CN116138217A - Ccn2基因人源化非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CCN2基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化CCN2基因、一种CCN2基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人CCN2蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CCN2蛋白，可以作为人CCN2信号机理研究、炎症、肿瘤、纤维化和纤维增生性疾病或免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CCN2基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
CCN2(cellular communication network factor 2)是作为一种具有有丝分裂活性的血小板来源的生长因子相关蛋白而被发现，因此也被称为结缔组织生长因子，是一种富含半胱氨酸的母细胞蛋白，具有4个功能性结构域：胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、von Wille-brand因子C型重复(VWC)、血小板反应蛋白I型重复(TSP-1)和含半胱氨酸结基序的羧基末端结构域(CTCK)，通过与骨形态发生蛋白2(BMP2)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、血管内皮生长因子(VEGF)等多种生长因子结合并以复合物形式参与多个信号通路的调节，包括控制细胞增殖、分化、粘附、血管生成等生理过程，以及肿瘤发生、组织纤维化等多种病理过程。
正常细胞中，CCN2刺激间充质细胞的粘附、迁移和增殖及其ECM(细胞外基质)生成。CCN2在胚胎发育和富含ECM的组织(如软骨和骨)快速生长期间以及愈合期间高度表达。当发育和生长完成或覆盖伤口缺损时，CCN2的上调表达立即终止，这些过程被称为“生理状态”。然而，如果过度表达持续存在，将导致纤维化和瘢痕形成，这是一种“病理状态”。
CCN2在多种纤维化和纤维增生性疾病中持续过表达，包括硬皮病、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、Dupuytren病、牙龈增生、肝纤维化、胰腺纤维化、心脏纤维化、特发性肺纤维化和肌营养不良等。除此之外，CCN2在具有显著肿瘤间质的高转移性癌症，如胰腺癌和黑素瘤中也过表达。因此，CCN2被认为是抗纤维化治疗以及肿瘤治疗的重要靶点。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
鉴于CCN2在纤维化及肿瘤治疗领域的潜在应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发CCN2相关信号通路的非人动物模型。
发明内容
本发明制备的CCN2基因人源化非人动物可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人CCN2基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源CCN2蛋白，可作为仅能识别人CCN2蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
本发明的第一方面，提供了一种人源化CCN2基因。
优选的，所述的人源化CCN2基因包含人CCN2基因的部分。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码人CCN2蛋白全部或部分的核苷酸序列；进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的人源化CCN2基因包含编码胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、von Wille-brand因子C型重复(VWC)、血小板反应蛋白I型重复(TSP-1)和/或含半胱氨酸结基序的羧基末端结构域(CTCK)的全部或部分的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2基因包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子，其中，人CCN2基因的1号外显子的部分包含1号外显子至少20bp到至少266bp，例如20、30、40、50、60、66、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或266bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，人CCN2基因的5号外显子的部分包含5号外显子至少100到至少1385bp，例如100、200、297、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1385bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的5号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含从起始密码子到终止密码子的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCN2基因的部分包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化CCN2基因还包含非人动物CCN2基因的全部或部分。优选包含非人动物CCN2基因1号外显子的部分和/或5号外显子的部分，进一步优选包含非人动物CCN2基因5’UTR的核苷酸序列和/或3’UTR的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化CCN2基因还包括如SEQ ID NO：9和/或10所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2基因从5’端到3’端依次包括非人动物5’UTR、人CCN2基因的部分(优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包括人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子)、非人动物3’UTR。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2基因从5’端到3’端依次包括非人动物5’UTR、SEQ ID NO：7或编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列、非人动物3’UTR。
优选的，所述的人源化CCN2基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二方面，提供了一种人源化CCN2蛋白。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白包含人CCN2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白包含人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸序列。
进一步优选的，所述的人源化CCN2蛋白包含胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、von Wille-brand因子C型重复(VWC)、血小板反应蛋白I型重复(TSP-1)和/或含半胱氨酸结基序的羧基末端结构域(CTCK)的全部或部分。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白包括人CCN2基因1号至5号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，进一步优选包含1号至5号外显子中的任一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列；更进一步优选包含1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分包含至少20bp到至少266bp，例如20、30、40、50、60、66、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或266bp连续核苷酸序列，或者，1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100到至少1385bp，例如100、200、297、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1385bp连续核苷酸序列，或者，5号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2蛋白包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白由上述第一方面的人源化CCN2基因编码。
本发明的第三方面，提供了一种靶向载体。
