CN113583876A - EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备。该专利将FnCas12a蛋白，体外合成的crRNA和同源重组片段（含有P2A‑DHFR‑EYFP表达框的Et.Actin基因）利用Lonza 4D‑Nucleofector核转仪导入鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子，实现对鸡柔嫩艾美尔球虫的编辑。将编辑虫株经过鸡体内乙胺嘧啶筛选，获得高纯度的基因编辑虫株。然后，利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证，证明EYFP成功标记了Et.Actin基因。通过细胞培养该虫株的子孢子并感染鸡后，取盲肠粘膜并涂片显示该EYFP在基因编辑虫株的整个生活史中都有表达。此基因编辑方法能够对鸡球虫的基因进行定点标记，有助于解析球虫基因的功能。本专利对新型抗球虫药物和疫苗的研发也具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子编辑领域，具体涉及EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备，尤其涉及EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法及其应用，该方法利用FnCas12a介导的基因编辑技术对鸡柔嫩艾美球虫的Et.Actin基因进行标记。该方法能够对鸡柔嫩艾美尔球虫基因进行定点特异性标记，有助于解析球虫基因的功能和新型抗球虫药物、疫苗的研发。
背景技术
鸡球虫病是有一种或多种顶复门原虫引起的肠道寄生虫病，其特征是腹泻、血便、饲料转化率低、生长发育迟缓和死亡。其在集约化养殖场中容易爆发，并给禽类养殖业带来巨大的经济损失。每年全球因鸡球虫病造成的损失高达30亿美元。鸡柔嫩艾美尔球虫是目前7种鸡致病性球虫中致病力最强的一种。鸡柔嫩艾美尔球虫的基因组在50-60 Mb，大约有8618基因。在以前的研究中，主要利用免疫荧光定位，重组蛋白，Western blot, RT-PCR,Pull down等技术研究与细胞周期，入侵，药物耐药性等相关基因。但是，由于缺乏基因组操作技术，只有少部分基因的功能被解析。近些年来，CRISPR/Cas (clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / associated endonuclease(Cas))系统在疟原虫、弓形虫和隐孢子虫中都得到了成功应用，主要应用于寄生虫的基因功能分析、抗药性研究、疫苗候选分子和药物作用靶点筛选等方面。
CRISPR/Cas9 系统在球虫基因组中已有应用，一种是通过构建球虫的 Cas9表达虫株，转染带有同源重组模板和 sgRNA 的质粒实现对目的基因的编辑，可以进行单基因编辑和基因家族编辑；另一种是，通过转染Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) 的质粒、sgRNA和同源模板，实现对球虫目的基因的编辑。这些为球虫功能基因组研究提供了强大的工具。但是， 前者Cas9表达的球虫虫株因为就是转基因虫株，几乎不可能作为疫苗研发的源球虫。另外Cas9表达的球虫虫株内部有多少个Cas9的拷贝，整合位点不清晰，遗传稳定性未知，这些都严重影响相关球虫药物和疫苗研发的进程。后者利用转染SpCas9的质粒来进行基因操作，质粒中的序列在基因组上的随机整合都可能对基因组产生意想不到的破坏。这些问题严重影响了基因编辑技术在球虫对应药物和疫苗的研发。
Cas12a (Cpf1), 是一种2型 CRISPR/Cas系统核酸酶，可以特异性的编码核苷酸，效率和SpCas9相似，并且脱靶效率低。目前，有至少3种Cas12a应用于基因编辑领域，包括Lachnospiracevae bacterium (LbCas12a), Acidaminococcus sp. (AsCas12a) 和Francisellanovicida U112 (FnCas12a)。相比于AsCas12a和LbCas12a，FnCas12a在人类细胞中的PAM序列为5'-KYTV-3'，拥有更多的基因编辑位点。本专利利用FnCas12a-RNP(FnCas12a蛋白和crRNA)开发一种无质粒污染的方法对鸡柔嫩艾美尔球虫Et.Actin基因进行编辑，该基因编辑方法有助于研究球虫基因的功能和新型抗球虫药物、疫苗的研发。
发明内容
本发明的目的是利用FnCas12a/crRNA介导的基因编辑技术对鸡柔嫩艾美尔球虫的Et.Actin基因进行标记，获得定点特异性敲入黄色荧光蛋白表达虫株。该方法能解决现有基因编辑方法中的转基因问题，为球虫未知基因的功能解析，以及新抗球虫药物和疫苗的研发提供一个有效的技术手段。
具体地，本发明利用FnCas12a表达质粒表达FnCas12a蛋白，体外合成Et.Actin基因的crRNA，构建含有P2A-DHFR-EYFP表达框的同源重组模板，将三者利用Lonza 4D-Nucleofector转入鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子。通过乙胺嘧啶筛选获得EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株，该标记的EYFP在球虫的整个生活史中都有表达。
所述方法的步骤为：
1. FnCas12a蛋白的表达与纯化。
