KR20040032105A - 재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 고수준대규모 생산방법 - Google Patents

재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 고수준대규모 생산방법 Download PDF

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Abstract

재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 고수준 대규모 생산방법이 개시된다. 예증적인 조성물은 혈청이 없는, 현탁배양에서 증식시킬 수 있는 불멸화된 숙주세포주와 조합하여 고수준 단백질 및/또는 폴리펩티드 발현이 가능한 하나 이상의 발현벡터를 포함한다. 양방향성 UCOE 벡터는 단일 UCOE 기초 플라스미드 벡터로부터 둘 이상의 재조합단백질 및/또는 폴리펩티드의 동시적이고, 고수준의 발현을 가능하게 한다.

Description

재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 고수준 대규모 생산방법{Compositions and methods for high-level, large-scale production of recombinant proteins}
생명공학산업의 주목표는 재조합 항체 등의 재조합 단백질을 대규모로 발현시키기 위한 안정한 세포주 시스템을 개발하는 것이다. 표준 방법론은 적당한 재조합 숙주 세포주의 시간소비 및 노동집약적 개발을 요구한다. 통상적으로, 예를 들면 CHO-K1 또는 CHO DUX 등의 세포는 소의 태아 혈청의 존재 하에 발육하며, 관련 발현 벡터에 의해 트랜스펙션된다. 이어서, 세포의 전체 집단은 발현벡터를 취하지 못한 세포를 제거하기 위하여 선택공정을 행한다. 이어서, 풀(pool)을 함유한 벡터를 전형적으로 서브클론하고, 고수준 발현시키기 위해 스크린한다. 이어서, 생성되는 고수준 발현 클론 각각을 팽창시키고, 혈청이 없는 현탁배양에 천천히 적응시키며, 이 적응(adaptation)은 흔히 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드 발현의 손실을가져온다.
재조합 단백질 발현에 있어서 이들 일반적인 제한 이외에, 예를 들면, 항체와 같은 멀티-서브유니트 단백질의 효율적인 기능적 발현은 서브유니트체인 모두의 적당히 균형잡힌 발현을 요구한다. 예를 들면, 항체 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 발현시키기 위한 전통적인 방법학은 중쇄 및 경쇄 코드영역을 독립적으로 전달하는 플라스미드의 코-트랜스펙션(co-transfection)에 의존하게 되어 같은 카피수의 유지를 어렵게 하고, 벡터가 게놈 중의 다른 하나에 근접해서 병합하는 경우 유전자들 사이에서 전사간섭의 포텐셜(potential)을 제공한다.
그래서, 상당한 연구에도 불구하고, 항체 중쇄 및 경쇄를 포함하는 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 고수준 대규모 발현의 개량된 조성물 및 방법의 기술에 있어서 필요가 존재한다. 본 발명은 이들 필요를 충족시키며, 또한 재조합 단백질 발현의 적합한 발현 벡터와 조합해서 혈청이 없는 현탁배양에 미리 적응시킨 숙주 세포주를 이용함으로써 기타 관련된 잇점들을 제공해 준다. 또한, 본 발명에 의하여, 단일 UCOE 기초 플라스미드 벡터로부터 2 이상의 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드를 동시에 고수준으로 발현시키게 하는 양방향 UCOE 벡터가 제공된다.
본 발명은 일반적으로 유전자 발현 및 단백질 생산에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 과발현(overexpression)방법에 관한 것이다. 이와 같은 조성물 및 방법은 재조합 단백질의 고수준 대규모 생산에 유용한 것이다.
도 1은 UCOE 기초 항체 발현 카세트의 도표이다.
도 2a 및 도 2b는 재조합 인간 항체의 발현에 사용될 수 있는 벡터의 플라스미드 지도이고, 도 2a는 재조합 인간 Ig 중쇄의 발현용 플라스미드를 나타낸 것이고, 도 2b는 재조합 인간 Ig 카파(kappa) 경쇄의 발현용 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 3은 UCOEs로 트랜스펙션시키고 UCOEs 없이 트랜스펙션시킨 CHO 세포 중에서 항체 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4는 진탕 플라스크 배양(shake-flask culture) 및 2리터 생물반응기(bioreactor) 중에서 항체 Ab1의 중쇄 및 경쇄를 발현시키는 벡터로 트랜스펙션시킨 CHO-S 세포주의 단계적인 증가의 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽 패널은 ELISA로 측정한 항체역가를 나타낸 것이고, 오른쪽 패널은 세포 증식을 나타낸 것이다.
도 5는 쥐의 하이브리도마, CHO-K1, 및 CHO-S 세포의 표면 위에서 gal-gal 잔기(Gal-Gal residues)의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 6은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUneo100의 도표이다.
도 7은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUneo200의 도표이다.
도 8은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro300의 도표이다.
도 9는 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro400의 도표이다.
도 10은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUneo500의 도표이다.
도 11은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUneo600의 도표이다.
도 12는 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro700의 도표이다.
도 13은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro800의 도표이다.
도 14는 CET720GFP의 8kb RNP UCOE내의 결실의 도표이다.
도 15는 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro350의 도표이다.
도 16은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro450의 도표이다.
도 17은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUneo1200의 도표이다.
도 18은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro1450의 도표이다.
도 19는 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUneo1600의 도표이다.
도 20은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터 pBDUpuro1800의 도표이다.
도 21은 양방향 UCOE 플라스미드 벡터를 함유하는 예증적인 세포주의 항체생산율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은, 일반적으로, 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 고수준 대규모 발육에 적합한 재조합 세포주의 조성물 및 이 재조합 세포주를 신속하고 효율적으로 발육시키기 위한 방법에 관한 것이다.
일면에 있어서, 본 발명은, (a) 배양 중에 연속적으로 증식할 수 있고, 혈청이 없는 현탁 배양 중에서 증식할 수 있는 불멸화된 숙주 세포주, 및 (b) 본 명세서에 기재된 UCOE 기초 벡터와 같은 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 지속된 과발현용 벡터로 이루어지는 조성물을 제공해 준다.
다른 면에 있어서, 본 발명은, 폴리펩티드의 고수준 대규모 생산방법을 제공해 준다. 구체적인 방법은, (a) 현탁액 중에서 증식할 수 있는 불멸화된 숙주 세포주를 얻고, (b) 혈청이 없는 배지 중에서 증식시키기 위해 숙주 세포주를 적응시키고, (c) 현탁액 중에서 증식시킬 수 있고, 혈청이 없는 배지 중에서 증식시킬 수 있는 생성되는 불멸화된 숙주 세포주를 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 과발현에 적합한 벡터로 트랜스펙션시키는(transfecting) 공정으로 이루어진다.
본 발명의 조성물 및 방법에 의해서, 불멸화된 적당한 세포주는 하나 이상의 다음과 같은 특성을 가질 수 있다:
(a) 16시간 이하, 바람직하기는 12 내지 16시간 사이의 배가시간(doubling times),
(b) 적어도 75%, 바람직하기는 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 트랜스펙션 효율,
(c) 예를 들면, 하이그로마이신, G41S, 및 퓨로마이신 등의 표준 선택제에 대한 감수성, 및
(d) 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 gal-gal 글리코실화(glycosylation)의 부재.
본 발명에 있어서 사용하기 위해 적응될 수 있는 예증적인 불멸화된 숙주 세포주는, 제한하는 것은 아니지만, 다음과 같은 시판용 숙주 세포주: (a) CHO-S(중국 햄스터 난소 숙주 세포주), (b) 293-F(인간 숙주 세포주), (c) 293-H(인간 숙주 세포주), (d) COS-7L(원숭이 숙주 세포주), (e) D-Mel-2(곤충 숙주 세포주), (f) SF21(곤충 숙주 세포주), 및 (g) SF9(곤충 숙주 세포주). 다른 방법으로, 적당한 숙주 세포주는 본 명세서에 기재된 방법학에 따라서 일상적인 실험을 통해서 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 과발현용 벡터는 하나 이상의 다음과 같은 특성을 갖는다:
(a) 불멸화된 숙주 세포주 중에서 고수준, 대규모 발현을 촉진시키는 하나 이상의 요소(elements)를 갖는다.
(b) 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 억제에 내성을 갖는다.
특정 구현예 중에서, 본 발명의 벡터는 또한 이하에 기재된 바와 같이 하나 이상의 만능 크로마틴 오프닝 요소(universal chromatin opening elements(UCOEs)로 이루어질 수 있다. 부차적으로 또는 다른 방법으로, 본 명세서에 기재된 벡터는, 예를 들면 CMV 프로모터 등의 하나 이상의 전사 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 조성물 및 방법은 배양 리터당 적어도 50㎎ 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드, 바람직하기는 배양 리터당 적어도 100㎎ 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드, 더욱 바람직하기는 배양 리터당 적어도 200㎎ 재조합 단벡질 및/또는 폴리펩티드의 발현 수준을 성취할 수 있다.
본 발명은, 또한 적어도 1g의 단백질 및/또는 폴리펩티드, 적합하기로는 적어도 5g의 단백질 및/또는 폴리펩티드, 더욱 적합하기로는 적어도 10g의 단백질 및/또는 폴리펩티드, 가장 적합하기로는 적어도 20g의 단백질 및/또는 폴리펩티드의 수율(100리터 배양액당)로 적어도 100리터 스케일로 단계적으로 늘릴 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은, 여전히 또한 단일 UCOE 기초 플라스미드 벡터에 대해서 2 이상의 재조합 단백질을 고수준으로 발현시키기 위한 양방향 벡터 시스템을 이용하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은, 또한 예를 들면 CET720GFP 등의 RNP UCOE 기초 플라스미드 벡터로 이루어지고, 임의로 8kb RNP UCOE 부분 내에서 하나 이상의 결실을 포함하는 하나 이상의 재조합 단백질의 조성물 및 이 재조합 단백질의 개량된 발현방법을 제공한다. 예증적인 UCOE 결실 구조물은, 본 명세서에 기재된 8kb RNP UCOE 요소의 활성에 관하여 상당한 UCOE 활성, 예를 들면 적어도 약 50%, 바람직하기는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하기는 적어도 90% 이상의 UCOE 활성을 보유하는 것이 바람직한 것이다. 예증적인 결실은, 임의로 도 4 및 도 14에 나타낸 바와 같은, ΔBS, ΔEcoNI, ΔEM, ΔMluI, 및 ΔRV로 이루어지는 군에서 선택된 RNP UCOE의 영역 내에서의 결실로 이루어진다. 본 발명의 범위 내에서 결실은 적어도 100bp, 바람직하기는 적어도 250bp, 더욱 바람직하기는 적어도 1000bp, 더욱 더 바람직하기는 적어도 2500bp, 및 여전히 더욱 더 바람직하기는 적어도 4000bp이다. 따라서, 본 발명의 특히 예증적인 UCOE 벡터는 최소로 적어도 하나 이상의 UCOE 부분으로 이루어질 것이며, 여기서 UCOE 부분은 원하는 수준의 UCOE 활성을 보유한다. 하나의 예증적인 구현예에서, CET720GFP(서열번호: 9)의 뉴클레오티드잔기에 대응하는 적어도 약 4.1kb UCOE 부분을 이용한다. 예를 들면, 이 UCOE 부분은 CET720GFP(서열번호: 9)의 뉴클레오티드잔기 2225-10525에 대응하는 관찰된 전(全) 8kb UCOE 요소에 비교할만한 수준의 UCOE 활성을 보유하는 것으로 입증되었다. 이들 그리고 기타 UCOE 부분은 용이하게 동정될 수 있으며, 이들의 활성은 본 명세서에 기재된 내용에 비추어서 일상적이고, 이 기술분야에 인식된 기술을 통해서 평가될 수 있다.
본 발명의 이들 면과 기타 면들은 다음과 같은 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하면 명백해질 것이다. 본 명세서에 기재된 모든 참조들은 이들 각각이 개별적으로 결합된 것처럼 전체로 참조로 결합된다.
서열 동정체(Sequence identifiers)의 간단한 설명
서열번호 1은 pBDUneo100의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 2는 pBDUneo200의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 3은 pBDUpuro300의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 3은 pBDUpuro400의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 5는 pBDUneo500의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 6은 pBDUneo600의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 7은 pBDUpuro700의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 8은 pBDUpuro800의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 9는 벡터 CET720GFP의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 10-26은 본 발명에 의한 개량된 UCOE 벡터를 생산하기 위한 실시예4에서 이용한 예증적인 프라이머 서열을 나타낸 것이다.
서열번호 27은 pBDUpuro350의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 28은 pBDUpuro450의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 29는 pBDUneo1200의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 30은 pBDUpuro1450의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 31은 pBDUneo1600의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 32는 pBDUpuro1800의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 발명은, 일반적으로 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드를 고수준, 대규모로 생산하는데 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이하에 더욱 더 기술하는 바와 같이, 본 발명의 예증적인 조성물은, 제한하는 것은 아니지만, 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드를 고수준, 대규모로 발현시키는데 적합한 하나 이상의 발현 벡터와 조합해서, 불멸화된 혈청이 없는 현탁 숙주 세포주를 포함한다.
본 발명의 실행은, 구체적으로 다르게 나타내지않는 한, 이 기술분야의 기술 중에서 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 종래의 방법을 이용할 것이며, 이 중 대부분은 설명의 목적으로 이하에 기재한다. 이러한 기술들은 다음과 같은 문헌, 예를 들면 Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & Ⅱ(D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription andTranslation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)에 충분히 설명되어 있다.
상기 또는 후기를 불문하고 본 명세서에 기재된 간행물, 특허 및 특허출원은 모두 전체로서 참조로 여기에 병합했다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "a", "an" 및 "the"는 그 내용을 명백히 다르게 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다.
