JP6067756B2 - マトリックスメタロプロテイナーゼ９に対する抗体 - Google Patents

Description

ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出された配列表の参照
ＭＰＥＰ§１７３０ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ｃ）に公認され記載されている以下のＵＳＰＴＯ ＥＦＳ−ＷＥＢサーバを介した配列表の電子提出の内容全体は、あらゆる目的について参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列表は、以下の通り電子出願されたテキストファイルで識別される：

分野
本開示は、細胞外酵素、細胞外マトリックス酵素、プロテアーゼおよび免疫学の分野に入る。

背景
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックスの形成およびリモデリングに関与する細胞外酵素のファミリーに属する。これらの酵素は、亜鉛原子が３つのヒスチジン残基によって配位されている保存された触媒ドメインを含有する。このファミリーのメンバーは２０超が公知であり、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン、エナメリシンおよび膜ＭＭＰを含めたいくつもの群で構成されている。

ＭＭＰ２およびＭＭＰ９は、マトリックスメタロプロテイナーゼのゼラチナーゼ群に属する。大多数のＭＭＰに共通するシグナルペプチド、プロペプチド、触媒ドメイン、亜鉛結合ドメインおよびヘモペキシン（ｈｅａｍｏｐｅｘｉｎ）様ドメインを含有することに加えて、ゼラチナーゼは、複数のフィブロネクチン様ドメインおよびＯ−グリコシル化ドメインも含有する。

ＭＭＰはいくつもの疾患に関連する。しかし、利用可能なＭＭＰの阻害剤は、毒性および有効性の欠如に一部起因して、いまだ成功に至っていない。したがって、特異的かつ有効なＭＭＰ阻害剤が必要とされている。

要旨
本開示は、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）タンパク質（ゼラチナーゼ−Ｂとしても公知である）に結合する結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合断片を含む組成物および使用方法を提供する。結合タンパク質は、一般には、抗体またはその断片（例えば、抗原結合断片）であり、一般には、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖（またはその機能性断片）およびＩｇ軽鎖（またはその機能性断片）を含有する。重鎖は、一般にはＩｇＧ、一般にはヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４、またはＩｇＧ２などの他のＩｇＧ、またはその改変型である。軽鎖は、一般には、カッパ鎖である。

ＭＭＰ９結合タンパク質、例えば、抗体としては、ＭＭＰ９に特異的に結合し、他のマトリックスメタロプロテイナーゼには結合しないものが挙げられる。そのようなＭＭＰ９結合タンパク質は、ＭＭＰ９の特異的な調節（例えば、阻害）を、例えば、他のマトリックスメタロプロテイナーゼの活性には直接影響を及ぼすことなく得ることが必要である、またはそれが望ましい適用において使用される。したがって、本開示のある特定の実施形態では、抗ＭＭＰ９抗体またはその断片は、ＭＭＰ９の活性の特異的な阻害剤である。一部の態様では、本明細書に開示されているＭＭＰ９結合タンパク質は、ＭＭＰ９を阻害する一方で、他の、関連するマトリックスメタロプロテイナーゼの正常な機能を可能にするために有用になる。

抗体および断片は、それらのアミノ酸配列もしくはその一部、ならびに／または種々の機能、例えば、ＭＭＰ９もしくはその特定のエピトープに対する結合特異性、またはＭＭＰ９上のエピトープとの結合について特定の抗体と競合する能力、ならびに／または活性、例えば、ＭＭＰ９を、例えば、非競合的に阻害する能力に関して記載することができる。

抗体および断片としては、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を有するもの；配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を有するものが挙げられる。例示的な抗体および断片としては、配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有するもの、ならびに配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を有するものが挙げられる。例示的な抗体および断片としては、さらに、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有するもの、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有するもの、ならびに配列番号１３、１４、および１５の重鎖ＣＤＲ、および配列番号１６、１７、および１８の軽鎖ＣＤＲを有するものが挙げられる。

例示的な抗体および断片としては、さらに、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有するもの、配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有するもの、配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有するもの、配列番号３９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有するもの、ならびに配列番号３４、３５、および３６の重鎖ＣＤＲ、および配列番号３７、３８、および３９の軽鎖ＣＤＲを有するものが挙げられる。

例示的な抗体および断片としては、さらに、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有するもの、ならびに配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有するものが挙げられる。

抗体および断片としては、さらに、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を有するもの、および配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有するもの、ならびに配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域、および配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する抗体および断片が挙げられる。特定の例では、抗体または断片は、配列番号７のＶＨ領域および配列番号１２のＶＬ領域、またはそのような配列との少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくはそれ超の配列同一性を有する。抗体または断片としては、さらに、配列番号３２または配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を有するもの、および配列番号３３に記載のアミノ酸配列または配列番号４１に記載のアミノ酸配列または配列番号４８に記載のアミノ酸配列、およびそれらの組合せを有するＶＬ領域を有するもの、ならびにそのような配列に対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくはそれ超の配列同一性を有する配列を有するものが挙げられる。

抗体および断片としては、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を有し、かつ／または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有し、かつ／またはそのような配列に対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくはそれ超の配列同一性を有するＶＨ領域もしくはＶＬ領域を有するものが挙げられる。

一部の場合には、重鎖は、配列番号１９〜２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ、軽鎖は、配列番号２３〜２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。

いくつかの実施形態では、抗体またはその断片により、ＭＭＰ９の酵素活性が、例えば、非競合的阻害によって阻害される。

抗体および断片としては、さらに、ＭＭＰ９の所与のエピトープに特異的に結合するものが挙げられる。一部の場合には、エピトープは、上記の抗体のいずれかが特異的に結合するエピトープである。一例では、エピトープは、配列番号２７のシステインスイッチ活性ポケットの外側のアミノ酸残基（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基）を含有する。ある特定の例では、エピトープは、ＭＭＰ９の所与の領域内のアミノ酸残基（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基）を含み、例えば、該領域は、配列番号２７の残基１０４〜２０２である。いくつかの例では、エピトープは、ＭＭＰ９の所与の領域内のアミノ酸残基（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基）を含み、例えば、該領域は、配列番号２７の残基１０４〜１１９、残基１５９〜１６６、または残基１９１〜２０２である。一例では、エピトープは、配列番号２７の残基１０４〜１１９であるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基）、配列番号２７の残基１５９〜１６６であるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基、および配列番号２７の残基１９１〜２０２であるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基を含む。一部の場合には、エピトープは、配列番号２７のＥ１１１、Ｄ１１３、Ｒ１６２、またはＩ１９８を含む。一部の場合には、エピトープは、配列番号２７のＲ１６２を含む。一部の場合には、エピトープは、配列番号２７のＥ１１１、Ｄ１１３、Ｒ１６２、およびＩ１９８を含む。

一部の場合には、抗体または断片は、ヒト抗体もしくは断片またはヒト化抗体もしくは断片である。

いくつかの例では、抗体および断片は、ヒトＭＭＰ９に、約４℃、２５℃、３７℃または４２℃の温度で測定して、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂの形態、または抗体の他の形態で１００ｎＭ以下、必要に応じて１０ｎＭ未満、必要に応じて１ｎＭ未満、必要に応じて０．５ｎＭ未満、必要に応じて０．１ｎＭ未満、必要に応じて０．０１ｎＭ未満、または必要に応じて０．００５ｎＭ未満、特定の例では、０．１ｎＭから０．２ｎＭまでの間、または０．１ｐＭから１０ｐＭの間、例えば、０．４ｐＭから９ｐＭの間、例えば、０．４ｐＭから８．８ｐＭの間の解離定数（Ｋ_ｄ）で特異的に結合する。

提供される抗体および断片としては、上記の抗体のいずれかに対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超の配列同一性を有するもの、または上記の抗体のそれぞれの部分に対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超の配列同一性を有する種々の部分を含有するもの、例えば、配列番号７に対してそのような同一性を有するＶＨ領域および配列番号１２に対してそのような同一性を有するＶＬ領域を有するものも挙げられる。ＭＭＰ９との結合について上記の抗体のいずれかと競合する抗体、例えば、ＭＭＰ９との結合について、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する抗体と競合するものも提供される。

抗体および断片をコードする単離された核酸、例えば、上記の抗体および断片のいずれかのコード配列を含む核酸も提供される。提供される核酸としては、配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む重鎖ポリペプチド、および／または配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するものが挙げられる。一例では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、および配列番号５〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドをコードする。別の例では、ヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、および配列番号９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードする。一例では、ヌクレオチド配列は、配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列、例えば、配列番号２１、配列番号２６、または配列番号２１および配列番号２６を含む。そのような核酸を含有するベクターおよびそれを含む細胞、例えば、宿主細胞も提供される。

抗体、断片、核酸、ベクター、および細胞を含む医薬組成物も提供される。いくつかの例では、医薬組成物は、キャリアまたは賦形剤、例えば、薬学的に許容されるまたは生物学的に許容されるキャリアまたは賦形剤をさらに含む。一部の場合には、医薬組成物は提供される治療方法および使用において使用される。

抗体、断片、核酸、ベクター、細胞、および組成物の方法および使用、例えば、治療、例えば、被験体におけるＭＭＰ９の阻害など、および診断、例えば、被験体におけるＭＭＰ９の検出などにおける方法および使用も提供される。

例えば、ＭＭＰ９の検出、およびそのような方法において使用するための作用剤（例えば、上記の抗ＭＭＰ９抗体および他のＭＭＰ９結合タンパク質のいずれか）を伴う診断方法および予後判定方法が提供される。一部の場合には、診断方法により、被験体由来の試験試料におけるＭＭＰ９発現が検出される。そのような方法は、例えば、試験試料を、本明細書に記載の抗体または断片（例えば、上記の抗体または断片のいずれか）と接触させ、抗体または断片と試料中のタンパク質との結合を検出し、それにより、ＭＭＰ９の存在を検出することによって行うことができる。一部の場合には、まず試料を得るまたは提供する。いくつかの例では、該方法は、検出されたＭＭＰ９の量またはレベルを対照レベルまたは量と比較すること、例えば、試験試料において検出された結合の量を、抗体または断片と対照試料との結合の量と比較することを含む。一部の場合には、該方法は、ＭＭＰ９の試験レベルと対照レベルを単に比較することを伴う。一部の場合には、試験レベルが高いこと（対照レベルと比較して）により、疾患または状態が示される。

