CN115161326A - Sost基因人源化非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种SOST基因人源化的非人动物及其构建方法和应用。本发明还提供了一种人源化SOST基因及一种靶向载体。本发明还提供了包含SOST基因人源化的多基因修饰的非人动物的构建方法，以及制备获得的SOST基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物在靶向人SOST信号通路药物的筛选、药效评价中的应用。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种SOST基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
硬化蛋白(Sclerostin,SOST)是由基因SOST编码的一个分泌性蛋白，主要由骨细胞特异性表达，是骨形成的负性调节因子。SOST主要在骨细胞中表达SOST主要表达于原代人成骨细胞、培养分化为成骨细胞的间充质细胞和软骨组织中肥大的软骨细胞。在脂肪细胞或脂肪组织中不表达。甲状旁腺激素和雌激素抑制SOST基因表达，转录因子Osterix、Runx2和Mef2c促进SOST基因表达，而转录因子Sirt1负调控SOST表达。此外，SOST基因表达还受DNA甲基化和microRNA等表观遗传学调控。SOST基因突变可引起骨硬缩症和VanBuchem病，与骨质疏松症相关联。Wnt和BMP是骨代谢调节的两个重要信号途径，SOST可通过结合BMP的Ⅰ型或Ⅱ型受体和Wnt的共受体LRP5/6分别抑制BMP和Wnt信号途径来调控成骨细胞分化和骨形成。抑制SOST为骨质疏松症的治疗提供了新的途径。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,SeiblerJ.Generation and utility of genetically humanized mouse models,Drug DiscovToday；18(23-24):1200-11,2013)。
鉴于SOST在骨质疏松等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化SOST信号通路相关的非人动物模型。
发明内容
本发明制备的SOST基因人源化的非人动物可改进和提升细胞或组织移植，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源SOST蛋白，可作为仅能识别人SOST蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
本发明的第一方面，提供了一种人源化SOST基因。
优选的，所述的人源化SOST基因包含人SOST基因的部分。
优选的，所述的人SOST基因的部分包含编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列。
更优选的，所述的人SOST基因的部分包含编码人SOST蛋白的至少10个到至少213个，优选为10、20、23、30、40、50、100、150、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个连续氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人SOST基因的部分核苷酸序列包含或不包含编码信号肽的部分。
进一步优选的，所述的人SOST基因的部分包含编码人SOST蛋白信号肽的序列，优选包含编码SEQ ID NO：2的1-23位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ IDNO：2的1-23位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的1-23位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的1-23位所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的人SOST基因的部分包含编码SEQ ID NO：2的24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。更进一步优选的，所述的人SOST基因的部分包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化SOST基因的核苷酸序列中连续20bp以上核苷酸与人SOST基因的核苷酸序列一致。
优选的，所述的人源化SOST基因的核苷酸序列中连续20bp到连续5054bp(优选20-3400bp、20-642bp或20-573bp)以上核苷酸与人SOST基因的核苷酸序列一致。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化SOST基因的核苷酸序列中连续50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、570、571、572、573、574、575、600、642、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、4000、5000或5054bp核苷酸与人SOST基因的核苷酸序列一致。
优选的，所述的人SOST基因的部分包含人SOST基因的1号外显子至2号外显子的全部或部分，进一步优选包含人SOST基因1号至2号外显子中的一种或两种的组合的全部或部分，更优选包含人SOST基因1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选还包括1-2号内含子，其中，人SOST基因1号外显子的部分包含至少50bp到至少270bp，优选为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，人SOST基因2号外显子的部分包含至少100bp到至少2026bp，优选为100、200、300、400、420、421、422、423、424、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2020或2026bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化SOST基因包含人SOST基因的全部或部分的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化SOST基因包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化SOST基因中还包含非人动物(优选内源)SOST基因的部分。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含或不包含编码内源SOST蛋白信号肽的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的人源化SOST基因还包含非人动物SOST基因的1号外显子的部分和/或2号外显子的部分，更优选的，所述的人源化SOST基因包含非人动物SOST基因的1号外显子的非编码区和/或2号外显子的非编码区，或者，包含非人动物SOST基因的5’UTR和/或3’UTR。
优选的，所述的人源化SOST基因还包含SEQ ID NO：6和/或7所示核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化SOST基因从5’端到3’端依次包括非人动物SOST基因的5’UTR、人SOST基因的部分(优选包含人SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选包含1号外显子的部分和/或2号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子)、非人动物SOST基因的3’UTR。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化SOST基因从5’端到3’端依次包括非人动物SOST基因的5’UTR、SEQ ID NO：5、非人动物SOST基因的3’UTR。
优选的，所述的人源化SOST基因编码人或人源化SOST蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化SOST基因转录的mRNA包含下列组中的一种：
A)SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的全部或部分；
B)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化SOST基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的人源化SOST基因中包含非人动物SOST基因启动子。优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二方面，提供了一种人或人源化SOST蛋白。
优选的，所述的人或人源化SOST蛋白由非人动物或非人动物细胞表达。
优选的，所述的人或人源化SOST蛋白包含人SOST蛋白的全部或部分。
进一步优选的，所述的人源化SOST蛋白包含人SOST蛋白至少10个到至少213个，优选为10、20、23、30、40、50、100、150、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个连续氨基酸。
