CN109182340B - 一种ox40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种OX40基因修饰人源化动物模型的制备方法，该方法利用CRIPSR/Cas9技术，通过构建打靶载体，利用同源重组的方式将小鼠OX40基因的外显子1－7替换为人OX40基因片段，从而制备出基因修饰人源化小鼠，该小鼠能正常表达含有人OX40蛋白功能域的蛋白，可以作为OX40信号机理研究，调节剂筛选，毒理研究的动物模型，这对于研究OX40基因的功能，以及新药研发具有重要的应用高价值。

Description

一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用
技术领域
本发明涉及动物模型领域，尤其涉及一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用。
背景技术
人源化动物模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的动物模型。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。
研究人类复杂疾病的发病机制，筛选有效药物，需要理想的动物模型来进行大量的体内试验。小鼠是应用最为广泛的生物模型之一，但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异，构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要。利用基因修饰的方法，将人类基因“放置”在大、小鼠染色体上所制备的人源化基因动物模型，是进行一些人类疾病研究的方法。
OX40，别名TNFRSF4(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 4)或者CD134，是TNFR/TNF超家族的一个极其重要的受体分子。OX40在CD4+和CD8+T细胞免疫应答中起重要作用，其影响T细胞依赖的B细胞的增殖和分化，此外OX40还促进凋亡抑制剂BCL2and BCL2lL1/BCL2-XL的表达，从而抑制细胞凋亡。
临床研究表明，OX40的激动可导致免疫效应和记忆功能的刺激，减少免疫抑制调节性T细胞(多出现在肿瘤中)。OX40激动剂在癌症中的作用已日益受到重视，目前多种激动剂处于研发阶段或已开始在临床试验中用于癌症治疗。
为了使临床前期的试验更有效并使治疗失败最小化，提供一种OX40基因人源化的改造动物模型非常重要，目前尚缺乏真正意义上的OX40基因人源化小鼠。虽然有文献报道制备人源化OX40基因的动物模型，但是其动物模型中OX40基因并未实现全部外显子的人源化，仅仅制备了第1号外显子的部分序列、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子的部分序列来自人源的OX40基因动物模型。这种动物模型还是未做到OX40基因及其表达产物尽可能与人相同的效果。
我们构建了针对mouse OX40基因的gRNA和携带human OX40片段的Donor vector，利用CRISPR/Cas9技术和囊胚注射技术，将mouse OX40基因的E1-7coding region替换为human OX40片段。在替换的同时保留了mouse OX40基因的UTR区域，保证了human OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。同时，我们对于CRISPR/Cas9技术中用到的各个原件包括gRNA等进行了充分的优化和调整，保证采用该技术制备人源化OX40基因动物模型的成功率和准确率。
发明内容
本发明提供了一种人源化小鼠OX40基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人OX40蛋白的功能域，其是将小鼠OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人OX40片段，在替换的同时保留了小鼠OX40基因的UTR区域，保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。
还提供了包含权利要求1所述DNA序列的载体。
提供所述DNA序列或所述载体在制备OX40基因修饰人源化的动物模型中的用途。
本发明还提供一种制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建表达针对鼠源OX40基因的sgRNA的质粒；
(2)将人源OX40基因的DNA序列、鼠源OX40基因的3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化OX40基因的载体。
(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产OX40基因修饰人源化鼠模型；
所述载体能够将鼠源OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人源OX40的片段，在替换的同时保留鼠源OX40基因的UTR区域，保证人源OX40表达受鼠自身启动子和调控序列控制。
优选地，其中针对鼠源OX40基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2所示。
优选地，其中步骤(2)中所述5’同源臂通过引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8扩增小鼠基因组DNA获得，所述3’同源臂通过引物对SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10扩增小鼠基因组DNA获得。
优选地，所述载体的制备步骤如下：
①以小鼠基因组为模板，分别利用引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、引物对SEQID NO:9和SEQ ID NO:10进行PCR，得到特异的PCR条带，分别命名为H1、H3片段，H1为5’端同源臂，H3为3’端同源臂；
②以人源OX40BAC为模板，利用引物对SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为H2，H2为hOX40序列片段；