优选的，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)人CCN2基因的部分，优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子，更进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子，其中，人CCN2基因的1号外显子的部分包含1号外显子至少20bp到至少266bp，例如20、30、40、50、60、66、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或266bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人CCN2基因的5号外显子的部分包含5号外显子至少100bp到至少1385bp，例如100、200、297、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1385bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的5号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选包含编码人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸序列的核苷酸序列；进一步优选包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
C)编码人或人源化CCN2蛋白(优选为上述的人源化CCN2蛋白)的核苷酸序列；或，
D)人或人源化CCN2基因(优选为上述的人源化CCN2基因)。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物CCN2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选的，所述的5’臂为与NCBI登录号为NC_000076.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：3或5，更优选如SEQ ID NO：3或5所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，其选自非人动物CCN2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选的，所述的3’臂为与NCBI登录号为NC_000076.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列包含SEQ ID NO：4或6，更优选如SEQ ID NO：4或6所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：9和/或10所示的核苷酸序列。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CCN2基因的1号至5号外显子上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-D)任一所述的核苷酸序列、3’同源臂。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第四方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物CCN2基因，其靶位点位于非人动物CCN2基因的1号至5号外显子上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于CCN2基因的1号外显子和/或5号外显子上。
优选的，所述的sgRNA在CCN2基因上的靶序列包含SEQ ID NO：15和/或16。
本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。
优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链的核苷酸序列如SEQ IDNO：17和SEQ ID NO:19，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO:20，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO:23，或者，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO:24。
本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgRNA或上述DNA分子的载体。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第八方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述的载体和/或上述细胞在CCN2基因编辑中的应用。
优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第九方面，提供了一种CCN2基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化CCN2蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白包含人CCN2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白包含人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化CCN2蛋白。
优选的，所述的人源化CCN2基因包含人CCN2基因的部分。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列；进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列或者包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含至少20bp连续核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列；优选的，所述的人CCN2基因的部分包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含从起始密码子到终止密码子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化CCN2基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化CCN2基因。
优选的，所述的非人动物的内源CCN2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，优选包含人CCN2基因1号至5号外显子的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子，其中，人CCN2基因的1号外显子的部分包含1号外显子至少20bp到至少266bp，例如20、30、40、50、60、66、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或266bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人CCN2基因的5号外显子的部分包含5号外显子至少100bp到至少1385bp，例如100、200、297、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1385bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的5号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含人CCN2基因的部分或上述的人源化CCN2基因或编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列。
优选的，人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因的核苷酸序列，和/或，编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性CCN2基因的内源调控元件。
优选的，所述的非人动物通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物CCN2基因座上构建获得：
A)人CCN2基因的部分，优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子，更进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子，其中，人CCN2基因的1号外显子的部分包含1号外显子至少20bp到至少266bp，例如20、30、40、50、60、66、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或266bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人CCN2基因的5号外显子的部分包含5号外显子至少100bp到至少1385bp，例如100、200、297、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1385bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的5号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选包含编码人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸序列的核苷酸序列；进一步优选包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