优选的，所述的人源化SOST蛋白包含人SOST蛋白的信号肽的全部或部分，进一步优选包含SEQ ID NO：2的1-23位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的1-23位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的1-23位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的1-23位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化SOST蛋白包含SEQ ID NO：2的24-213位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的24-213位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的24-213位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。更优选的，所述的人源化SOST蛋白包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化SOST蛋白还包含非人动物SOST蛋白的全部或部分。
可选的，所述的人源化SOST蛋白还包含非人动物SOST蛋白的部分，所述的非人动物SOST蛋白的部分包含非人动物SOST蛋白的信号肽，优选包含SEQ ID NO：1的1-23位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的1-23位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：1的1-23位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的1-23位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化SOST蛋白包含人SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，进一步优选包含人SOST基因的1号至2号外显子中一种或两种的组合的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选包含人SOST基因的1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，其中，人SOST基因1号外显子的部分包含至少50bp到至少270bp，优选为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270bp连续核苷酸序列，人SOST基因2号外显子的部分包含至少100bp到至少2026bp，优选为100、200、300、400、420、421、422、423、424、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2020或2026bp连续核苷酸序列。
进一步优选的，所述的人源化SOST蛋白包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化SOST蛋白包含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：10所示核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化SOST蛋白包含非人动物SOST基因的全部或部分编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化SOST蛋白的氨基酸序列包含下列组中任一种：
A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。优选的，所述的人源化SOST蛋白由上述的人源化SOST基因编码。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第三方面，提供了一种编码上述人源化SOST蛋白的核酸。
本发明的第四方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
优选的，所述的供体核苷酸包含下列组中的任一种：
A)上述的人源化SOST基因；
B)编码上述的人源化SOST蛋白的核苷酸序列；
C)人SOST基因的部分，优选人SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选人SOST基因的1号至2号外显子中一种或两种的组合的全部或部分，更优选人SOST基因的1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，人SOST基因1号外显子的部分包含至少50bp到至少270bp，优选为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，人SOST基因2号外显子的部分包含至少100bp到至少2026bp，优选为100、200、300、400、420、421、422、423、424、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2020或2026bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选所述人SOST基因的部分包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人SOST蛋白至少10个到至少213个，优选为10、20、23、30、40、50、100、150、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选人SOST蛋白的部分包含或不包含人SOST蛋白的信号肽，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述C)中的人SOST基因的部分核苷酸序列包含或不包含编码信号肽的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述C)中的人SOST基因的部分包含编码人SOST蛋白的核苷酸序列或cDNA序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。其中，
所述的5’臂(5’同源臂)为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物SOST基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：3，更优选如SEQ ID NO：3所示。
所述的3’臂(3’同源臂)为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，其选自非人动物SOST基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述3’臂序列包含SEQ ID NO：4，更优选如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：6和/或7所示核苷酸序列。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物SOST基因的1号外显子至2号外显子上。
进一步优选的，所述的待改变的转换区从1号外显子编码区的第一个核苷酸起到2号外显子编码区的最后一个核苷酸为止。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-D)任一所述的核苷酸序列、3’同源臂。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统具有两个Frt重组位点，分别同向连接在抗性基因的两侧。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第五方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物SOST基因。
本发明的第六方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。
优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。
本发明的第八方面，提供了一种包含上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第九方面，提供了一种上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子、上述载体和/或上述细胞在SOST基因编辑中的应用。
优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第十方面，提供了一种SOST基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化SOST蛋白，和/或，所述的非人动物基因组中包含人或人源化SOST基因。
优选的，所述的非人动物内源SOST蛋白表达降低或缺失。优选的，所述的人源化SOST蛋白包含人SOST蛋白的全部或部分，所述的人SOST蛋白的部分包含或不包含信号肽。
优选的，所述的人源化SOST蛋白为上述的人源化SOST蛋白。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人SOST蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的非人动物基因组中包含编码人SOST蛋白至少10个到至少213个，优选为10、20、23、30、40、50、100、150、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个连续氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人SOST基因的部分核苷酸序列包含或不包含编码信号肽的部分。