③以pMD18-T vector为模板，利用引物对SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为18T骨架；
④将H1、H2、H3、18T骨架共四个片段连接，构建质粒Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor；
⑤酶切Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor，产物大小4284+2720bp，回收4284bp片段；酚:氯仿抽提，溶于Rnase free的水中，直接用于注射。
优选地，其中步骤(1)中构建表达sgRNA的质粒的过程如下：
1)BsaI线性化pUC57-gRNA-T7载体，并用CIAP去磷酸化；
2)退火：序列如SEQ ID NO：3和4的上下游引物、以及序列如SEQ ID NO：5和6的上下游引物分别稀释成100umol，退火；
3)加磷酸：退火产物进行加磷酸处理
4)连接：取加磷酸后的产物与线性化并去磷酸处理的pUC57-gDNA-T7进行连接，分别获得表达序列如SEQ ID NO：1所示的sgRNA的质粒1和序列如SEQ ID NO：2所示的sgRNA的质粒2。
优选地，所述方法进一步包括利用引物鉴定所述动物模型的步骤
本发明还提供所述的DNA序列或者所述制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法在评估靶向OX40的药物有效性、OX40靶向药物筛选开发、免疫检查点肿瘤药物联用的开发、或OX40靶向药物的毒理研究中的应用。
另外，本发明还提供了特异性靶向小鼠OX40基因的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示。
本发明具有以下积极效果：
1、本发明的动物模型，其OX40基因的第1－7号外显子全部被人为替换成人源OX40基因第1－7外显子，同时保留小鼠OX40基因的UTR区域，能在动物体内表达含有人OX40蛋白功能域的OX40蛋白，同时保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。采用本方法能最大程度减少人源化可能造成的基因转录的影响；同时使表达出的蛋白最大程度的接近人OX40蛋白。
2、本发明提供了优化的制备人源OX40基因动物模型的具体操作方法，该方法中优化了sgRNA、donor vector的制备，确保了动物模型的成功率。
3、本发明的方法制备的OX40基因修饰人源化动物模型可作为标准的模型动物，应用于OX40信号机理研究。可作为标准的模型动物，接种C57BL6背景的同源性肿瘤进行造模，如接种MC38、B16F10等细胞系，造模后可应用于：
A.OX40靶向药物筛选开发；
B.免疫检查点肿瘤药物联用的开发、评价；
C.OX40靶向药物的毒理研究等方面，推进开发进程，在减少时间成本的同时降低药物开发的风险。
附图说明
图1为humanized OX40donor制备策略图。
图2为输卵管移植示意图。
图3为鼠尾DNA PCR鉴定的引物设计示意图：引物对Pair1和Pair3基因鉴定5’端的正确中靶，以及H1与human OX40片段的正确拼接；Pair2和Pair4基因鉴定3’端的正确中靶，以及H3与human OX40片段的正确拼接。。
图4(a)和图4(b)为鼠尾DNA PCR鉴定的结果图：注：B6为阴性对照，是B6基因组DNA；N为空白对照,无模板的对照；DL2000条带，2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图5为用于人源化鉴定的引物位置示意图，引物(mouse Ox40-RTF1、human OX40-RTR2)位于鼠源OX40 mouse-Exon1、人源OX40 Human-Exon7内，引物(Human OX40-RTF2、mouse Ox40-RTR1)位于人源OX40 Human-Exon2、鼠源OX40 mouse-Exon7内。
图6为OX40 mouse-human chimeric mRNA的RT-PCR电泳图。
图7为测序比对结果。
图8(a)和图8(b)为雌性小鼠流式细胞仪检测的细胞分群图片。
图9(a)和图9(b)为雄性小鼠流式细胞仪检测的细胞分群图片。
图10为肿瘤的生长及小鼠体重的数据变化趋势。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：Guide RNA、Cas9mRNA以及Donor vector制备
一、Guide RNA(sgRNA)
1、sgRNA序列
通过多次试验确定出最适合的sgRNA序列：
ox40-S4 sgRNA:cccacagcccttctgctgct ggg
ox40-S8 sgRNA:cacagacgcacactttactc tgg
2、sgRNA构建
(1)准备工作：Bsa I线性化pUC57-gRNA-T7载体，并用CIAP(TaKaRa,Cat#2250A)去磷酸化。
(2)退火：上下游引物稀释成100umol，按照1:1比例。95℃退火5min。(去热盖)
(3)加磷酸：去退火产物2ul进行加磷酸处理(TaKaRa,Cat#2021S)，体系如下：
Figure BDA0001815708810000071
PCR仪去热盖，程序：37℃30min。
(4)连接
取加磷酸后的产物与线性化并去磷酸处理的pUC57-gDNA-T7进行连接。
体系：
pUC57-gDNA-T7 2ul
DNA 6ul
T4 1ul
T4Buffer 1ul
16℃连接至少4h，化学转化涂Kan板。
(5)PCR克隆鉴定，送阳性克隆测序。
引物：pUC57-T7-F、sgRNA的下游引物
体系：普通Taq酶体系
程序：普通Taq酶程序
sgRNA引物
Figure BDA0001815708810000081
(6)测序结果比对
比对测序结果，将阳性的克隆提取质粒。准备模板进行转录。
3、sgRNA转录：
3.1质粒线性化及纯化
(1)采用Ambion MEGA shortscript T7kit(Ambion,Cat#AM1354)进行转录。
(2)取约50ug质粒DNA进行酶切(不用去磷酸化处理)，酶切体系视DNA的浓度而定，大概400-500ul体系即可，37℃酶切过夜。
(3)分别加入(以500ul体系为例)：PK(10mg/ml)10ul(终浓度为200ug/ul)10％SDS5ul(1:100的比例)混匀，50℃温育30min.