FnCas12a蛋白的表达载体序列信息如SEQ ID NO.1所示。FnCas12a蛋白的表达与纯化结果见图1。
2. 体外crRNA的合成。
Et.Actin基因的crRNA序列信息如SEQ ID NO.2所示。
3. 同源重组模板的构建。
构建含有P2A-DHFR-EYFP表达框的Et.Actin基因同源重组模板载体pActin-P2A-DHFR-EYFP。其序列信息如SEQ ID NO.3所示；同源重组模板构建示意图如图2A所示。
4. EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建与筛选。
1）EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建：将30 µg FnCas12a：crRNA (摩尔比1:1) 和40 µg 线性化的pActin-P2A-DHFR-EYFP同源重组模板利用Lonza4D-Nucleofector的100 uL核转杯和转染程序EH100转入1×107球虫子孢子。将转染子孢子通过泄殖腔接种给3日龄的雏鸡，经过乙胺嘧啶的3次筛选，获得高纯度的基因编辑虫株。
2）利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证。所需的引物序列如SEQID NO.4；NO.5；NO.6；NO.7；NO.8；NO.9所示；验证结果如图2D所示。
3）观察EYFP在子孢子、第一代裂殖子、第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化卵囊中的表达情况，如图2E，F所示。
本专利中的方法首次利用FnCas12a蛋白和体外转录的crRNA对球虫基因进行了编辑，简化了实验步骤，避免了质粒污染问题，这些将加速球虫基因功能的阐明、抗球虫药物和对应疫苗研发。
有益效果
由于球虫不能在体外完成整个生活史，其相关的基因编辑技术进展缓慢。目前有报道，利用CRISPR/Cas9质粒系统可以实现对球虫进行基因编辑，因为该方法有质粒污染问题，将直接影响相关的实验结果。本发明公开了一种将EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法。该方法第一次报道了关于FnCas12a-RNP介导的基因编辑技术在鸡柔嫩艾美尔球虫上的应用。 本发明提供的基因编辑方法可以对鸡柔嫩艾美尔球虫的基因进行荧光标记，并且没有外源基因的干扰，为球虫基因的功能研究，以及新型抗球虫药物和疫苗研究提供了有效的技术手段。
本专利中的将EYFP（黄色荧光蛋白）敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法，首次利用FnCas12a蛋白和体外转录的crRNA对球虫基因进行了编辑，简化了实验步骤，避免了质粒污染问题，这些将加速球虫基因功能的阐明、抗球虫药物和对应疫苗研发。
附图说明
图1：FnCas12a蛋白的表达和纯化。
A：FnCas12a在大肠杆菌裂解液上清和沉淀中的表达情况。M：培养基；P：细胞裂解液沉淀；S：细胞裂解液上清。
B：FnCas12a在其纯化过程中的表达情况。
C：FnCas12a纯化后的纯度。
图2：FnCas12a/crRNA介导的基因编辑技术将EYFP敲入到鸡柔嫩艾美尔球虫的Et.Actin基因。
A：FnCas12a/crRNA介导的Et.Actin基因EYFP标记的示意图。
B：FnCas12a crRNA-DNA-靶位点复合物示意图。蓝色表示靶序列，粉色表示PAM位点。
C：Et.Actin基因编辑位点的体外切割示意图。
D：EYFP标记Et.Actin基因虫株和未编辑虫株(WT)的PCR验证。引物F1/R1；F2/R2；F3/R3的位置见图A。
E：EYFP标记Et.Actin基因虫株子孢子在MDBK细胞中培养，观察子孢子入侵后24h，48 h，72 h EYFP的表达情况。
F：EYFP标记Et.Actin基因虫株在给鸡接种后96 h，120 h，144 h，168 h（h.p.i）进行盲肠粘膜涂片观察第二代裂殖子，未孢子化卵囊中EYFP的表达情况；以及收获的孢子化卵囊中EYFP的表达情况。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。现结合实施例和附图，对本发明做进一步描述。
下例实施例所用如无特殊说明所用方法均为常规方法。
实施例1 利用FnCas12a/crRNA介导的基因编辑技术将EYFP敲入鸡柔嫩艾美尔球虫的Et.Actin基因。
1. FnCas12a蛋白的表达与纯化。
FnCas12a蛋白的表达和纯化过程同SaCas9的表达纯化过程相似 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30927491/)。表达FnCas12a的质粒的序列信息见SEQ ID NO.1。使用BeyoGoldTM His-tag Purification Resin (P2210, 碧云天)试剂盒纯化FnCas12a蛋白，洗脱液为200 mM咪唑缓冲液(200 mM 咪唑, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, PH 8.0)。纯化后的蛋白用50%的甘油保存，存放于-80℃备用。FnCas12a的表达和纯化过程见图1。
2. 体外crRNA的合成。