更优选的，所述的非人动物基因组中包含编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人SOST基因的部分，进一步优选包含人SOST基因1号至2号外显子的全部或部分，更优选包含人SOST基因1号至2号外显子中的一种或两种的组合的全部或部分，更进一步优选包含人SOST基因1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选还包括1-2号内含子，其中，人SOST基因1号外显子的部分包含至少50bp到至少270bp，优选为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，人SOST基因2号外显子的部分包含至少100bp到至少2026bp，优选为100、200、300、400、420、421、422、423、424、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2020或2026bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物基因组中包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的人SOST基因的部分核苷酸序列包含编码人SOST蛋白的核苷酸序列或cDNA序列。优选的，所述的非人动物基因组中缺失非人动物内源SOST基因的部分。
进一步优选的，所述的非人动物基因组中缺失内源SOST基因1号至2号外显子的一种或两种的组合的全部或部分。更优选的，所述的非人动物基因组中还缺失内源SOST基因的1-2号内含子。
优选的，所述的非人动物基因组中包含非人动物内源SOST基因的部分。
进一步优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的5’UTR和/或3’UTR。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的1号外显子的非编码区和/或2号外显子的非编码区。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含或不包含编码内源SOST蛋白信号肽的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化SOST基因。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列，和/或，人或人源化SOST基因。
优选的，所述的非人动物通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物SOST基因座构建获得：
A)上述的人源化SOST基因；
B)编码上述的人源化SOST蛋白的核苷酸序列；
C)人SOST基因的部分，优选人SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选人SOST基因的1号至2号外显子中一种或两种的组合的全部或部分，更优选人SOST基因的1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，人SOST基因1号外显子的部分包含至少50bp到至少270bp，优选为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，人SOST基因2号外显子的部分包含至少100bp到至少2026bp，优选为100、200、300、400、420、421、422、423、424、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2020或2026bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选所述人SOST基因的部分包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人SOST蛋白至少10个到至少213个，优选为10、20、23、30、40、50、100、150、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选包含编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的编码人或人源化SOST蛋白或人或人源化SOST基因在非人动物体内通过外源或内源调控元件进行调控。更进一步优选的，所述人或人源化SOST基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的调控元件包括但不限于启动子。
编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列、人或人源化SOST基因的核苷酸序列可操作的连接到至少一条染色体中内源性SOST基因的内源调控元件。
在本发明的一个具体实施方式中，编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列、人或人源化SOST基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物SOST启动子之后。
优选的，所述的导入包括插入或替换。
优选的，所述的非人动物包括将人SOST基因的部分插入或替换非人动物SOST基因的全部或部分核苷酸序列获得。
优选的，所述的非人动物包括将编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物SOST基因的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，将编码人SOST蛋白的核苷酸序列或cDNA序列插入或替换非人动物SOST基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的插入位点为SOST基因的内源调控元件之后。进一步优选的，插入位点位于起始密码子上。更进一步优选的，所述插入位点位于起始密码子之前，5’UTR之后。优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体构建。
优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，进一步优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73中的至少一种。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73蛋白中的至少一种。
优选的，所述的人或人源化SOST基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座是纯合的；
优选的，所述的人或人源化SOST基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座是杂合的。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人SOST基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中至少一个染色体上包含上述人源化SOST基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化SOST蛋白。进一步优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达上述人源化SOST蛋白。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十一方面，提供了一种SOST基因人源化的非人动物的构建方法。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化SOST蛋白，和/或，所述的非人动物基因组中包含人或人源化SOST基因。
优选的，所述的人源化SOST蛋白为上述的人源化SOST蛋白。
优选的，所述的非人动物内源SOST蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人SOST蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的非人动物基因组中包含编码人SOST蛋白至少10个到至少213个，优选为10、20、23、30、40、50、100、150、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个连续氨基酸的核苷酸序列。
更优选的，所述的非人动物基因组中包含编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人SOST基因的部分，进一步优选包含人SOST基因1号至2号外显子的全部或部分，更优选包含人SOST基因1号至2号外显子中的一种或两种的组合的全部或部分，更进一步优选包含人SOST基因1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选还包括1-2号内含子，其中，人SOST基因1号外显子的部分包含至少50bp到至少270bp，优选为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，人SOST基因2号外显子的部分包含至少100bp到至少2026bp，优选为100、200、300、400、420、421、422、423、424、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2020或2026bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物基因组中包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，具有SEQ IDNO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中缺失非人动物内源SOST基因的部分。
进一步优选的，所述的非人动物基因组中缺失内源SOST基因1号至2号外显子的一种或两种的组合的全部或部分。更优选的，所述的非人动物基因组中还缺失内源SOST基因的1-2号内含子。
优选的，所述的非人动物基因组中包含非人动物SOST基因的部分。