一部の場合には、該方法によってＭＭＰ９が検出されることにより、被験体においてＭＭＰ９に関連する疾患または状態などの疾患または状態が存在することが示される。一部の場合には、該方法は、被験体を処置すること、または、該方法の結果に基づいて、例えば、試料において検出されたＭＭＰ９のレベルに基づいて被験体の処置を調整すること（すなわち、変更または中止すること）をさらに含む。生体試料としては、組織、そのような組織から単離された細胞などが挙げられる。一部の場合には、該方法を液体試料、例えば、血液、血漿、血清、全血、唾液、尿、または精液に対して実施する。組織試料としては、例えば、ホルマリン固定したまたは凍結させた組織切片が挙げられる。

例えば、ＭＭＰ９を非競合的に阻害する作用剤を使用して被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害する、および／または被験体における疾患または状態を治療する方法、ならびにそのような方法において使用するための作用剤（例えば、上記の抗ＭＭＰ９抗体および他のＭＭＰ９結合タンパク質のいずれか）も提供される。該方法は、一般に、被験体に、ＭＭＰ９結合タンパク質、例えば、本明細書において提供されるＭＭＰ９結合抗体またはその断片を、例えば、有効量で投与することによって行われる。抗体または断片は、一般に、ＭＭＰ９に特異的に結合し、それを非競合的に阻害し、したがって、例えば、被験体におけるＭＭＰ９活性が阻害される。一部の場合には、抗体または断片は、上記のエピトープのうちの１つにあるものなどのＭＭＰ９のシステインスイッチ活性ポケットの外側に結合するものである。一部の場合には、抗体または断片は、ＭＭＰ９以外のＭＭＰタンパク質には実質的に結合せず、かつ／またはＭＭＰ２には実質的に結合しない。

被験体は、一般に、疾患または状態を有する被験体、一般には、ＭＭＰ９の発現および／または活性の増加または減少に関連する疾患または状態を有する被験体である。ある場合では、ＭＭＰ９の発現および／または活性の増加に関連する疾患または状態を有する被験体。他の場合では、ＭＭＰ９の発現および／または活性の減少に関連する疾患または状態を有する被験体。

配列番号２７の残基１１１〜１９８を含有するもの、および配列番号２７の残基１１１〜１９８を含有し、配列番号２７の残基１１１、１１３、１６２、もしくは１９８にアミノ酸置換を有するまたはそのような残基の全てにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するものなどのミュータントＭＭＰ９ポリペプチドを含めたＭＭＰ９ポリペプチドも提供される。

上記の抗体、核酸、ベクター、細胞、および組成物のいずれかの、上記の治療方法および診断方法における使用も提供される。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む単離された抗体またはその断片。
（項目２）
前記ＶＨ領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有する項目１に記載の抗体または断片。
（項目３）
配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単離された抗体またはその断片。
（項目４）
前記ＶＬ領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する、項目３に記載の抗体または断片。
（項目５）
前記抗体が、配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有するＶＨ領域をさらに含む、項目３または４に記載の抗体または断片。
（項目６）
前記ＶＨ領域が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、項目１、項目２、および項目５のいずれかに記載の抗体または断片。
（項目７）
前記ＶＨ領域が、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、項目６に記載の抗体または断片。
（項目８）
前記ＶＬ領域が、配列番号２、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、項目３から７までのいずれかに記載の抗体または断片。
（項目９）
前記ＶＬ領域が、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、項目８に記載の抗体または断片。
（項目１０）
前記ＶＨ領域が配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＶＬ領域が配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、項目５に記載の抗体または断片。
（項目１１）
ＭＭＰ９との結合について、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ領域および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を有する抗体と競合する単離された抗体またはその断片。
（項目１２）
配列番号２７の残基１０４〜１１９、残基１５９〜１６６、または残基１９１〜２０２からなるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基を含むＭＭＰ９のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその断片。
（項目１３）
前記エピトープが、配列番号２７の残基１０４〜１１９からなるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基、配列番号２７の残基１５９〜１６６からなるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基、および配列番号２７の残基１９１〜２０２からなるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基を含む、項目１２に記載の抗体または断片。
（項目１４）
前記エピトープが配列番号２７のＥ１１１、Ｄ１１３、Ｒ１６２、またはＩ１９８を含む、項目１２または１３に記載の抗体または断片。
（項目１５）
前記エピトープが配列番号２７のＲ１６２を含む、項目１４に記載の抗体または断片。
（項目１６）
前記エピトープが配列番号２７のＥ１１１、Ｄ１１３、Ｒ１６２、およびＩ１９８を含む、項目１４に記載の抗体または断片。
（項目１７）
ＭＭＰ９の酵素活性を阻害する、項目１から１６までのいずれかに記載の抗体または断片。
（項目１８）
前記酵素活性の阻害が非競合的である、項目１７に記載の抗体または断片。
（項目１９）
ヒト抗体もしくは断片またはヒト化抗体もしくは断片である、項目１から１８までのいずれかに記載の抗体または断片。
（項目２０）
被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害する方法であって、該被験体に、前記抗体または断片を、該被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害するために有効な量で投与することを含む方法において使用するための、項目１から１９までのいずれかに記載の抗体または断片。
（項目２１）
被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害する方法であって、該被験体に、項目１から１９までのいずれかに記載の抗体または断片を、該被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害するために有効な量で投与することを含む方法。
（項目２２）
前記抗体またはその断片が、約１ｍｇ／ｋｇから約１４ｍｇ／ｋｇまでの用量で静脈内投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記抗体または断片が、約４ｍｇ／ｋｇ〜約２８ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記抗体または断片が７日〜２８日ごとに１回投与される、項目２１から２３までのいずれかに記載の方法。
（項目２５）
配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む重鎖ポリペプチドまたは配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
（項目２６）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、および５〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドをコードする、項目２５に記載の単離された核酸。
（項目２７）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２、４、および９〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドをコードする、項目２５または２６に記載の単離された核酸。
（項目２８）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列を含む、項目２５から２７までのいずれかに記載の単離された核酸。
（項目２９）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２１および配列番号２６を含む、項目２５から２８までのいずれかに記載の単離された核酸。
（項目３０）
項目２５から２９までのいずれかに記載の単離された核酸を含むベクター。
（項目３１）
項目３０に記載のベクターを含む細胞。
（項目３２）
項目１から１９までのいずれかに記載の抗体またはその断片を含む医薬組成物。
（項目３３）
項目３０に記載のベクターを含む医薬組成物。
（項目３４）
項目３１に記載の細胞を含む医薬組成物。
（項目３５）
被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害する方法であって、該被験体に、前記医薬組成物を、該被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害するために有効な量で投与することを含む方法において使用するための、項目３２から３４までのいずれかに記載の医薬組成物。
（項目３６）
被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害する方法であって、該被験体に、項目３２から３４までのいずれかに記載の医薬組成物を、該被験体におけるＭＭＰ９活性を阻害するために有効な量で投与することを含む方法。
（項目３７）
被験体由来の試験試料におけるＭＭＰ９発現を検出する方法であって、
（ａ）該試験試料を、項目１から１９までのいずれかに記載の抗体または断片と接触させるステップと、
（ｂ）該抗体または断片と該試料中のタンパク質との結合を検出し、それにより、ＭＭＰ９の存在を検出するステップと
を含む方法。
（項目３８）
前記試験試料において検出された結合の量を、前記抗体または断片と対照試料との結合の量と比較するステップをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
配列番号２７の残基１１１〜１９８から本質的になるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
（項目４０）
配列番号２７の残基１１１〜１９８を含有し、残基１１１、１１３、１６２、または１９８にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む単離されたミュータントＭＭＰ９ポリペプチド。
（項目４１）
前記アミノ酸配列が、配列番号２７の残基１１１、１１３、１６２、および１９８にアミノ酸置換を含有する、項目４０に記載の単離されたミュータントＭＭＰ９ポリペプチド。

図１は、マウスモノクローナル抗ＭＭＰ９抗体（ＡＢ００４１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を、重鎖（ＶＨ１〜ＶＨ４）のヒト化変異体のアミノ酸配列と一緒に示し、ヒト化によって生じるフレームワークのアミノ酸配列の差異を示すためにアラインメントした図である。ＣＤＲがイタリック体で示されており、ヒト化変異体において親マウスモノクローナルと比較して異なるアミノ酸に下線が引かれている。

図２は、マウスモノクローナル抗ＭＭＰ９抗体（ＡＢ００４１）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、この軽鎖（ＶＨ１〜ＶＨ４）のヒト化変異体のアミノ酸配列と一緒に示し、ヒト化によって生じるフレームワークのアミノ酸配列の差異を示すためにアラインメントした図である。ＣＤＲがイタリック体で示されており、ヒト化変異体において親マウスモノクローナルと比較して異なるアミノ酸に下線が引かれている。

図３は、ＭＭＰ９タンパク質の概略図である。

図４は、ＡＢ００４１、Ｍ４、およびＭ１２と称される抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の間の比較を示す図である。

詳細な説明
本開示の実施には、別段の指定のない限り、細胞生物学、毒性学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組換えＤＮＡの分野および当技術分野の技術の範囲内の関連する分野における標準の方法および従来の技法が使用される。そのような技法は、文献に記載されており、それにより、当業者が利用可能である。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００８年；Ｖｏｅｔ， Ｄ．ら、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｌｉｆｅ ａｔ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２００８年；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新版； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ、２０００年；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡを参照されたい。例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、（Ｒ． Ｃｏｉｃｏ、シリーズ編集者）、Ｗｉｌｅｙ、２０１０年８月に最新更新されたものも参照されたい。