혈청이 없는, 현탁 숙주 세포주의 제조 및 선택
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 이상적으로 적합한 숙주 세포주는 하나 이상의 다음과 같은 속성을 가질 수 있다.
(a) 배양 중에 죽지않고 연속적으로 증식할 수 있음, (b) 현탁액 중에서 증식에 적응함, (c) 신속한 증식, 바람직하기는 12-16시간 배가시간, (d) 고트랜스펙션효율, 바람직하기는 적어조 70%, (e) 표준 선택제, 바람직하기는 하이그로마이신, G418 또는 퓨로마이신에 의한 선택에 대한 감수성, (f) 인간 치료로서 겸용하는 단백질 글리코실화 패턴, 바람직하기는 gal-gal 글리코실화 패턴의 부재, 및 (g) 혈청이 없는 배지, 바람직하기는 간접적인 동물유도 성분 없이 화학적으로 정의한, 단백질이 없는 증식에 적응
이들 속성 중 하나 이상을 갖는 숙주 세포주는, 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 고수준, 대규모 생산의 기존 방법학과 비교했을 때 노력과 시간을 줄여서 발육 및 제조로 옮겨질 수 있는 재조합 숙주 세포주의 신속한 발육용 시스템을 개발하기 위하여 사용될 수 있다.
재조합 단백질을 장기간 동안, 고수율로 생산하기 위하여, 안정한 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들면, 관련 폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현하는 세포주는, 동일 벡터 또는 몇개의 벡터상에 내생적 발현 요소와 선택 마커 유전자를 함유할 수 있는 발현 벡터를 사용해서 트랜스펙션시킬 수 있다. 벡터를 도입한 다음에, 세포들이 선택적인 매질에 스위치되기 전에 세포들을 풍부한 매질 중에서 1~2일 동안 증식하도록 허여할 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 내성을 주기 위한 것이며, 그의 존재는 도입한 서열들을 성공적으로 발현시키는 세포의 증식 및 회수를 허용한다. 안정하게 형질전환한 세포의 내성 클론은 세포 유형에 적당한 조직배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
다수의 선택 시스템이 형질전환된 세포주를 회수하기 위하여 사용될 수 있다. 이들은, 제한하는 것은 아니지만, tk. sup.- 또는 aprt. sup.-세포에 각각 이용될 수 있는 단순포진 바이러스 티미닌 키나제(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232) 및 아데닌 포스포리보실트란스페라제(Lowy, I. et al. (1990) Cell 22: 817-823) 유전자를 포함한다. 또한, 항대사물, 항생제 또는 제초제 내성은 선택의 기초, 예를 들면 메토트렉세이트에 내성을 주는 dhfr(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570); 메티오닌 술폭시민에 글루타민- 독립적 증식 및 내성을 주는 글루타민 합성효소(GS)(Bebbington et al.(1992) Biotechnology 10(2): 169-175; 및 Cockett et al. (1991) Nucleic Acids Res. 25; 19(2): 319-325; 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 주는npt(Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); 및 클로르술푸론 및 포스피노트리신 각각에 내성을 주는 als 또는 pat (Murry, Supra)로서 사용될 수 있다. 추가 선택성 유전자로서 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하게 해주는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하게 해주는 hisD가 기재되어 있다(Hartman, S.C. and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.- 85: 8047-8051). 가시성 마커의 사용은, 형질전환체를 동정할 뿐만 아니라 특이 벡터계에 기인할 수 있는 일시적인 또는 안정한 단백질 발현량을 정량하기 위하여 널리 사용되는, 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 그의 기질 GUS, 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 이러한 마커로 인기를 얻었다(Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
마커 유전자 발현의 존재/부재가 관련 유전자가 또한 존재하는 것을 시사할지라도, 그의 존재 및 발현은 확인받기 위해 요구될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 마커 유전자 서열내에 삽입하는 경우, 서열들을 포함하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인 될 수 있다. 다른 방법으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 제어하에 폴리펩티드를 암호화화는 서열로 세로 1열이 되어 배치될 수 있다. 유도 또는 선택에 응답하여 마커 유전자의 발현은 또한 일반적으로 탄뎀 유전자(Tandem gene)의 발현을 나타낸다.
다른 방법으로, 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 발현시키는 숙주세포는 당업자들에게 알려진 여러 가지의 방법에 의해 동정될 수 있다. 이들 방법은, 제한하는 것은 아니지만, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리다이제이션, 및 핵산 또는 단백질을 검출 및/또는 정량하기 위한 막, 용액, 또는 칩기초 기술을 포함하는 단백질 생물검사 또는 면역검사 기술을 포함한다.
생성물에 특이적인 플리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 폴리뉴클레오티드 암호화 생성물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 여러 가지의 프로토콜은 이 기술 분야에 알려져 있다. 그 예로서 효소결합면역흡수검사(ELISA), 방사선면역검사(RIA) 및 형광활성화세포선택(FACS)을 포함한다. 주어진 폴리펩티드에 대하여 2개의 비간섭 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체를 이용하는 2부위 모토클로날기초 면역검사는 몇개의 적용에 적합하지만, 경쟁적인 결합검사가 또한 이용될 수 있다. 이들 검사 및 기타 검사방법들은 Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn) and Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)에 기재되어 있다.
넓은 범위의 레이블 및 배합기술이 당업자에게 알려졌으며, 여러 가지의 핵산 및 아미노산 검사에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 관련한 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리다이제이션 또는 PCR 프로브를 생산하는 수단은 올리고레이블링, 닉 번역 (nick translation), 말단-표지화(end-labeling) 또는 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 PCR 증폭을 포함한다. 다른 방법으로, 서열 또는 그의 어떤 부분은 mRNA 프로브 생산용 벡터로 클론될 수 있다. 이러한 벡터는 이 기술분야에 알려졌으며, 시판되고 있고, T7, T3 또는 SP6등의 적당한 RNA 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오티드를 첨가하여 생체외(in vitro)에서 RNA 프로브를 합성하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 방법은 여러 가지의 시판용 키트를 사용하여 행할 수 있다.사용될 수 있는 적당한 리포터 분자 또는 표지는 방사성핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 색소생성제와 기질 조인자(cofactors), 억제제, 자기입자 등을 포함한다.
관련 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환시킨 숙주 세포는 세포배양으로부터 단백질을 발현시키고, 회수하는데 적당한 조건하에서 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산된 단백질은 사용한 서열 및/또는 벡터에 의존해서 분비되거나 또는 세포내에 포함될 수 있다. 당업자들에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터는 원시핵 또는 성숙핵 세포막을 통해서 코드화 폴리펩티드의 분비를 조종하는 신호 서열을 포함하도록 디자인 될 수 있다. 관련 폴리펩티드를 코드화하는 서열을, 가용성 단백질의 정제를 촉진시키게 될 폴리펩티드 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드서열에 접합시키기 위하여 다른 재조합 구조물이 사용될 수 있다. 이와 같은 정제 촉진 도메인은 제한하는 것은 아니지만, 고정된 금속상에서 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이팅 펩티드, 고정된 면역글로블린상에서 정제를 허용하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 견인/친화성 정제 시스템 (Immunex Corp., Seattle, WA.)에서 이용한 도메인을 포함한다. 정제 도메인과 코드화 폴리펩티드 사이의 팩터 XA 또는 엔테로키나제 (Invitrogen)에 대해 특이적인 것들과 같은 분열시킬 수 있는 링커(linker) 서열의 포함은 정제를 촉진시키기 위하여 사용될 수 있다. 이와 같은 발현 벡터는 관련 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질 및 티오레독신 또는 엔테로키나게 분열 부위 앞의 6개의 히스티딘잔기를 암호화하는 핵산의 발현을 제공한다. 히스티딘잔기는Porath, J. et al. (1992, Prot, Exp. Purif. 3:263-281)에 기재된 바와 같이 IMIAC(고정된 금속이온 친화성 크로마토그래피)상에서 정제를 촉진시키며, 한편으로 엔테로키나제 분열 부위는 융합 단백질로부터 원하는 폴리펩티드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 함유하는 벡터의 논의는 Kroll, D. J. et al. (1993: DNA cell Biol. 12:44-453)에 기재되어 있다.
혈청이 없는, 죽지않는 숙주 세포주는 여러 가지의 대중 및/또는 상업용 출처, 예를 들면 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA); Celox (St. Paul, MN); Invitrogen (Carlsbad, CA); the European and Japanese Cell Banks (ECACC, Salisbury, Wiltshire (UK) and JCRB, Shinjuku, Japan, respectively)로부터 용이하게 입수할 수 있다.
적당한 숙주 세포주는 상기 속성 중 하나 이상을 가지는 기존 숙주 세포주를 선택해서 이 숙주 세표계에 변이체가 나머지 속성들을 얻도록 적응 및/또는 선택해서 얻을 수 있다. 미리 적응시칸 숙주 세포주를 사용하면, 트랜스펙션 및 재조합 단백질 발현의 공정을 시작하기 전에 세포들이 원하는 조건을 성취할 수 있도록 보장해준다. 아래에서 알 수 있는 바와 같이, 이러한 세포주는 발현 벡터를 함유하는 UCOE와 관련해서 사용하기에 이상적으로 적합한데, 왜냐하면 이를 벡타계는 안정한 장기, 고수준 단백질 발현에 의해 특징지어지기 때문이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 의해 사용하기 위해 수식 및/또는 적응될 수 있는 예증적인 적당한 숙주 세포주는, 제한하는 것은 아니지만, 다음과 같은 것들을 포함한다: (a) 293-F, 인간 숙주세포주; (b) 293-H, 인간 숙주세포주; (c) COS-7L,원숭이 숙주 세포주; (d) D.MEL-2, 곤충 숙주 세포주; (e) SF 21, 곤충 숙주 세포주; (f) SF9, 곤충 숙주 세포주; 및 (g) CHO-S, 중국 햄스터 난소 숙주 세포주.
예를 들면, 시판용 화학적으로 정의된, 단백질이 없는 매질에 적응시킨 중국 햄스터 난소 서브클론 (CHO-S; Invitrogen/Gibco)은 본 발명의 조성물 및 방법에 적당히 이용될 수 있다. (D'Anna et al., Radiation Research148:260-271 (1997); D'Anna et al., Methods in Cell Science 18:115-125 (19960; Deaven et al., Chromosoma41:129-144(1973); Gorfein et al., Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects9:247-252 (Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1998) 참조]. CHO-S 숙주 세포주는 9-11X106생존할 수 있는 세포/㎖의 피크 세포밀도에 도달하는 진탕 플라스크 배양물 중에서 12내지 16시간 배가시간을 갖는다. 이들은 400㎍/㎖에서 하이그로마이신에 대하여, 그리고 600㎍/㎖에서 지네티신(G418)에 대하여 감수성을 갖는다. 세포들은 고정 배양 중에서도 부착 독립 단일 세포로서 중식한다.
임상적으로 사용한 재조합 단백질상의 Galα1→3Galβ1→4GlcNAc-R (Gal-Gal)탄수화물잔기의 존재는 혈청으로부터 신속한 단백질 제거와 관련된다. 로덴트 세포(Rodent cells)는 전형적으로, 비록 Gal-Gal 잔기가 인간 당단백질 중에서 발견되지 않았더라도, 말단 Gal-Gal 디사카라이드를 분비된 당단백질의 탄수화물 구조로 도입시킨다. 그 결과, 이 특정 탄수화물 구조 없이 재조합 단백질을 생산하는 능력이 유리하다.
CHO-S 숙주 세포주는 이하에서 알 수 있는 바와 같이, 하나 이상의 UCOE 요소로 이루어지는 발현 벡터와 관련해서 사용하는데 특히 적합하다. 이 숙주세포주는 유리한 증식특성을 가지며, 그의 표면 당단백질 중에서 검출 할 수 없는 수준의 Gal-Gal 탄수화물성분을 생성한다. 그래서, CHO-S 숙주 세포주는 임상용도로 생산한 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현에 적합하다.
발현 벡터의 제조 및 선택
본 발명에 의해 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현에 적합한 백터계는 다음과 같은 속성 중 하나 이상을 포함할 수 있다. (a) 조작의 용이; (b) 병합독립의 고수준 발현 부위를 만드는 요소; (c) 침묵(Silencing)/억제에 발현내성을 만들어서 장기간 동안 지속적이고 안정한 발현을 허용하는 요소; 및 (d) 서로 다른 세포 유형과 다른 종(種)에서 고수준으로 발현시키는 요소.
원하는 단백질 및/또는 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 기능적 등가물은 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 코딩서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 벡터에 삽입될 수 있다. 관련 폴리펩티드를 암호화하는 서열과 적당한 전사 및 번역 제어 요소를 갖는 발현 벡터를 구축하기 위하여 당업자에게 알려진 방법들이 사용될 수 있다. 이들 방법은 인 비트로 재조합 DNA 기술, 합성기술, 및 인 비보 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술들은 예를 들면 Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,N.Y.에 기재되어 있다.
여러 가지의 발현 벡터계/숙주계를 폴리뉴클레오티드 서열을 함유 및 발현시키기 위하여 사용할 수 있다. 이들은, 제한하는 것은 아니지만, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현벡터, 바이러스 발현 벡터(예, baculovirus)로 형질전환시킨 곤충세포주, 바이러스 발현 벡터 (예, cauliflower mosaic virus, CaMV: tobacco mosaic virus, TMV)로 형질전환시킨 식물세포주, 또는 동물 세포주를 포함한다.