进一步优选的，所述的非人动物基因组中包含内源SOST基因的部分，所述的内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的5’UTR和/或3’UTR。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的1号外显子的非编码区和/或2号外显子的非编码区。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含或不包含编码内源SOST蛋白信号肽的核苷酸序列。优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化SOST基因。
优选的，所述的构建方法包括将人SOST基因的部分核苷酸序列可操作的连接在非人动物SOST基因座上。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列，和/或，人或人源化SOST基因。
其中，编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列、人或人源化SOST基因的核苷酸序列可操作的连接到至少一条染色体中内源性SOST基因的内源调控元件。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的调控元件为启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列、人或人源化SOST基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物SOST启动子之后。
优选的，所述的人或人源化SOST基因在非人动物体内通过外源或内源调控元件进行调控。更优选的，所述的编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列或人或人源化SOST基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控
在本发明的一个具体实施方式中，所述的调控元件为启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列或人或人源化SOST基因连接至非人动物SOST启动子之后。优选的，所述的非人动物为上述的非人动物。
优选的，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物SOST基因座上：
A)上述的人源化SOST基因；
B)编码上述的人源化SOST蛋白的核苷酸序列；
C)人SOST基因的部分，优选人SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选人SOST基因的1号至2号外显子中一种或两种的组合的全部或部分，更优选人SOST基因的1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，人SOST基因1号外显子的部分包含至少50bp到至少270bp，优选为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，人SOST基因2号外显子的部分包含至少100bp到至少2026bp，优选为100、200、300、400、420、421、422、423、424、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2020或2026bp连续核苷酸序列，或者，人SOST基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选所述人SOST基因的部分包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人SOST蛋白至少10个到至少213个，优选为10、20、23、30、40、50、100、150、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选人SOST蛋白的部分包含或不包含人SOST蛋白的信号肽，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，上述A)-D)中任一个核苷酸序列在质粒上表达或在染色体上表达。优选的，所述C)中的人SOST基因的部分核苷酸序列包含或不包含编码信号肽的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述C)中的人SOST基因的部分核苷酸序列包含编码人SOST蛋白的核苷酸序列或cDNA序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中缺失非人动物内源SOST基因的部分。
优选的，所述的非人动物的基因组中缺失内源SOST基因的1号外显子、2号外显子的一种或两种的组合的全部或部分。优选的，所述的非人动物的基因组中还缺失内源SOST基因的1-2号内含子。
优选的，所述的非人动物基因组中包含内源SOST基因的部分，所述的内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的5’UTR和/或3’UTR。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的1号外显子的非编码区和/或2号外显子的非编码区。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含或不包含编码内源SOST蛋白信号肽的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含如上所述的人源化SOST基因。
优选的，所述的构建方法包括将编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列或人SOST基因的部分核苷酸序列可操作的连接在非人动物SOST基因座上。
优选的，所述的人或人源化SOST基因在非人动物体内通过外源或内源调控元件进行调控。更优选的，编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列或人或人源化SOST基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的调控元件为启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列或人源化SOST基因连接至非人动物SOST启动子之后。
优选的，所述的导入为替换或插入。
其中，所述的插入为在不删除核苷酸的前提下，将目的片段直接置于相邻两个碱基之间，其中目的片段如人SOST基因、人源化SOST基因、编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列、人SOST基因与非人动物SOST基因拼接获得的核苷酸序列。当然也可以为人SOST基因的部分核苷酸序列。
优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能包括破坏非人动物内源SOST基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源SOST基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤既可以给内源SOST基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。在一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物SOST基因的编码框，将包含如上所述的核苷酸序列插入非人动物SOST基因内源调控元件之后，其中，所述的修饰非人动物SOST基因的编码框采用敲除非人动物SOST基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物内源的人源化SOST蛋白不表达、表达降低或表达的内源SOST蛋白无功能，进一步优选的，所述的修饰非人动物SOST基因的编码框优选为敲除非人动物SOST基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。
进一步优选的，所述的插入还可能在插入目的片段后加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点之后的非人动物内源SOST蛋白不能正常表达。
优选的，所述的插入位点为SOST基因的内源调控元件之后。进一步优选的，插入位点位于起始密码子上。更进一步优选的，所述插入位点位于起始密码子之前，5’UTR之后。
其中，所述的替换包括相应位置的替换或不相应位置的替换，所述的相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物SOST基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。
优选的，所述的导入非人动物SOST基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选替换非人动物基因组中编码非人动物SOST蛋白的全部或部分的核苷酸序列，更优选的，非人动物SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分被替换。再优选的，非人动物SOST基因的1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分被替换，进一步优选的，非人动物的1-2号内含子也被替换。
更优选的，非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列被替换。
其中，编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列、人或人源化SOST基因在非人动物体内通过调控元件进行调控。