C)编码人或人源化CCN2蛋白(优选为上述的人源化CCN2蛋白)的核苷酸序列；或，
D)人或人源化CCN2基因(优选为上述的人源化CCN2基因)。
优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体构建。
优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，进一步优选的，所述其他基因选自EGFR、HER2、VEGF、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、TNFR2、IL-2、IL-15、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28中的至少一种。
优选的，人或人源化CCN2基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。
优选的，人或人源化CCN2基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十方面，提供了一种CCN2基因人源化的非人动物的构建方法。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化CCN2蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白包含人CCN2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白包含人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCN2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化CCN2蛋白。
优选的，所述的人源化CCN2基因包含人CCN2基因的部分。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列；进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列或者包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含至少20bp连续核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列；优选的，所述的人CCN2基因的部分包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含从起始密码子到终止密码子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化CCN2基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化CCN2基因。
优选的，所述的非人动物的内源CCN2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，优选包含人CCN2基因1号至5号外显子的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子，其中，人CCN2基因的1号外显子的部分包含1号外显子至少20bp到至少266bp，例如20、30、40、50、60、66、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或266bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人CCN2基因的5号外显子的部分包含5号外显子至少100bp到至少1385bp，例如100、200、297、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1385bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的5号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含人CCN2基因的部分或上述的人源化CCN2基因或编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列。
优选的，人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因的核苷酸序列，和/或，编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性CCN2基因的内源调控元件。
优选的，所述的非人动物为上述的CCN2基因人源化的非人动物。
优选的，所述的构建方法包括将包含下列任一种的核苷酸序列导入非人动物CCN2基因座上：
A)人CCN2基因的部分，优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子，更进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子，其中，人CCN2基因的1号外显子的部分包含1号外显子至少20bp到至少266bp，例如20、30、40、50、60、66、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或266bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人CCN2基因的5号外显子的部分包含5号外显子至少100bp到至少1385bp，例如100、200、297、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1385bp连续核苷酸序列，或者，人CCN2基因的5号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选包含编码人CCN2蛋白至少50个到至少349个，例如50、100、150、200、250、300、310、320、330、340或349个连续氨基酸序列的核苷酸序列；进一步优选包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
C)编码人或人源化CCN2蛋白(优选为上述的人源化CCN2蛋白)的核苷酸序列；或，
D)人或人源化CCN2基因(优选为上述的人源化CCN2基因)。
优选的，上述A)-D)中的任一个核苷酸序列在质粒上表达或在染色体上表达。
优选的，所述的导入包括但不限于插入或替换或转基因。
优选的，所述的导入的位置位于非人动物CCN2基因的内源调控元件之后。
其中，所述的插入为在不删除核苷酸的前提下，将目的片段直接置于相邻两个碱基之间。其中，目的片段例如人CCN2基因、人源化CCN2基因、编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列、人CCN2与非人CCN2基因拼接获得的核苷酸序列。当然也可以为人CCN2基因的部分核苷酸序列，例如在非人动物CCN2基因1号外显子紧邻插入人CCN2基因的2号至5号外显子，在非人动物CCN2基因的2号外显子紧邻插入人CCN2基因的3号至5号外显子，在非人动物的3号外显子紧邻插入人CCN2基因的4号至5号外显子等等。
优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能包括破坏非人动物内源CCN2基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源CCN2基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源CCN2基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
进一步优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能在插入的目的片段后加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源CCN2蛋白不能正常表达。优选的，所述的辅助序列可以为WPRE和/或STOP序列。
其中，所述的替换包括相应位置的替换或不相应位置的替换。所述相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物CCN2基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。例如用编码人CCN2蛋白的信号肽的核苷酸序列替换编码非人动物CCN2蛋白的信号肽的核苷酸序列等等。
优选的，所述的导入非人动物CCN2基因座为替换非人动物相应区域。