발현 벡터 중에 존재하는 "제어요소" 또는 "조정서열"은 벡터-인핸서, 프로모터의 비번역 영역, 전사 및 번역을 행하기 위하여 숙주세포 단백질과 상호작용하는 5' 및 3' 비번역 영역들이다. 이러한 요소들은 그 들의 강도 및 특이성에 있어서 변할 수 있다. 이용한 벡터계 및 숙주에 의존해서, 구성 프로모터 및 유도 프로모터를 포함하는 다수의 적당한 전사 및 번역 요소들이 사용될 수 있다. 포유 동물 세포주에 있어서, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩티드를 암호화하는 북수 카피의 서열을 함유하는 세포주를 생성하는 것이 필요한 경우, SV40 또는 EBV에 기초한 GS 또는 DHFR 선택성 마커 또는 벡터를 함유하는 벡터를 적당한 선택성 마커와 함께 사용하는 것이 유리할 수 있다.
곤충계를 관련 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 하나의 계에서, 오토그라파 캘리포니카 누클리어 폴리히드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV))를 스포돕테라 프루지페르다 세포 (Spodoptera frugiperda cells) 또는 트리코플루시아(Trichoplusia)유충에서 이종 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용한다. 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 비본질적인 바이러스 영역으로 클론시킬 수 있고, 폴리헤드린 프로모터의 제어하에 놓을 수 있다. 폴리펩티드 암호화 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성으로 만들어서 재조합체 바이러스결핍 코트 단백질을 생산하게 한다. 이어서, 재조합체 바이러스를, 예를 들면 스포돕테라 프루지페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키기 위해 사용 할 수 있으며, 여기서 관련 폴리펩티드는 발현될 수 있다(Engelhard, E.K. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유동물 숙주 세포에 있어서, 다수의 바이러스계 발현계가 일반적으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터로서 아데노바이러스를 사용할 경우에, 관련 펩티드를 암호화하는 서열을 후기 프로모터 및 삼자구성 리더 서열(tripartite leader sequence)로 이루어지는 아데노바이러스 전사/번역 컴플렉스로 결찰될 수 있다. 바이러스성 게놈의 비본질적 E1 또는 E3 영역에서 삽입은 감염된 숙주세포에서 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 생존할 수 있는 바이러스를 얻기 위하여 사용될 수 있다(Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659), 그 외에, 로스 사코마 바이러스(Rous sarcoma virus(RSV))인핸서와 같은 전사 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
특이개시신호(specific initiation signals)가 관련 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 더욱 더 효율적인 번역을 성취하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 서열, 그의 개시 코돈 및 상류 서열를 적당한 발현벡터에 삽입하는 경우에 있어서, 추가 전사 또는 번역 제어신호가 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 코딩서열만, 또는 그의 일부분을 삽입하는 경우에 있어서, ATG 개시 코돈을 포함하는 외생적 번역 제어신호가 제공되어야 한다. 또한, 개시코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위하여 정확한 리딩 프레임(reading frame) 중에 있어야 한다. 외생적인 번역 요소 및 개시코돈은 여러 가지의 기원, 천연 및 합성일 수 있다.
발현의 효율은, 예를 들면 다음과 같은 문헌, 즉 Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162에 기재된 바와 같은, 사용한 특정 세포주에 적합한 인핸서를 포함시킴으로써 증대될 수 있다.
병합독립의 고수준 발현 부위를 만들기에 적합한 예증적인 요소는, 예를 들면 만능 크로마틴 오프닝 요소(UCOEs)를 포함한다. UCOEs는 "오픈" 배열에서 크로마틴을 유지하는 폴리뉴클레오티드 서열이다(Crombie 등의 PCT 특허출원 WO 0005393(2000) 참조). 프로모터의 발현벡터상류에 UCOE의 포함은 병합부위와 관계 없고, 사일런싱(silencing)이 내성인 고수준의 발현을 제공한다. 효율적인 발현은, 표준 비-UCOE 함유 벡터와 비교해서 선택된 풀 중에서 마커 유전자를 발현시키는 보다 높은 백분율의 세포를 생성하는 단일 카피의 병합된 유전자 부위로부터 유도될 수 있다. 이것은, 혈청이 없는, 현탁 적응 모세포주의 이용과 조합해서 짧은 기간에 다량의 단백질을 신속하게 생산해주게 한다. UCOE벡터로 얻은 증가된 효율은 고증식성 서브클론을 얻기 위하여 스크린시킬 필요가 있는 트랜스펙션체의 수효를 현저하게 감소시킨다.
현탁 적응 숙주세포주에서 하나 이상의 UCOEs를 함유하는 벡터의 이용은 단백질 및/또는 폴리펩티드, 예를 들면 항체 또는 그의 단편을 생산을 위한 신속한 발육 및 증가를 허용한다. UCOEs는, 적어도 50㎎/L의 단백질 및/또는 폴리펩티드, 바람직하기는 적어도 100㎎/L의 단백질 및/또는 폴리펩티드, 더욱 바람직하기는 적어도 200㎎/L의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 혈청이 없는 조건에서 5주 내에 생산할 수 있는 클론을 얻기 위하여 소수의 서브클론의 스크리닝을 허용한다.
바람직하게, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 발현벡터계는 현탁 배양액 리터당 단백질 및 폴리펩티드 1g을 초과하여 발현수준을 생기게 할 수 있다. 더욱 바람직하게, 발현벡터를 안정한 숙주 세포주에서 사용할 수 있으며, 여기서 세포당 적어도 20pg 단백질 및/또는 폴리펩티드가 매일 이루어질 수 있다.
이하에서 상세히 논의하는 바와 같이, 본 발명의 특정 구현예에서, 단백질 및/또는 폴리펩티드는 하나 이상의 서브유니트, 에를 들면 항체 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편으로 이루어질 수 있다. 이 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 효율적인 기능항체생산은 중쇄 및 경쇄의 적당하게 균형잡힌 발현을 요구한다. 개별 플라스미드상의 2개 사슬의 트랜스펙션은 같은 카피수의 유지를 어렵게 만들어, 벡터들이 게놈 중에서 서로 가깝게 병합하는 경우 유전자들 사이에서 전사간섭의 포텐셜을 제공한다. 따라서, 동일한 벡터상에서 2개 유전자의 공발현용 양방향 벡터가 이용될 수 있다. 이하 실시예에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 범위 내에서, 예증적인 이 방향 UCOE 기초 벡터계는 임의로 "hybrid" RNP/beta-action UCOE(Cobra Therapeutics)에 기초해서 구축될 수 있다. 벡터는, 하나 이상의 항생물질 내성 마커, 예를 들면 네오마이신, 또는 프로마이신 내성 마커로 이루어질 수있고, 하나 이상의 포유동물 프로모터, 예를 들면 무린 CMV 프로모터(mCMV), 인간 CMV 프로모터(hCMV), 또는 경쇄 또는 중쇄 발현을 드라이브하기 위한 인간 액틴 프로모터로 이루어질 수 있다.
본 발명의 발현벡터로 숙주 세포주의 트랜스펙션
대규모 세팅으로 증식시키기 위하여 미리 적응시킨 표준 숙주 세포주의 트랜스펙션은 더욱 신속한 세포주 발육을 허용해서 연구로부터 발육 및 제조로 변이율을 증가시킨다. 이와 대조적으로, 트랜스펙션 후 혈청이 없는 현탁 적응을 필요로 하는 모세포주를 사용하는 전통적인 시도는 다수의 서브클론의 스크리닝의 필요를 또한 증가시키는데, 왜냐하면 서브클론의 대부분은 대규모 단백질 생산을 허용하는 조건하에서 증식할 수 없기 때문이다. 미리 적응시킨 세포주를 사용해서 세포주를 발육시키는데 요구되는 시간을 수개월로부터 수주일로 단축할 수 있다. 세포주를 화학적으로 정의한, 단백질이 없는 매질에 미리 적응시켜, 진탕 플라스크 또는 생물반응기 중에서 높은 세포밀도로 신속하게 증식시킨다.
적당한 트랜스펙션 프로토콜은 당업자에게 쉽게 알려지고 및/또는 이용될 수 있다. 고수준, 대규모 트랜스펙션을 성취시키는데 적합한 예증적인 트랜스펙션 프로토콜은 CHO-S 숙주 세포주를 트랜스펙션시키기 위해 Invitrogen/Gibco에 의해 추천된 것들이다. 일반적으로, 트랜스펙션된 세포의 양성 선택은, 예를 들면 하이그로마이신, G418 및 퓨로마이신과 같은 약제를 사용하여 성취될 수 있다. 트랜스펙션 효율은 전형적으로 적어도 70%, 더욱 적합하기로는 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 트랜스펙션 및 선택 다음에, 얻어지는 클론의 풀은, 임의로 최고 수준의 단백질 발현을 갖는 개별 클론을 동정하기 위하여 더욱 서브클론될 수 있다.
세포 배양 조건의 선택
본 발명에 의한 불멸화된 현탁세포의 배양에 적합한 혈청이 없는 매질의 선택 및 시험은 일상의 실험에 의하여 숙련된 기술자에 의해 이루어질 수 있다. 상기한 CHO-S 세포에 대해서, CD-CHO 매질(Invitrogen 또는 Gibco에서 입수)이 적합하다.
고수준, 대규모 발현에 적합한 예증적인 단백질 및/또는 폴리펩티드
본 명세서에 기재된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 이들의 관례적인 의미, 즉 아미노산의 서열로서 사용된다. 폴리펩티드는 생성물의 특정 길이에 제한되지 않으며, 따라서 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의에 포함되며, 이러한 용어들은 특별히 다르게 나타내지 않는 한 본 명세서에서 교환해서 사용될 수 있다. 이 용어는 폴리펩티드의 후발현 수식, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등과 기타 이 기술분야에 알려진 수식(양자는 자연적으로 그리고 비자연적으로 생김)을 언급하지 않거나 또는 배제하지 않는다. 그러나, 상기한 바와 같이, 본 발명에 의한 바람직한 단백질 및/또는 폴리펩티드는 Gal-Gal 글리코실화가 부족하다. 폴리펩티드는 전(全)단백질 또는 그의 서브서열이다. 본 발명의 문맥에서 관련 특징 폴리펩티드는 에피토프로 이루어지는 아미노산 서브서열, 즉 폴리펩티드의 면역유전성에 대해 실질적으로 원인이 되고, 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원성 결정인자이다.
특정 바람직한 구현예에서, 본 발명에 의해 생산 및/또는 이용한 폴리펩티드는 면역유전성, 즉 상기 폴리펩티드는 암환자의 항혈청 및/또는 T-세포로 면역검사(예, ELISA 또는 T-세포 자극 검사)에서 검출할 수 있도록 반응한다. 면역유전 활성의 스크리닝은 당업자에게 주지된 기술을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 이러한 스크린은 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988에 기재된 것들과 같은 방법을 사용하여 행할 수 있다. 한 예로서, 폴리펩티드를 고체지지체에 고정시켜서 환자의 혈청과 접촉시켜서 혈청 내의 항체를 고정시킨 폴리펩티드에 결합시킬 수 있다. 이어서, 결합되지 않은 혈청을 제거할 수 있고, 결합된 항체는, 예를 들면 I-표지 단백질 A를 사용해서 검출할 수 있다.
당업자가 인식하는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 내용에 의해 생산한 폴리펩티드의 면역유전성 부분을 또한 본 발명에 포함시켰다.
본 명세서에 기재한 "면역유전성 부분"은 본 발명의 면역유전성 폴리펩티드의 단편이며, 이 것은 그 자체로 폴리펩티드를 인식하는 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 리셉터와 면역적으로 반응성(특이적으로 결합)이다. 면역유전성 부분은, 일반적으로 Paul. Fundamental Immunology, 제3판, 243-247 (Raven Press, 1993)에 요약된 것들과 거기에 인용된 참고들과 같은 공지기술을 사용해서 동정될 수 있다. 이러한 기술은 항원-특이 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응시킬 수 있는 폴리펩티드의 스크리닝을 포함한다. 본 명세서에 기재된, 항혈청 및 항체는 이들이 항원에 특이적으로 결합하는 경우(즉, 이들이 ELISA 또는 기타 면역검사에서 단백질과 반응하고, 비관련 단백질과 검출할 수 있게 반응하지 않는다) "항원-특이"이다. 이러한 항혈청 및 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 주지의 기술을 이용해서 제조될 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 면역유전성 부분은 전장(全長) 폴리펩티드 반응성보다 실질적으로 작지 않은 수준에서(예, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검사에서) 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 부분이다. 바람직하기로, 면역유전성 부분의 면역유전성 활성의 수준은 전장 폴리펩티드의 면역유전성의 적어도 약 50%, 바람직하기로는 적어도 70%, 가장 바람직하기는 약 90% 이상이다. 몇개의 경우에, 바람직한 면역유전성 부분이 동정될 것이며, 이 것은 대응하는 전장 폴리펩티드의 것보다 큰 수준의 면역유전성 활성, 예를 들면 약 100% 또는 150% 이상의 면역유전 활성을 갖는다.