所述的调控元件可以是内源或外源的，例如所述的调控元件包括但不限于内源启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来源于非人动物SOST基因；所述的外源调控元件来源于人SOST基因。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人SOST基因的部分核苷酸序列插入或替换非人动物SOST基因的全部或部分核苷酸序列获得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人SOST基因1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，插入或替换非人动物SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体方式中，所述的构建方法包括用包含人或人源化SOST基因，或者，编码人或人源化SOST蛋白的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物SOST基因的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人SOST基因的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物编码SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2或其1-23或24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQID NO：1或其1-23或24-211位所示氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人SOST基因的起始密码子ATG至终止密码子TGA的序列替换非人动物内源相应区域(优选非人动物内源SOST基因的起始密码子ATG至终止密码子TGA的序列)。优选的，使用基因编辑技术进行SOST基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，所述的构建方法包括使用上述靶向载体和/或sgRNA进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中(优选为胚胎肝细胞)，筛选出正确的阳性克隆细胞导入已分离好的胚囊中，培养该胚囊，然后将培养后的胚囊移植至磁性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得SOST基因人源化的非人动物。
优选的，为提高重组效率，还可以使用上述的靶向载体于上述sgRNA一起进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、上述sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至磁性非人动物输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得SOST基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，所述的构建方法还包括将SOST基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73中的至少一种。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73蛋白中的至少一种。
优选的，所述的人或人源化SOST基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合的；
优选的，所述的人或人源化SOST基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为杂合的。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人SOST基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中至少一个染色体上包含上述人源化SOST基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人SOST蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达上述人源化SOST蛋白。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。本发明的第十二方面，提供了一种SOST基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失SOST基因的全部或部分，优选缺失SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选缺失SOST基因的1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分。
优选的，所述的非人动物还缺失SOST基因的1-2号内含子。
优选的，所述的非人动物缺失SOST基因的1号外显子的编码区和/或2号外显子的编码区。
本发明的第十三方面，提供了一种所述的SOST基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述的靶向载体和/或上述sgRNA进行SOST基因缺失的非人动物的制备。
本发明的第十四方面，提供了一种SOST基因缺失的细胞，所述的细胞缺失SOST基因的全部或部分，优选缺失SOST基因的1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选缺失SOST基因的1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分。
优选的，所述的细胞还缺失SOST基因的1-2号内含子。
本发明的第十五方面，提供了一种所述的SOST基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法包括采用上述的靶向载体和/或上述sgRNA进行SOST基因缺失细胞的制备。
本发明的第十六方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
1)提供上述任一的非人动物，或采用上述任一的构建方法获得的非人动物；
2)将步骤1)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73修饰的非人动物中的至少一种。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰基因座可以是纯合的。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰基因座可以是杂合的。
本发明的第十七方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。
优选的，所述的非人动物包括SOST基因人源化的非人动物、SOST基因缺失的非人动物或多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十八方面，提供了一种疾病动物模型，所述的疾病动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的非人动物或其子代。
优选的，所述的疾病为与骨细胞分化、骨形成相关的疾病，例如骨质疏松症。
本发明的第十九方面，提供了一种上述的疾病动物模型的构建方法，所述的构建方法包括采用上述的非人动物的构建方法的步骤。
本发明的第二十方面，提供了一种动物肿瘤或炎症模型。
优选的，所述的动物肿瘤或炎症模型来源于上述的非人动物或其子代，或者上述的构建方法获得的非人动物或其子代。
本发明的第二十一方面，提供了一种动物肿瘤或炎症模型的制备方法，所述的制备方法包括采用上述的构建方法制备非人动物的步骤。优选的，所述的制备方法还包括植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第二十二方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的非人动物或其子代在制备动物肿瘤或炎症模型中的应用。
本发明的第二十三方面，提供了一种上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的疾病动物模型或上述的动物肿瘤或炎症模型在制备在治疗和/或预防肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
优选的，所述的炎症或自身免疫疾病包括但不限于I型糖尿病、糖尿病肾病、多发性硬化症、哮喘、动脉粥样硬化、神经性疼痛或类风湿关节炎。
本发明的第二十四方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的疾病动物模型或者上述的动物肿瘤或炎症模型。
本发明的第二十五方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达人SOST蛋白或上述的人源化SOST蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含人SOST基因或上述的人源化SOST基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物、上述的疾病动物模型或者上述的动物肿瘤或炎症模型。
优选的，所述细胞中内源SOST蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的细胞的基因组中包含人SOST基因的部分。进一步优选的，所述的人SOST基因的部分包含1号至2号外显子的全部或部分。优选的，所述的人SOST基因的部分包含1号至2号外显子中的一种或两种的组合的全部或部分。优选的，所述的人SOST基因的部分包含1号外显子的全部或部分和/或2号外显子的全部或部分，优选的还包括第1-2号内含子。