进一步优选的，非人动物CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分被替换。更优选替换非人动物基因组中编码非人动物CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
进一步优选的，非人动物CCN2基因中编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列被替换。
优选的，所述的人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因，和/或，编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列在非人动物体内通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。
优选的，所述的调控元件包括但不限于启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，内源调控元件来自非人动物CCN2基因。外源性调控元件来自人CCN2基因。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人CCN2蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换编码非人动物CCN2蛋白的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人CCN2基因的全部或部分插入或替换非人动物CCN2基因的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分插入或替换非人动物CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或4-5号内含子，插入或替换非人动物CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列或者人或人源化CCN2基因的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人CCN2基因的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明的第一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在非人动物内源CCN2基因座处用人CCN2基因的基因组片段置换非人动物CCN2基因的基因组片段以形成经修饰的CCN2基因。
优选的，所述的经修饰的CCN2基因编码人源化CCN2蛋白，优选编码上述的人源化CCN2蛋白。
优选的，所述的经修饰的CCN2基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人源化的CCN2基因座，在该基因座中，内源CCN2基因座的区段已被缺失并被替换为对应的人CCN2序列。
优选的，所述的人源化的内源CCN2基因座包括非人动物内源CCN2启动子，其中，人CCN2序列可操作的连接到非人动物内源CCN2启动子。
优选的，非人动物内源CCN2基因座的至少一个内含子和/或外显子已被缺失并被替换为所对应的人CCN2序列。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物内源CCN2基因座的整个CCN2编码序列已被缺失并被替换为所对应的人CCN2序列。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物内源CCN2基因座从起始密码子到终止密码子的区段已被缺失并被替换为所对应的人CCN2序列。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物CCN2的5’非翻译区和/或3’非翻译区尚未被缺失并尚未被替换为所对应的人CCN2序列。
优选的，所述的构建方法使用基因编辑技术进行CCN2基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，所述的构建方法包括使用上述的靶向载体和/或sgRNA进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中(优选为胚胎干细胞)，筛选出正确的阳性克隆细胞导入已分离好的囊胚中，培养该囊胚，然后将培养后的囊胚移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CCN2基因人源化的非人动物。
优选的，为提高重组效率，还可以使用上述的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、上述的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CCN2基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将CCN2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因选自EGFR、HER2、VEGF、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、TNFR2、IL-2、IL-15、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28中的至少一种。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的EGFR、HER2、VEGF、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、TNFR2、IL-2、IL-15、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28蛋白中的至少一种。
优选的，人或人源化CCN2基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。
优选的，人或人源化CCN2基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十一方面，提供了一种CCN2基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失CCN2基因的全部或部分，优选缺失CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分。
本发明的第十二方面，提供了一种CCN2基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体和/或上述的sgRNA进行CCN2基因缺失的非人动物的制备。
本发明的第十三方面，提供了一种CCN2基因缺失的细胞，所述的细胞缺失CCN2基因的全部或部分，优选缺失CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分。
本发明的第十四方面，提供了一种CCN2基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法包括使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行CCN2基因缺失的细胞的构建。
本发明的第十五方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，包括如下步骤：
I)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；
II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因EGFR、HER2、VEGF、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、TNFR2、IL-2、IL-15、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28修饰的非人动物的至少一种。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰(优选替换)基因座均为纯合的。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰(优选替换)基因座均为杂合的。
本发明的第十六方面，提供了上述任一构建方法获得的非人动物或其子代。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十七方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化CCN2蛋白或人CCN2蛋白，和/或，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含人CCN2基因的部分或上述的人源化CCN2基因，和/或，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第十八方面，提供了一种瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化CCN2蛋白或人CCN2蛋白，和/或，所述的瘤组织的基因组中包含人CCN2基因的部分或上述的人源化CCN2基因，和/或，所述的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第十九方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第二十方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述的构建方法是利用上述的非人动物，或者，上述构建方法获得的非人动物进行的。