(4)加入等体积(以500ul为例)酚/氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min；
(5)小心吸取上清至一个新的1.5ml EP管(RNeasy-free),加入等体积的氯仿再次抽提；
(6)小心吸取上清(注意不要吸取过于彻底，可留一部分上清)至一个新的1.5mlEP管，加入1ml无水乙醇，混匀，12000rpm离心10min；
(7)倒掉上清，吸取700ul无水乙醇及300ul RNeasy-free water，混匀，12000rpm,离心10min.倒掉上清，盖上盖子空离15s，用枪头吸取残留的液体，室温晾干月3分钟，加入20ul RNeasy free water溶解DNA。
(8)测取DNA浓度，DNA OD260/280应介于1.8-2.0范围内，并计算DNA的浓度，将DNA的浓度稀释至1ug/ul。
3.2配液及温育
(1)试剂解冻
室温解冻T710X Reaction Buffer、四种核苷酸和水。T7Enzyme Mix置于冰上。
(2)室温下配置反应液
按照顺序加入各种试剂，为了方便起见，可以将四种核苷酸预混，加入8ul到20ul反应体系。
Figure BDA0001815708810000101
(3)彻底混匀手指轻弹或者用移液器轻轻上下吹打混匀，离心混合液。
(4)37℃温育4-6小时。
(5)加入2ul TURBO DNase,混匀后，37℃温育30min。此步目的为去除模板DNA。
3.3RNA的纯化
(1)使用Ambion的MEGAclear kit(Ambion，Cat#AM1908)进行纯化。
(2)第一次使用前，加入20ml ACS级别的100％无水乙醇入Wash SolutionConcentrate，混匀备用；
(3)将RNA样品溶于100ul Elution Solution,轻柔混匀；
(4)加入350ul Binding Solution Concentrate,用移液器轻柔的混匀；
(5)加入250ul 100％无水乙醇，用移液器轻柔的混匀；
(6)样品过滤：
a:将1个滤芯插入收集管；
b:将RNA样品用移液器转移至滤芯；
c:10000-15000g离心15s-1min；
d:倒掉滤液，将收集管重复利用；之后进行RNA的洗涤；
(7)用2×500μL Wash Solution洗涤RNA
a:加入500μL Wash Solution，通过滤芯进行过滤；
b:再加入500μL Wash Solution进行过滤；
c:去除Wash Solution，继续离心或者将滤芯从虑管中取出10-30s,去除残留的wash
solution；
(8)用下列方法溶解RNA
a:取110ul Elution Solution 95℃预热；
b:加入50ul预热的Elution Solution入滤芯，盖上盖子，室温10000-15000g离心1min。
c:为了最大限度的回收RNA,可重复此洗脱步骤，再加入50ul Elution Solution,同步骤b
将滤液收集到同一管中，得到100ulRNA样品。
(9)5M醋酸铵沉淀RNA
a:按照1/10的体积加入5M醋酸铵，例如：RNA样品总体积为100ul,则应加入10ul的
5M醋酸铵；
b:加入2.75倍体积的100％乙醇，例如，100ul的RNA样品，应该加入275ul的无水乙
醇；混匀，-20℃静置30min；
c:最大离心力离心15min(4℃或者RT)；
d:小心转移并倒掉上清；
e:加入500ul 70％的酒精(预冷)，再次离心，并倒掉70％酒精；
f:为了去除残液，快速离心离心管，用干净的枪头洗掉管底的残液；
g:晾干，溶解，一般可以得到60-150ug的RNA，可加入40ul RNA free water进行溶解，并分装成小样进行保存。
4、sgRNA产物定量
A260 x dilution factor x 40＝μg/mL RNA长度大于1.5K的RNA可以用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶定量。每个泳道加入1ug的量，为了得到更好的效果，琼脂糖凝胶和buffer里面应分别加入0.5μg/mL ethidium bromide，10μg/mL ethidium bromide入样品。建议：将RNA+Loading buffer于70℃作用5min，再跑胶定量(可将RNA的高级结构打开得到线状的RNA)
(二)mRNA转录(Cas9体外转录)
使用Ambion的mMESSAGE
Figure BDA0001815708810000131
T7Ultra Kit(Ambion,Cat#AM1345)进行转录，操作步骤如下：
1、质粒线性化及纯化
(1)取约20-50ug质粒DNA进行酶切(不用去磷酸化处理)，酶切体系视DNA的浓度而定，大概400-500ul体系即可，37℃酶切过夜。
(2)分别加入(以500ul体系为例)：
PK(10mg/ml)10ul(终浓度为200ug/ul)
10％SDS 5ul(1:100的比例)
混匀，50℃温育30min.
(3)加入等体积(以500ul为例)酚/氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min；
(4)小心吸取上清至一个新的1.5ml EP管(RNeasy-free),加入等体积的氯仿再次抽提；
(5)小心吸取上清(注意不要吸取过于彻底，可留一部分上清)至一个新的1.5mlEP管，加入1ml无水乙醇，混匀，12000rpm离心10min；
(6)倒掉上清，吸取700ul无水乙醇及300ul RNeasy-free water，混匀，12000rpm,离心10min.
(7)倒掉上清，盖上盖子空离15s，用枪头吸取残留的液体，室温晾干月3分钟，加入20ul RNeasy free water溶解DNA。
(8)测取DNA浓度，DNAOD260/280应介于1.8-2.0范围内，并计算DNA的浓度，将DNA的浓度稀释至1ug/ul。
2、转录及加帽
(1)试剂解冻
RNA Polymerase Enzyme Mix在冰上解冻；涡旋震荡10X T7 Reaction Buffer和T7 2X NTP/ARCA直到其完全溶解，然后将T7 2X NTP/ARCA置于冰上，10X T7 ReactionBuffer室温备用。所有试剂在开盖使用前请低速离心，避免管盖或管壁的残留。
(2)室温下配置反应液
如果在冰上，10X Reaction Buffer里面的亚精胺(spermidine)可以使模板DNA沉淀下来。按照下面顺序加入试剂：核苷酸——水——10X T7 Reaction Buffer，终体积为20ul。
Figure BDA0001815708810000141
(3)彻底混匀
手指轻弹或者用移液器轻轻上下吹打混匀，离心混合液。
(4)37℃温育2小时(用PCR仪)。
(5)加入1ul TURBO DNase,混匀后，37℃温育15min。此步目的为去除模板DNA.
3、RNA加尾
(1)按照下列步骤加入加尾反应液：
Figure BDA0001815708810000151
(2)预留2.5ul的加尾反应液：
加E-PAP enzyme前转移2.5ul的反应混合液，在反应结束后作为对照。
(3)加入4ul E-PAP,轻柔混匀，最终反应体系为100ul.