다른 특정 구현예에서, 예증적인 면역유전부분은 펩티드를 포함하여, 여기서 N-말단 리더 서열 및/또는 트랜스멤브레인 도메인이 결실된다. 기타 예증적인 면역유전성 부분은 성숙 단백질에 관하여, 작은 N-말단 및/또는 C-말단 결실(예, 1~30개 아미노산, 바람직하기로는 5~15개 아미노산)을 함유할 것이다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명에 의해 제조 및/또는 사용된 단백질 및/또는 폴리펩티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드, 특히 본 명세서에 기재된 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드에 대해서 생성한 T세포 및/또는 항체, 또는 면역유전성 단편 또는 그의 변이체에 면역학적으로 반응성인 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리펩티드 "변이체"은 하나 이상의 치환, 결실, 첨가및/또는 삽입에 있어서 본 명세서에 특히 기재된 폴리펩티드와 전형적으로 다른 폴리펩티드이다. 이러한 변이체는 천연적으로 생기거나, 또는 예를 들면 본 발명의 상기 폴리펩티드서열의 하나 이상을 수식하고, 그의 활성을 본 명세서에 기재한 바와 같이 검사하고, 및/또는 당업계에 잘 알려진 다수의 기술 중 어느 하나를 사용하여 합성할 수 있다. 본 발명에 의한 예증적인 변이체서열은 원하는 정도의 UCOE 활성을 보유하는 본 명세서에 기재된 8kb RNP UCOE 서열의 동족체에 관련된 서열 또는 그의 서열이다.
한 구현예에서, 예를 들면, 본 발명의 특히 예증적인 변이체서열은 본 명세서에 구체적으로 기술된 UCOE 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 동질성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 바람직하게, 이러한 변이체는 본 명세서에 기재된 8kb RNP UCOE 요소에 의해 나타낸 UCOE 활성과 비교했을 때에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상의 UCOE 활성을 나타낸다.
대부분의 경우에 있어서, 변이체는 보존 치환을 갖게될 것이다. "보존치환"은 아미노산이 유사한 성상을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이며, 펩티드화학 기술분야의 숙련자는 실질적으로 변하지 않게 되는 폴리펩티드의 이차구조 및 수치료 성질(hydropathic nature)을 예측할 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 폴리클레오티드 및 폴리펩티드의 구조에 있어서 변형이 만들어질 수 있으며, 바람직한 특성, 예를 들면 면역유전 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩티드를 암호화하는 기능성 분자를 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 변이체, 그의 일부분, 등가물 또는 개량된 것까지도 만들기 위하여 아미노산서열을 변경하는 것을 원하는 경우에, 당업자는 전형적으로 표 1에 따른 암호화 DNA 서열의 하나 이상의 코돈을 변경할 것이다.
예를 들면, 특정 아미노산을, 예를 들면 항체의 항원-결합영역 또는 기질분자상의 결합부위와 같은 구조물로 상호작용 결합 용량의 상당한 손실 없이, 단백질 구조 중에서 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있다. 왜냐하면, 그것은, 단백질의 생물학적 기능활성, 특정 아미노산서열치환이 단백질 서열, 및 물론 그의 기초가 되는 DNA 코딩 서열에서 만들어질 수 있고, 그럼에도 불구하고 같은 성상을 갖는 단백질이 얻어질 수 있는 것을 정의하는 단백질의 상호반응용량 및 성상 때문이다. 따라서, 다양한 변경이 본 명세서에 기재된 조성물의 펩티드서열, 또는 그의 생물학적 유용성 또는 활성의 상당한 손실이 없이 상기 펩티드를 암호화하는 대응하는 DNA 서열에 있어서 이루어질 수 있는 것으로 예상된다.
아미노산 코돈
알라닌 Ala A GCA GCC GCG GCU
시스테인 Cys C UGC UGU
아스파르산 Asp D GAC GAU
글루탐산 Glu E GAA GAG
페닐알라닌 Phe F UUC UUU
글리신 Gly G GGA GGC GGG GGU
히스티딘 His H CAC CAU
이소루신 Ile I AUA AUC AUU
라이신 Lys K AAA AAG
루신 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌 Met M AUG
아스파라긴 Asn N AAC AAU
프롤린 Pro P CCA CCC CCG CCU
글루타민 Gln Q CAA CAG
알지닌 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 Thr T ACA ACC ACG ACU
발린 Val V GUA GUC GUG GUU
트립도판 Trp W UGG
티로신 Tyr Y UAC UAU
이러한 변경을 만드는 데에 있어서, 아미노산의 수치료의 색인은 고려될 수 있다. 단백질에 대하여 상호작용의 생물학적인 기능을 수여하는 데에 있어서의 수치료의 아미노산 색인의 중요성은 일반적으로 종전 기술분야에서 이해된다(Kyte and Doolittle, 1982, 여기서 참고문헌으로 사용됨). 아미노산의 관련된 수치료 특성은 생성된 단백질의 이차 구조에 기여하고, 차례로 다른 분자 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등등과 단백질의 상호작용을 정의한다. 학학의 아미노산은 그것의 소수성 및 전하 특징을 기초로 한 수치료 색인을 부여하고 있다(Kyte and Doolittle, 1982). 이들의 값은 이소루신(+4.5), 발린(+4.2), 루신(+3.8), 페닐알라닌(+2.8), 시스테인/시스틴(+2.5), 메티오닌(+1.9), 알라닌(+1.8), 글리신(-0.4), 트레오닌(-0.7), 세린(-0.8), 트립토판(-0.9), 티로신(-1.3), 프롤린(-1.6), 히스티딘((-3.2), 글루타메이트(-3.5), 글루타민(-3.5), 아스파르테이트(-3.5), 아스파라긴(-3.5), 라이신(-3.9) 및 알지닌(-4.5)이다.
어떤 아미노산이 유사한 수치료 색인 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 유사한 생물학적인 활성을 갖는 단백질을 생성되는 것, 즉 생물학적인 기능상으로 동등한 단백질을 얻을 수 있다는 것은 종래의 기술분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 변경을 만드는 데에 있어서, 수치료 색인이 ±2이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, 특히 바람직하게는 수치료 색인이 ±1인 것이고, 매우 바람직하게는 수치료 색인이 ±0.5인 것이 가장 바람직하다. 또한, 동등한 아미노산의 치환은 친수성을 기초로 하여 효과적으로 이루어질 수 있는 것이 종래 기술분야에 알려져 있다. 미국 특허 제 4,554,101호(여기서 참고문헌으로 자세히 참조된)는 그것의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 가장 지역적인 평균 친수성은 단백질의 생물학적인 고유성에 관계있다고 개시한다.
미국 특허 제 4,554,101호에서 상세한 바와 같이, 하기 친수성 값은 아미노산 잔기: 알지닌(+3.0), 라이신(+3.0), 아스파르테이트(+3.0±1), 글루타메이트(+3.0±1), 세린(+0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민(+0.2), 글리신(0), 트레오닌(-0.4), 프롤린(-0.5±1), 알라닌(-0.5), 히스티딘(-0.5), 시스테인(-1.0), 메티오닌(-1.3), 발린(-1.5), 류신(-1.8), 이소류신(-1.8), 티로신(-2.3), 페닐알라닌(-2.5), 트립토판(-3.4)에 부여되고 있다. 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고, 생물학적으로 동등한, 특히, 면역학적으로 동등한 단백질을 얻을 수 있다. 이러한 전하에서, 친수성 값이 ±2이내인 아미노산의 치환은 바람직하고, 특히 바람직하게는 ±1이내의 것이고, 매우 바람직하게는 ±0.5이내의 것이다.
상기한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기, 예를 들면, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등등의 관련된 유사성에 기초로 한다. 다양한 이전 특징을 침작한 전형적인 치환은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 알지닌과 라이신, 글루타메이트와 아스파르테이트, 세린과 트레오닌, 글루타민과 아스파라긴, 및 발리,류신과 이소류신를 포함한다.
더구나, 어느 폴리뉴클레오티드는 인 비보에서 안정성을 증가하도록 추가로 변형할 수 있다. 가능성 있는 변형은, 여기에 한정하지는 않지만, 5' 및/또는 3'말단에서 측면화된 서열의 첨가, 골격에서 포스포로티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합보다 2' O-메틸의 사용, 및/또는 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 다른 변형된 형태뿐만 아니라, 이노신, 퀘오신 및 와이부토신(wybutosine)과 같은 비전통적인 염기의 포함 등이 포함된다.
아미노산 치환은 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 잔기의 양쪽 친매성에서의 유사성을 기초로 하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 음성적으로 전하된 아미노산은 아스파르산 및 글루탐산; 양성적으로 전하된 아미노산은 라이신 및 알지닌을 포함하고, 그리고 유사한 친수성 값을 갖는 비전하된 극성 해드(head) 군을 갖는 아미노산은 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존전하를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 군은 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his, 및 (5) phe, tyr, trp, his를 포함한다. 변이체는 또한, 혹은 대체가능하게는, 비-보존전하를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 변이된 폴리펩티드는 다섯개 또는 그 이하의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 천연 서열로부터 달라진다. 변이체는 또한(또는 대체가능하게는), 예를 들어 폴리펩티드의 면역원성, 이차 구조 및 수치료 본성에 최소한의 영향을 주는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 변형된다.
상기와 같이, 폴리펩티드는 단백질의 N-터미널 말단 시그널(또는 리더) 서열을 포함할 수 있고, 공동-번역적으로(co-translationally) 또는 번역이후로(post-translationally) 단백질의 전달을 이끈다. 폴리펩티드는 또한 링커 또는 폴리펩티드(예를 들어, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 동정에 용이한, 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 상승시키기에 용이한 다른 서열에 연결될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 면역글로블린 Fc 영역에 접합될 수 있다.
폴리펩티드를 비교하는 경우에, 두 개의 서열은 두 개의 서열에서 아미노산의 서열이 하기에 기재한 바와 같이, 최대한의 일치로 정렬되는 경우와 같다면 "동일하다"고 말하여진다. 두 개의 서열 사이에서의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부적인 영역을 동정하고 비교하기 위하여 비교 창(comparison window) 전체로 서열을 비교하는 것으로 수행된다. 여기서 사용한 바와 같이 "비교 창"은 약 20개 이상의, 일반적으로 30 내지 약 75개의, 40 내지 약 50개의 연속적인 위치의 구획으로 간주하고, 여기서 서열은 두 개의 서열이 최선으로 배열된 후 연속적인 위치의 동일한 수의 참고 서열에 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최상의 배열은 암묵치(default) 매개변수를 사용하여,생체정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene suite에서 Megalign 프로그램을 사용하여 구성하였다. 이 프로그램은 하기 참고문서에서 개시한 여러 배열 개요를 통합한다: Dayhoff, M.O. (1978) 단백질의 진화론적인 변경의 모형-원거리 관계를 탐지하기 위한 매트릭스. Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Reserch Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645Methods in Enzymologyvol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989)CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. 및 Muller W. (1988)CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971)Comb. Theor 11:105; Saitou, N. Nei, M. (1987)Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A and Sokal, R.R. (1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983)Proc. Natl. Acad., Sci. USA80:726-730.
대체가능하게는, 비교를 위한 서열의 최상의 배열은 Smith and Waterman (1981)Add. APL. Math2:482의 국부적인 동일성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch (1970)J. Mol. Biol.48:443의 동일성 배열 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444의 유사성 방법의 위한 조사에 의해, 이들 알고리즘(Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI에서의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및TFASTA)의 이행을 컴퓨터화하는 것으로, 또는 정밀 검사에 의해 구성될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성의 퍼센트를 결정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 개별적으로 Altschul et al. (1977)Nucl. Acids Res.25:3389-3402 및 Altschul et al. (1009)J. Mol. Biol.215:403-410에서 기재되어 있다.
BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들어, 여기서 개시된 매개변수를 이용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 서열 동일성의 퍼센트를 결정하기 위해 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 대중적으로 사용가능하다. 아미노산 서열인 경우, 점수화 매트릭스는 누적 점수를 계산하는 데에 사용할 수 있다. 각 방향에서 적중하는 단어의 확장은 누적 배열 점수가 그것의 최대 성취값으로부터 양 X에 의해 떨어지는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음성-점수화 잔기 배열의 축적에 기인하여 제로 또는 그 이하로 가는 경우; 또는 어느 한 서열의 말단이 도달한 경우에 중지된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 민감도 및 배열의 속도를 결정한다.
하나의 바람직한 접근에서 "서열 동일성의 퍼센트"는 20개 이상의 위치의 비교 창에 걸쳐 두 개의 최상으로 배열된 서열을 비교하는 것으로 결정되고, 여기서, 비교 창에서의 폴리펩티드 서열의 일부는 두 개의 서열의 최상의 배열을 위해 참고문헌(첨가 또는 결실을 포함하지 않는)에 비교한 바와 같이, 20퍼센트 이하로, 일반적으로 5 내지 15퍼센트, 또는 10 내지 12퍼센트로 첨가 또는 결실(즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 상기 퍼센트는 동일한 아미노산 잔기가 양쪽 서열 모두에서 발생하여 조화된 위치의 수를 나타내는 위치의 수를 결정하고, 참고문헌(즉, 창 크기)에서 위치의 총 수에 의해 조화된 위치의 수를 나누고 그리고 그 결과에 100으로 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 나타내는 것을 계산된다.
다른 예증적인 구현예에서, 본 발명에 따라서 생산된 그리고/또는 사용된 폴리펩티드는 이종발생성 폴리펩티드일 수 있고, 이것은 상기한 바와 같이, 참고 폴리펩티드로서 제공되는 인간 폴리펩티드(또한, 자가 항원)에 대하여 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하지만, 이종항원성 폴리펩티드는 다른 비-인간 종으로부터 유도된다. 당업자들은 "자가"항원이 종종 CD8+ 및 CD4+ T-림프구 반응의 약한 자극제이므로 종양 폴리펩티드에 대항하여 지시된 효율적인 면역치료 계획은 특정한 자가 종양 폴리펩티드에 대한 면역 항독성을 극복하기 위한 방법의 개발을 요구한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 프로스타제 단백질을 이용하여 이종항원성(비 인간) 원천으로부터 면역화된 인간은 대응하는 인간 단백질(예를 들어, 인간 종양 세포에 존재하는 인간 프로스타제 종양 단백질에 대항하는 면역 반응을 상승시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 한 관점은 여기서 기재한 단백질 및/또는 폴리펩티드의 이종항원성 변이체를 제공하는 것이다.