优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。进一步优选的，所述的构建方法还包括植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第二十一方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。
本发明的第二十二方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物、上述的动物模型或者上述构建方法获得的动物模型在制备治疗和/或预防肿瘤、纤维化和纤维增生性疾病、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明的第二十三方面，提供了一种CCN2基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化CCN2蛋白，或者，所述的细胞的基因组中包含人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化CCN2蛋白。
优选的，所述的细胞的基因组中包含上述的人源化CCN2基因。本发明的第二十四方面，提供了一种CCN2基因人源化的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行CCN2基因人源化的细胞的构建。
本发明的第二十五方面，提供了一种CCN2基因人源化的非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化CCN2基因的全部或部分，和/或，编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列的全部或部分。
优选的，所述的人源化CCN2基因为上述的人源化CCN2基因。
优选的，所述的人源化CCN2蛋白为上述的人源化CCN2蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源CCN2基因座处用人CCN2基因的基因组片段(优选人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分)置换非人动物CCN2基因的基因组片段以形成经修饰的CCN2基因。
优选的，被置换的非人动物CCN2基因的基因组片段包含非人动物CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分。
优选的，所述的经修饰的CCN2基因编码人源化CCN2蛋白，优选编码上述的人源化CCN2蛋白。
优选的，所述的经修饰的CCN2基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人源化的CCN2基因座，在该基因座中，内源CCN2基因座的区段已被缺失并被替换为对应的人CCN2序列。
优选的，所述的人源化的内源CCN2基因座包括非人动物内源CCN2启动子，其中，人CCN2序列可操作的连接到非人动物内源CCN2启动子。
优选的，非人动物内源CCN2基因座的至少一个内含子和/或外显子已被缺失并被替换为所对应的人CCN2序列。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物内源CCN2基因座的整个CCN2编码序列已被缺失并被替换为所对应的人CCN2序列。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物内源CCN2基因座从起始密码子到终止密码子的区段已被缺失并被替换为所对应的人CCN2序列。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物CCN2的5’非翻译区和/或3’非翻译区尚未被缺失并尚未被替换为所对应的人CCN2序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十六方面，提供了一种上述的人源化CCN2蛋白、上述的人源化CCN2基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述的细胞、组织或器官、瘤组织、上述动物模型或上述构建方法获得的动物模型的应用。
优选的，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与CCN2相关的免疫过程的产品开发中的应用；所述的产品优选为抗体；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与CCN2相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与CCN2相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)筛选、验证、评价或研究CCN2通路功能；优选为人CCN2通路信号机理；或者，
E)筛选和评估与CCN2靶点相关的人用药及药效研究方面的应用；优选的，所述的药物优选为抗体、免疫相关药物。
优选的，所述的应用为与CCN2基因或蛋白相关的应用。
本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型或上述的构建方法获得的动物模型用于人CCN2特异性调节剂的筛选。
本发明的第二十八方面，提供了一种人CCN2特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型或者上述的构建方法获得的动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗CCN2抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述筛选方法可以为治疗目的或非治疗目的。例如该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第二十九方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建动物模型，向动物模型给予候选药物，对给予候选药物的动物模型进行药效检测和/或比较。
优选的，所述人用药物筛选或评价的方法可以为治疗目的或非治疗目的。例如该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
本发明所述的“纤维化和纤维增生性疾病”包括但不限于硬皮病、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、Dupuytren病、牙龈增生、肝纤维化、胰腺纤维化、心脏纤维化、特发性肺纤维化或肌营养不良等等。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于GVHD(移植物抗宿主病)、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
本发明所述“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CCN2基因座”表示CCN2基因1号至5号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的CCN2基因座可以是CCN2基因1号至5号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化CCN2蛋白”，包含来源于人CCN2蛋白的部分。其中，所述的“人CCN2蛋白”同“人CCN2蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人CCN2蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CCN2蛋白的部分”，为连续或间隔的5-349个(优选为10-349个，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、349个)氨基酸序列与人CCN2蛋白的氨基酸序列一致或与人CCN2蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化CCN2基因”，包含来源于人CCN2基因的部分。其中，所述的“人CCN2基因”同“人CCN2基因的全部”，即其核苷酸序列与人CCN2基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人CCN2基因的部分”为连续或间隔的20bp-3197bp(优选为20bp-1909bp、20bp-2338bp或20bp-1050bp，例如20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、1909、2000、2100、2200、2300、2338、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3197bp)核苷酸序列与人CCN2核苷酸序列一致或与人CCN2核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“4号至5号外显子”包含4号外显子、4-5号内含子和5号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个、几百个或几千个核苷酸与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人CCN2基因的5号外显子的部分，包含连续或间隔的5-1385bp。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、红细胞、单核细胞、小胶质细胞、粒细胞、活化的巨噬细胞、树突状细胞、以及肿瘤细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“组织”或“器官”不能发育为个体。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠CCN2基因和人CCN2基因座对比示意图(非按比例)；