最为优选的，所述的人SOST基因的部分包含人SOST基因第1号外显子的全部或部分和第2号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人SOST基因的部分还包含第1-2号内含子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人SOST基因1号外显子的部分为1号外显子上编码区对应的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人SOST基因2号外显子的部分为2号外显子上编码区对应的核苷酸序列。
优选的，所述的人SOST基因的部分核苷酸序列包含或不包含编码信号肽的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人SOST基因的部分核苷酸序列包含编码人SOST蛋白的核苷酸序列或cDNA序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人SOST基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：
(A)SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；
(B)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(C)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述细胞的基因组中缺失非人动物内源SOST基因的部分。
优选的，所述细胞的基因组中缺失非人动物内源SOST基因1号至第2号外显子的一种或两种的组合的全部或部分。优选的，所述的所述细胞的基因组中还缺失非人动物内源SOST基因的1-2号内含子。
优选的，所述细胞的基因组中包含非人动物内源SOST基因的部分。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的5’UTR和/或3’UTR。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含内源SOST基因的1号外显子的非编码区和/或2号外显子的非编码区。
优选的，所述的非人动物内源SOST基因的部分包含或不包含编码内源SOST蛋白信号肽的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞的基因组中包含上述的人源化SOST基因。
优选的，所述的细胞选自非人动物原代细胞或细胞系，或来源于非人动物的胚胎干细胞、生殖细胞或体细胞。
优选的，所述的组织、器官来源于所述的细胞。
本发明的第二十六方面，提供了一种SOST基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化SOST蛋白，和/或，所述的细胞基因组中包含人或人源化SOST基因。
优选的，所述的非人动物细胞表达的人或人源化SOST蛋白能够识别人SOST蛋白抗体。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化SOST蛋白。
优选的，所述的细胞的基因组中包含上述的人源化SOST基因。
优选的，所述的人源化SOST基因被非人动物的SOST基因的调控元件调控。
优选的所述的细胞选自来自非人动物的原代细胞或细胞系。
在一个具体实施方式中，所述的细胞选自非人动物的胚胎干细胞。
本发明的第二十七方面，提供了一种SOST基因人源化的细胞的构建方法，所述的构建方法包括使用上述靶向载体和/或上述sgRNA进行SOST基因人源化的细胞的构建。
本发明的第二十八方面，提供了来源于上述的人源化SOST蛋白、上述的人源化SOST基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的与骨细胞分化和/或骨形成相关的疾病动物模型、动物肿瘤或炎症模型、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、组织或器官、的应用。
优选的，所述的应用可以为非疾病的诊断和/或治疗目的，也可以为疾病的诊断和/或治疗目的。
优选的，所述的应用包含：
A)在需要涉及人类细胞的与SOST相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与SOST相关的模型系统中的应用；
C)在生产和利用动物实验疾病模型用于与SOST相关的病原学研究，和/或，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；
D)在体内研究人SOST信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)在研究SOST基因功能，研究针对人SOST靶位点的药物、药效，研究与SOST相关的炎症、免疫相关疾病以及抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的第二十九方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的与骨细胞分化和骨形成相关的疾病动物模型、动物肿瘤或炎症模型用于人SOST特异性调节剂的筛选。
本发明的第三十方面，提供了一种人SOST特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的细胞、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的与骨细胞分化和骨形成相关的疾病动物模型、上述的动物肿瘤或炎症模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体结合蛋白或疫苗。所述的抗体结合蛋白为抗体。
具体的，所述的药物可以为抗SOST抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述人SOST特异性调节剂的筛选方法可以为治疗目的或非治疗目的。例如该筛选方法可以用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第三十一方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建动物模型，向动物模型给与候选药物，对给与候选药物的动物模型进行药效检测和/或比较。
优选的，所述的人用药物筛选或评价的方法可以为治疗目的也可以为非治疗目的。例如该方法可以用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
本发明的第三十二方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的细胞、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型。
优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白或疫苗。所述的抗体结合蛋白为抗体。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述干预方案的评价方法可以为治疗目的，也可以为非治疗目的。例如该评价方法可以对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第三十三方面，提供了一种来源于上述的细胞、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型在制备人SOST特异性调节剂中的用途。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于GVHD(移植物抗宿主病)、银屑病、过敏、哮喘、特异性皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的肿瘤包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
通过本发明的构建方法成功构建SOST基因人源化的非人动物，在非人动物体内成功表达了人或人源化SOST蛋白，本发明构建的非人动物可以应用于针对人SOST靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，加快新药研发过程，节约时间和成本。对于研究SOST蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“xx号至xx号外显子”或“xx号至xx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子，例如所述的“1号至2号外显子”或“1号外显子至2号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子和2号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
本发明所述的“人源化SOST蛋白”，包含来源于人SOST蛋白的部分。其中，所述的“人SOST蛋白”同“人SOST蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人SOST蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人SOST蛋白的部分”，为连续或间隔的5-213个(优选为10-213个)，例如5、10、20、23、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、185、189、190、191、192、195、200、210、211、212或213个，氨基酸序列与人SOST蛋白的氨基酸序列一致或与人SOST蛋白的氨基酸序列具有80％以上的同源性。