더욱 바람직하게는, 본 발명은 여기서 설명한 인간 폴리펩티드의 이종항원성 형태로서 사용될 수 있는 마우스, 래트, 원숭이, 돼지 및 다른 비-인간 폴리펩티드에 대하여 나타낸다.
다른 예증적인 구현예에서, 본 발명은 여기서 기재한 바와 같이, 다중 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 서브유니트를 포함하는, 또는 여기서 기재한 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 및 관계없는 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 사용할 수 있고 그리고/또는 생산할 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어, T 헬퍼 에피토프 (면역학적인 융합 파트너), 바람직하게는 인간에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 데에 보조할 수 있거나, 또는 천연 재조합 단백질보다 더 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)를 발현하는 데에 보조할 수 있을 것이다. 어떤 바람직한 융합 파트너는 면역학적인 및 발현을 증폭시키는 융합 파트너가다. 다른 융합 파트너는 폴리펩티드의 용해도를 증가시키기 위해 또는 원하는 세포내의 구역에 표적화되는 폴리펩티드를 가능하게 하기 위해서 선택될 수 있다. 추가의 융합 파트너는 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 친화도 태그를 포함한다.
융합 폴리펩티드는 일반적으로 화학적인 접합을 포함하는 표준기술을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 융합 펩티드는 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하고, 발현 시스템에서 증가된 수준의 생산을 가능하게 하는 재조합 펩티드로서 발현된다. 간략하게는, 예를 들어, 폴립펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 분리되어 집합될 수 있고, 적당한 발현 벡터로 연결된다. 하나의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3'말단은, 펩티드 링커로 또는 없이, 이차 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5'말단에 연결되어 서열의 리딩 프레임이 일치한다. 이것은 양쪽 성분 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지하는 단일 융합 폴리펩티드로 번역되는 것을 허락한다.
펩티드 링커 서열은 각각의 폴리펩티드가 그것의 이차 및 삼차 구조로 접히도록 하기에 충분한 거리에 의해서 일차 및 이차 폴리펩티드 성분을 분리하도록 사용될 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 종래의 기술분야에서 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩티드로 합체된다. 적합한 펩티드 링커 서열은 하기 요소: (1) 그것들의 휘기 쉬운 확장된 구조를 가질 수 있는 능력; (2) 일차 및 이차 폴리펩티드에서 기능적인 에피토프와 상호작용할 수 있는 이차 구조를 가질 수 없음; 및 (3) 폴리펩티드의 기능적인 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 전하된 잔기의 결핍를 기초로 하여 선택될 수 있다. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 가까운 천연 아미노산은 또한 링커 서열에서 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 Maratea et al.,Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국특허 제 4,935,233호 및 미국특허 제 4,751,180호에 개시되었다. 링커 서열은 일반적으로 길이상 1내지 약 50개의 아미노산이다. 링커 서열은 일차 및 이차 폴리펩티드가 융합 도메인을 분리하고 그리고 입체 간섭을 방해하는 데에 사용될 수 있는 비-필수적인 N-터미널 아미노산 영역을 갖는다.
연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 번역의 조절 성분에 작동가능하게 연결된다. DNA의 발현을 초래하는 조절 성분은 일차 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 대하여 5'에서만 위치된다. 유사하게는, 전사를 종료하는 정지 코돈 및 번역 종결 시그널은 이차 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 대하여 3'에서만 존재한다.
융합 폴리펩티드는 소환 반응을 이끌어낼 수 있는 면역원성 단백질과 같은, 무관한 단백질과 함께 여기서 생성된 그리고/또는 기재된 폴리펩티드를 포함할 수있다. 이러한 단백질의 예로는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질(예로는 Stoute et al.New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997을 참조)을 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 면역원성 융합 파트너는 결핵 미토박테리움-유도된 Ra12 단편과 같은 미코박테리움 종으로부터 유도된다. 이종성 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 증폭하는 데에서 그것들을 사용하는 Ra12 조성물 및 방법은 미국특허출원 제 60/158,585호에 개시되어 있고, 전문을 참고문서로 여기서 참조되었다. 간결하게, Ra12는Mycobacterium tuberculosisMTB32A 핵산의 연속인 폴리뉴클레오티드 영역으로 간주한다. MTB32A는M. tuberculosis의 독성 및 비독성 균주에서 유전자에 의해 암호화되는 32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 개시되고 있다(예를 들어, 미국특허출원 제 60/158,585호, 여기서 참고문서로 인용된 Skeikyet al., Infection and Immun.(1999) 67:3998-4007을 참조). MTB32A를 암호화하는 서열의 C-터미널 단편은 높은 수준에서 발현하고, 정재 공정을 통하여 용해성 폴리펩티드로서 남는다. 더구나, Ra12은 그것이 융합되는 이종성 면역원성 폴리펩티드의 면역원성을 증폭시킬 수 있다. 하나의 바람직한 Ra12 융합 펩티드는 MTB32A의 192 내지 323의 아미노산 잔기에 상응하는 12 KD C-터미널 단편을 포함한다. 다른 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 Ra12 폴리뉴클레오티드의 일부분을 암호화하는 약 15개이상의 연속되는 뉴클레오티드, 약 30개이상의 뉴클레오티드, 약 60개이상의 뉴클레오티드, 약 200개이상의 뉴클레오티드 또는 약 300개이상의 뉴클레오티드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오티드는 천연 서열을 포함할 수있거나(즉, Ra12 폴리펩티드 또는 그것의 일부분을 암호화하는 내성적인 서열) 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함하므로, 상기 암호화된 융합 폴리펩티드의 생물학적인 활성이 천연 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴피펩티드에 관련하여 실질적으로 감소되지 않는다. 변이체는 천연 Ra12 폴리펩티드 또는 그것의 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 바람직하게는 약 70%이상의 동일성을 나타내고, 더욱 바람직하게는 약 80%이상의 동일성, 가잘 바람직하게는 약 90%이상의 동일성을 나타낸다.
다른 바람직한 구현예에서, 면역학적인 융합 파트너는 그램-음성의 박테리움 해모필러스 인플루엔자의 표면 단백질, 단백질 D로부터 유도된다(WO 91/18926). 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 대략 처음 삼차 단백질(예를 들어, 처음 N-터미널 100-110개의 아미노산)을 포함하고, 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 어떤 바람직한 구현예에서, 지단백질 D 융합 파트너의 처음 109개의 잔기는 폴리펩티드에 추가의 외성적인 T-세포 에피토프를 제공하기 위해 그리고 E. Coli에서 발현 수준을 증가시키기 위해(그러므로 발현 인핸서로 기능하는) N-종단(terminus)에 포함된다. 지질 하부는 항원이 존재하는 세포에 대하여 항원의 최상의 표현을 가능하게 한다. 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스, NS1(헤마글로티닌)으로부터의 비구조적인 단백질을 포함한다. 전형적으로, N-터미널의 81개의 아미노산은 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 다른 단편이 사용될 수 있을 지라도, 사용된다.
또 다른 구현예에서, 면역학적인 융합 파트너는 LYTA 또는 그것의 일부분(바람직하게는 C-터미널 일부분)으로 알려진 단백질이다. LYTA는Streptococcus pneumoniae에서 유도되고, 아미다제 LYTA(LytA 유전자에 의해 암호화된;Gene 43:265-292, 1986)로서 알려진 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성한다. LYTA는 명확하게는 펩티도글리칸 골격에서 어떤 결합을 퇴화시키는 자가용해소이다. LYTA 단백질의 C-터미널 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 콜린 유사체에 대한 친화도의 원인이 된다. 이 고유성은 융합 단백질의 발현에 유용한, E. Coli C-LYTA를 발현하는 플라스미드의 발전을 촉진하고 있다. 아미노 종단에서 C-LYTA 단편을 함유하는 잡종 단백질의 정제는 개시되고 있다(Biotechnology 10:795-798, 1992를 참조). 바람직한 구현예에서 LYTA의 반복 부분은 융합 폴리펩티드로 합체될 수 있다. 반복 부분은 178번 잔기에서 출발하는 C-터미널 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부분은 188-305의 잔기를 합체한다.
또 다른 예증적인 구현예는 융합 폴리펩티드 및 그것들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 융합 파트너는 미국특허 제 5,633,234호에 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드를 엔도솜/리소좀 구역으로 유도할 수 있는 표적화하는 시그널을 포함한다. 이 표적화하는 시그널과 융합하는 경우에, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 더욱 효율적으로 결합할 것이고, 그것으로 인하여 폴리펩티드에 특정한 CD4+T-세포의 상승된 인 비보 자극을 제공할 것이다.
일반적으로, 본 발명의 단백질 및/또는 폴리펩티드(융합 폴리펩티드를 포함하는)는 단리된다. "단리된" 폴리펩티드는 그것의 본래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들면, 자연적으로 발생하는 단백질 또는 폴리펩티드는 그것이 자연 시스템에서 공존하는 물질의 전부 또는 약간으로부터 분리된다면 단리된다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 약 90%이상 순수하게, 더욱 바람직하게는 약 95%이상 순수하게 그리고 가장 바람직하게는 약 99%이상 순수하게 정제된다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 특히 바람직한 폴리펩티드는 항체 및 그것의 항원-결합과 같은, 단편 결합 제제를 포함하고, 이들은 특정 질병 상태와 관련된 폴리펩티드와 같은, 관심의 표적 폴리펩티드, 또는 그것의 일부분, 변이체 또는 유도체에 대한 면역학적인 결합을 나타낸다. 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 그것이 폴리펩티드와 탐지가능한 수준에서 반응하고(예를 들어, ELISA 평가와 같이) 유사한 조건에서 무관한 폴리펩티드와 탐지가능하게 반응하지 않는다면, 본 발명의 폴리펩티드에 "특히 결합" 및/또는 "면역학적으로 결합"으로 말하여진다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 면역학적인 결합은 일반적으로 면역 글로블린 및 상기 면역 글로블린에 특정적인 항원 사이에서 발생하는 유형의 비-공유결합적 상호작용으로 간주된다. 면역학적인 결합 상호작용의 세기 또는 친화도는 상호작용의 해리상수(Kd)의 용어로 나타낼 수 있고, 더 작은 Kd는 더 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적인 결합 고유성은 종래의 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 정량할 수 있다. 이러한 하나의 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 비율을 측정하는 것을 수반하고, 이들 비율은 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도 및 양 방향에서 비율에 평등하게 영향을 주는 기하학적인 매개변수등에 의존한다. 그러므로, "on 비율상수"(Kon) 및 "off 비율상수"(Koff) 모두는 농도 및 결합과 분리의 실제 비율을 계산하는 것으로 결정될 수 있다. Koff/Kon의 비율은 친화도에 관계되지 않은 모든 매개변수를 소거할 수 있으므로, 해리상수 Kd에 평등하다. 일반적으로, Davies et al. (1990) Annual Rev. Boichem. 59:439-473을 참조.
항체의 "항원-결합 부위" 또는 "결합 일부분"는 항원 결합하는 데에 참여하는 면역글로블린 분자의 부분으로 간주한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-터미널 변수("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역에서 세 개의 높게 발산하는 스트래치(stretch)는 "골격 영역" 또는 "FRs"로 알려진 더욱 보존된 측면화하는 신장 사이에서 개재되는 "초변수 영역"으로 간주된다. 그러므로, "FR"이라는 용어는 자연적으로 면역 글로블린에서 초변수 영역에 인접하고, 그 사이에서 발견된다. 항체 분자에서, 경쇄의 세 개의 초변수 영역 및 중쇄의 세 개의 초변수은 항원-결합 표면을 형성하기 위하여 3차원 공간에서 서로 관계되어 처리된다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이고, 중쇄 및 경쇄의 세 개의 초변수 영역은 "상보적으로 결정하는 영역", 또는 "CDRs"로 간주된다.
종양 관련된 단백질에 특정적인 것들과 같은 특정 결합제는 기술분야에서 알려지고 여기서 제공된 전형적인 평가법을 사용하여 암이 존재하거나 또는 존재하지않는 환자 사이에서 추가로 구별할 수 있을 것이다. 예를 들어, 종양 단백질에 결합하는 항체 또는 다른 결합제는 바람직하게는 질병을 가진 환자의 약 20%이상에서, 더욱 바람직하게는 질병을 가진 환자의 약 30%이상에서 암의 존재를 나타내는 시그널을 생성할 것이다. 대체가능하게는, 또는 덧붙여, 항체는 암을 갖지 않은 개체의 약 90%이상에서 질병의 부존재를 나타내는 음성적인 신호을 생성할 것이다. 결합제가 이러한 요건을 충족하는가를 결정하기 위해서, 암을 가진 또는 갖지 않은 환자로부터의 생물학적인 샘플(예를 들면, 혈액, 혈청, 타액, 소변 및/또는 종양 생체검사)이 결합제에 대하여 결합하는 폴리펩티드의 존재를 위해, 여기서 기재한 바와 같이, 평가할 수 있다. 바람직하게는, 질병의 가진 그리고 갖지 않은 샘플의 통계학적으로 중요한 수치는 평가될 것이다. 각각의 결합제는 상기 척도를 만족할 것이다; 하지만, 당업자들은 결합제는 민감도를 향상시키기 위하여 조합하여 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명에 따라서 생성된 다른 결합제는 또한 종양 관련된 폴리펩티드 서열에 대하여 그들의 특이성에 기초한 치료요법의 가치를 가질 것이다.