ある特定のＭＭＰは、腫瘍の成長、転移、炎症、自己免疫、および血管疾患において役割を果たす。例えば、Huら（２００７年）Nature Reviews： Drug Discovery ６巻:４８０〜４９８頁を参照されたい。したがって、ある特定の治療的状況において１種または複数の特定のＭＭＰの活性を阻害することが望ましい。配列レベルでは著しい相同性を有するが、２種のゼラチナーゼ、ＭＭＰ９およびＭＭＰ２の発現および機能的役割は著しく異なる。ＭＭＰ９発現は、いくつもの疾患に関連するサイトカインおよび増殖因子によって誘導される。また、ＭＭＰ９ノックアウトマウスは種々の疾患モデルにおいて保護されるが、ＭＭＰ２はより構成的に発現され、ＭＭＰ２ノックアウト動物は、あまり保護されない傾向がある。いくつかの試験により、ＭＭＰ２ノックアウトマウスが誘発モデル（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｏｄｅｌ）において疾患の悪化を示したことが示された。いくつかの疾患または障害に対しては、２種以上のＭＭＰの活性が阻害される。臨床試験では、２種以上のＭＭＰに対する阻害剤により、望ましくない毒性または有効性の欠如などの有害作用が引き起こされた。特定のＭＭＰ、例えば、ＭＭＰ２の活性は、多くの場合、正常な組織恒常性のために必要であり、かつ／または疾患を防止することが示されている。ある特定の利用可能なＭＭＰ阻害剤では副作用が引き起こされている。

提供される実施形態としては、治療用試薬、例えば、単一のＭＭＰまたは選り抜きの複数のＭＭＰ（ａ ｓｅｌｅｃｔ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ ｏｆ ＭＭＰｓ）、例えば、ＭＭＰ９の触媒活性を特異的に阻害する、および特定の他のＭＭＰまたは任意の他のＭＭＰとは反応しないまたはそれを阻害しない抗体およびその抗原結合断片を含めた作用剤が挙げられる。提供される実施形態としては、種々の疾患を処置するための、その方法および使用も挙げられる。
ＭＭＰ９結合タンパク質

本開示は、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）タンパク質（ＭＭＰ９は、ゼラチナーゼ−Ｂとしても公知である）に結合する結合タンパク質、例えば、抗体およびその断片（例えば、抗原結合断片）、例えば、配列番号２７または配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するヒトＭＭＰ９などのヒトＭＭＰ９を提供する。本開示の結合タンパク質は、一般には、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖（またはその機能性断片）およびＩｇ軽鎖（またはその機能性断片）を含む。

本開示は、さらに、ＭＭＰ９に特異的に結合し、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１２、およびＭＭＰ１３などの他のマトリックスメタロプロテイナーゼには結合しないＭＭＰ９結合タンパク質を提供する。したがって、そのような特異的なＭＭＰ９結合タンパク質は、一般に、非ＭＭＰ９マトリックスメタロプロテイナーゼとは有意にまたは検出可能に交差反応しない。ＭＭＰ９に特異的に結合するＭＭＰ９結合タンパク質は、例えば、他のマトリックスメタロプロテイナーゼの活性には直接影響を及ぼすことなく、ＭＭＰ９の特異的な調節（例えば、阻害）を得ることが必要である、またはそれが望ましい適用において使用される。

本開示のある特定の実施形態では、抗ＭＭＰ９抗体は、ＭＭＰ９の活性の阻害剤であり、ＭＭＰ９の特異的な阻害剤であってよい。一実施形態では、本明細書に開示されているＭＭＰ９結合タンパク質は、ＭＭＰ９を阻害するために有用であるが、他のマトリックスメタロプロテイナーゼには影響を及ぼさない。「ＭＭＰの阻害剤」または「ＭＭＰ９活性の阻害剤」は、これだけに限定されないが、酵素的プロセシング、ＭＭＰ９のその基質に対する作用を阻害すること（例えば、基質の結合、基質の切断などを阻害することによって）などを含め、直接的に、または間接的にＭＭＰ９の活性を阻害する抗体またはその抗原結合断片であってよい。

本開示は、ヒトＭＭＰ９、カニクイザルＭＭＰ９、およびラットＭＭＰ９などの非マウスＭＭＰ９に特異的に結合するＭＭＰ９結合タンパク質も提供する。

本開示は、非競合的な阻害剤としての機能を果たすＭＭＰ９結合タンパク質（例えば、抗ＭＭＰ９抗体およびその機能性断片）も提供する。「非競合的な阻害剤」とは、酵素の基質結合部位から離れた部位に結合する、したがって、酵素がその基質と結合しているか否かにかかわらず酵素に結合し、阻害活性に影響を及ぼすことができる阻害剤を指す。非競合的な阻害またはアロステリックな阻害は、一般に、基質の会合または濃度に依存しない。そのような非競合的な阻害剤により、例えば、基質濃度に実質的に非依存性であり得る阻害のレベルをもたらすことができる。

本開示のＭＭＰ９結合タンパク質（例えば、抗体およびその機能性断片）は、ＭＭＰ９、特にヒトＭＭＰ９に結合し、本明細書に開示されている重鎖ポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超のアミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペプチド（またはその機能性断片）を有するものを包含する。

本開示のＭＭＰ９結合タンパク質（例えば、抗体およびその機能性断片）は、ＭＭＰ９、特にヒトＭＭＰ９に結合し、本明細書に開示されている重鎖ポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチド（ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（またはその機能性断片）を有するものを包含する。

本開示のＭＭＰ９結合タンパク質（例えば、抗体およびその機能性断片）は、ＭＭＰ９、特にヒトＭＭＰ９に結合し、本明細書に開示されている重鎖ポリペプチドの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する重鎖ポリペプチド（またはその機能性断片）および軽鎖ポリペプチド（またはその機能性断片）のＣＤＲを有するものを包含する。

「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、本明細書において核酸およびポリペプチドに関して使用される場合、それぞれ、アミノ酸配列または核酸配列のアラインメントに基づいた２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の関係を指す。相同性および同一性は、それぞれ比較するためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較する配列内の同等の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されていれば、それらの分子はその位置において同一であり、同等の部位が同じまたは類似したアミノ酸残基（例えば、立体的本質および／または電子的本質が類似している）によって占有されていれば、その分子は、その位置において相同である（類似した）と称することができる。相同性／類似性または同一性の百分率としての表示とは、比較される配列によって共有される位置における同一のまたは類似したアミノ酸の数の関数を指す。２つの配列の比較において、残基（アミノ酸または核酸）が存在しないことまたは余分の残基が存在することによっても、同一性および相同性／類似性が低下する。

本明細書で使用される場合、「同一性」とは、配列をアラインメントして配列マッチングを最大にした場合、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮に入れた場合に、２つ以上の配列内の対応する位置にある同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味する。配列は、一般に、指定の領域、例えば、少なくとも約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５またはそれ超のアミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたって、および参照アミノ酸またはヌクレオチドの全長に至ってよい領域にわたって一致が最大になるようにアラインメントされる。配列比較のために、一般には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータプログラムにインプットし、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムにより、試験配列（複数可）について、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列と比較してパーセント配列同一性を算出する。

パーセント配列同一性を決定するために適したアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３〜４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３８９〜３４０２頁に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて公的に入手可能である。別の例示的なアルゴリズムとしては、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにおいて入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．ら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２巻：４６７３〜４６８０頁）が挙げられる。

同一でない残基の位置は保存的アミノ酸置換によって異なり得る。保存的アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびトレオニンであり、アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。

２つの核酸の間の配列同一性を、２つの分子の、ストリンジェントな条件下での互いとのハイブリダイゼーションに関して記載することもできる。ハイブリダイゼーション条件は当技術分野における標準の方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０℃以上、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム／１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、溶液：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で一晩インキュベートし、その後、フィルターを０．１×ＳＳＣ中、約６５℃で洗浄することである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも上記の代表的な条件と同様にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり、条件は、上記の特定のストリンジェントな条件と少なくとも約８０％同様にストリンジェント、一般には、少なくとも９０％同様にストリンジェントであれば、少なくとも同様にストリンジェントであるとみなされる。

したがって、本開示は、例えば、本明細書に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号１または配列番号５〜８）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ超のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域ポリペプチド、および本明細書に記載の軽鎖ポリペプチド（例えば、配列番号２または配列番号９〜１２）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ超のアミノ酸配列同一性を有する可変軽鎖ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。

本開示の抗ＭＭＰ９抗体の例を、以下により詳細に記載する。
抗体

ＭＭＰ９結合タンパク質は、ＭＭＰ９に特異的に結合するものなどの抗体およびその機能性断片を含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原エピトープに特異的に結合するペプチド配列（例えば、可変領域の配列）を含む、単離された、または組換え型のポリペプチド結合作用剤を意味する。この用語は、その最も広範な意味で使用され、特にモノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに、所望の生物活性を示す限りは、これだけに限定されないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦａｂ_２を含めた抗体断片を包含する。「ヒト抗体」という用語は、可能な非ヒトＣＤＲ領域以外はヒト起源の配列を含有する抗体を指し、また、免疫グロブリン分子の完全な構造が存在することを意味するものではなく、抗体が、ヒトにおいて最小の免疫原性作用を有する（すなわち、それ自体に対する抗体の産生を誘導しない）ことのみを意味する。

「抗体断片」とは、全長の抗体の一部、例えば、全長の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。そのような抗体断片は、本明細書では、「機能性断片」または「抗原結合断片」とも称することができる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａら（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁）；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と称される、それぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片、および残りの、容易に結晶化することができることが名称に反映された「Ｆｃ」断片が生じる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原と架橋することができるＦ（ａｂ’）_２断片がもたらされる。

「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが密接に非共有結合で会合した二量体からなる。この立体配置では、各可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が相互作用してＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原結合部位が確定される。集合的に、６つのＣＤＲにより抗原との結合の特異性が抗体に付与される。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な６つのＣＤＲのうちの３つしか含まない単離されたＶ_Ｈ領域またはＶ_Ｌ領域）でさえ、抗原を認識し、それに結合することができるが、一般に親和性はＦｖ断片全体よりも低い。

「Ｆ_ａｂ」断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域に加えて、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ_１）も含有する。Ｆａｂ断片は、抗体のパパイン消化後に最初に観察された。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）断片が重鎖ＣＨ_１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めたいくつかの追加の残基を含有するという点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ヒンジ領域の近くでジスルフィド結合によってつながった２つのＦａｂ断片を含有し、また、抗体のペプシン消化後に最初に観察された。Ｆａｂ’−ＳＨとは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離型のチオール基を担持するＦａｂ’断片に対する名称である。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。

任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと称される２つの明白に異なる種類の一方に割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てることができ、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖが抗原と結合するための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻（ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内で接続した重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合が可能になるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的なドメインと対合させ、それにより、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、さらに、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：６４４４〜６４４８頁に記載されている。