(4)37℃温育30–45min，反应结束置于冰上；
4、mRNA的纯化
RNeasy mini Kit 74104法：
使用QIAGEN的Rneasy Mini kit(Qiagen,Cat#74104)进行mRNA纯化，Buffer RPE使用前加入4倍体积的乙醇(96-100％)。
1)将RNA样品调整终体积为100ul；加入350ul RLT Buffer,混匀；
2)加入250ul乙醇(96-100％)用枪头混匀，不要离心，立即进行第3步；
3)转移该700ul样品入RNeasy Mini spin column,放置一个2ml的收集管，盖上盖子，≧8000g离心15s,倒掉滤液；
4)加入500ul RPE buffer,盖上盖子，12000g离心15s，弃掉滤液；
5)加入500ul RPE buffer,盖上盖子，12000g离心2min；更换一个新的收集管，盖上盖子，全速空离1min；
6)将柱子放置在一个新的1.5ml收集管中，加入30-50ul RNase-free water到吸附膜中央，盖上管盖，12000g离心1min；
5、产物定量
A260 x dilution factor x 40＝μg/mL RNA
每个泳道加入1ug的量，为了得到更好的效果，琼脂糖凝胶和buffer里面应分别加入0.5μg/mL ethidium bromide，10μg/mL ethidium bromide入样品。
建议：将RNA+Loading buffer于70℃作用5min，再跑胶定量(可将RNA的高级结构打开得到线状的RNA)。
(三)Donor vector制备
1、方案设计
将mouse OX40基因的E1-7 coding region替换为human OX40片段。在替换的同时保留了mouse OX40基因的UTR区域，保证了human OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。
humanized OX40 Donor制备策略图参见图1。
human OX40分子对应的Gene ID:7293；mRNA序列如NM_003327所示；蛋白质序列如NP_003318所示。
Donor vector制备
按照下表，以C57BL/6JNju基因组为模板，进行高保真PCR，得到特异的PCR条带，胶回收，分别命名为H1，H3片段。H1为5’端同源臂，H3为3’端同源臂。
以人源OX40 BAC为模板进行高保真PCR，得到特异的PCR条带，胶回收，片段命名为H2。H2为hOX40序列片段。
以pMD18-T vector为模板进行高保真PCR，得到特异的PCR条带，胶回收，片段命名为18T骨架。
通过sLIC方法，将H1、H2、H3、18T骨架共四个片段连接，构建质粒Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor；
用I-CeuI酶切Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor，产物大小4284+2720bp，回收4284bp片段；酚:氯仿抽提，溶于Rnase free的水中，直接用于注射。
Donor制备相关引物序列，Donor序列见附件
Figure BDA0001815708810000171
Figure BDA0001815708810000172
Figure BDA0001815708810000173
Figure BDA0001815708810000181
实施例2注射样品制备
1.先在离心管上按注射表的名字写好标识，根据事先已计算好的配制表上的体积按顺序加入管中：
Injection buffer→Cas9-mRNA→Donor→sgRNA。
2.样品混合完，盖紧盖子，用手指轻弹EP管8～10次，使之混匀。
3.混匀的样品在已预冷的离心机中12000g离心5min中。
注射样品配制(总体积50ul)：
Cas9：100ng/ul
Donor:100ng/ul
sgRNA：每条20ng/ul。
实施例3注射及移植
1、IVF提供注射用胚胎
1)材料：
雌鼠：3-4周龄，13-15g
雄鼠：3-6个月，单放10天以上
人绒毛膜促性腺激素(HCG)(宁波三生药业有限公司)
孕马血清促性腺激素(PMSG)(宁波三生药业有限公司)
矿物油(Sigma M5310)
HTF(使用Sigma试剂自配)
c-TYH(使用Sigma试剂自配)
2)超排：腹腔注射
Day1:供卵鼠早上8:30-9:00注射PMSG(宁波三生药业有限公司)5IU/只。
Day3:供卵鼠早上8:15-8:45注射HCG(宁波三生药业有限公司)5IU/只。
3)精子采集与活力检测
采集时间:22:00-22:05之间采集精子
4)采集卵子
在注射过HCG13-14h小时后，处死雌鼠，取出输卵管，并放于盛有DPBS的皿盖内清洗血液毛发，再移到滤纸尽可能去除周围水分，最后将输卵管放入受精皿的矿物油中，用显微镊将每个输卵管的膨大部撕破使卵母细胞团流出，同时用另一把显微镊将卵母细胞团拨到受精滴中。
5)精卵混合
获能30分钟，从培养皿中去除获能结束的精子皿，在显微镜下迅速观察精子活力，选择精子活力较好的精子进行IVF。从精子滴边缘吸取精子，加到卵子滴中，每滴加5-8ul左右的精子，精卵混合后，置于培养箱中培养。
6)收集可用胚胎
次日早晨，挑选形态好的受精卵注射用。
2、小鼠核质注射
1)仪器：
倒置显微镜(Olympus IX51)显微操作系统(Eppendorf Transfer Man NK2)，拉针仪(Sutter P-1000)，断针仪(Narishige)
2)注射过程：
在3.5mm dish(Corning)盖子中央做一个宽度约为2mm的长条M2(sigma M7167)液滴，覆盖矿物油，作为操作皿。将已加入DNA溶液(1-3ng/μL)的注射管和固定管装入操作手臂。在操作皿M2液滴中移入受精卵，使其排成一列(50枚)。用固定管吸住受精卵，注射管调整位置，使原核清晰可见，且针尖与原核位于同一焦平面，之后刺入原核，按Inject键将包含sgRNA及Cas9mRNA的样品打入原核及胞质，完成一次注射后用注射管将受精卵推向下方，进行下个受精卵操作，全部结束后移至M16(sigma M7292)培养皿中恢复1h。
3、受体鼠制备
1)周龄体重要求
受体雌鼠(ICR)：≥8周龄，25-33g
结扎雄鼠(ICR):2-8月龄
2)0.5天受体鼠制备过程
挑选周龄体重合格的雌鼠，下午3:30将结扎雄鼠与雌鼠1:2合笼，第二天上午8:00开始对受体进行检栓，检栓过程中将见栓受体和未见栓受体提出，按照小鼠标准饲养密度分开饲养。见栓小鼠即为0.5天受体，作为当天胚胎移植实验的受体。
4、小鼠输卵管移植
1)实验材料
a.受体雌鼠(8-10周龄，体重25-33g)，产自南京大学-南京生物医药研究院
b.试剂：M16(sigma M7792)M2(sigma M7167)70％酒精、麻醉剂(1.25％三溴乙醇，自配)镇痛剂(0.1％Carprofen)
c.仪器：体视显微镜(麦克奥迪SMZ-168)热台