本发明所述的“人源化SOST基因”，包含来源于人SOST基因的部分和非人SOST基因的部分。其中，所述的“人SOST基因”同“人SOST基因的全部”，即其核苷酸序列与人SOST基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人SOST基因的部分”为连续或间隔的20bp-5054bp(优选20bp-3400bp、20bp-2296bp、20bp-642bp或20bp-573bp)，例如20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、573、574、600、642、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2296、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、4000、5000、5054bp核苷酸序列与人SOST基因的核苷酸序列一致或与人SOST基因的核苷酸序列具有80％以上同源性。
本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或其他体细胞，优选包括但不限于原代人成骨细胞、培养分化为成骨细胞的间充质细胞和软骨组织中肥大的软骨细胞。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-PrkdcscidIL-2rgnull背景的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：人和小鼠SOST基因结构对比示意图(非按比例)；
图2：人源化SOST基因座示意图(非按比例)；
图3：SOST打靶策略示意图(非按比例)；
图4：重组后ES细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照；
图5：人源化SOST小鼠Flp-Frt重组过程示意图(非按比例)；
图6：F1代小鼠PCR结果，其中，WT为野生型对照，PC为阳性对照，M为Marker，H2O为水对照；
图7：脾的RT-PCR结果示意图，其中，GAPDH为内参，+/+为野生型对照，H/+代表人源化SOST杂合小鼠，H2O为水对照；
图8：心脏的RT-PCR结果，其中，GAPDH为内参，+/+为野生型对照，H/H代表人源化SOST纯合小鼠，H2O为水对照；
图9：睾丸的RT-PCR结果示意图，其中，GAPDH为内参，+/+为野生型对照，H/H代表人源化SOST纯合小鼠，H2O为水对照；
图10：野生型C57BL/6小鼠(C57BL/6)和人源化SOST纯合小鼠(H/H)的心脏组织中SOST蛋白的Western blot检测结果，其中，GAPDH为内参；
图11：野生型C57BL/6小鼠(C57BL/6)和人源化SOST纯合小鼠(H/H)的心脏组织中SOST蛋白的ELISA检测结果，其中，β-actin为内参。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从表1所指出的几家公司获得。
表1：设备和材料的来源
| 检测试剂 | 厂家 | 货号 |
| sost-romosozumab-IgG2 | BIOCYTOGEN | / |
| 山羊抗人IgG Fc(HRP) | Abcam | ab97225 |
| β-actin Mouse Monoclonal Antibody | 碧云天 | AF0003 |
| Mouse SOST(Sclerostin)ELISA Kit | Elabscience | E-EL-M2435c |
实施例1 SOST基因人源化小鼠的制备
本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码SOST蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达SOST蛋白。小鼠SOST基因(NCBI GeneID：74499，Primary source：MGI:1921749，UniProt ID：Q99P68，位于11号染色体NC_000077.7的第101853284位至第101857841位，基于转录本NM_024449.6及其编码蛋白NP_077769.4(SEQ ID NO：1))和人SOST基因(NCBI Gene ID：50964，Primary source：HGNC：13771，UniProt ID：Q9BQB4，位于17号染色体NC_000017.11的第43753738-43758791位，基于转录本NM_025237.3及其编码蛋白NP_079513.1(SEQ ID NO：2))。对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源SOST基因座引入编码人SOST蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达SOST蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源SOST基因座上用人SOST基因的核苷酸序列(例如DNA序列、cDNA序列等)替换小鼠相应序列，如将至少包含小鼠SOST基因的起始密码子ATG至终止密码子TGA的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化SOST基因座，也可以SOST基因的起始密码子ATG至终止密码子TGA中间的一部序列进行替换(示意图如图2所示)，实现对小鼠SOST基因的人源化改造。
进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠SOST基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人SOST序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000077.7第101857800至101861199位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000077.7第101848329至101852962位核苷酸序列相同；人SOST序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000017.11的第43755342至43758741位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与小鼠的连接设计为
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR(PCR引物详见表2)和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用ScaI或SspI或EcoRV消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表3所示)检测，Southern Blot检测结果如图4所示，表明8个经PCR验证为阳性的胚胎干细胞(ES-01至ES-08)均为阳性的克隆，且无随机插入。
表2：PCR检测引物序列及目的片段长度
表3：Southern Blot酶和探针表
| 限制性内切酶 | 探针 | 野生型片段大小 | 重组序列片段大小 |
| ScaI | 5’Probe | 15.4kb | 10.4kb |
| SspI | 3’Probe | 13.9kb | 8.0kb |
| EcoRV | Neo Probe | -- | 8.3kb |
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针(5’Probe)：
5’Probe-F：5’-GGTGCCTTTCCACCTTAAGTTGCTT-3’(SEQ ID NO：13)，
5’Probe-R：5’-ACAACAGCACCACCACAGCAGTTAT-3’(SEQ ID NO：14)；
3’探针(3’Probe)：
3’Probe-F：5’-TGATGTCACATGCTCATCTTGCCCT-3’(SEQ ID NO：15)，
3’Probe-R：5’-TACTTGTCCCAGAGGTAAGCGTTGC-3’(SEQ ID NO：16)；
Neo探针(Neo Probe)：
Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：17)，
Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：18)。
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化SOST基因纯合子小鼠。示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01至F1-07的小鼠均为阳性杂合小鼠。PCR测定引物如表4所示
表4：PCR检测引物序列及目的片段长度
这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的SOST人源化基因工程小鼠。可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内SOST蛋白的表达情况，例如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)。本实施例使用Mouse SOST(Sclerostin)ELISA Kit试剂盒(购自Elabscience，Cat NO：E-EL-M2435c)，分别选取9周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和本实施例制得的SOST人源化杂合小鼠(hSOST(H/+)各2只，分别取小鼠血清样本，分离单核细胞，使用20ug/200uL的LPS，刺激1小时，取上清。试验步骤按照试剂盒说明书进行操作。由于人和鼠抗体的交叉反应，在野生型小鼠及SOST基因人源化杂合小鼠中均检测到小鼠SOST蛋白(mSOST)的表达。
提取野生型C57BL/6小鼠和人源化SOST杂合小鼠脾，以及人源化SOST纯合小鼠心脏和睾丸细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，利用引物mSOST-RT-PCR-F：5’-CCCGAGCCTCCTCCTGAGAA-3’(SEQ ID NO：27)和mSOST-RT-PCR-R：5’-CGGCCGCGCGGTCTCCGGC-3’(SEQ ID NO：28)扩增大小为432bp的鼠SOST片段；