图2：小鼠CCN2基因人源化改造示意图(非按比例)；
图3：CCN2基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
图4：CCN2基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；
图5：CCN2基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
图6：CCN2基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型对照，H2O为水对照，M为Marker；
图7：Southern Blot检测结果示意图，其中WT为野生型对照；
图8：Western blot检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为CCN2基因人源化纯合子小鼠，β-actin为β肌动蛋白内参；
图9：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CCN2基因人源化纯合子小鼠(H/H)RT-PCR检测结果，其中，H2O为水对照，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参；
图10：CCN2人源化纯合子小鼠肺纤维化模型组(G2)、对照组(G1)、治疗组(G3)的体重情况；
图11：CCN2人源化纯合子小鼠肺纤维化模型组(G2)、对照组(G1)、治疗组(G3)的体重变化情况；
图12：CCN2人源化纯合子小鼠肺纤维化模型组(G2)、对照组(G1)、治疗组(G3)的肺部HYP含量检测情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
BspHI、BstEII、BbsI、EcoRI、BamHI酶购自NEB，货号分别为R0517S、R0162S、R0539L、R0101M、R0136M；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
重组Anti-CTGF抗体购自Abcam，货号：ab209780；
TRIzolTMReagent购自Invitrogen，货号：15596018；
PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser购自Takara，货号：6110A；
β-Actin Mouse Monoclonal Antibody购自碧云天，货号：AF5001。
实施例1：CCN2基因人源化小鼠
小鼠CCN2基因(NCBI Gene ID：14219，Primary source：MGI：95537，UniProt ID：P29268，位于10号染色体NC_000076.7的第24471340至24474581位，基于转录本NM_010217.2及其编码蛋白NP_034347.2(SEQ ID NO：1))和人CCN2基因(NCBI Gene ID：1490，Primary source：HGNC：2500，UniProt ID：P29279，位于6号染色体NC_000006.12的第131948176至131951372位，基于转录本NM_001901.4及其编码蛋白NP_001892.2(SEQ IDNO：2))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CCN2基因座引入编码人CCN2蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CCN2蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠CCN2基因调节元件的控制下，用包含人CCN2基因的1号外显子部分序列至5号外显子部分序列约1.9kb替换小鼠1号外显子的部分序列至5号外显子的部分序列约1.9kb，得到人源化CCN2基因座示意图如图2所示，实现对小鼠CCN2基因的人源化改造。
设计如图3所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠CCN2基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CCN2 DNA片段的A片段。其中，上游5’同源臂序列(SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000076.7的第24467752至24471623位核苷酸序列相同，下游3’同源臂序列(SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000076.7的第24474914至24478703位核苷酸序列相同。A片段上人CCN2 DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000006.12的第131949264至131951172位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统FRT重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为：5’-TAAAGCTAATTTATAATCTTTCACATCACAGATTAGTTAACGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGA-3’(SEQ ID NO：9)，其中序列“ATTA”中最后一个“A”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“GTTA”中的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为：5’-TCTAGA AAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCATCTGTGCCTTACATGGA GAAT-3’(SEQ ID NO：10)，其中序列“ATCC”中最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“ATCT”中的“A”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CCN2的mRNA序列如SEQ ID NO：8所示，表达的蛋白序列如SEQID NO：2所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经PCR鉴定(引物如表1所示)为阳性的克隆再进行Southern Blot检测确认无随机插入后，进一步测序验证正确的克隆进行下一步实验。
表1：PCR引物名称及具体序列
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图4)后，再通过互相交配即可得到CCN2基因人源化纯合子小鼠。
此外，还可引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，设计如图5所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠CCN2基因上游和下游的同源臂序列，以及人CCN2 DNA片段序列。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000076.7的第24470230至24471623位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000076.7的第24473510至24474973位核苷酸序列相同，人CCN2 DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000006.12的第131949264至131951172位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠CCN2的mRNA序列如SEQ ID NO：8所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，示例性sgRNA在CCN2基因上的靶序列如下：
sgRNA1靶位点(SEQ ID NO：15)：5’-CGTCCCTTCCGTCAGTCCCGGGG-3’；
sgRNA2靶位点(SEQ ID NO：16)：5’-CGTACATCTTCCTGTAGTACAGG-3’；