d.耗材：手术器械(使用前需高压灭菌)3.5cm培养皿(Corning)移卵管(自制)1ml注射器、平板纸、消毒棉球、剃毛器
2)输卵管移植
输卵管移植示意图参见图2。
a.将左侧生殖系统暴露的小鼠连同平板纸一起放到体视显微镜下，小鼠的头朝向右侧。
b.在体视显微镜下找到输卵管膨大部，左手用显微镊固定输卵管，右手持锋利的针头在膨大部前端拐弯处刺开一个小口，然后把吸有胚胎的移植管插入开口处，轻轻吹入胚胎，保证胚胎吹入输卵管膨大部。
c.松开血管夹，将小鼠从体视显微镜下取下，用钝镊子夹起脂肪垫，将子宫、输卵管、卵巢等放回体腔，缝合线缝合肌肉层。
d.重复2--5，将胚胎移植到右侧输卵管。
e.创口夹缝合皮肤层，70％酒精消毒伤口处皮肤。
f.将做完移植手术的小鼠放在干净鼠笼内，37℃热台上保温直到小鼠苏醒。将苏醒后的小鼠转移入相应的动物饲养房，等待生仔。
实施例4基因鉴定
1、移植后将受体鼠放回鼠笼饲养，19天左右生仔。小仔出生后5-7天剪取2mm左右鼠尾提取基因组DNA进行PCR鉴定。
2、鼠尾基因组DNA提取(酚氯仿法)
1)设备：水平离心机、恒温干燥箱、移液器
试剂耗材：裂解液Tail Digestion Buffer(500ml)：1M Tris Hcl(PH＝8.0)25.0ml、0.5M EDTA 100.0ml、5M Nacl 10.0ml、20％SDS 25.0ml、MillQ 340.0ml，蛋白酶K(简称PK，10mg/ml)，100％乙醇，70％乙醇，TE Buffer(500ml)：1M Tris Hcl(PH＝8.0)5ml、0.5M EDTA(PH＝8.0)1ml、MillQ 494ml，酚和氯仿1∶1混合溶液(4℃保存，取下层液体)
2)操作步骤
a.取小鼠尾巴(长不超过0.3cm)，放入1.5ml EP管内；
b.准备裂解液：每500μl裂解液加5μl蛋白酶K，每个装有尾巴的EP管分装500μl；
c.将加好裂解液的EP管放在EP管架上并用保鲜膜将其包裹好放入55℃的恒温干燥箱中(使用保鲜膜是为了防EP管受热打开造成裂解液减少)，进行过夜消化；
d.第二天用力摇晃EP管使消化好的组织均匀分布；
e.每管加入等体积的酚/氯仿混合溶液(500μl)；
f.用力混匀后，放入水平离心机中12,000rpm离心12min；
g.用1000μl移液器从离心好的EP管中吸取200μl上清液到新的EP管中并一一对应的将号码标示清楚，在吸取上清时需要注意一定不要吸到中间层或者下层，如不好操作可将大枪头的尖端剪去，减少吸力可避免将中间蛋白层吸起；
h.每管中加入2倍于上清体积(400μl)的100％乙醇，上下颠倒混匀，此时应可看到白色丝状的DNA，以12,000rpm离心5min；
i.弃去上清，再加入400μl 70％乙醇，以12,000rpm离心5min；
j.弃去上清，小心吸取残留乙醇，室温晾干(注意：时间大于30min，不可用DNA-Plus真空抽干，可能会导致基因组织DNA难溶)；
k.加入200μl TE溶解液溶解DNA，可在55℃或37℃助溶(短期可4℃保存，长期则需-20℃保存)。
3、鼠尾DNA PCR鉴定
1)设备：PCR仪(东胜品牌)移液器(eppendoff)电泳系统、凝胶成像系统
试剂耗材：Taq酶全套(博彩生物)，移液管，Agarose，EB(溴化乙锭)，DNA Marker
2)操作步骤：
a.按照下表中成分配制PCR反应体系，并按照PCR反应条件在PCR仪中进行；
Figure BDA0001815708810000241
b.制胶(1.5％)
称取1.5g琼脂糖，加入100ml的1×TAE缓冲液(PH＝8.0)，摇匀；微波炉加热，至琼脂糖完全溶解；将制胶板两端封好，插入适当的梳子，再将冷却至50℃并已加入EB的琼脂糖倒入其中(如有气泡需赶出)，在室温下冷却凝固(约30～45min)；凝固后小心的垂直向上将梳子拔出，把胶及底座一起放入电泳槽中，以保证点样孔完好。
c.点样
将2.0μl溴酚蓝加入到PCR产物中，然后用移液器混匀；每孔点样10-15μl，样品混合物将沉入点样孔下部。
d.电泳
打开电源开关，调节电压至恒压(140V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，20～30min后即可在凝胶成像系统下观察。
3)结果分析
Figure BDA0001815708810000251
①PCR鉴定引物及引物设计示意图
如图3所示，引物对Pair1和Pair3基因鉴定5’端的正确中靶，以及H1与human OX40片段的正确拼接；Pair2和Pair4基因鉴定3’端的正确中靶，以及H3与human OX40片段的正确拼接。
Pair1与Pair2引物鉴定阳性，或Pair3与Pair4引物鉴定阳性，且PCR产物测序序列正确的小鼠认定为是正确中靶的阳性小鼠。
②PCR鉴定图
PCR鉴定结果图参见附图4(a)和图4(b)。
注：B6为阴性对照，是B6基因组DNA
N为空白对照，无模板的对照
DL2000务带：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp
③测序结果分析
将PCR产物跑胶条带切胶送测序，经测序比对确认92#、130#、181#、189#、244#为KI阳性鼠。
实施例5小鼠繁育
选取Founder鼠92#、130#、181#、189#、244#进行繁育：
ID Gender color Gty DOB Gen
92 ♂ B + 2015-8-4 F0
130 ♀ B + 2015-10-6 F0
181 ♀ B + 2015-10-6 F0
189 ♂ B + 2015-10-6 F0
244 ♀ B + 2015-10-6 F0
将上述Founder鼠与背景鼠C57BL/6J配繁，从F1后代小鼠中选取197#，199#，200#，201#继续繁育，其基因型分别为：
ID Gender DOB color Gty Gen
197 ♂ 2016-1-18 B KI/wt F1
199 ♀ 2016-1-18 B KI/wt F1
200 ♀ 2016-1-18 B KI/wt F1
201 ♀ 2016-1-18 B KI/wt F1
将上述雄鼠和雌鼠相互交配，并传代，直到分离出纯合小鼠Human OX40emlCin/Nju小鼠。
实施例6 Human OX40emlcin/Nju表型鉴定
(一)mRNA水平人源化鉴定
1.样品小鼠信息：
ID Sex Genotype D.O.B Age(W) Generation
278 ♂ KI/wt 2016-7-14 4 N2
279 ♂ KI/wt 2016-7-14 4 N2
287 ♀ KI/wt 2016-7-14 4 N2
289 ♀ KI/wt 2016-7-14 4 N2
2.方法：
采用小鼠脾脏、胸腺RNA进行RT-PCR验证mRNA剪接，同时将PCR获得的目的条带测序。
3.方案说明：
Detect the mouse-human chimeric mRNA：
Figure BDA0001815708810000271