「単離された」抗体とは、その天然の環境の構成成分から同定され、分離および／または回収された抗体である。その天然の環境の構成成分は、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定したところ、抗体の９５重量％超、例えば、９９重量％超まで、（２）例えば、スピニングカップシークエネーターを使用することによって少なくとも１５残基のＮ末端または内部のアミノ酸配列を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）または銀染色による検出を用いた、還元条件下または非還元条件下でのゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって均一になるまで、精製される。組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕ抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないので、「単離された抗体」という用語に包含される。ある特定の実施形態では、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。

本明細書で使用される場合、「免疫反応性の」とは、他のペプチド／タンパク質に対して交差反応性であっても、アミノ酸残基の配列（「結合部位」または「エピトープ」）に特異的であって、ヒトへの使用のために投与するために製剤化されるレベルにおいて毒性でない抗体またはその断片を指す。「エピトープ」とは、抗体またはその抗原結合断片との結合相互作用を形成することができる抗原の部分を指す。エピトープは、直鎖ペプチド配列（すなわち、「連続的」）であってもよく、連続していないアミノ酸配列で構成されてもよい（すなわち、「立体構造」または「不連続」）。「優先的に結合する」という用語は、結合作用剤が、結合部位に、無関係のアミノ酸配列に結合するよりも大きな親和性で結合することを意味する。

抗ＭＭＰ９抗体は、重鎖および軽鎖のＣＤＲに関して記載することができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域において見出される連続していない抗原結合部位を意味するものとする。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２巻：６６０９〜６６１６頁（１９７７年）；Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９９１年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）；およびＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６２巻：７３２〜７４５頁（１９９６年）によって記載されており、定義は、互いに比較した場合にアミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それにもかかわらず、いずれの定義を適用して抗体または移植抗体またはその変異体のＣＤＲについて言及することも、本明細書において定義され、使用されるこの用語の範囲内であるものとする。上で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は以下の表１に比較として記載されている。

本明細書で使用される場合、「フレームワーク」という用語は、抗体可変領域に関して使用される場合、抗体の可変領域内のＣＤＲ領域の外側の全てのアミノ酸残基を意味するものとする。可変領域フレームワークは、一般に、長さが約１００アミノ酸から約１２０アミノ酸の間の不連続なアミノ酸配列であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを指すものとする。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」という用語は、ＣＤＲによって分離されているフレームワークの各ドメインを意味するものとする。

いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（レシピエント抗体）を包含する。したがって、非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。非ヒト配列は、主に可変領域、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基で置き換えられている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲやフレームワーク配列にも見出されない残基も含んでよい。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する。本開示の目的に関して、ヒト化抗体は、免疫グロブリン断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または他の抗体の抗原結合部分配列も含んでよい。

ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、一般には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）も含んでよい。例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３〜３２９頁；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２巻：５９３〜５９６頁を参照されたい。

非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で公知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒトである供給源から１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」または「ドナー」残基と称され、一般には、「移入」または「ドナー」可変ドメインから得られる。例えば、ヒト化は、基本的にＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で対応するヒト抗体の配列を置換することによって実施することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓら、上記；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、上記およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：１５３４〜１５３６頁を参照されたい。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満が非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）を包含する。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基、および必要に応じていくつかのフレームワーク領域残基がげっ歯類抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）の類似の部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。

ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイライブラリーを使用することによっても産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、２２７巻：３８１頁；Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２巻：５８１頁。ヒトモノクローナル抗体を調製するための他の方法は、Ｃｏｌｅら（１９８５年）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、７７頁およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７巻：８６〜９５頁に記載されている。

ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的に、または完全に不活性化されたトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。免疫学的に攻撃するとヒト抗体産生が観察され、これはヒトにおいて見られるものと、遺伝子再構成、集合、および抗体レパートリーを含めたあらゆる点でよく似ている。この手法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、および以下の科学的刊行物に記載されている：Ｍａｒｋｓら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８巻：８５６〜８５９頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８巻：８１２〜８１３頁；Ｆｉｓｈｗａｌｄら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４巻：８４５〜８５１頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４巻：８２６頁；およびＬｏｎｂｅｒｇら（１９９５年）Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３巻：６５〜９３頁。

抗体は、上記の公知の選択方法および／または変異誘発方法を使用して親和性成熟させることができる。いくつかの実施形態では、親和性成熟した抗体は、成熟抗体を調製する出発抗体（一般にマウス、ウサギ、ニワトリ、ヒト化またはヒト）の親和性よりも５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、または３０倍以上の親和性を有する。

抗体は二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体はモノクローナルであり、少なくとも２種の異なる抗原に対して結合特異性を有するヒト抗体またはヒト化抗体であってよい。この場合、２つの異なる結合特異性は、２つの異なるＭＭＰ、または単一のＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ９）上の２つの異なるエピトープに対するものであってよい。

本明細書に開示されている抗体は、免疫コンジュゲートであってもよい。そのような免疫コンジュゲートは、第２の分子、例えば、レポーターにコンジュゲートした抗体（例えば、ＭＭＰ９に対する）を含む。免疫コンジュゲートは、細胞傷害性薬剤、例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））とコンジュゲートした抗体も含んでよい。

特定のポリペプチドまたはエピトープに「特異的に結合する」または「特異的な」抗体とは、抗体と標的抗原またはエピトープの選択的結合を指し、これらの用語および特異的な結合を決定するための方法は当技術分野においてよく理解されている。抗体は、標的抗原またはエピトープと、他の物質よりも大きな親和性、アビディティで、より容易に、かつ／またはより長い持続時間で結合する場合に、特定の標的抗原またはエピトープに対する「特異的な結合」を示す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合する抗体とは、他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープのいずれにも実質的に結合することなく特定のポリペプチドまたはエピトープに結合する抗体である。

いくつかの実施形態では、提供される抗体は、ヒトＭＭＰ９に、約４℃、２５℃、３７℃または４２℃の温度で測定して、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂの形態、または抗体の他の形態で、１００ｎＭ以下、必要に応じて１０ｎＭ未満、必要に応じて１ｎＭ未満、必要に応じて０．５ｎＭ未満、必要に応じて０．１ｎＭ未満、必要に応じて０．０１ｎＭ未満、または必要に応じて０．００５ｎＭ未満、特定の例では、０．１ｎＭから０．２ｎＭまでの間、または０．１ｐＭから１０ｐＭの間、例えば、０．４ｐＭから９ｐＭの間、例えば、０．４ｐＭから８．８ｐＭの間の解離定数（Ｋ_ｄ）で特異的に結合する。

ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＭＭＰ９の１つまたは複数のプロセシング部位（例えば、タンパク質分解的切断の部位）に結合し、それにより、プロ酵素またはプレプロ酵素がプロセシングされて触媒として活性な酵素になることを有効に遮断し、したがって、ＭＭＰ９のタンパク質分解活性を低下させる。

ある特定の実施形態では、本開示による抗体は、ＭＭＰ９に、別のＭＭＰに対するその結合親和性よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍大きな親和性で結合する。結合親和性は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができ、例えば、会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、解離定数（Ｋ_ｄ）、平衡定数（Ｋ_ｅｑ）または当技術分野における任意の用語として表すことができる。

ある特定の実施形態では、本開示による抗体は、ＭＭＰ９の酵素（すなわち、触媒）活性を阻害する抗体、例えば、ＭＭＰ９の触媒活性の非競合的な阻害剤である。ある特定の実施形態では、本開示による抗体は、ＭＭＰ９の触媒ドメイン内に結合する。さらなる実施形態では、本開示による抗体は、ＭＭＰ９の触媒ドメインの外側に結合する。

本明細書に記載の抗ＭＭＰ９抗体またはその抗原結合断片の任意の１つまたは複数と、ＭＭＰ９との結合について競合する抗体またはその抗原結合断片も提供される。したがって、本開示は、例えば、配列番号１または配列番号５〜８のいずれかの重鎖ポリペプチド、配列番号２または配列番号９〜１２の軽鎖ポリペプチド、またはそれらの組合せを有する抗体との結合について競合する抗ＭＭＰ９抗体およびその機能性断片を意図している。一実施形態では、抗ＭＭＰ９抗体またはその機能性断片は、本明細書においてＡＢ００４１と記載されている抗体と、ヒトＭＭＰ９との結合について競合する。
エピトープ結合

本明細書に記載の抗体の任意の１つまたは複数と同じエピトープ、例えば、ＭＭＰ９エピトープに結合する抗体およびその断片も提供される。ＭＭＰ９のエピトープに特異的に結合する抗体および断片も提供され、エピトープは、ＭＭＰ９の特定の領域またはＭＭＰ９の複数の領域内のアミノ酸残基を含む。そのような領域は、例えば、ＭＭＰ９の構造ループおよび／または他の構造ドメイン、例えば、本明細書に記載の例示的な抗体と結合するために重要であることが示されているものを含んでよい。一般には、領域は、全長のＭＭＰ９配列、例えば、配列番号２７におけるアミノ酸残基の位置に従って定義される。いくつかの例では、エピトープは、配列番号２７のシステインスイッチ活性ポケットの外側にある。いくつかの例では、エピトープは、配列番号２７の残基１０４〜２０２である領域内のアミノ酸残基（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基）を含有する。一例では、エピトープは、配列番号２７の残基１０４〜１１９、残基１５９〜１６６、または残基１９１〜２０２である領域内のアミノ酸残基（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基）を含有する。一部の態様では、エピトープは、配列番号２７の残基１０４〜１１９であるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基）、配列番号２７の残基１５９〜１６６であるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基、および配列番号２７の残基１９１〜２０２であるＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基を含む。一部の場合には、エピトープは、配列番号２７のＥ１１１、Ｄ１１３、Ｒ１６２、またはＩ１９８を含む。一部の場合には、エピトープは配列番号２７のＲ１６２を含む。一部の場合には、エピトープは、配列番号２７のＥ１１１、Ｄ１１３、Ｒ１６２、およびＩ１９８を含む。
ＭＭＰ９配列