상기 조건을 만족하는 제제는 결합제일 수 있고, 예를 들어, 결합제는 펩티드 성분을 갖거나 갖지 않은, 리보솜, RNA 분자 또는 폴리펩티드일 것이다. 바람직한 구현예에서, 결합제는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 항체는 당업자들에게 알여진 여러가지 기술 중 하나로 제조될 수 있다. 예를 들어, Harlow and Land,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988을 참조. 본 발명에 따라서 여기서 예를 든 방법에 더하여, 많은 항체 생산 기술은 당업자에게 사용가능하다. 예를 들어, 항체는 또한 세포 배양기술에 의해 생산될 수 있고 재조합 항체의 생산을 가능하게 하기 위해서, 적합한 박테리아 또는 포유동물 세포숙주로 항체 유전자를 트랜스펙션하는 것으로, 여기서 기재한 바와 같이, 모노클로날 항체의 생성하는 것을 포함한다. 하나의 기술에서, 폴리펩티드를 포함하는 면역원은 처음에는 매우 다양한 포유동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 염소)중 하나로 주입되었다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩티드는 변형없이 면역원으로 제공할 것이다. 대체 가능하게는, 관련되게 짧은 폴리펩티드를 위해 특히, 우수한 면역 반응은 상기 폴리펩티드가 소혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 합쳐진다면 추출될 수 있다. 면역원은 바람직하게는 하나 이상의 효능 촉진제 면역화를 혼합하는 예비결정된 예정표에 따른, 동물 숙주에 주입하고, 동물은 정기적으로 채혈되었다. 폴리펩티드에 특정한 폴리클로날 항체는 예를 들어, 적합한 고체 지지체에 짝을 이룬 폴리펩티드를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의하여, 이러한 항 혈청으로부터 정제될 수 있다.
관심의 항원 폴리펩티드에 특정한 모노클로날 항체는 예를 들어, Kohler and Milstein,Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976의 기술 및 그것에 개량된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 간략하게는, 이들 방법은 원하는 특이성(즉, 관심의 폴리펩티드와의 반응성)을 갖는 항체를 생산할 수 있는 불멸화된 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들어, 상기한 바와 같이 면역화된 동물로부터 얻어진 비장 세포로부터 제조될 수 있다. 그런 다음, 비장 세포는 예를 들어, 골수종 세포 듕합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물와 공동유전자인 것에 의해 불멸화된다.다양한 융합 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 비장 세포 및 골수종 세포는 몇 분동안 비이온성 세척제로 결합될 수 있고, 골수종 뿐만 아니라, 잡종 세포의 성장을 지지하는 선택적인 배지에서 낮은 밀도로 도포할 수 있다. 바람직한 선택기술은 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘)선택법을 사용한다. 일반적으로, 약 1 또는 2주의 충분한 시간 후, 잡종 콜로니를 관측된다. 단일 코롤니는 선택되고, 그것들의 배양 상청액은 폴리펩티드에 대항하는 결합 활성에 대하여 시험된다. 높은 반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 콜로니을 생장시키는 상청액으로부터 단리시킬 수 있다. 더욱이, 다양한 기술이 마우스와 같은, 적합한 척추동물 숙주의 복막강으로 하이브리도마 세포주의 주입과 같이, 수율을 높이기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음, 모노클로날 항체는 복수액 또는 혈액으로부터 채집될 수 있다. 오염물질은 크로마토그래피, 겔 여과법, 침전법 및 추출법과 같은 통상적인 기술에 의해 항체로부터 제거될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 친화도 크로마토그래피 단계에서 정제 공정에 사용될 수 있다.
치료요법적으로 유용한 많은 분자는 항체 분자의 면역학적으로 결합하는 고유성을 나타낼 수 있는 항워-결합 부위를 포함하는 것으로 종래의 기술분야에 잘 알려져 있다. 단백질분해효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 균열하어 여러 단편으로 만든고, 그("F(ab)" 단편) 중 두 개에서 각각은 완언잔 항원-결합 부위를 포함하는 공유결합 이종이합체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 균열하어 항원-결합 부위 모두를 포함하는 "F(ab')2" 단편을 포함하는 여러 단편을 제공한다. "Fv"단편은 IgM 및 드물게 발생하지만, IgG 또는 IgA 면역 글로블린 분자의 우선적인 단백질분해의 균열에 의해 생산될 수 있다. 하지만, Fv 단편은 더욱 일반적으로 종래의 기술분야의 재조합 기술을 사용하여 유도될 수 있다. Fv 단편은 많은 항원 인식 및 천연 항체 분자의 결합능력을 유지하는 항원-결합 부위를 포함하는 비공유결합의 VH::VL이종이합체를 포함한다. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; 및 Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.
단일 사슬 Fv("sFv") 폴리펩티드는 공유결합적으로 연결된 VH::VL이종 이합체이고, 펩티드-암호화하는 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL-암호화하는 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 발현된다. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 (16):5879-5883. 많은 방법은 자연적으로 집합된, 하지만 화학적으로 분리된, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 항체 V 영역에서, 항원-결합 부위의 구조에 실질적으로 유사한 3차 구조로 포개어질, sFv분자로 변환하기 위한 화학적 구조를 분별하도록 기재될 수 있다. 예를 들면, Huston et al.의 미국특허 제 5,091,513 및 5,132,405호; 및 Ladner et al.의 미국특허 제 4,946,778호를 참조.
상기 분자의 각각은 상대적으로 CDRs에 대한 지지체를 제공하고, 상호 관련된 CDRs의 공간적인 관련성을 정의하는 중쇄 및 경쇄 FR 세트 사이에서 개재된, 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 포함한다. 여기서 사용한 바와 같이, "CDR 세트"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 세 개의 초변수 영역으로 간주된다. 중쇄 또는 경쇄의 N-종단으로부터 기인하는, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"로 명명된다. 그러므로, 항워-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역의 각각으로부터 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 단일 CDR(예를 들면, CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩티드는 여기서 "분자 재인식 유니트"로 간주된다. 많은 항원-항체 복합체의 결정학 분석은 CDR의 아미노산 잔기가 갇힌 항원과 광범위한 접촉을 형성하는 것을 예증하고, 가장 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3와 이루어진다. 그러므로, 분자 재인식 유니트는 항원-결합 부위의 특이성에 주로 부합한다.
여기서 사용한 바와 같이, "FR 세트"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세포의 CDR을 세우는, 네 개의 측면화하는 아미노산 서열로 간주한다. 어떤 FR 잔기는 갇힌 항원과 접촉할 수 있다: 하지만, FR은 주로 항원-결합 부위로, 특히 CDR 직접적으로 인접한 FR 잔기로 V영역을 포개는 것에 부합한다. FR에서, 특정 아미노 잔기 및 특정 구조적인 특성은 매우 높게 보존된다. 이 관계에서, 모든 V 영역 서열은 약 90개의 아미노산 잔기의 내부 이황화물 루프(loop)를 함유한다. V 영역이 결합부위로 포개어지는 경우, CDRs은 항원 결합 표면을 형성하는 루프 모티프를 도모하는 것으로 나타난다. 정확한 CDR 아미노산 서열이 없음에도 불구하고, 특정 "인정된" 구조로 CDR 루프의 포개어진 형상에 영향을 주는 FRs의 보존된 구조의 영역이라는 것이 일반적으로 인식된다. 추가로, 특정 FR 잔기는 항체 중쇄 및 경쇄의 상호작용을 안정화하는 비-공유결합의 인터도메인(interdomain) 접촉에 참여하는 것으로 알려져 있다.
비-인간 면역 글로블린로부터 유도된 항원-결합 부위를 포함하는, 많은 "인간화된" 항체 분자는 설치류 V 영역 및 인간 일정한 도메인에 융합된 그것들의 연관된 CDRs(Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538; and Brown et al. (1987) cancer Res. 47:3577-2583), 적절한 인간 항체 일정한 도메인과 융합되기 이전에 FR을 지지하는 인간으로 이식하는 설치류 CDRs(Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) Nature 321:522-525), 및 재조합으로 베니어링(vereering)된 설치류 FRs에 의해 지지된 설치류 CDRs(1992년 12월 23일에 발행한 유럽특허공보 제 519,596호)를 갖는 키메라 항체를 포함하는 것으로 개시되고 있다. 이들 "인간화된" 분자는 인간 수령체에서 그것들의 몫의 치료학적인 적용의 효율성 및 기간을 한정하는 설치류 항인간 항체 분자에 대한 원하지 않는 면역학적인 반응 을 최소화하도록 고안된다.
여기서 사용한 바와 같이, "베니어링된 FRs" 및 "재조합으로 베니어링된 FRs"라는 용어는 예를 들어, 모든 천연 FR 폴리펩티드를 포개는 구조를 실질적으로 유지하는 항원-결합 부위를 포함하는 이종의 분자를 제공하기 위하여 인간 FR 잔기를 갖는, 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역으로부터 FR 잔기의 선택적인 대체에 언급된다. 베니어링하는 기술은 항원-결합 부위의 리간드결합 특징이 항원-결합 표면에서 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 관련된 성질에 의해 주로 결정된다는 이해를 기초로한다. Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:439-473. 그러므로, 항원 을 결합하는 특이성은 CDR 구조, 그것들끼리의 상호작용, 및 그것들의 남은 V 영역 도메인와의 상호작용이 주의깊게 유지되는 경우에만, 인간화된 항체에서 보존된다. 베니어링하는 기술을 사용하는 것으로, 면역 시스템에 의해 쉽게 마주치게 되는 외부(예를 들어, 용매접근이 용이한) FR 잔기는 약하게 면역원성의 또는 실질적으로 비-면역원성의 서로 합친 표면 중 하나를 포함하는 잡종 분자를 제공하는 인간 잔기로 선택적으로 교체된다.
베니어링 공정은 Kabat et al., in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987)에 의해 편찬된 인간 항체 변수 도매인용으로 사용가능한 서열의 용도를 만들고, Kabat 데이타베이스 및 다른 사용가능한 미국 및 외국 데이타베이스(핵산 및 단백질 모두에서)에 업데이트된다. V 영역 아미노산의 용매접근가능성은 인간 및 뮤린 항체 단편의 알려진 3차 구조로부터 유추될 수 있다. 뮤린 항체-결합 부위를 베니어링하는 데에 있어서 두 개의 일반적인 단계가 있다. 처음에, 관심의 항체분자의 변수 도메인의 FRs는 상기 동정화된 원천으로부터 얻어진 인간 변수 도메인의 상응하는 FR 서열과 비교된다. 그런 다음, 가장 균일한 인간 V 영역은 상응하는 뮤린 아미노산에 대하여 잔기 대 잔기로 비교한다. 인간 대응물로부터 다른 뮤린 FR에서의 잔기는 종래의 기술분야에서 알려진 재조합 기술을 사용하여 인간 몫에서 존재하는 잔기에 의해 대체될 수 있다. 잔기 교환은 적어도 부분적으로 노출된(용매접근이 용이한) 몫에서만 실행되고, 프롤린, 글리신 및 전하된 아미노산과 같은 V 영역 도메인의 3차 구조에서 중요한 영향을 가질 수 있는 아미노산 잔기의 대체에서 감독이 발휘된다.
이 방법에서, 합성적인 "베니어링된" 뮤린 항체-결합 부위는 뮤린 CDR 잔기, 실질적으로 CDRs에 인접한 잔기, 묻히거나 또는 대부분 묻힌(용매접근이 용이하지않은) 바와 같이 동정화된 잔기, 중쇄 및 경쇄 도메인 사이에서 비-공유결합적인(예를 들어, 정전기적인 그리고 소수성의) 접촉에 기여하는 것으로 믿어지는 잔기 및 CDR 루프의 "인정된" 3차 구조에 영향을 주는 것으로 믿어지는 FRs의 보존된 구조 영역으로부터의 잔기를 유지하도록 고안된다. 이들 고안의 척도는 뮤린 항체 분자의 항원 특이성을 나타내는 재조합 인간 항체의 발현을 위한 포유동물 세포를 트랜스펙션하는 데에 사용될 수 있는 인간에 나타나는 FRs로 뮤린 항원-결합 부위의 중쇄 또는 경쇄 모두의 CDRs을 화합하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 제조하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따라서 생성된 항체는 하나 이상의 치료제에 짝을 이룰 수 있다. 이와 관련하여 적당한 제제는 방사서 핵종, 구분 인핸서, 약제, 독소 및 그것들의 유도체를 포함한다. 바람직한 방사성 핵종은90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi를 포함한다. 바람직한 약제는 메소트렉세이트 및 피리미딘 및 퓨린 유사체를 포함한다. 바람직한 구분 인핸서는 포르볼 에스테르 및 부티르산을 포함한다. 바람직한 독소는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라 독소 및 미국자리공 항바이러스 단백질을 포함한다.
치료제는 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 군) 중 하나로 적당한 모노클로날 항체에 짝을(예를 들어, 공유결합적으로 결합된) 이룰 수 있다. 제제와 항체 사이의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환기를 소유하는 경우에 가능하다. 예를 들어, 아미노 또는 술프히드릴기와 같은 친핵성기는 안히드라이드 또는 산 할라이드와 같은 카르보닐함유기 또는 다른 곳에 좋은 이탈기(예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬기와 반응할 수 있다.
대체가능하게는, 링커 군을 통하여 치료제 및 항체가 짝을 이루는 것이 바람직할 것이다. 링커 군은 결합 능력을 갖는 간섭을 피하기 위하여 제제로부터 항체를 거리를 갖게 하는 스페이서로서의 기능을 할 수 있다. 링커 군은 또한 제제 또는 항체에서 치환기의 화학적 반응성을 증가시키도록 제공될 수 있다. 그러므로, 짝지움 효유성을 증대시킨다. 화학적 반응성에서의 증가는 또한 제제, 제제에서의 기능기의 용도를 촉진할 것이나, 그렇지 않은 것은 가능하지 않다.