利用UCA试剂盒检测sgRNA的活性，确定其可介导高效切割效率后，在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表2)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-CCN2-1和pT7-CCN2-2。
表2：sgRNA1和sgRNA2序列列表
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：25)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-CCN2-1和pT7-CCN2-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的CCN2基因人源化小鼠品系。
可通过PCR鉴定F1代小鼠体细胞的基因型(引物如表1所示)，示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03和F1-04的小鼠为阳性杂合子小鼠。
对F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BspHI酶或BstEII酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表3，示例性F1代的检测结果如图7所示，F1-01、F1-02、F1-03和F1-04均为阳性杂合子小鼠。这表明使用本方法成功构建出可稳定传代且无随机插入的CCN2基因人源化小鼠。
表3：具体探针及目的片段的长度
| 限制性内切酶 | 探针 | 野生型片段大小 | 重组序列片段大小 |
| BspHI | 5’Probe | 4.7kb | 2.9kb |
| BstEII | 3’Probe | 19.8kb | 12.7kb |
探针合成引物如下：
5’Probe-F(SEQ ID NO：26)：5’-CAACACACGAGCAGGGGATAAAGC-3’，
5’Probe-R(SEQ ID NO：27)：5’-CAGGCATTTGATCTTTGGTCACTGG-3’；
3’Probe-F(SEQ ID NO：28)：5’-GAAGGTGATTCCACACTATTGTCCCAC-3’，
3’Probe-R(SEQ ID NO：29)：5’-GTTTCCCCCCACAATTCTTTGATTCC-3’；
使用Western Blot检测小鼠体内CCN2蛋白的表达情况。具体来说，分别选取8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和本实施例制备的CCN2基因人源化纯合子各1只，脱颈安乐死后取肾脏组织，并使用人鼠交叉CCN2抗体(重组Anti-CTGF抗体)和β-Actin Mouse MonoclonalAntibody进行Western Blot检测，检测结果如图8所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠和CCN2基因人源化纯合子小鼠体内均检测出CCN2蛋白。
因Western Blot检测所用CCN2抗体可以交叉识别人CCN2和小鼠CCN2蛋白，为验证CCN2基因人源化纯合子小鼠体内检测到的CCN2蛋白为人CCN2蛋白，进一步通过RT-PCR检测小鼠体内CCN2 mRNA的表达情况。具体来说，分别取C57BL/6野生型小鼠和本实施例获得的CCN2基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取肾脏组织和血浆，按照TRIzolTMReagent和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测(引物见表4)，检测结果(如图9所示)显示：在C57BL/6野生型小鼠体内仅检测到鼠CCN2 mRNA，未检测到人CCN2 mRNA；在CCN2基因人源化纯合子小鼠体内仅检测到人CCN2 mRNA。结合Western Blot检测结果，说明本实施制备的CCN2基因人源化小鼠体内可成功表达人CCN2蛋白。
表4：RT-PCR引物名称及具体序列
实施例2：药效验证
利用本方法制得的CCN2基因人源化小鼠可以用于评估靶向人CCN2抗体的药效。例如，取8周龄CCN2基因人源化纯合子小鼠，腹腔注射四氯化碳，每周两次，诱导数周后可形成肝纤维化小鼠模型。将小鼠模型分为对照组或治疗组，治疗组注射靶向人CCN2的抗体药物，对照组注射等体积的生理盐水。然后测定肝功能指标：血浆中的转氨酶量、肝组织中的羟基脯氨酸量，或者进行免疫组化分析，可有效评估抗体药物在人源化CCN2小鼠体内的安全性和体内药效。
还可以构建CCN2人源化小鼠肺纤维化模型评估靶向CCN2抗体的药效。例如，取8～10周龄CCN2基因人源化纯合子小鼠建立肺纤维化小鼠模型，具体的，CCN2人源化小鼠根据体重情况随机分为对照组、造模组或治疗组，每组4～9只小鼠。造模方案为：麻醉小鼠，暴露小鼠气管，向气管内注射博来霉素(bleomycin)每只约20ug，对照组注射等体积的生理盐水(Saline)。治疗组在注射博来霉素前2小时，向小鼠体内第一次给药注射10mg/kgPamrevlumab analog。造模组注射等体积PBS，给药频率为2天给药一次，共给药7次(具体给药情况如下表5)。给药当天测定小鼠体重，之后每2天测一次，共测量8次。在第一次给药后14天安乐死小鼠，取肺部组织，左肺进行苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)或免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理检测，右肺检测羟脯氨酸(HYP)的含量。
Pamrevlumab是一种靶向CCN2的IgG1亚型全人源抗体，由FibroGen开发，其重链(HC)序列如SEQ ID NO：36，轻链(LC)序列如SEQ ID NO：37所示。
表5：分组及给药
| 组别 | 动物数量 | 造模方案 | 受试品名称 | 给药方式 | 给药频率及次数 |
| G1 | 4 | 生理盐水 | — | — | — |
| G2 | 9 | 博来霉素 | PBS | i.p. | Q2D×7 |
| G3 | 9 | 博来霉素 | Pamrevlumabanalogy | i.p. | Q2D×7 |
结果如图10-11所示，在整个实验周期中，造模组G2小鼠体重呈下降趋势，治疗组G3小鼠体重与对照组G1整体趋势一致，说明使用Pamrevlumab可以促使造模组小鼠体重恢复。小鼠肺部的羟脯氨酸检测结果显示(图12)，与G2组相比，治疗组G3组小鼠羟脯氨酸含量显著降低。这表明本方法制备的人源化CCN2小鼠可以模拟疾病模型，在临床前研究中用于筛选、评估抗人CCN2抗体的体内药效，并可用于表征抗人CCN2抗体特性。
实施例3：双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的CCN2小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有EGFR、HER2、VEGF、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、TNFR2、IL-2、IL-15、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD28等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化CCN2小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CCN2与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CCN2小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化CCN2与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CCN2和其它基因调节剂的体内药效验证等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (19)
1.一种CCN2基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CCN2蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCN2蛋白包含人CCN2蛋白的全部或部分；
优选的，所述的人源化CCN2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCN2基因包含人CCN2基因的部分；
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列；进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列或者包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含至少20bp连续核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列；优选的，所述的人CCN2基因的部分包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