按照FnCas12a的crRNA设计原则，设计Et.Actin基因编辑位点的crRNA序列 (SEQID NO.2)，使用MEGAscript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA)试剂盒体外合成crRNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30927491/)。
3. 同源重组模板的构建。
构建含有P2A-DHFR-EYFP表达框的Et.Actin基因同源重组模板载体。其具体方法是利用PCR方法扩增P2A-DHFR-EYFP序列；再扩增含有酶切位点HindⅢ 和SACⅡ的 Actin-P2A-DHFR-EYFP序列；再将原pH4质粒上H4-DHFR-EYFP序列进行替换，从而成功构建含有Et.Actin基因编辑位点的同源重组模板序列的质粒。将该质粒用SnaBI限制性内切酶进行酶切，获得线性化的含有Et.Actin 基因同源臂序列pActin-P2A-DHFR-EYFP（具体序列信息如SEQ ID NO.3，其示意图见图2A所示。
4. EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建与筛选。
1）利用FnCas12a/crRNA介导的基因编辑技术构建EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株：将30 µg FnCas12a：crRNA (摩尔比1:1) 和40 µg 线性化的pActin-P2A-DHFR-EYFP同源重组模板利用Lonza 4D-Nucleofector的100 uL核转杯和转染程序EH100转入1×107球虫子孢子。将转染子孢子通过泄殖腔接种给3日龄的雏鸡，分别经过150mg/kg，250 mg/kg，300 mg/kg的乙胺嘧啶的3次筛选，获得高纯度的基因编辑虫株。
2）利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证，所用引物的序列信息见表1，引物位置如图2A所示，验证结果如图2D所示。
表1所用引物的序列信息
| 名称 | 序列 |
| F1 | TGTGTCCCACACTGTTCCTA（SEQ ID NO.4） |
| R1 | TGCTTTCCCAGTTTTTCCGT（SEQ ID NO.5） |
| F2 | GAACGGCATCAAGGTGAACT（SEQ ID NO.6） |
| R2 | CCACAACTTTCCGTCACACT（SEQ ID NO.7） |
| F3 | CCGGTTCTAACTGCGTCTTT（SEQ ID NO.8） |
| R3 | TCTCTGGGTTCACAATGCAC（SEQ ID NO.9） |
3）观察基因编辑虫株中EYFP在整个生活史中的表达情况。
(1). 第1 d，用胰蛋白酶消化对数生长期的MDBK细胞，细胞计数后接种于24孔板，细胞密度为1×105细胞/孔。用含有10 % FBS的DMEM培养。
第2 d，纯化基因编辑虫株子孢子，将基因编辑虫株子孢子接种含有5 % FBS培养基MDBK细胞中，观察基因编辑虫株中EYFP在子孢子阶段以及子孢子入侵后发育到第一代裂殖子的表达情况，结果如图2E所示。
(2). 按照8×104卵囊/只接种14日龄的三黄鸡，在接种后96 h，120 h，144 h，168h进行盲肠粘膜涂片，用荧光显微镜观察EYFP在第二代裂殖子，未孢子化卵囊时期的表达情况。将第7 d收获的卵囊进行孢子化，观察孢子化卵囊中EYFP的表达情况，结果如图2F所示。
由图2E，F的结果显示：EYFP在子孢子，第一代和第二代裂殖子中表达主要集中在细胞核，在细胞质中低表达；在未孢子化的卵囊中表达均一。这些结果表明我们利用FnCas12a/crRNA介导的基因编辑技术成功构建EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株。因此，该技术可以应用于球虫未知基因的表达和功能研究；加快抗球虫药物和疫苗的研发。被标记的虫株不仅能够研究被标记基因在球虫中的表达情况，而且可以用于抗球虫药物的高通量筛选，为抗球虫药物的研发提供新的思路。
〈110〉 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
〈120〉EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备
〈160〉 9
〈170〉 PatentIn version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 7779
〈212〉 nt
〈213〉FnCas12a表达载体
〈400〉
ggggaattgtgagcggataacaattcccctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatataccatgagcatctaccaggagttcgtcaacaagtattcactgagtaagacactgcggttcgagctgatcccacagggcaagacactggagaacatcaaggcccgaggcctgattctggacgatgagaagcgggcaaaagactataagaaagccaagcagatcattgataaataccaccagttctttatcgaggaaattctgagctccgtgtgcatcagtgaggatctgctgcagaattactcagacgtgtacttcaagctgaagaagagcgacgatgacaacctgcagaaggacttcaagtccgccaaggacaccatcaagaaacagattagcgagtacatcaaggactccgaaaagtttaaaaatctgttcaaccagaatctgatcgatgctaagaaaggccaggagtccgacctgatcctgtggctgaaacagtctaaggacaatgggattgaactgttcaaggctaactccgatatcactgatattgacgaggcactggaaatcatcaagagcttcaagggatggaccacatactttaaaggcttccacgagaaccgcaagaacgtgtactccagcaacgacattcctacctccatcatctaccgaatcgtcgatgacaatctgccaaagttcctggagaacaaggccaaatatgaatctctgaaggacaaagctcccgaggcaattaattacgaacagatcaagaaagatctggctgaggaactgacattcgatatcgactataagactagcgaggtgaaccagagggtcttttccctggacgaggtgtttgaaatcgccaatttcaacaattacctgaaccagtccggcattactaaattcaataccatcattggcgggaagtttgtgaacggggagaataccaagcgcaagggaattaacgaatacatcaatctgtatagccagcagatcaacgacaaaactctgaagaaatacaagatgtctgtgctgttcaaacagatcctgagtgataccgagtccaagtcttttgtcattgataaactggaagatgactcagacgtggtcactaccatgcagagcttttatgagcagatcgccgctttcaagacagtggaggaaaaatctattaaggaaactctgagtctgctgttcgatgacctgaaagcccagaagctggacctgagtaagatctacttcaaaaacgataagagtctgacagacctgtcacagcaggtgtttgatgactattccgtgattgggaccgccgtcctggagtacattacacagcagatcgctccaaagaacctggataatccctctaagaaagagcaggaactgatcgctaagaaaaccgagaaggcaaaatatctgagtctggaaacaattaagctggcactggaggagttcaacaagcacagggatattgacaaacagtgccgctttgaggaaatcctggccaacttcgcagccatccccatgatttttgatgagatcgcccagaacaaagacaatctggctcagatcagtattaagtaccagaaccagggcaagaaagacctgctgcaggcttcagcagaagatgacgtgaaagccatcaaggatctgctggaccagaccaacaatctgctgcacaagctgaaaatcttccatattagtcagtcagaggataaggctaatatcctggataaagacgaacacttctacctggtgttcgaggaatgttacttcgagctggcaaacattgtccccctgtataacaagattaggaactacatcacacagaagccttactctgacgagaagtttaaactgaacttcgaaaatagtaccctggccaacgggtgggataagaacaaggagcctgacaacacagctatcctgttcatcaaggatgacaagtactatctgggagtgatgaataagaaaaacaataagatcttcgatgacaaagccattaaggagaacaaaggggaaggatacaagaaaatcgtgtataagctgctgcccggcgcaaataagatgctgcctaaggtgttcttcagcgccaagagtatcaaattctacaacccatccgaggacatcctgcggattagaaatcactcaacacatactaagaacgggagcccccagaagggatatgagaaatttgagttcaacatcgaggattgcaggaagtttattgacttctacaagcagagcatctccaaacaccctgaatggaaggattttggcttccggttttccgacacacagagatataactctatcgacgagttctaccgcgaggtggaaaatcaggggtataagctgacttttgagaacatttctgaaagttacatcgacagcgtggtcaatcagggaaagctgtacctgttccagatctataacaaagatttttcagcatacagcaagggcagaccaaacctgcatacactgtactggaaggccctgttcgatgagaggaatctgcaggacgtggtctataaactgaacggagaggccgaactgttttaccggaagcagtctattcctaagaaaatcactcacccagctaaggaggccatcgctaacaagaacaaggacaatcctaagaaagagagcgtgttcgaatacgatctgattaaggacaagcggttcaccgaagataagttctttttccattgtccaatcaccattaacttcaagtcaagcggcgctaacaagttcaacgacgagatcaatctgctgctgaaggaaaaagcaaacgatgtgcacatcctgagcattgaccgaggagagcggcatctggcctactataccctggtggatggcaaagggaatatcattaagcaggatacattcaacatcattggcaatgaccggatgaaaaccaactaccacgataaactggctgcaatcgagaaggatagagactcagctaggaaggactggaagaaaatcaacaacattaaggagatgaaggaaggctatctgagccaggtggtccatgagattgcaaagctggtcatcgaatacaatgccattgtggtgttcgaggatctgaacttcggctttaagagggggcgctttaaggtggaaaaacaggtctatcagaagctggagaaaatgctgatcgaaaagctgaattacctggtgtttaaagataacgagttcgacaagaccggaggcgtcctgagagcctaccagctgacagctccctttgaaactttcaagaaaatgggaaaacagacaggcatcatctactatgtgccagccggattcacttccaagatctgccccgtgaccggctttgtcaaccagctgtaccctaaatatgagtcagtgagcaagtcccaggaatttttcagcaagttcgataagatctgttataatctggacaaggggtacttcgagttttccttcgattacaagaacttcggcgacaaggccgctaaggggaaatggaccattgcctccttcggatctcgcctgatcaactttcgaaattccgataaaaaccacaattgggacactagggaggtgtacccaaccaaggagctggaaaagctgctgaaagactactctatcgagtatggacatggcgaatgcatcaaggcagccatctgtggcgagagtgataagaaatttttcgccaagctgacctcagtgctgaatacaatcctgcagatgcggaactcaaagaccgggacagaactggactatctgattagccccgtggctgatgtcaacggaaacttcttcgacagcagacaggcacccaaaaatatgcctcaggatgcagacgccaacggggcctaccacatcgggctgaagggactgatgctgctgggccggatcaagaacaatcaggaggggaagaagctgaacctggtcattaagaacgaggaatacttcgagtttgtccagaatagaaataacaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggatccggaCACCATCACCATCACCATtaagaattctgcagatatccagcacagtggcggccgcataatgcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcataatcgaaattaatacgactcactatagGGaatttctactgttgtagattgagaccacggcaggtctctAATTTCTACTGTTGTAGATccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcgaatttgctttcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatagtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaactccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctgttcagctactgacggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgctagcggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttcccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctcatgttagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaaattaatacgactcactata
〈210〉 2
〈211〉20
〈212〉 nt
〈213〉Et.Actin基因编辑位点的crRNA序列
〈400〉
ctgcaaacttagaagcactt
〈210〉 3
〈211〉4154t
〈213〉pActin-P2A-DHFR-EYFP基因
〈400〉
