权利要求1～25中任一项所定义的方法。
30.一种发现用于疾病或病理状况的新的生物标记的方法，该方法包括权利要求1或2所定义的方法。
CNA2006101657124A 2005-12-13 2006-12-13 测定核酸中的突变和/或大规模改变的方法及其应用 Pending CN1982477A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05027186.5 2005-12-13
EP05027186A EP1798291B1 (en) 2005-12-13 2005-12-13 Methods and compositions for assaying mutations and/or large scale alterations in nucleic acids and their uses in diagnosis of genetic diseases and cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1982477A true CN1982477A (zh) 2007-06-20

Family

ID=36293478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006101657124A Pending CN1982477A (zh) 2005-12-13 2006-12-13 测定核酸中的突变和/或大规模改变的方法及其应用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20070161032A1 (zh)
EP (1) EP1798291B1 (zh)
JP (1) JP2007202552A (zh)
CN (1) CN1982477A (zh)
AT (1) ATE510025T1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102762987A (zh) * 2010-02-18 2012-10-31 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 测定多肽的序列变体的方法
CN110982887A (zh) * 2019-12-30 2020-04-10 上海健康医学院 用于lkb1基因突变检测的引物及其应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003301503A1 (en) * 2003-12-16 2005-07-14 Centre National De La Recherche Scientifique Methods and compositions for assaying mutations in nucleic acids
WO2017189677A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Arc Bio, Llc Machine learning techniques for analysis of structural variants
WO2024111038A1 (ja) * 2022-11-22 2024-05-30 株式会社日立ハイテク 変異遺伝子検出方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5885432A (en) * 1992-11-05 1999-03-23 Soane Biosciences Un-crosslinked polymeric media for electrophoresis
WO1995016910A1 (en) 1993-12-17 1995-06-22 Perkin-Elmer Corporation Uncharged polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis
US5994075A (en) * 1996-05-17 1999-11-30 Hexagen Technology Limited Methods for identifying a mutation in a gene of interest without a phenotypic guide
CA2257109C (en) * 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
US20020169309A1 (en) * 1997-08-05 2002-11-14 Gjerde Douglas T. Mutation detection method
AU1297599A (en) * 1997-10-31 1999-05-24 Transgenomic, Inc. Method of detecting mutant dna by mipc and pcr
ATE310103T1 (de) * 1998-08-19 2005-12-15 Bioventures Inc Methode zur bestimmung von polynukleotidsequenzvariationen
EP1137811B1 (en) * 1998-12-09 2005-11-30 Massachusetts Institute Of Technology Methods of identifying point mutations in a genome
EP1230393A1 (en) * 1999-11-12 2002-08-14 Charles L.M. Dunlop Approaches to identify genetic traits
FR2811083B1 (fr) 2000-06-30 2002-11-22 Inst Curie Milieu liquide non-thermosensible pour l'analyse d'especes au sein d'un canal
US20040018497A1 (en) * 2002-07-26 2004-01-29 Warden Craig H Human obesity LIPIN3 polynucleotide and polypeptide sequences and methods of use thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102762987A (zh) * 2010-02-18 2012-10-31 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 测定多肽的序列变体的方法
CN102762987B (zh) * 2010-02-18 2016-03-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 测定多肽的序列变体的方法
CN110982887A (zh) * 2019-12-30 2020-04-10 上海健康医学院 用于lkb1基因突变检测的引物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20070161032A1 (en) 2007-07-12
EP1798291B1 (en) 2011-05-18
JP2007202552A (ja) 2007-08-16
EP1798291A1 (en) 2007-06-20
ATE510025T1 (de) 2011-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210054458A1 (en) Methods of fetal abnormality detection
EP2697397B1 (en) Safe sequencing system
JP2000508539A (ja) Ｓｔｒ座位の多重増幅
US20150203907A1 (en) Genome capture and sequencing to determine genome-wide copy number variation
JP2004166716A (ja) プローブアレイを使用して、遺伝子多型性を検出し、対立遺伝子発現をモニターする方法
JP2022505050A (ja) プーリングを介した多数の試料の効率的な遺伝子型決定のための方法および試薬
WO2017193044A1 (en) Noninvasive prenatal diagnostic
Butz et al. Brief summary of the most important molecular genetic methods (PCR, qPCR, microarray, next-generation sequencing, etc.)
CN1982477A (zh) 测定核酸中的突变和/或大规模改变的方法及其应用
Goswami et al. An overview of molecular genetic diagnosis techniques
AU3118600A (en) Methods of identifying point mutations in a genome
US20210277458A1 (en) Methods, systems, and aparatus for nucleic acid detection
Sridhar et al. Molecular genetic testing methodologies in hematopoietic diseases: current and future methods
KR20010051353A (ko) 변동된 종결 분석에 의한 핵산 서열의 변형 검출 방법
Coticone et al. Development of the AmpFℓSTR SEfiler PCR amplification kit: a new multiplex containing the highly discriminating ACTBP2 (SE33) locus
CN113234838A (zh) 高分辨率熔解曲线鉴定绵羊FecB基因型的引物对、产品和方法
CN113151435A (zh) 一种定性检测hla-b*1502等位基因的试剂盒及方法
Tong et al. Prenatal diagnosis of trisomy 21, 18 and 13 by quantitative pyrosequencing of segmental duplications
Amr et al. Targeted Hybrid Capture for Inherited Disease Panels
EP1207209A2 (en) Methods using arrays for detection of single nucleotide polymorphisms
RU2600874C2 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для генотипирования полиморфных локусов днк, ассоциированных с риском развития спорадической формы болезни альцгеймера в российских популяциях
JPWO2013085026A1 (ja) 塩基変異の検出方法及び検出用キット
Aligoodarzi et al. Multiplex Snapshot minisequencing for the detection of common PAH gene mutations in Iranian patients with Phenylketonuria
Nagarajan et al. 36 Mutation Detection
JP2024035110A (ja) 変異核酸の正確な並行定量するための高感度方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20070620