ヒトＭＭＰ９タンパク質のアミノ酸配列は以下の通りである：

タンパク質ドメインは、図３に概略的に示されており、また、以下に示されている：
アミノ酸番号 特徴
１〜１９ シグナルペプチド
３８〜９８ ペプチドグリカン結合ドメイン
Ｒ９８／Ｃ９９ システインスイッチ活性ポケット
１１２〜４４５ Ｚｎ依存性メタロプロテイナーゼドメイン
２２３〜２７１ フィブロネクチンＩＩ型ドメイン（ゼラチン結合ドメイン）
２８１〜３２９ フィブロネクチンＩＩ型ドメイン（ゼラチン結合ドメイン）
３４０〜３８８ フィブロネクチンＩＩ型ドメイン（ゼラチン結合ドメイン）
４００〜４１１ Ｚｎ結合領域
５２１〜５６５ ヘモペキシン様ドメイン
５６７〜６０８ ヘモペキシン様ドメイン
６１３〜６５９ ヘモペキシン様ドメイン
６６１〜７０４ ヘモペキシン様ドメイン

成熟全長ヒトＭＭＰ９のアミノ酸配列（シグナルペプチドを伴わない配列番号２７のプロポリペプチドのアミノ酸配列である）は：
である。

シグナルペプチドのアミノ酸配列はＭＳＬＷＱＰＬＶＬＶＬＬＶＬＧＣＣＦＡ（配列番号２９）である。

ミュータントＭＭＰ９ポリペプチドを含めた、ＭＭＰ９ポリペプチドも提供される。そのようなペプチドは、例えば、本明細書において提供される抗体および断片を生成および選択することにおいて有用である。例示的なポリペプチドとしては、配列番号２７の残基１０４〜２０２を含有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号２７のアミノ酸配列を有し、配列番号２７の残基１１１、１１３、１６２、もしくは１９８にアミノ酸置換を有する、またはそのような残基全てにアミノ酸置換を有するポリペプチドが挙げられる。その他の例示的なポリペプチドとしては、配列番号２７の残基１１１〜１９８を含有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号２７の残基１１１〜１９８を含有するアミノ酸配列を有し、配列番号２７の残基１１１、１１３、１６２、もしくは１９８にアミノ酸置換を有する、またはそのような残基全てにアミノ酸置換を有するポリペプチドが挙げられる。そのようなポリペプチドは、例えば、本明細書に記載のものなどの、そのような残基を含有するエピトープおよび／またはＭＭＰ９のそのような残基が結合のために重要であるエピトープに結合する抗体を選択することにおいて使用が見出される。

本開示は、ＭＭＰ９、例えば、ヒトＭＭＰ９の任意の部分に結合するＭＭＰ９結合タンパク質を意図しており、他のＭＭＰと比較してＭＭＰ９に優先的に結合するＭＭＰ９結合タンパク質が特に興味深い。

抗ＭＭＰ９抗体およびその機能性断片は、当技術分野で周知の方法に従って生成することができる。例示的な抗ＭＭＰ９抗体が以下に提供される。
マウスモノクローナル抗ＭＭＰ９抗体

ヒトＭＭＰ９に対するマウスモノクローナル抗体を実施例１に記載のとおりに得た。この抗体は、マウスＩｇＧ２ｂ重鎖およびマウスカッパ軽鎖を含有し、ＡＢ００４１と称される。

ＡＢ００４１重鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：

シグナル配列に下線が引かれており、ＩｇＧ２ｂ定常領域の配列がイタリック体で示されている。

ＡＢ００４１軽鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：

シグナル配列に下線が引かれており、カッパ定常領域の配列がイタリック体で示されている。

以下のアミノ酸配列は、ＡＢ００４１のＩｇＧ２ｂ重鎖の可変領域のフレームワーク領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（ＣＤＲに下線が引かれている）：

以下のアミノ酸配列は、ＡＢ００４１のカッパ軽鎖の可変領域のフレームワーク領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（ＣＤＲに下線が引かれている）：
他の例示的なマウス抗ヒトＭＭＰ９抗体（例えば、Ｍ４およびＭ１２）は実施例１Ｂに記載されている。例示的な抗マウスＭＭＰ９抗体（ＡＢ００４６）は、実施例１Ｃに記載されている。他の例示的なマウス抗ヒトＭＭＰ９抗体としては、配列番号３の配列を有する可変領域、およびＩｇＧ２ｂ定常領域の配列に対して９５％の類似性を有する定常領域を含む抗体が挙げられる。さらに、例示的なマウス抗ヒトＭＭＰ９抗体としては、配列番号４の配列を有する可変領域、およびＩｇＧ２ｂ定常領域の配列に対して９５％の類似性を有する定常領域を含む抗体が挙げられる。他の例示的なマウス抗ヒトＭＭＰ９抗体としては、配列番号３および４の配列を有する可変領域、およびＩｇＧ２ｂ定常領域の配列に対して９５％の類似性を有する定常領域を含む抗体が挙げられる。そのような抗マウス抗体は、ＭＭＰ９阻害方法を試験および評価するために適している。
重鎖変異体

ＡＢ００４１重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域の配列を変更することによって、別々に改変した。これらの配列変更の効果は、ヒトＴ細胞エピトープの抗体を枯渇させ、それにより、ヒトにおけるその免疫原性を低下させるまたは無効にすることであった。

ヒンジドメインを安定化するＳ２４１Ｐアミノ酸変化（Ａｎｇａｌら（１９９３年）Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０巻：１０５〜１０８頁）を含有するヒトＩｇＧ４重鎖バックグラウンドで、４種の重鎖変異体を構築し、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４と名付けた。それらのフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りである：

図１に、ヒト化重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントが示され、４種の変異体の間のフレームワーク領域内のアミノ酸配列の差異が示されている。
軽鎖変異体

ヒトカッパ鎖バックグラウンドで、４種の軽鎖変異体を構築し、Ｖｋ１、Ｖｋ２、Ｖｋ３およびＶｋ４と名付けた。それらのフレームワーク領域およびＣＤＲのアミノ酸配列は以下の通りである：

図２に、ヒト化軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアラインメントが示され、４種の変異体の間のフレームワーク領域内のアミノ酸配列の差異が示されている。

ヒト化重鎖および軽鎖を、可能性のある対組合せの全てに組み合わせて、いくつもの機能的なヒト化抗ＭＭＰ９抗体を生成する。例えば、配列番号３、５、６、７、および８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を有する抗体；配列番号４、９、１０、１１、および１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗体；および配列番号３、５、６、７、および８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域および配列番号４、９、１０、１１、および１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗体、ならびにそのような抗体とＭＭＰ９との結合について競合する抗体、およびそのような抗体に対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超の配列同一性を有する抗体が提供される。一例では、抗体は、配列番号７に対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ領域および配列番号１２と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬ領域、または配列番号７のＶＨ領域および配列番号１２のＶＬ領域を有する。

本明細書に開示されている重鎖可変領域の配列に対して７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の相同性を有する追加の重鎖可変領域アミノ酸配列も提供される。さらに、本明細書に開示されている軽鎖可変領域の配列に対して７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の相同性を有する追加の軽鎖可変領域アミノ酸配列も提供される。

本明細書に開示されている重鎖可変領域の配列に対して７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有する追加の重鎖可変領域アミノ酸配列も提供される。さらに、本明細書に開示されている軽鎖可変領域の配列に対して７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有する追加の軽鎖可変領域アミノ酸配列も提供される。
相補性決定領域（ＣＤＲ）

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている例示的な提供される抗ＭＭＰ９抗体の重鎖のＣＤＲは以下のアミノ酸配列を有する：
ＣＤＲ１：ＧＦＳＬＬＳＹＧＶＨ（配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＶＩＷＴＧＧＴＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＹＹＹＧＭＤＹ（配列番号１５）

したがって、提供される抗ＭＭＰ９抗体としては、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１領域を有する抗体、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２領域を有する抗体、および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体、およびＭＭＰ９上のそのような抗体と同じエピトープとの結合について競合する、またはそれに結合する抗体が挙げられる。一部の場合には、抗体は、配列番号１３、１４および１５に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲを含有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている例示的な抗ＭＭＰ９抗体の軽鎖のＣＤＲは以下のアミノ酸配列を有する：
ＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＲＮＴＶＡ（配列番号１６）
ＣＤＲ２：ＳＳＳＹＲＮＴ（配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＱＱＨＹＩＴＰＹＴ（配列番号１８）

したがって、提供される抗ＭＭＰ９抗体としては、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１領域を有する抗体、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２領域を有する抗体、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体、およびＭＭＰ９上のそのような抗体と同じエピトープとの結合について競合する、またはそれに結合する抗体が挙げられる。一部の場合には、抗体は、配列番号１６、１７および１８に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲを含有する。
抗ＭＭＰ９抗体をコードする核酸

本開示は、抗ＭＭＰ９抗体およびその機能性断片をコードする核酸を提供する。したがって、本開示は、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド（核酸）、そのようなポリヌクレオチドを含有するベクター、ならびにそのようなポリヌクレオチドをポリペプチドへと転写し、翻訳するための宿主細胞および発現系を提供する。

本開示は、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセットもしくは発現カセットの形態の構築物も意図している。

本開示は、上記の１つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞、ならびに本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法も提供し、該方法は、組換え宿主細胞において重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を発現させること（同じ宿主細胞において、または異なる宿主細胞において、同じ構築物から、または異なる構築物から）を含む。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成することができる。発現によって産生した後、抗体または抗原結合断片を、任意の適切な技法を使用して単離し、かつ／または精製し、次いで適切に使用することができる。

種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングし、発現させるための系が周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物の細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドを発現させるために当技術分野において利用可能な哺乳動物の細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞およびその他の多くの細胞が挙げられる。一般的な細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。

作動可能に連結したプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および／または適宜他の配列を含めた適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス性の例えばファージまたはファージミドであってよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析において核酸を操作するための多くの公知の技法およびプロトコールは、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年に詳しく記載されている。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

対象のポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むか、あるいは安定なまたは一過性のエピソームエレメントとして維持することができる。

多種多様な発現制御配列−作動可能に連結したＤＮＡ配列の発現を制御する配列−のいずれも、ＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターに使用することができる。例えば、対象のポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結させ得、組換えＭＭＰ９タンパク質またはその一部を産生する方法において使用するための発現構築物中に提供することができる。