引物位置示意参见图5：引物(mouse Ox40-RTF1、human OX40-RTR2)位于鼠源OX40mouse-Exon1、人源OX40 Human-Exon7内，引物(Human OX40-RTF2、mouse Ox40-RTR1)位于人源OX40 Human-Exon2、鼠源OX40 mouse-Exon7内，以脾脏、胸腺RNA的反转录cDNA为模板扩增，如果OX40 mRNA正确剪接，则出现的目的条带，野生型B6无目的条带。
1、PCR体系：
试剂 体积(ul)
2×Primer Star Max 25
ddH2O 22
primerF 1
primerR 1
Template 1
2、PCR程序：
Figure BDA0001815708810000281
3、电泳图：
参见图6。图6为OX40 mouse-human chimeric mRNA的RT-PCR电泳图片humanOX40-RTR2。(注：图中箭头标出的为测序的目的片段)
1为278♂-脾脏；2为278♂-胸腺；
3为279♂-脾脏；4为279♂-胸腺；
5为287♀-脾脏；6为287♀-胸腺；
7为289♀-脾脏；8为289♀-胸腺；
9为B6♂-脾脏；10为B6♂-胸腺；
11为B6♀-脾脏；12为B6♀-胸腺；
M为DL2000，条带：
2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
4、测序比对结果：
参见图7,测序结果表明人源化OX40的序列符合预期。
5、结论：
RT-PCR以及测序结果显示，人源化OX40 278#、279#、287#、289#mRNA转录剪接正确，符合预期设计。
(二)FACS分析人源化OX40的表达鉴定
利用流式细胞分选技术，在细胞水平检测Human OX40em1Cin/Nju小鼠体内的人源hOX40是否成功表达，以及人源化蛋白表达后是否对小鼠外周血、脾脏T/B/NK产生影响。
1、实验方案
样品：脾脏、全血
检测指标：CD3、CD8、CD4、CD19、hOX40、mOX40、CD335、IgM
供鼠要求：wt(1♂)、hez(1♂+1♀)、homo(1♂+1♀)
仪器：BD FACSAria II流式细胞仪，Eppendorf 5810R冷冻离心机，组织处理器(GentleMACS)
抗体列表：
Figure BDA0001815708810000291
Figure BDA0001815708810000301
2、实验步骤
1)取材与消化
a.外周血。
眼眶采集小鼠外周血200ul至1.5mLEP管(预先加入EDTA.2K抗凝)，轻轻拨动，避免发生凝血，将血液转移到10mL离心管中，每管加入4mL 1×RBC(10×原液用蒸馏水稀释)，混匀，室温避光裂红10min，8℃，400g，离心5min，去上清。如需要，可2次裂红。用FACS buffer洗涤1次，冰上放置，备用。
b.脾脏处理
取脾脏，称重，置于C型管。C型管中有预冷的酶消化液3ml(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，运行spleen2.2，置于37℃水浴中消化30min。将消化完成的脾脏细胞运行spleen3.3，加300ul 0.1M的EDTA终止消化。用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块。
2)裂红
脾脏与骨髓每管加2ml 1×RBC混匀，室温裂解红细胞1min，加2mlFACS buffer(PBS+2％CS，10mM HEPES)终止。
8℃,400g,离心5min,去上清，加500ul FACS buffer混匀。
FACS buffer洗一次8℃,400g,离心5min,去上清，调整细胞浓度为1×106/mL
3)分管
根据实验需要，将细胞分到不同的流式管中100uL
4)孵育抗体
根据样品管数目配置抗体，按照0.5ul/每管抗体添加，单染管每管加0.5ul抗体，冰上避光孵育1h。
FACS buffer洗两次，4℃290*g离心5min
每管加500ul FACS buffer封口膜封好，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。
3、雌性小鼠实验结果
1)小鼠脾脏重量比较
Figure BDA0001815708810000311
Figure BDA0001815708810000321
不同基因型的雌性小鼠脾脏在重量上没有显著性差异。
2)细胞标志物检测
图8(a)和图8(b)为流式细胞仪检测的细胞分群图片(以外周血细胞为例，脾脏细胞图片略去)。
3)FACS数据统计
Figure BDA0001815708810000322
Figure BDA0001815708810000331
统计结果表明，外周血中，hOX40_Cas9_KI杂合子和纯合子的4周龄雌鼠hOX40表达显著，分别占T细胞的10.93％和21.95％，两者之间有显著差异*。mOX40在hOX40_Cas9_KI杂合子雌鼠中T细胞的比例由0.77％降到0.35％**。mOX40的表达在hOX40_Cas9_KI杂合子和纯合子间差异显著*。OX40人源化后对小鼠T、B、NK细胞的的发育成熟没有影响。
Figure BDA0001815708810000332
统计结果表明，脾脏中，hOX40_Cas9_KI杂合子和纯合子4周龄雌鼠hOX40的表达明显，分别占T细胞的8.27％和16.05％，两者之间有显著差异**。hOX40_Cas9_KI杂合子雌鼠T细胞中mOX40的表达显著下降，由2.8％下降到1.65**。hOX40_Cas9_KI纯合子雌鼠脾脏中T细胞没有明显的变化，hOX40_Cas9_KI纯合子雌鼠脾脏中的B细胞比例由65.9％上升到69.45％*，NK细胞的比例由2.39％下降到1.95％*。hOX40_Cas9_KI杂合子雌鼠脾脏中T/B/NK细胞没有明显的变化。
4、雄性小鼠实验结果
1)小鼠脾脏重量比较
Figure BDA0001815708810000341
不同基因型的雌性小鼠脾脏在重量上没有显著性差异。
2)细胞标志物检测
图9(a)和图9(b)为流式细胞仪检测的细胞分群图片(以外周血细胞为例，脾脏细胞图片略去)。
3)FACS数据统计
Figure BDA0001815708810000351
统计结果表明，外周血中，hOX40_Cas9_KI杂合子和纯合子雄性小鼠hOX40的表达明显，分别占T细胞的10.73％和21.23％，两者之间有显著差异*。而mOX40在野生型小鼠中的比例仅为0.25％。OX40人源化后对小鼠B细胞的发育成熟没有影响，CD4+T细胞的比例显著上升，由40.20％上升到53.20％***，NK细胞的比例略微下降wt 3.41％，homo 2.46％*。
Figure BDA0001815708810000361
统计结果表明，脾脏中，hOX40_Cas9_KI杂合子和纯合子雄性小鼠hOX40的表达明显，分别占T细胞的7.40％和15.93％，两者之间有显著差异*。杂合子中mOX40的表达明显下降，由1.96％下降到0.86％**。脾脏中T/B/NK没有明显的变化。