利用引物hSOST-RT-PCR-F：5’-CGAGCCTCCACCGGAGCTGGA-3’(SEQ ID NO：29)，和hSOST-RT-PCR-R：5’-GCGGCCGAGCGGCCTCGGTC-3’(SEQ ID NO：21)扩增大小为437bp的人SOST片段。
实验结果显示(见图7-9)，野生型C57BL/6小鼠细胞中仅检测到鼠SOST表达，人源化SOST纯合子小鼠细胞中可检测到人SOST的mRNA表达，人源化SOST杂合子小鼠细胞中可同时检测到人和鼠SOST的mRNA表达。
进一步地，提取野生型C57BL/6小鼠和人源化SOST纯合小鼠的心脏的总蛋白，分别进行Western Blot和ELISA检测，结果如图10-11所示，其中图10为Western Blot检测结果，图11为ELISA检测结果。由于两种检测方法中所用抗体(SOST-romosozumab-IgG2，序列信息参见公开号：WO2020002673(B)的专利文件)可交叉识别人和鼠SOST蛋白，在野生型C57BL/6小鼠和人源化SOST纯合小鼠中均检测到SOST蛋白的表达。但是，结合RT-PCR结果(图8)，人源化SOST纯合小鼠心脏组织中表达的只能是人SOST蛋白。表明本方法制备的SOST人源化小鼠体内可成功表达人SOST蛋白。
实施例2体内药效验证
利用本方法制得的SOST人源化小鼠可以用于评估靶向人SOST的调节剂的药效。例如，构建SOST人源化小鼠的骨质疏松模型，将建模成功的小鼠分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人SOST的药物，对照组注射等体积的生理盐水。定期检测骨质疏松情况并称量小鼠的体重，可通过比较小鼠体重变化和骨质疏松情况即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。
实施例3双基因或多基因人源化小鼠
利用本方法或制得的SOST基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化SOST小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得SOST与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的SOST小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到SOST基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人SOST和其它基因调节剂的体内药效验证等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (19)
1.一种人源化SOST基因，其特征在于，所述的人源化SOST基因包含人SOST基因的部分。
2.根据权利要求1所述的人源化SOST基因，其特征在于，所述的人SOST基因的部分包含编码人SOST蛋白的全部或部分的核苷酸序列；优选的，所述的人SOST基因的部分包含编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
3.根据权利要求1-2任一所述的人源化SOST基因，其特征在于，所述的人SOST基因的部分包含人SOST基因的1号外显子的部分和/或2号外显子的部分，其中，人SOST基因的1号外显子的部分至少包含50bp连续核苷酸序列，人SOST基因的2号外显子的部分至少包含100bp连续核苷酸序列；进一步优选的，所述的人SOST基因的部分包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的人源化SOST基因，其特征在于，所述的人源化SOST基因还包含非人动物SOST基因的部分，所述的非人动物SOST基因的部分包括非人动物SOST基因的5’UTR和/或3’UTR。
5.根据权利要求1-4任一所述的人源化SOST基因，其特征在于，所述的人源化SOST基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
B)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
D)具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
6.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)权利要求1-5任一所述的人源化SOST基因；
B)人SOST基因的部分，优选人SOST基因的1号外显子的部分和/或2号外显子的部分，其中，人SOST基因的1号外显子的部分至少包含50bp连续核苷酸序列，人SOST基因的2号外显子的部分至少包含100bp连续核苷酸序列；进一步优选包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或，
C)编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
8.一种SOST基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化SOST蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化SOST基因；
优选的，人源化SOST基因为权利要求1-5任一所述的人源化SOST基因。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的内源SOST蛋白表达降低或缺失。
10.根据权利要求8-9任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物SOST基因座上：
A)权利要求1-5任一所述的人源化SOST基因；
B)人SOST基因的部分，优选人SOST基因的1号外显子的部分和/或2号外显子的部分，其中，人SOST基因的1号外显子的部分至少包含50bp连续核苷酸序列，人SOST基因的2号外显子的部分至少包含100bp连续核苷酸序列；进一步优选包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或，
C)编码人SOST蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2或其24-213位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，
优选的，所述的导入非人动物SOST基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物SOST基因的1号外显子的部分和/或2号外显子的部分被替换，进一步优选的，非人动物的1-2号内含子也被替换。
12.根据权利要求8-11任一所述的构建方法，其特征在于，其中，人或人源化SOST基因、编码人SOST蛋白的核苷酸序列在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。
13.根据权利要求8-12任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求6-7任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。
14.根据权利要求8-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将SOST基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；
优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73中的至少一种。
15.根据权利要求8-14任一所述的构建方法，其特征在于，人或人源化SOST基因和/或其他基因对于内源被修饰SOST基因座是纯合或杂合的。
16.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含权利要求1-5任一所述的人源化SOST基因，或者，所述的细胞、组织或器官表达人SOST蛋白，或者，所述细胞、组织或器官来源于权利要求8-15任一所述的构建方法获得的非人动物。
17.一种荷瘤后的瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织的基因组中包含权利要求1-5任一所述的人源化SOST基因，或者，所述的瘤组织表达人SOST蛋白，或者，所述的瘤组织来源于权利要求8-15任一所述的构建方法获得的非人动物。
18.一种权利要求1-5任一所述的人源化SOST基因，或，权利要求8-15任一所述的构建方法获得的非人动物，或，权利要求16所述的细胞、组织或器官，或，权利要求17所述的瘤组织的应用，其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与SOST相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与SOST相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与SOST相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人SOST信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究SOST基因功能，研究针对人SOST靶位点的药物、药效，研究与SOST相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
19.根据权利要求4-5任一所述的人源化SOST基因、权利要求8-15任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为大鼠或小鼠。
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