동종- 및 이종-기능적인, 다양한 두 기능적인 또는 다중기능적인 제제(Pierce Chemical Co., Rockford, IL의 상품일람표에 기재된 것들과 같이)는 링커 군으로서 사용될 수 있다. 짝지움은 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기 또는 산화된 카르보히드라이트 잔기에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, Rodwell et al.에 의한 미국 특허 제 4,671,958호와 같이, 이러한 방법을 기재하는 많은 참고문헌이 있다.
치료제가 본 발명의 면역접합의 항체 일부분으로부터 자유로운 경우에 더욱 강력한 곳에서, 세포로 내제화하는 중에 균열될 수 있는 링커 군을 사용하는 것이바람직할 것이다. 이들 링커 군으로부터 제제의 세포내 방출에 대한 메카니즘은 이황화물 결합의 환원(예를 들어, Spitler의 미국특허 제 4,489,710호)에 의한, 광감성 결합의 조사(예를 들어, Senter et al.,의 미국특허 제 4,625,014호)에 의한, 유도된 아미노산 측쇄의 가수분해(예를 들어, Kohn et al.의 미국특허 제 4,638,045)에 의한, 혈청 보충-중재된 가수분해(예를 들어, Rodwell et al.의 미국특허 제 4,671,958호)에 의한, 그리고 산-촉매화 가수분해(예를 들어, Blattler et al.의 미국특허 제 4,569,789호)에 의한 균열을 포함한다.
단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현에 적절한 폴리뉴클레오티드
다른 국면에서 본 발명은 상기에서 개시된 재조합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. "DNA" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 특정 종의 전체 유전자(genomic) DNA의 단리된 유리 DNA 분자를 언급하는 것으로 본 명세서에서 본질적으로 호환성 있게 사용된다. 본 명세서에서 사용된 "단리된(Isolated)"이란 폴리뉴클레오티드가 실질적으로 다른 암호화 서열(coding sequence)과 떨어져 있으며, DNA 분자가 큰 염색체 단편 또는 다른 기능적인 유전자 또는 폴리펩티드 암호화 부분 같은, 무관한 암호화 DNA의 큰 부분을 포함하지 않는 것을 의미한다. 물론, 이는 처음부터 단리된 대로의 DNA 분자를 말하며, 인간의 손으로 구획에 후에 덧붙여진 유전자 또는 암호화 부분을 제외하지 않는다.
폴리뉴클레오티드는 천연의 서열(즉, 예를 들어 항체 같은 단백질 및/또는 폴리펩티드 또는 그의 부분을 암호화하는 내생적인 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 그러한 서열의 변이체 또는 유도체를, 바람직하게는 면역원성 변이체 또는 유도체를 암호화하는 서열을 포함할 수도 있다. 어떤 구현예에서는, 폴리뉴클레오티드 서열은 상기에서처럼, 면역원성 폴리뉴클레오티드를 암호화할 수 있다.
전형적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 1 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있고, 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 면역원성이 본 명세서에 특별히 설명된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 관련하여 실질적으로 줄어들지 않는다. "변이체"라는 용어는 이종 원천의 상동적인 유전자를 포함하는 것으로도 이해되어져야 한다.
암호화 서열 자체의 길이에는 무관하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 단편은 다른 DNA 서열, 예를 들어 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 부가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 구획 등과 결합될 수 있으며 그들의 총체적인 길이는 상당히 다양할 수 있다. 그러므로, 바람직하게는 표본(preparation)의 용이성과 계획된 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용에 의해 제한되는 총 길이를 갖는, 거의 모든 길이의 핵산 단편들이 이용될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, (모든 중간적 길이를 포함하는) 길이에서 약 10,000, 약 5,000, 약 3,000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍 등의, 예증되는 폴리뉴클레오티드 구획들은 본 발명의 많은 실행에서 유용할 것이라고 예상된다.
본 발명에 의한 높은-수준 및 대 규모의 발현을 위해 적절한 폴리뉴클레오티드들은 다양한 잘 확립된 기술들을 이용해서 동정되고 제조되며/또는 다루어질 수 있다(일반적으로, Sambrook et al.,Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 및 다른 참고문헌 참조). 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 종양-관련 발현을 위한 cDNA의 마이크로어레이(microarray)를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 이러한 스크리닝은 행해질 수 있다. 예를 들어 제조업자의 설명서에 따른 (및 본질적으로 Schena et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:10614-10619, 1996 및 Heller et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:2150-1997) Affymetrix, Inc.(Santa Clara, CA)의 마이크로어레이 기술을 이용해서 행해질 수 있다. 다른 방법으로는 폴리뉴클레오티드는 암세포 처럼, 본 명세서에 기재된 단백질을 발현하는 세포들로부터 만들어진 cDNA로부터 증폭될 수 있다.
많은 주형(template) 의존적인 과정들은 샘플에 존재하는 흥미있는 표적 서열을 증폭시킬 수 있다. 가장 잘 알려진 증폭 기술의 하나는 미국특허 번호 4,683, 195, 4,683,202 및 4,800,159에서 상세하게 기술되어 있으며 각각은 전문이 본 명세서에서 참조된, 중합요소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCRTM)이다. 간단히, PCRTM에서, 표적 서열의 반대되는 상보적인 가닥들에서의 부분들에 상보적인 두 프라이머 서열들이 만들어졌다. 과도한 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 DNA 폴리머라제(예:Taqpolamerase)와 함께 첨가하였다. 표적 서열이 샘플에 준자한다면, 프라이머들은 표적에 결합하고 폴리머라제는 프라이머들이 뉴클레오티드를 첨가함에 의해 표적 서열을 따라 연장되도록 할 것이다. 반응 혼합물의 온도를 높이거나 낮춤으로써, 연장된 프라이머들은 표적으로부터 분리되어 반응 생성물을 형성하고, 과량의 프라이머들은 표적 및 반응 생성물에 결합할 것이고 과정이 반복된다. 바람직하게는 역전사 및 PCRTM증폭 절차가 증폭된 mRNA 양을 정량하기 위해 수행될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 방법론은 해당 기술분야에서 잘 알려져 있다.
다수가 PCRTM증폭 기술의 변형인, 많은 다른 주형 의존적 과정의 일부는, 쉽게 알려지고 이용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 방법의 일부는, 예를 들어 유럽 특허 출원 공개 번호 320,308 및 미국특허 번호 4,884,750에서 기재된, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR이라 언급됨); PCT 국제출원 공개번호 PCT/US87/00880에 기재된 Qbeta 레플리카제 (replicase); 가닥 치환 증폭법(strand displacement amplification, SDA) 및 복구 연쇄 반응 (repair chain reaction)을 포함한다. 또한 다른 증폭법들도 영국 특허 출원 번호 2 202 328 및 PCT 국제 특허 출원 공개 번호 PCT/US89/01025 기재되어 있다. 다른 핵산 증폭 절차들은 핵산 서열 기초한 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA) 및 3SR을 포함하는, 전사-기초한 증폭 시스템(transcription-based amplification system, TAS)(PCT 국제 특허 출원 공개 번호 WO 88/10315)을 포함한다. 유럽 특허 출원 공개 번호 329,822는 환형으로 합성되는 단일-가닥 RNA ("ssRNA"), ssDNA, 및 이중 나선 DNA (dsDNA)와 관련된 핵산 증폭 과정을 기재하고 있다. PCT 국제 특허 출원 공개 번호 WO 89/06770은 이후에 서열의 많은 RNA 카피의 전사가 이루어지는 프로모터/프라이머 서열의 표적 단일-가닥 DNA ("ssDNA")에의 하이브리드형성 (hybridization)에 기초한 핵산 서열 증폭 체계(scheme)를 기재하고 있다. "RACE"(Frohman, 1990) 및 외방향 중합효소 연쇄 반응 ("one-sided PCR")(Ohara, 1989) 같은 다른 증폭 방법은 또한 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 증복된 부분은 잘 알려진 기술을 이용하여 적절한 라이브러리(예, 종양 cDNA 라이브러리)로부터 전장 유전자 (full length gene)를 단리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 기술내에서, (cDNA 또는 유전자의)라이브러리는 증폭에 적절한 1 이상의 폴리뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 이용하여 스크린된다. 바람직하게는, 라이브러리는 크기로 선택되어(size-selected) 더 큰 분자를 포함한다. 임의적으로 프라임드된 라이브러리들은 또한 5' 및 유전자의 상류(upstream) 부분을 동정하는 데 바람직하다. 유전자 라이브러리들은 인트론과 확장하는 5' 서열을 동정하는 데 바람직하다. 이와 달리, 또는 추가로, 본질적으로 어떤 증폭된 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 의하여 UCOE-기초한 벡터에 도달하기 위한 일상적인 서브클로닝 기술에 이용될 수 있다.
하이브리드형성 기술을 위해, 부분적인 서열은 잘 알려진 기술(예, 닉 전사(nick-translation) 또는32P로의 말단 표지화(end-labling))을 이용하여 표지화될 수 있다. 그 후 세균 또는 박테리오파지의 라이브러리는 표지화된 프로브(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조)와 함께 일반적으로 변성된 세균 콜로니 (또는 파지 용균반점(plaque))를 포함하는 하이브리드 필터에 의해 스크린된다. 하이브리드한 콜로니 또는 용균반점은 선택되고, 연장되며, DNA는추후 분석을 위해 단리된다. cDNA 클론은, 예를 들어 부분적인 서열로부터의 프라이머와 벡터로부터의 프라이머를 이용한 PCR에 의해, 추가적인 서열의 양을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 그 후 제한 지도(restriction map) 및 부분적인 서열이 1 이상의 중복되는 클론을 동정하기 위해 만들어질 수 있다. 이 후 완벽한 서열은 일련의 결실 클론 생성과 관련될 수 있는 표준 기술(standard technique)을 이용해서 결정될 수 있다. 결과적인 중복 서열들은 이 후 하나의 끊임없는 서열로 모아질 수 있다. 전장 cDNA 분자는 잘 알려진 기술을 이용해서, 적절한 단편들을 연결시킴으로써 만들어질 수 있다.
대신으로, 상기에서 언급된 것과 같은 증폭 기술이 부분적인 cDNA 서열로부터 전장 암호화 서열을 얻는데 유용할 수 있다. 그런 증폭 기술의 하나는 역 PCR (Triglia et al.,Nucl. Acids Res.16: 8186, 1998 참조)인데, 이는 유전자의 기지의 부위에서 단편을 만들기 위해 제한효소를 이용한다. 그 후 단편은 분자내 연결에 의해 고리화되고 알려진 부분으로부터 유도된 다양한 프라이머들과 PCR을 위한 주형으로 사용된다. 다른 시도에서는, 부분적인 서열에 인접한 서열들은 링커 서열 (linker sequence)에 대한 프라이머 및 알려진 부분에 특이적인 프라이머와의 증폭에 의해 회복(retrieve)할 수 있다. 증폭된 서열들은 전형적으로 동일한 링커 프라이머 및 알려진 부위에 특이적인 두번째 프라이머와의 두 번째 증폭을 하게 된다. 알려진 부분으로부터의 반대 방향에서 연장을 개시하는 두 프라이머를 사용하는, 본 절차의 변형은 WO 96/38591에 기재되어 있다. 그러한 기술의 다른 것은 "cDNA 말단의 신속한 증폭 (rapid amplification of cDNA ends)" 또는 RACE로 알려져 있다. 본 기술은 알려진 서열의 5' 및 3' 서열을 동정하기 위해, 폴리A 부분 또는 벡터 서열에 하이브리드하는, 내부 프라이머 및 외부 프라이머의 사용을 포함한다. 또 다른 기술은 캡쳐 PCR (Lagerstrom et al.,PCR Methods Applic.1:111-19, 1991) 및 워킹 PCR (Parker et al.,Nucl. Acids. Res19: 3055-60, 1991)을 포함한다. 증폭을 이용하는 다른 방법도 전장 cDNA 서열을 얻는데 이용될 수있다.
어떤 예에서, GenBank로부터 활용가능한 것과 같은, 발현된 서열 tag (expressed sequence tag, EST) 데이타 베이스에서 제공된 서열의 분석에 의해 전장 cDNA 서열을 얻을 수 있다. 중복 ESTs를 위한 연구는 일반적으로 잘 알려진 프로그램(예, NCBI BLAST 써치)을 이용해 수행되며, 그러한 ESTs는 인접한 전장 서열을 만드는 데 이용될 수 있다. 전장 DNA 서열은 유전자 단편의 분석에 의해서도 얻어질 수 있다.
발명의 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 단편은 UCOE-기초한 벡터들의 구성 또는 이용에 사용될 수 있으며, 1 이상의 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 기능적인 균등물 같은 흥미있는 폴리펩티드를 암호화 할 수 있다. 유전자 코드의 본질적인 퇴화(degeneracy)때문에, 실질적으로 동일하거나 기능적으로 균등한 아미노산을 암호화 하는 다른 DNA 서열이 만들어질 수 있고 이들 서열은 주어진 폴리펩티드를 클론하고 발현하는 데 이용될 수 있다.
당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 어떤 예에서는 비-자연적으로 발생한 코돈을 갖고 있는 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 폴리펩티드를 생산하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 특정한 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 선호되는 코돈들은단백질 발현률을 증가시키거나, 자연적으로 발생하는 서열로부터 유래된 전사체의 그것 보다 더 긴 반감기와 같이 바람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사체를 만들기 위해 선택될 수 있다.