5、结论
(1)Human OX40em1Cin/Nju小鼠较野生型小鼠在CD3+T细胞中表达OX40比例上存在较大差异。
Human OX40em1Cin/Nju雌鼠外周血中，hOX40 21.95％VS mOX40 0.765％；脾脏中，hOX40 16.05％VS mOX40 2.8％。Human OX40em1Cin/Nju雄鼠外周血中，hOX40 21.23％VSmXO40 0.25％；脾脏中，hOX40 15.93％ VS mOX40 1.96％。
(2)Human OX40em1Cin/Nju雌鼠的OX40表达比例上升的同时，外周血中T/B/NK细胞比例没有显著变化。脾脏中T细胞比例没有显著变化，但B细胞比例略微上升，wt 65.9％，homo 69.45％*；NK细胞比例略微下降，wt 2.39％，homo 1.95％*。
(3)Human OX40em1Cin/Nju雄性小鼠的OX40表达比例上升的同时，外周血中B细胞没有明显的变化，CD4+T细胞的比例显著上升，由40.20％上升到53.20％***，NK细胞略微下降wt 3.41％，homo 2.46％*；脾脏中T/B/NK没有明显的变化。
实施例7Human OX40em1Cin/Nju小鼠接种MC38后评价OX40激动剂的抗肿瘤疗效
1、实验步骤：
(1)小鼠MC38结肠癌皮下肿瘤模型建立
采用MC38细胞专用培养液(10％FBS，90％RPMI-1640 MEDIUM,HEPS(GIBCO22400089)，1×penicillin streptomycin(GIBCO 15140-122))在37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中常规培养肿瘤细胞，隔日换液。
将处于对数生长期的细胞，用胰酶消化后收集在离心管中，离心。用无钙镁PBS重悬细胞，调整细胞终浓度为5×106/ml。
无菌条件下，用注射器抽取瘤细胞悬液，进行皮下注射。注射部位为右侧背部，大腿上方。
每只小鼠注射100ul，即5×105细胞。
设立OX40 Agonist治疗组与对照组。从第5天开始评价肿瘤的生长及小鼠体重。
(2)移植后小鼠观察
每天观察鼠的生长以及健康情况，从第5天开始，每隔2日称重记录，并观察是否有实体瘤生成。
(3)瘤体测量
用指腹按压触碰，左右轻拉小鼠皮肤，明显感觉皮下有凸起物时，为瘤体生长。瘤体明显可测量时，用游标卡尺测量长(a)宽(b)。从第5天开始，每2天测量1次，按照V＝1/2×a×b2，计算瘤体积。
2、实验结果：
从第5天开始评价肿瘤的生长及小鼠体重，数据变化趋势如图10所示。
3、实验结论：
该OX40 Agonist的肿瘤抑制效果明显。在hOX40小鼠上，可进行理想的OX40激动剂的评价实验。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司
<120> 一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
cccacagccc ttctgctgct ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
cacagacgca cactttactc tgg 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
atagcccagc agcagaaggg ctgt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
aaacacagcc cttctgctgc tggg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
atagcacaga cgcacacttt actc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
aaacgagtaa agtgtgcgtc tgtg 24
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 7
ctaagcatgg gctacagaat gagttcaaat gttagcctg 39
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
agcccccacg cacatccttg tctgctttct gccttcac 38
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
gatctgagca ttactacagg agtggatttt atgg 34
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
gcagtactgt tgctacaaag gaccatcaaa cccttctcac 40
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 11
agacaaggat gtgcgtgggg gctcggcggc tg 32
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 12
ccactcctgt agtaatgctc agatcttggc cagggtggag 40
<210> 13
<211> 71
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 13
ggtcctttgt agcaacagta ctgctaacta taacggtcct aaggtagcga atctagagga 60
tccccgggta c 71
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 14
ctcattctgt agcccatgct tagttcgcta ccttaggacc gttatagtta gtcgacctgc 60
aggcatgca 69
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 15
caccatgcag ctcacaactg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 16
ggagctcggt cttgaggatg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 17
tggacagcta caagcctgga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 18
tcaagaccag cctggtctac 20
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 19