本明細書に開示されている抗体鎖をコードする核酸を分子生物学における標準の知識および手順を使用して合成することができることは、当業者には知られている。

本明細書に開示されている重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例は、以下の通りである：

可変領域内のＣＤＲおよびフレームワーク領域の近位（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）、フレームワーク領域の構造および重鎖定常領域および軽鎖定常領域の構造を含めた抗体の構造は当技術分野で周知であるので、抗ＭＭＰ−９抗体をコードする関連する核酸を得ることは、十分に当技術分野の技術の範囲内である。したがって、本明細書に開示されているヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の相同性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドも提供される。したがって、本明細書に開示されているヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％および少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドも提供される。一例では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１に対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超の配列同一性を有するか、または配列番号２１を含むもしくは配列番号２１であり、かつ／または配列番号２６に対して少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超の配列同一性を有する、または配列番号２６を含むもしくは配列番号２６である。
医薬組成物

ＭＭＰ９結合タンパク質、ならびにＭＭＰ９結合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、例えば、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせた医薬組成物として提供することができる。そのような医薬組成物は、例えば、被験体にｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで投与するため、および、被験体を、例えば本明細書において提供される処置方法または診断方法のいずれにおいてもＭＭＰ９結合タンパク質を使用して診断し、かつ／または処置するために有用である。

薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤は、投与される患者に生理的に許容され、一緒に投与される抗体またはペプチドの治療的性質を保持する。薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤およびそれらの製剤は、一般に、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １９９０年）に記載されている。１つの例示的な医薬キャリアは生理食塩水である。キャリアまたは賦形剤のそれぞれは、製剤の他の成分と適合し、患者に対して実質的に傷害性ではないという意味で「薬学的に許容される」。

医薬組成物は、全身的または局所的な特定の投与経路と適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、種々の経路によって投与するために適したキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む。

医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤を含んでよい。添加剤の例としては、これだけに限定されないが、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、ブドウ糖、フルクトース、ラクトースならびにそれらの混合物などの糖が挙げられる。薬学的に許容される添加剤は、ブドウ糖などの薬学的に許容されるキャリアおよび／または賦形剤と組み合わせることができる。添加剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などの界面活性物質も包含する。

製剤および送達方法は、一般に、処置される部位および疾患に応じて適合させる。例示的な製剤としては、これだけに限定されないが、非経口投与、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、もしくは皮下投与、または経口投与に適した製剤が挙げられる。

非経口的送達用の医薬組成物としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ハンクス液、リンゲル液、ブドウ糖／食塩水、およびグルコース溶液が挙げられる。製剤は、生理的条件に近づけるための補助的な物質、例えば、緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、界面活性剤などを含有してよい。添加剤は、殺菌剤または安定剤などの追加の活性成分も含んでよい。例えば、液剤は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートまたはオレイン酸トリエタノールアミンを含有してよい。追加の非経口的な製剤および方法は、Ｂａｉ（１９９７年）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８０巻：６５〜７５頁；Ｗａｒｒｅｎ（１９９７年）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ． １５２巻：３１〜３８頁；およびＴｏｎｅｇａｗａ（１９９７年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６巻：５０７〜５１５頁に記載されている。非経口的調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投薬バイアルに封入することができる。

皮内投与または皮下投与用の医薬組成物は滅菌した希釈剤、例えば、水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、グルタチオンまたは亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および張度を調整するための作用剤、例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖を含んでよい。

注射用の医薬組成物としては、滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための水性液剤（水溶性の場合）または分散製剤および滅菌粉剤を含む。静脈内投与に関して、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）など）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散製剤の場合では必要な粒度を維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。抗細菌剤および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが挙げられる。等張化剤、例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを組成物に含めることができる。生じた溶液は、そのまま使用するために包装することもでき、凍結乾燥させることもできる。凍結乾燥した調製物は、後で投与する前に滅菌溶液と組み合わせることができる。

薬学的に許容されるキャリアは、吸収またはクリアランスを安定化する、増加させるまたは遅延させる化合物を含有してよい。そのような化合物としては、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン；低分子量のタンパク質；ペプチドのクリアランスまたは加水分解を減少させる組成物；または賦形剤または他の安定剤および／もしくは緩衝剤が挙げられる。吸収を遅延させる作用剤としては、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。医薬組成物の吸収を安定化するため、または増加もしくは減少させるために、リポソームキャリアを含めた界面活性剤も用いることができる。化合物を消化から保護するために、組成物と複合体化させて（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）、酸性および酵素による加水分解に対して抵抗性にすることもできるか、または化合物をリポソームなどの適切に抵抗性のキャリアに複合体化させることもできる。化合物を消化から保護する手段は当技術分野で公知である（例えば、Ｆｉｘ（１９９６年）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． １３巻：１７６０〜１７６４頁；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６年）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４８巻：１１９〜１３５頁；および治療剤を経口送達するための脂質組成物が記載されている米国特許第５，３９１，３７７号を参照されたい）。

本発明の組成物は、本明細書において提供される他の治療用部分またはイメージング／診断用部分と組み合わせることができる。治療用部分および／またはイメージング用部分は、別々の組成物として、またはＭＭＰ９結合タンパク質上に存在するコンジュゲートした部分として提供することができる。

ｉｎ ｖｉｖｏ投与用の製剤は、一般に、無菌である。一実施形態では、医薬組成物は、発熱物質を含まず、したがってヒト患者への投与が許容されるように製剤化される。

種々の他の医薬組成物およびそれらを調製および使用するための技法は、本開示を考慮すると当業者に公知である。適切な薬理学的組成物および関連する管理技法の詳細な一覧については、本明細書における詳細な教示を参照することができ、これは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３年）などのテキストによってさらに補充することができる。

医薬組成物は、処置を必要としている患者／被験体の身体特性、投与経路などに基づいて製剤化することができる。そのような医薬組成物は、病院および診療所に配布するために適切なラベルを伴う適切な医薬用パッケージに包装することができ、ラベルは、被験体における本明細書に記載の障害の処置を表示するためのものである。医薬品は、単一単位として包装することもでき、複数の単位として包装することもできる。本発明の医薬組成物の投与量および投与についての指示を医薬用パッケージおよび下記のキットに含めることができる。
使用方法

本開示の抗ＭＭＰ９抗体およびその断片を含めたＭＭＰ９結合タンパク質は、例えば、治療方法および診断方法、例えば、試料中のＭＭＰ９を検出する方法、処置の方法（例えば、血管新生を阻害する方法など）、ならびに診断および予後判定の方法において使用することができる。したがって、診断方法および治療方法ならびに抗ＭＭＰ９抗体の使用が提供される。使用方法の例は下に記載されている。
処置の方法

本明細書では、ＭＭＰ９の発現および／または活性に関連する疾患および障害の処置の方法を含めた処置の方法、ならびに、そのような方法における、提供される抗体および組成物の使用が提供される。疾患および障害としては、これだけに限定されないが、がん、例えば、腫瘍（例えば、原発性腫瘍または転移性腫瘍）、例えば、ＭＭＰ９を発現する組織において発現するまたは配置されるもの、ならびに炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患、関節リウマチおよび炎症性ミオパチーが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本明細書に記載の疾患または障害に関連する１つまたは複数の症状の発生を停滞もしくは延期させること、または現存する制御されていないまたは望ましくない症状を改善すること、さらなる症状を予防すること、または症状の根底にある代謝的原因を改善もしくは予防することを意味する。したがって、この用語は、疾患もしくは症状を有する、またはそのような疾患もしくは症状が発生する潜在性がある哺乳動物の被験体に有益な結果が付与されたことを示す。応答は、患者が、これだけに限定することなく、生存の延長を含み得る、疾病の徴候または症状の部分的もしくは完全な緩和、または低減を経験したときに達成される。予測無増悪生存時間は、再発の数、疾患の病期、および他の因子を含めた予後因子に応じて、数か月から数年の単位で測定することができる。

そのような方法と併せて使用するための医薬組成物、例えば、本明細書に記載の抗体またはその断片のいずれかを含有する医薬組成物も提供される。組成物は、任意の適切な経路によって局所的または全身的に投与するために適したものであってよい。

一般に、ＭＭＰ９結合タンパク質は、治療有効量、例えば、被験体における腫瘍の成長の阻害に影響を及ぼす量、転移を阻害する量、炎症を阻害する量、組織破壊を阻害する量、ＭＭＰ９活性を阻害する量、またはＭＭＰ９に関連する特定の疾患または状態を治療する量で投与される。

本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「治療有効量」または「有効量」という用語は、被験体に投与されると（単独で、または別の治療剤と組み合わせてのいずれかで、場合により指定の通り）疾患の状態または疾患の進行を予防または改善するために有効である、または症状の改善、例えば、関連性のある医学的状態の処置、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の処置、治癒、予防または改善の割合の増大をもたらす作用剤または化合物または組成物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分に適用する場合、治療有効用量とは、その成分単独を指す。組合せに適用する場合、治療有効用量とは、組み合わせて投与されるか、段階的に投与されるか、または同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、活性成分を組み合わせた量を指す。一例では、抗ＭＭＰ９抗体のｉｎ ｖｉｖｏ投与を使用する場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、１日当たり哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇから約１００ｍｇもしくはそれ超に至るまで、好ましくは１日当たり１ｋｇ当たり約１μｇ〜１日当たり１ｋｇ当たり５０ｍｇ、必要に応じて１日当たり１ｋｇ当たり約１００μｇ〜１日当たり１ｋｇ当たり２０ｍｇ、１日当たり１ｋｇ当たり５００μｇ〜１日当たり１ｋｇ当たり１０ｍｇ、または１日当たり１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１日当たり１ｋｇ当たり１０ｍｇの範囲であり得る。一実施形態では、静脈内投与量は、約１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまでにわたる。いくつかの実施形態では、静脈内投与量は、ｑ１４ｄ、１４日ごとに１回、約１ｍｇ／ｋｇから約１４ｍｇ／ｋｇまで、例えば、約２ｍｇ／ｋｇから約１４ｍｇ／ｋｇまでにわたる。他の実施形態では、皮下投与量は、ｑ１４ｄ、１４日ごとに１回、約１ｍｇ／ｋｇから約２８ｍｇ／ｋｇまで、例えば、約２ｍｇ／ｋｇから約２８ｍｇ／ｋｇまでにわたる。いくつかの実施形態では、有効投与量を７日〜２８日ごとに１回投与する。一実施形態では、有効投与量を７日ごとに１回投与する。別の実施形態では、有効投与量を２８日ごとに１回投与する。

選択された投与レジメンは、ＭＭＰ９結合タンパク質の活性、投与経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、使用する特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康ならびに以前の病歴、ならびに同様に医学の分野で周知の因子を含めた種々の因子に依存する。