优选的，所述的人源化CCN2基因转录的mRNA包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的内源CCN2蛋白表达降低或缺失。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将包含下列任一种的核苷酸序列导入非人动物CCN2基因座上：
A)人CCN2基因的部分，优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含至少20bp连续核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列，更优选包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
B)编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)人或人源化CCN2基因；或，
D)编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列；
优选的，所述的导入为替换或插入，进一步优选的，导入非人动物CCN2基因座为替换非人动物相应区域，更优选的，非人动物CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分被替换。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，其中，人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因，和/或，编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将CCN2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；
优选的，所述的其他基因选自EGFR、HER2、VEGF、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、TNFR2、IL-2、IL-15、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28中的至少一种。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人CCN2基因的部分或人源化CCN2基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。
9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法为使用靶向载体进行非人动物的构建；
优选的，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，
所述的供体核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)人CCN2基因的部分，优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含至少20bp连续核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列，更优选包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
B)编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)人或人源化CCN2基因；或，
D)编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列；
进一步优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，其中，
所述的5’臂为与NCBI登录号为NC_000076.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3或5所示；
所述的3’臂为与NCBI登录号为NC_000076.7至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4或6所示。
10.一种人源化CCN2基因，其特征在于，所述的人源化CCN2基因包含人CCN2基因的部分。
11.根据权利要求10所述的人源化CCN2基因，其特征在于，所述的人CCN2基因的部分包含编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列；优选的，所述的人CCN2基因的部分包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列或者包含与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人CCN2基因的部分包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含至少20bp连续核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列；优选的，所述的人CCN2基因的部分包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
12.根据权利要求10-11任一所述的人源化CCN2基因，其特征在于，所述的人源化CCN2基因还包含非人动物CCN2基因的部分，优选包含非人动物CCN2基因的5’UTR和/或3’UTR。
13.根据权利要求10-12任一所述的人源化CCN2基因，其特征在于，所述的人源化CCN2基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
14.根据权利要求1-9任一所述的构建方法、权利要求12-13任一所述的人源化CCN2基因，其特征在于，所述的非人动物为大鼠或小鼠。
15.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，
所述的供体核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)人CCN2基因的部分，优选包含人CCN2基因的1号至5号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CCN2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含至少20bp连续核苷酸序列，5号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列，更优选包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
B)编码人CCN2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或，
C)权利要求10-13任一所述的人源化CCN2基因；或，
D)编码人或人源化CCN2蛋白的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，其中，
所述的5’臂为与NCBI登录号为NC_000076.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3或5所示；
所述的3’臂为与NCBI登录号为NC_000076.7至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4或6所示。
17.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求10-13任一所述的人源化CCN2基因，或者，所述的细胞、组织或器官表达人或人源化CCN2蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求1-9任一所述的构建方法获得的非人动物；
优选的，所述的组织为瘤组织。
18.一种动物模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法是利用权利要求1-9任一所述的构建方法获得的非人动物进行的，优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型，进一步优选的，所述的构建方法包括植入肿瘤细胞的步骤。
19.一种权利要求10-13任一所述的人源化CCN2基因、权利要求1-9任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求17所述的细胞、组织或器官、权利要求18所述的构建方法获得的动物模型的应用，
优选的，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与CCN2相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与CCN2相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与CCN2相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)筛选、验证、评价或研究CCN2通路功能；或者，
E)筛选和评估与CCN2靶点相关的人用药及药效研究方面的应用。
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