AAGCTTccgccgagaaagaaattgtgcgcgacattaaggagaagctctgctacatcgcgctcgacttcgatgaaGAGATGAAGGTTCGGCGCCGAAACATTTTATTGCTGTTGGTCTTGGAGTGACAATTTGTTGCCAGTAGACCTCACGCGCTCAGTTCTAACATCCATCGTACGAGTTGCCTGATGGCAACATAATCACTGTTGGCAATGGGCGTTTGCGTTGCCCTGACATCCGGTTCTAACTGCGTCTTTCATTCTGAGCTGTTTTTTCACGTGAATGGTTTGTGTCTTTTTTGTTTCCGCAGaatgctgaggactcgagtgacatcgagaagtcgtacgagttgcctgatggcaacataatcactgttggcaatgagcgtttccgttgccctgaggctcttttccagccttcattcttgggcaaggaggcatcgggtatccatcgtaccacgttcgactccatcatgaagtgcgatgtggatatcaggaaggacctctacggcaatgttgttctctctggcggcacaaccatgtacgaaggcattggcgagcgccttaccagggagctcacatcgctggctccgtctacgatgaagattaaggttgttgcgcctcctgagcgcaagtacagtgtctggattggagggtcaattctgtcttcgttatcgactttccagcagatgtggatcacgaaggaagaatatgatgagtctgggccgagcatcgttcaccgcaagtgcttcGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCAGAAGCCGGTGTGTCTGGTCGTCGCGATGACCCCCAAGAGGGGCATCGGCATCAACAACGGCCTCCCGTGGCCCCACTTGACCACAGATTTCAAACACTTTCGTCGTGTGACAAAAACGACGCCCGAAGAAGCCAGTCGCCTGAACGGGTGGCTTCCCAGGAAATTTGCAAAGACGGGCGACTCTGGACTTCCCTCTCCATCAGTCGGCAAGAGATTCAACGCCGTTGTCATGGGACGGAAAAACTGGGAAAGCATGCCTCGAAAGTTTAGACCCCTCGTGGACAGATTGAACATCGTCGTTTCCTCTTCCCTCAAAGAAGAAGACATTGCGGCGGAGAAGCCTCAAGCTGAAGGCCAGCAGCGCGTCCGAGTCTGTGCTTCACTCCCAGCAGCTCTCAGCCTTCTGGAGGAAGAGTACAAGGATTCTGTCGACCAGATTTTTGTCGTGGGAGGAGCGGGACTGTACGAGGCAGCGCTGTCTCTGGGCGTTGCCTCTCACCTGTACATCACGCGTGTAGCCCGCGAGTTTCCGTGCGACGTTTTCTTCCCTGCGTTCCCCGGAGATGACATTCTTTCAAACAAATCAACTGCTGCGCAGGCTGCAGCTCCTGCCGAGTCTGTGTTCGTTCCCTTTTGTCCGGAGCTCGGAAGAGAGAAGGACAATGAAGCGACGTATCGACCCATCTTCATTTCCAAGACCTTCTCAGACAACGGCGTACCCTACGACTTTGTGGTTCTCGAGAAGAGAAGGAAGACTGACGACGCAGCCACTGCGGAACCGAGCAACGCAATGAGCTCCTTGACGTCCACGAGGGAGACAACTCCCGTGCACGGGTTGCAGGCTCCTTCTTCGGCCGCAGCCATTGCCCCGGTGTTGGCGTGGATGGACGAAGAAGACCGGAAAAAACGCGAGCAAAAGGAACTGATTCGGGCCGTTCCGCATGTTCACTTTAGAGGCCATGAAGAATTCCAGTACCTTGATCTCATTGCCGACATTATTAACAATGGAAGGACAATGGATGACCGAACGGGCGTTGGTGTCATCTCCAAATTCGGCTGCACTATGCGCTACTCGCTGGATCAGGCCTTTCCACTTCTCACCACAAAGCGTGTGTTCTGGAAAGGGGTCCTCGAAGAGTTGCTGTGGTTCATTCGCGGCGACACGAACGCAAACCATCTTTCTGAGAAGGGCGTGAAGATCTGGGACAAGAATGTGACACGCGAGTTCCTCGATTCGCGCAATCTCCCCCACCGAGAGGTCGGAGACATCGGCCCGGGCTACGGCTTCCAGTGGAGACACTTCGGCGCGGCATACAAAGACATGCACACAGACTACACAGGGCAGGGCGTCGACCAGCTGAAGAATGTGATCCAGATGCTGAGAACGAATCCAACAGATCGTCGCATGCTCATGACTGCCTGGAATCCTGCAGCGCTGGACGAAATGGCGCTGCCGCCTTGTCACTTGTTGTGCCAGTTCTACGTGAACGACCAGAAGGAGCTGTCGTGCATCATGTATCAGCGGTCGTGCGATGTCGGCCTCGGCGTCCCCTTCAACATCGCTTCCTATTCGCTTTTGACGCTCATGGTTGCACACGTCTGCAACCTAAAACCTAAGGAGTTCATTCACTTCATGGGGAACACGCATGTCTACACGAACCATGTCGAGGCTTTAAAAGAGCAGCTGCGGAGAGAACCGAGACCGTTCCCCATTGTGAACATCCTCAACAAGGAACGCATCAAGGAAATCGACGATTTCACCGCCGAGGATTTTGAGGTCGTGGGCTACGTCCCGCACGGACGAATCCAGATGGAGATGGCTGTCTTGGATCCTGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGCTGTAGAGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGCCGCGTTTGCAGCAGAGTAGTTCATGACTTGCGAAACGGCCTCTCGATTAATAATACGCTTTGCCGCAACGTGAAGTAGGCGTTATTGTGTGCTGCCTGTCGCTGAGCTCCTGCATCGAGCGGCAAGGGGTTCAACCGAGCGCAAATTCTGTGGAAATAGCTGGACAAAAGCATCTGCGACGGGTGGGGGCAGGCGCAGCTAGCTGTTGCTCCCGACATCAGTCATGGAAATGCGTTTCAGGCTAAGCAAGTAGCTGCCCGCCTGGTGGGAAGATGAGGCTAGGAACTGCTATGTTTGCCCCTCACTTGGCGGTATTGCAGTGTAGTACGTGCATTGTGAACCCAGAGAAATGTGCTCCGCGTGACGCAGCGAGGCACAGGGGAACAGCAAGAGGGGCCGTTATTGCTCAGCGTGCTGGACCCCCTTGTTCCTTCAAACCTTACTTATGAGGGCTTACGCATCGCACCTGATGGGTCGGTGTAGCGTGATCATTTCACTGTTCAGTAGTAGGTATGGGAGGAGTGTAGTTGGCAGGATGTAGGAGCTTTGCAAGCGGTGGAACGGTTGAGATGAGTAGTGAACAGAGGCTTTGCCCAATGTCGGATAGTGAGTGTTTCTCGAGCACGAAACGTGCAAGGCAACAGGTTACTGTAGGTTTATGTAGTTGGCAAGAGTGGGCCTTGCCCAGTATTCGGTAGTAAGTGTCAAGCACGACACCAGATTGCGAAGCAACAGGTAATTGTAGGTTTACGTA
〈210〉 4
〈211〉 20
〈212〉 nt
〈213〉F1
〈400〉 TGTGTCCCACACTGTTCCTA
〈210〉 5
〈211〉 20
〈212〉 nt
〈213〉R1
〈400〉 TGCTTTCCCAGTTTTTCCGT
〈210〉 6
〈211〉 20
〈212〉 nt
〈213〉F2
〈400〉 GAACGGCATCAAGGTGAACT
〈210〉 7
〈211〉 20
〈212〉 nt
〈213〉R2
〈400〉 CCACAACTTTCCGTCACACT
〈210〉 8
〈211〉 20
〈212〉 nt
〈213〉F3
〈400〉 CCGGTTCTAACTGCGTCTTT
〈210〉 9
〈211〉 20
〈212〉 nt
〈213〉R3
〈400〉 TCTCTGGGTTCACAATGCAC
Claims (7)
1.一种EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法，其特征在于该制备方法是利用FnCas12a/crRNA对鸡柔嫩艾美尔球虫基因组进行编辑，主要包括如下步骤：1）FnCas12a蛋白的表达与纯化；2）Et.Actin基因编辑位点crRNA的体外合成；3）Et.Actin基因特异性编辑位点同源重组模板的构建；4）EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建；5)EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的验证。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1）中FnCas12a的表达载体序列如SEQ IDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）中Et.Actin基因的crRNA序列如 SEQID NO.2 所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中Et.Actin基因特异性编辑位点的同源重组模板序列如SEQ ID NO.3 所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）中EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建步骤为：将30 µg FnCas12a：crRNA (摩尔比1:1) 和40 µg 线性化的pActin-P2A-DHFR-EYFP同源重组模板利用Lonza 4D-Nucleofector的100 uL核转杯和转染程序EH100转入1×107的球虫子孢子；将转染子孢子通过泄殖腔接种给3日龄的雏鸡，经过乙胺嘧啶的3次筛选，获得高纯度的基因编辑虫株。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤5）EYFP敲入Et.Actin基因的柔嫩艾美尔球虫虫株的验证是利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证；所用的引物序列如 SEQ ID NO.4；NO.5；NO.6；NO.7；NO.8；NO.9 所示，并观察EYFP在基因编辑虫株整个生活史中的表达情况。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于乙胺嘧啶在3次传代中的筛选浓度分别为150mg/kg；250 mg/kg；300 mg/kg。
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