当技術分野における通常の技術を有する臨床医は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物に使用する本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、投与量を所望の効果が達成されるまで徐々に上昇させることができる。

一部の場合には、処置の方法は、作用剤、例えば、抗ＭＭＰ９抗体またはそれを含有する組成物を非経口投与、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、もしくは皮下投与すること、または経口投与することを含む。

本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、哺乳動物の被験体を意味する。例示的な被験体としては、これだけに限定されないが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジが挙げられる。いくつかの実施形態では、被験体は、がん、炎症性の疾患もしくは状態、または自己免疫性の疾患もしくは状態を有し、下記の通り本発明の作用剤を用いて処置することができる。

必要であれば、処置のために、方法は、追加の療法、例えば、がんの場合では、ＭＭＰ９結合タンパク質に加えて、がんの外科的除去および／または抗がん剤の投与または処置をさらに含んでよい。そのような抗がん剤の投与または処置は、本明細書に開示されている組成物の投与と同時であってもよい。
ＭＭＰ９の検出方法

本開示は、被験体におけるＭＭＰ９を検出する方法、例えば、ＭＭＰ９を発現している腫瘍もしくは腫瘍に関連する組織、または自己免疫疾患または炎症性疾患などの本明細書に記載の疾患に関連する組織もしくは体液もしくは他の生体試料を検出するための、方法も意図している。したがって、ＭＭＰ９活性を有する腫瘍を診断する、モニタリングする、病期分類するまたは検出する方法が提供される。

被験体（例えば、ＭＭＰ９発現と関連する腫瘍を有する疑いがある、もしくはそれを有することが分かっている個体、または別の疾患または状態を有する疑いがある、もしくはそれを有することが分かっている個体）由来の試料（例えば、試験生体試料）を、ＭＭＰ９の存在、非存在、発現、および／またはレベルについて分析することができる。例えば、そのような試料を収集し、本明細書に記載の抗体または断片などのＭＭＰ９結合タンパク質と試料中の物質（例えば、タンパク質）との結合が存在するかしないかを検出することによって分析することができる。いくつかの例では、該方法は、検出された結合の量を対照試料との結合の量と比較すること、またはＭＭＰ９の検出レベルをＭＭＰ９の対照レベルと比較することをさらに含む。一部の場合には、該方法により、ＭＭＰ９関連疾患または状態（例えば、本明細書に記載のもの）の存在、非存在、または重症度が示される。

この分析は、本明細書に記載のＭＭＰ９結合タンパク質を使用した処置を開始する前に実施することができ、がん処置の進行のモニタリングの一部として行うこともできる。いくつかの実施形態では、検出アッセイを実施し、例えば、診断アッセイの結果に基づいて被験体の処置を開始、変更、または中止することによって行われる処置の方法が提供される。そのような診断分析は、これだけに限定されないが、組織、そのような組織から単離された細胞などを含めた任意の試料を使用して実施することができる。一部の場合には、該方法を、血液、血漿、血清、全血、唾液、尿、または精液などの液体試料に対して実施する。組織試料としては、例えば、ホルマリン固定したまたは凍結させた組織切片が挙げられる。

ＭＭＰ９を検出および分析するための任意の適切な方法を使用することができる。当技術分野で公知の種々の診断アッセイ技法、例えば、競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイおよび不均一相または均一相のいずれかで行われる免疫沈降アッセイが、そのような目的に適し得る。

検出方法において使用するためのＭＭＰ９結合タンパク質は、検出可能部分を用いて標識することができる。検出可能部分により、直接的に、または間接的に、検出可能なシグナルが生じる。例えば、検出可能部分は、例えば、放射性同位元素、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉ、蛍光化合物もしくは化学発光化合物、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、シアニン、フォトシアン、ローダミン、もしくはルシフェリン、または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの本明細書に記載のもののいずれであってもよい。

検出は、ＭＭＰ９結合タンパク質とＭＭＰ９との結合に適した条件下で試料を接触させ、ＭＭＰ９結合タンパク質−ＭＭＰ９複合体が存在すること（例えば、レベル）または存在しないことを評価することによって達成することができる。参照試料のレベルと比較した試料中のＭＭＰ９のレベルにより、ＭＭＰ９活性を有する腫瘍または腫瘍に関連する組織が存在することが示され得る。参照試料は、被験体から以前に取得した試料であっても別の個体由来の試料であってもよい。

本発明の種々の態様が、以下のいくつかの実施例を介してさらに記載され、例示されており、これはいずれも本発明の範囲を限定するものではない。

（実施例１Ａ）
ヒトＭＭＰ−９に対する抗体の調製
シグナルペプチドを含まない全長のヒトＭＭＰ９タンパク質（配列番号２８）を用いてマウスを免疫した。免疫したマウス由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマライブラリーを生成した。モノクローナル培養物を調製し、スクリーニングして、抗ＭＭＰ９モノクローナル抗体を発現している培養物を同定した。

抗体（ＡＢ００４１）を培養物のうちの１つから精製し、特徴付けた。この抗体は、ＩｇＧ２ｂ重鎖およびカッパ軽鎖を含有した。特徴付けは、ＡＢ００４１の、他のヒトＭＭＰおよびカニクイザル、ラットおよびマウスを含めた他の種由来のＭＭＰ９タンパク質との結合について試験することを含んだ。表２に示されているように、ＡＢ００４１抗体はヒトＭＭＰ９およびカニクイザルＭＭＰ９に対する親和性がより大きく、ラットＭＭＰ９に対する親和性がより低かった。さらに、ＡＢ００４１抗体は、マウスＭＭＰ９にも多くのヒト非ＭＭＰマトリックスメタロプロテイナーゼにも結合しなかった。

追加の特徴付けは、ＡＢ００４１とミュータントマウスＭＭＰ９タンパク質およびヒトＭＭＰ９タンパク質との結合をアッセイすることを含んだ。マウスＭＭＰ９タンパク質およびヒトＭＭＰ９タンパク質の触媒ドメインにおける同一でない残基を同定し、４６の同一でないアミノ酸残基を変異誘発のために選択した。大部分の変異をマウスＭＭＰ９において生成した：マウスアミノ酸残基を変異させて、ヒトＭＭＰ９のアミノ酸残基とマッチさせた。他の変異をヒトＭＭＰ９において生成した：ヒトアミノ酸残基を変異させて、マウスＭＭＰ９のアミノ酸残基とマッチさせた。変異させたマウスＭＭＰ９タンパク質またはヒトＭＭＰ９タンパク質をＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した。

ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＡＢ００４１抗体を一次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して結合を検出した。野生型ヒトＭＭＰ９を陽性対照として使用し、野生型マウスＭＭＰ９を陰性対照として使用した。ＥＬＩＳＡアッセイの結果により、ＭＭＰ９アミノ酸配列の１６２位のアルギニン残基（Ｒ１６２）がＡＢ００４１抗体のＭＭＰ９との結合に重要であることが示された。結果により、アミノ酸残基Ｅ１１１、Ｄ１１３、およびＩ１９８がＡＢ００４１抗体のＭＭＰ９との結合に重要であることも示された。ＭＭＰ９の結晶構造に基づいて、Ｅ１１１、Ｄ１１３、Ｒ１６２、およびＩ１９８が、互いに近く、ＭＭＰ９のＣａ２＋イオン結合ポケット周辺に集まっていた。この試験では、ＡＢ００４１抗体は、アミノ酸残基１０４〜１１９、１５９〜１６６、および１９１〜２０２を含有するＭＭＰ９の領域内のアミノ酸残基を含有するエピトープに特異的に結合することが示された。

ＭＭＰ９についての酵素アッセイにより、ＡＢ００４１抗体がＭＭＰ９の非競合的阻害剤としての機能を果たすことが見出された。
（実施例１Ｂ）
ヒトＭＭＰ−９に対する追加の抗体の調製

追加のハイブリドーマを生成し、それによりＡＢ００４１と同一性を有する可変領域を有する抗体を産生した。Ｍ４と称される１つのそのようなハイブリドーマは重鎖（ＩｇＧ２ｂ）配列：

（シグナルペプチドが、下線が引かれたテキストで記載されており、可変領域がプレーンテキストで記載されており、定常領域がイタリック体で記載されている）、および軽鎖（カッパ）配列：

（シグナルペプチドが、下線が引かれたテキストで記載されており、可変領域がプレーンテキストで記載されており、定常領域がイタリック体で記載されている）（配列番号３１）を含有する抗体を発現した。

Ｍ４抗体は、アミノ酸配列：

（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号３４、３５、および３６）下線が引かれている）（配列番号３２）を有する可変重鎖

およびアミノ酸配列

（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号３７、３８、および３９）下線が引かれている）（配列番号３３）を有する可変軽鎖を有した。

Ｍ１２と称される別のそのようなハイブリドーマは、配列：

（シグナルペプチドが、下線が引かれたテキストで記載されており、可変領域がプレーンテキストで記載されており、定常領域がイタリック体で記載されている）（配列番号４０）を有するカッパ鎖のみを発現した。

Ｍ１２抗体は、アミノ酸配列

（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（それぞれ配列番号４２、４３、および４４）下線が引かれている）（配列番号４１）を有する可変軽鎖を有した。

Ｍ４の重鎖および軽鎖とＭ１２の重鎖および軽鎖の間の差がＡＢ００４１抗体と比較して示されている配列比較が図４に示されている。

酵素アッセイを行った。結果により、Ｍ４ハイブリドーマおよびＭ１２ハイブリドーマによって産生される抗体がＭＭＰ９の非競合的阻害剤として作用することが実証された（データは示していない）。
（実施例１Ｃ）
マウスＭＭＰ−９に対する抗体の調製

別のマウス抗体ＡＢ００４６を生成した。実施例１Ａに記載のものと同様のプロセスを使用し、ＭＭＰ９ノックアウトマウス（Ｂ６．ＦＶＢ（Ｃｇ）−Ｍｍｐ９^{ｔｍｌＴｖｕ}／Ｊ系統）を、マウスＭＭＰ９のプロ／触媒ドメイン断片の標的化ドメインを使用して免疫した。ＡＢ００４６抗体は、アミノ酸配列
（配列番号４５）（シグナルペプチドが、下線が引かれたテキストで記載されており、可変領域がプレーンテキストで記載されており、定常領域がイタリック体で記載されている）を有するカッパ軽鎖およびアミノ酸配列
（配列番号４６）（シグナルペプチドが、下線が引かれたテキストで記載されており、可変領域がプレーンテキストで記載されており、定常領域がイタリック体で記載されている）を有するＩｇＧ１重鎖を有した。