ggaagatggg gggtacaagg tcatcg 26
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 20
ttggagcccc tgcagccccc gag 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 21
gcccagcggg gcccccaacc cga 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 22
tcaagaccag cctggtctac agc 23
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 23
acataccttc ttgcctgtcc gcctactctt 30
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 24
ccccaggggg cttgtgggca tc 22
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 25
gcttctacaa cgacgtggtc agctccaag 29
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 26
tgtggagggt actggcaggc atcag 25

Claims (7)

1.一种包含人源化小鼠OX40基因的DNA序列的载体，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人OX40蛋白的功能域，其是将小鼠OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人OX40片段，在替换的同时保留了小鼠OX40基因的UTR区域，保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制，所述载体的制备步骤如下：
①以小鼠基因组为模板，分别利用引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、引物对SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10进行PCR，得到特异的PCR条带，分别命名为H1、H3片段，H1为5’端同源臂，H3为3’端同源臂；
②以人源OX40BAC为模板，利用引物对SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为H2，H2为hOX40序列片段；
③以pMD18-T vector为模板，利用引物对SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为18T骨架；
④将H1、H2、H3、18T骨架共四个片段连接，构建质粒Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor；
⑤用I-CeuI酶切Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor，产物大小4284+2720bp，回收4284bp片段；酚:氯仿抽提，溶于Rnase free的水中，直接用于注射。
2.权利要求1所述的载体在制备OX40基因修饰人源化的动物模型中的用途。
3.一种制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建表达针对鼠源OX40基因的sgRNA的质粒；其中针对鼠源OX40基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2所示；
(2)将人源OX40基因的DNA序列、鼠源OX40基因的3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化OX40基因的载体；
(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产OX40基因修饰人源化鼠模型；
所述载体能够将鼠源OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人源OX40的片段，在替换的同时保留鼠源OX40基因的UTR区域，保证人源OX40表达受鼠自身启动子和调控序列控制，所述载体的制备步骤如下：
①以小鼠基因组为模板，分别利用引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、引物对SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10进行PCR，得到特异的PCR条带，分别命名为H1、H3片段，H1为5’端同源臂，H3为3’端同源臂；
②以人源OX40BAC为模板，利用引物对SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为H2，H2为hOX40序列片段；
③以pMD18-T vector为模板，利用引物对SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为18T骨架；
④将H1、H2、H3、18T骨架共四个片段连接，构建质粒Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor；
⑤用I-CeuI酶切Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor，产物大小4284+2720bp，回收4284bp片段；酚:氯仿抽提，溶于Rnase free的水中，直接用于注射。
4.如权利要求3所述的方法，其中步骤(1)中构建表达sgRNA的质粒的过程如下：
1)BsaI线性化pUC57-gRNA-T7载体，并用CIAP去磷酸化；
2)退火：序列如SEQ ID NO：3和4的上下游引物、以及序列如SEQ ID NO：5和6的上下游引物分别稀释，退火；
3)加磷酸：退火产物进行加磷酸处理
4)连接：取加磷酸后的产物与线性化并去磷酸处理的pUC57-gDNA-T7进行连接，分别获得表达序列如SEQ ID NO：1所示的sgRNA的质粒1和序列如SEQ ID NO：2所示的sgRNA的质粒2。
5.如权利要求3或4所述的方法，进一步包括利用引物鉴定所述动物模型的步骤。
6.权利要求1-2任一项所述的载体或者权利要求3-5任一种所述的方法在制备用于评估靶向OX40的药物有效性、OX40靶向药物筛选开发、免疫检查点肿瘤药物联用的开发、或OX40靶向药物的毒理研究中的模型中的应用。
7.特异性靶向小鼠OX40基因的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
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