以下のアミノ酸配列は、ＡＢ００４６のＩｇＧ１重鎖の可変領域のフレームワーク領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（ＣＤＲに下線が引かれている）：

（配列番号４７）。

以下のアミノ酸配列は、ＡＢ００４６のカッパ軽鎖の可変領域のフレームワーク領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（ＣＤＲに下線が引かれている）：

（配列番号４８）

追加の特徴付けにより、ＡＢ００４６抗体がマウスＭＭＰ９に非競合的に結合した、またはその結合がマウスＭＭＰ９の濃度に依存しなかったことが示された。ＡＢ００４６抗体はヒトＭＭＰ９およびＭＭＰ２、マウスＭＭＰ２、３、７、８、および１２に結合しなかった。実施例１Ａに記載のエピトープ分析を使用して、マウスＭＭＰ９アミノ酸配列の１６２位のプロリン残基（Ｐ１６２）（ヒトＭＭＰ９のＲ１６２に対応する）がＡＢ００４６抗体のＭＭＰ９との結合のために重要であることが示された。結果により、ＡＢ００４６抗体が、ヒトＭＭＰ９のアミノ酸１５９〜１６６を含有する部分に対応するマウスＭＭＰ９の一部内の残基を含有するエピトープに特異的に結合したことが示唆された。したがって、ＡＢ００４６抗体はマウスＭＭＰ９に特異的な阻害性の抗体であり、ＡＢ００４１と同様の結合および阻害のカイネティクスを有した。ＡＢ００４６はマウスＭＭＰ９に特異的であり、ＡＢ００４１／ＡＢ００４５と同様のエピトープに結合するので、ＡＢ００４６は、ＡＢ００４１またはＡＢ００４５のいずれかを使用するアッセイのために適している。

さらに特徴付けることにより、ＡＢ００４６抗体がマウスＩｇＧ１アイソタイプであり、マウスにおいて限られたエフェクター機能を有することが示された。

非阻害性であり、Ｐ１６２が結合のために重要である３種の他のマウス抗ＭＭＰ９抗体を、同様の方法を使用して生成した。
（実施例２）
ヒトＭＭＰ９に対する抗体のヒト化

マウスＡＢ００４１抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、それらの可変領域のフレームワーク（すなわち、非ＣＤＲ）部分の特定の位置で変更して、ヒトにおいて免疫原性の少ないタンパク質を生成した。これらのアミノ酸配列の変化を図１および図２に示した。ＡＢ００４５と称される１つのヒト化抗体の交差反応性が上の表２Ａに示されている。

ヒト化変異体抗ＭＭＰ９抗体ＡＢ００４５（ヒト化、改変ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）；上の実施例２を参照されたい）は、ヒト化ＡＢ００４１重鎖変異体ＶＨ３（配列番号７

に記載の配列を有する）

およびヒト化ＡＢ００４１軽鎖変異体ＶＨ４（Ｖｋ４（配列番号１２

に記載の配列を有する）に記載の軽鎖配列を有する）
を含んだ。

ＡＢ００４５抗体の重鎖は、配列番号４９（
（シグナル配列に下線が引かれている；定常領域の配列がイタリック体で示されている））に記載の配列を有し、ＡＢ００４５抗体の軽鎖は、配列番号５０（
（シグナル配列に下線が引かれている；定常領域の配列がイタリック体で示されている））に記載の配列を有する。抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖で構成される１３１２アミノ酸長を含有し、理論的ｐＩは約７．９０であり、吸光係数は１ｇ／Ｌについて２８０ｎｍにおいて約１．５０ＡＵ／ｃｍであり、分子量は約１４４ｋＤａであり、密度は製剤緩衝液中約１ｇ／ｍＬ（製品濃度１ｍＬあたり５０〜１００ｍｇ）である。

この抗体のさらなる特徴付けは、下の実施例３に記載されている。
（実施例３）
変異体ＭＭＰ９抗体ＡＢ００４５の特徴付け、ならびにＡＢ００４１およびＡＢ００４６との比較

上記の通り、ＡＢ００４５抗体およびＡＢ００４１抗体はＭＭＰ９の非競合的阻害剤である。したがって、どちらの抗体も、基質濃度に非依存的にＭＭＰ９酵素活性を阻害する。ＡＢ００４５抗体は、直接結合アッセイおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって示された通り、ＡＢ００４１抗体の場合と同じＭＭＰ９エピトープに、１×１０〜１２モル濃度の範囲の親和性で結合する。どちらの抗体もＭＭＰ９に特異的であり、ＭＭＰ酵素の精製されたドメインおよび全長の形態を含めた他の精製タンパク質標的に対する有意な非特異的結合は観察されなかった。ＡＢ００４５抗体およびＡＢ００４１抗体はどちらも、ネイティブヒトＭＭＰ９および組換えヒトＭＭＰ９ならびに組換えラットＭＭＰ９および組換えカニクイザルＭＭＰ９と交差反応性である。

ヒトおよび非ヒト起源のＭＭＰ９に対する抗体ＡＢ００４５、ＡＢ００４１およびＡＢ００４６のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合親和性、阻害特性、および特異性を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＭＭＰ９酵素アッセイを使用して決定した。ＡＢ００４５およびＡＢ００４１の解離定数（Ｋ_ｄ）を生成するためにＳＰＲ分析も使用した。

ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＥＬＩＳＡから得られたヒトＭＭＰ９、カニクイザルＭＭＰ９、およびラットＭＭＰ９に対するＡＢ００４５抗体およびＡＢ００４１抗体のＫ_ｄ値は、全て＜４００ｐＭであることが見出された。ＥＬＩＳＡのデータにより、ＡＢ００４５抗体およびＡＢ００４１抗体がどちらも、試験した関連する毒性学的種の全て由来のＭＭＰ９と交差反応することが例証された。ＡＢ００４６抗体は、マウスＭＭＰ９に特異的であり、したがって、マウス有効性モデルにおいて代理抗体として使用することができることが示された。結果により、ヒトＭＭＰ９に対するＡＢ００４５抗体のＫ_ｄ値は０．１６８±０．１１７ｎＭであり、ＡＢ００４１抗体のＫ_ｄ値は０．１３３±０．０３０ｎＭであることが示された。ＡＢ００４６抗体に関する結果により、ＡＢ００４６抗体がマウスＭＭＰ９に０．２１８±０．０９７ｎＭのＫ_ｄ値で結合したことが示された。ＳＰＲ分析では、結果により、ヒトＭＭＰ９に対するＡＢ００４５抗体およびＡＢ００４１抗体のＫ_ｄ値がそれぞれ８．８ｐＭおよび０．４ｐＭであることが示された。

ＡＢ００４５抗体、ＡＢ００４１抗体、およびＡＢ００４６抗体の酵素阻害活性を、蛍光発生ペプチド基質Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２のＭＭＰ９媒介性切断を評価するアッセイにおいて評価した。３種の抗体全てがＭＭＰ９酵素活性を阻害した。ヒトＭＭＰ９に対するＡＢ００４５のＩＣ_５０値（０．６９１±０．０９７ｎＭ）およびＡＢ００４１のＩＣ_５０値（０．５６９±０．１８５ｎＭ）は統計的に差がなかった。マウスＭＭＰ９のＡＢ００４６による阻害についてのＩＣ_５０値は０．３５２±０．０３ｎＭであった。値は、調製中に生成した活性な酵素の濃度について調整しなかった。定常状態下での追加のＭＭＰ９酵素アッセイを使用して、ＩＣ_５０および阻害の様式を決定した。このアッセイでは、ＡＢ００４５のＩＣ_５０値は、２０倍の範囲の基質濃度で０．１４８ｎＭ〜０．１６１ｎＭにわたり、一例では、０．１５８ｎｍであった。結果により、ＡＢ００４５のＭＭＰ９阻害活性が非競合的であることが示された。

結果により、ＡＢ００４５とＡＢ００４１が同等の結合性および阻害性を有すること、およびＡＢ００４６が、例えば、ヒト疾患のマウスモデルにおいて関連するマウス代理抗体としての機能を果たし得ることが確認された。

Claims (17)

1. 重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単離された抗ＭＭＰ９抗体またはその抗原結合断片であって、該重鎖可変領域は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、該軽鎖可変（ＶＬ）領域は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
2. 前記重鎖可変（ＶＨ）領域は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記軽鎖可変（ＶＬ）領域は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記重鎖可変（ＶＨ）領域は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変（ＶＬ）領域は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
5. 試料中でヒトＭＭＰ９を検出する方法であって、
   該試料中での、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片のヒトＭＭＰ９との結合を検出し、それにより、該ヒトＭＭＰ９の存在を検出するステップを含み、該試料は、該単離された抗体またはその抗原結合断片と接触されることを特徴とする、方法。
6. 前記試料において検出された結合の量を、対照試料との結合の量と比較するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記試料が、被験体由来の組織または体液試料である、請求項５に記載の方法。
8. 前記体液試料が、血液、血漿、血清、全血、唾液、尿、または精液試料である、請求項７に記載の方法。
9. 前記組織試料が、ホルマリン固定試料または凍結試料である、請求項７に記載の方法。
10. 前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、検出可能部分を用いて標識化される、請求項５に記載の方法。
11. 重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む単離された抗ＭＭＰ９抗体またはその抗原結合断片であって、該重鎖可変領域は、配列番号４７に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号４８に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
12. 試料中でマウスＭＭＰ９を検出する方法であって、
    該試料中での、請求項１１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片のマウスＭＭＰ９との結合を検出し、それにより、該マウスＭＭＰ９の存在を検出するステップを含み、該試料は、該単離された抗体またはその抗原結合断片と接触されることを特徴とする、方法。
13. 前記試料において検出された結合の量を、対照試料との結合の量と比較するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記試料が、被験体由来の組織または体液試料である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記体液試料が、血液、血漿、血清、全血、唾液、尿、または精液試料である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記組織試料が、ホルマリン固定試料または凍結試料である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、検出可能部分を用いて標識化される、請求項１２に記載の方法。