게다가, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은, 유전자 산물의 클로닝, 프로세싱, 및/또는 발현을 변경하는 개조를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 이유에서 폴리펩티드 암호화 서열을 변경시키기 위해 해당 기술분야에서 일반적으로 알려진 방법을 이용하여 처리될 수 있다. 예를 들어, 임의의 분열에 의한 DNA 셔플링(shuffling) 및 유전자 단편들의 PCR 재집합(reassembly) 및 합성 올리고뉴클레오티드들이 뉴클레오티드를 처리하는 데 이용도리 수 있다. 이에 더하여, 위치-특이적인 변이유발 (side-directed mutagenesis)은 새로운 제한효소 자리 삽입, 글리코실화 양식(glycosylation patterns)의 변경, 코돈 선호도(preference) 변경, 삽입 변이체 생성 또는 돌연변이 도입 등에 사용될 수 있다.
새로 합성된 펩티드는 예를 들어 제조용 고성능 액체 크로마토그래피 (preparative high performance liquid chromatography)(예, Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.) 또는 해당 기술분야에서 사용할 수 있는 다른 그에 상당한 기술에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. 합성 펩티드의 구성물(composition)은 아미노산 분석 또는 서열결정(예, Edman 분해 방법)에 의해 확인될 수 있다. 추가적으로 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 그의 일부는 직접 합성하는 동안 변할 수도 있고/또는, 변이 폴리펩티드를 생산하기 위해, 다른 단백질 또는 그의 일부로부터의 서열과 화학적방법을 이용해 결합할 수도 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더 설명하기 위한 것이며 제한하지 않는다.
실시예 1
UCOE-기초한 발현 벡터 시스템에서 재조합 항체의 발현
본 실시예는 UCOEs 존재 또는 비존재시 벡터를 이용한 재조합 항체의 발현 수준간의 비교를 기재한다.
처리된 인간 항체 Ab3을 도 1에서 보는 바와 같이 인간 RNP UCOE를 포함하는벡터로부터 발현시켰다. 동일한 벡터를, 그러나, UCOE 요소 비존재하에서 만들었다. 본 실시예에서 Ig 중쇄 암호화 서열은 인간 Ig 감마-1 불변 영역을 암호화하는 유전자 DNA 단편을 골조로 하여 그 상류에 삽입된 처리된 인간 V-영역 서열을 포함한다. Ig 경쇄 암호화 서열은 인간 Ig 카파 불변 영역 암호화하는 cDNA 단편을 골격으로 하고 그 상류에 삽입된 처리된 인간 V-영역 서열을 포함한다. 추가적으로 Ig 중쇄의 발현을 위한 벡터는neo선택이능한 마커 유전자를 포함하며, Ig 경쇄의 발현을 위한 벡터는 히그로마이신(hygromycin) 선택이능한 마커를 포함한다. 도 2A 참조.
CHO-K1 세포를 경쇄 및 중쇄 벡터와 제조업자의 설명서에 따라 리포펙타민 (lipofectamine, Life Technologies)을 이용하여 코-트랜스펙션시켰다. 세포는 히그로마이신 및 G418을 이용해 선택하였다. 트랜스펙턴트(transfectant)의 풀을 유지하였고, 배양 배지로 분비된 모아진 면역글로불린 수준은 트랜스펙션 후 다양한 시간에서 ELISA에 의해 결정하였다(도 3). RNP UCOE의 부재하에 항체 발현 수준은 트랜스펙션 48시간 후에 낮았으며 (약 48ng/㎖), 그 이후 감소하였다. 대조적으로, RNP UCOE를 포함하는 발현 벡터로부터의 트랜스펙션 풀에서, 항체 수준은 트랜스펙션된 배양이 증가함에 따라 항체 수준도 축적이 지속되어 트랜스펙션 15일 후 3㎍/㎖에 이르렀다. 따라서, UCOEs의 사용은 높은 수준의 재조합 면역글로불린을 발현하는 트랜스펙션된 세포의 풀을 빠르게 형성하도록 하였다.
실시예 2
UCOE-기초한 발현 벡터 시스템과 트랜스펙션된 CHO 숙주 세포주에서 얻어진 높은수준, 대규모 발현
CHO-S 세포들을 처리된 인간 항체 Ab1을 만들기 위해 (도1에 나타낸) UCOE 항체 발현 카세트를 포함하는 벡터와 함께 코-트랜스펙션시켰다. Ig 중쇄 암호화 서열은 인간 Ig 감마-4 불변 영역을 암호화하는 유전자 DNA 단편을 골조로 하고 그 상류에 삽입된 처리된 인간 V-영역 서열을 포함한다. Ig 경쇄 암호화 서열은 인간 Ig 카파 불변 영역을 암호화하는 cDNA 단편을 골조로 하고 그 상류에 삽입된 처리된 인간 V-영역 서열을 포함한다. 추가적으로 Ig 중쇄의 발현을 위한 벡터는neo선택이능한 마커 유전자를 포함하며, Ig 경쇄의 발현을 위한 벡터는 히그로마이신(hygromycin) 선택이능한 마커를 포함한다. 도 2A 참조.
트랜스펙션은 제조업자의 설명서에 따라 리포펙타민(Life Technologies)을 이용해 수행되었다. 세포는 CD-CHO 배지 (Life Technologies)에서 히그로마이신 및 G418을 이용해 선택하였고 서브클론을 선택하였다. 이 과정은 약 5주 소요되었다. 한 서브클론을 100ℓ 생물반응기로 스케일하기 전에 최종 파라미터 최적화를 수행하기 위해 2ℓ 생물 반응기로 스케일하였다. 재조합 항체를 발현하는 트랜스펙턴트의 대부분으로부터의 생산률은 전형적으로 약 5pg/세포/일 이었다. 현택 배양에서 한 항체의 수율은 거의 200㎎/ℓ에 달했다. 도 4 참조. CHO-S 세포로 코-트랜스펙션된 두 발현 벡터에서의 UCOE의 포함으로, 정의된(defined) 배지에서 현탁에서 즉각적으로 배양될 수 있는 트랜스펙턴트 클론의 신속한 단리가 되었다.
실시예 3
CHO-K1 및 CHO-S 숙주 세포주에서 Gal-Gal 잔기의 낮은 수준
상기에 토의된 대로, 인간 치료에서 사용된 항체에서 Galα1→3Galβ1→4GlcNAc-R (Gal-Gal) 탄수화물 잔기의 존재는 혈청에서 신속한 단백 클리어런스와관련되었다. 결고로, 본 잔기 없는 재조합 단백을 생산하는 능력이 유리하였다. Borrebaeck et al.,Immunology To일14: 477-479 (1993) 및 Kagawa et al.,J. Biol. Chem.263: 17508-17515 (1988) 참조. FITC 표지된 IB2 렉틴(lectin)과 유세포분석법 (flow cytometry)의 이용은 Gal-Gal 잔기가 CHO-S 세포의 표면에 존재하지 않는 다는것을 입증하였다. 도 5; Cho et al.,J. Biol. Chem.272: 13622-13628 (1997) 및 Gorelik et al.,Cancer Res.55: 4185-4173 (1995) 참조. 이 점에 있어서, CHO-S는 다른 광범위하게 사용된 시험된? CHO 라인인, CHO-K1과 유사하다. 대조적으로, 본 실험에서 시험된 마우스 하이브리도마 세포주는 Gal-Gal 탄수화물 관련된 세포-표면의 높은 수준을 보였다. 세포주에서 생산된 정제된 재조합 단백질의 질량 분석은 Gal-Gal 잔기가 없슴을 증명한다 (자료 없슴).
실시예 4
중복-서브 유닛 재조합 단백질의 향상된 발현 수준을 위한 양방향성 UCOE 벡터
본 실시예는 양방향성 UCOE 벡터 시스템에서 재조합 항체 중쇄 및 경쇄 단백질의 향상된 발현을 개시했다.
pORT1의 두 SfiⅠ자리 (Cobra therapeutics)는 어닐된 올리고머 Mfe.F, 5'-(SEQ ID NO: 10) 및 Mfe.R,(SEQIN NO: 11)로 구성된 어댑터(adapter) 분자의 도입으로 MfeⅠ자리로 바꿨다. 그 후 HSV TK 폴리A 자리를 프라이머 TK.f,(SEQ ID NO: 12)와 TK.R(SEQ ID NO: 13)로 pVgRXR (Invitrogen)으로부터 증폭시키고, SalⅠ에서 XhoⅠ단편을 SalⅠ자리에 삽입하였다. 이 후에, 쥐의 PGK 폴리A 자리를 프라이머 mPGK.F,(SEQ ID NO: 14)와 mPGK.R ,(SEQ ID NO: 15)을 이용하여 수컷 BALB/c 유전자 DNA(Clontech)로 부터 증폭시키고, BamHⅠ에서 BglⅡ 단편을 BamHⅠ자리에 삽입하였다. neo 카세트를 포함하고 있는 pcDNA 3.1의 AseⅠ에서 SalⅠ단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, SPEⅠ링커 (; SEQ ID NO: 16)에 연결한 후 SpeⅠ단편을 SpeⅠ자리에 클론하여 pORTneoF를 만들고; 또는 퓨로마이신 저항 카세트를 갖고 있는 CET700의 EcoRⅠ에서 NotⅠ단편 (Cobra Therapeutics)을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, XbaⅠ링커에 연결한 후 XbaⅠ단편을 XbaⅠ자리에 클론하여 pORTpuroF를 만들었다. pCMVEGFPN-1 (Cobra)로 부터의 HindⅢ에서 BamHⅠ쥐의 CMV 프로모터 단편(Cobra)을 BKS+에서 하이브리드 UCOE의 HindⅢ에서 BamHⅠ자리(Cobra)로 서브클론하였다. 그 후 인간 CMV 프로모터를 프라이머 hCMVF,(SEQ ID NO: 17) 및 hCMVR,(SEQID NO: 18)를 이용하여 플라스미드 pIRESneo (Clontech)로부터 증폭시키고, XhoⅠ에서 SalⅠ단편을 SalⅠ자리로 클론하였다. 그 후 BamHⅠ에서 SalⅠ단편을 pORTneoF의 BamHⅠ에서 SalⅠ자리로 클론하여 pBDUneo100을 만들거나, pORTpuroF에 클론하여 pBDUpuro300을 만들었다. BKS+에서 하이브리드 UCOE에서 SalⅠ클로닝 자리의 상류의 두 ATG 코돈을 위치-특이적 변이 유발에 의해 바꾸고, BamHⅠ에서 SalⅠ단편을 pORTneoF의 BamHⅠ에서 SalⅠ자리에 클론하여 pBDUneo200을 만들거나, pORTpuroF에 클론하여 pBDUpuro400을 만들었다.
안간 항체 경쇄를 모든 4개의 양방향성 UCOE 벡터(pBDUneo100, pBDUneo200, pBDUneo300, 및 pBDUneo400; 도 6-9 및 SEQ ID NOs: 1-4, 각각)의 BamHⅠ또는 SalⅠ자리에 클론한 후, 남는 BamHⅠ또는 SalⅠ클로닝 자리에서 중쇄에 의해 pBDUneo112, pBDUneo121, pBDUneo212, pBDUneo221, pBDUpuro112, pBDUpuro121, pBDUpuro212, 및 pBDUpuro221을 만들었다.
2 이상의 재조합 단백질의 공동발현(co-expression)에 적절한 추가적인 양방향성 UCOE 벡터는 도 10-13(SEQ ID NOs:5-8)에 기재되어 있고, 각각 pBDUneo500, pBDUneo600, pBDUpuro700, pBDUpuro800으로 나타냈다. 이들 벡터는 예를 들어 항체 발현을 위한 하이브리드 UCOE 방향성(orientation)을 최적화하기 위해서 뿐만 아니라, 최적화를 위한 대신의 프로모터를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
플라스미드 pORTpuroF를 XbaⅠ(부분적) 및 NsⅡ으로 소화시켜 소의 성장 호르몬 폴리A 자리를 제거한 후, 프라이머 14506, 5'-(SEQ ID NO: 19) 및 5'-(SEQ ID NO: 20)으로 증폭된 SV40 초기(early) 폴리A 자리에 연결하고, XbaI 및 NsⅡ으로 소화하여 플라스미드 pORTpuroF2를 만들었다. 인간 RNP UCOE의 하류에 쥐의 CMV 프로모터를 포함하며 액틴 프로모터와 SalⅠ자리 사이에 두 변이된 ATG 코돈을 갖는 하이브리드 UCOE 벡터를 BamHⅠ과 HindⅢ으로 소화하여 쥐의 CMV 프로모터를 제거한 후, 프라이머 14425, 5'-(SEQ ID NO: 21) 및 14426,(SEQ ID NO: 22)로 증폭된 인간의 CMV 프로모터와 연결하고, BamHⅠ과 HindⅢ으로 소화하였다. 그 후 어닐된 올리고머 14466,(SEQ ID NO: 23) 및 14465, 5'-(SEQ ID NO: 24)로 구성된 어댑터(adapter)를 SalI 자리에 삽입하고 PmeⅠ 및 SalⅠ으로 소화하고, 프라이머 14435, 5'-(SEQ ID NO: 25) 및 14436,(SEQ ID NO: 26)으로 증폭시킨 쥐의 CMV 프로모터에 연결한 후, SalI으로 소화하였다. 그 후 쥐의 CMV 프로모터 존재 하 또는 부존재 하의 플라스미드를 BamHI 및 SalI으로 소화시키고, BamHI 및 SalI 소화된 pORTneoF에 연결하여 pBDUneo500 및 pBDUneo600을 만들거나; BamHI 및 SalI 소화된 플라시미드 pORTpuroF2에 연결하여 플라스미드pBDUpuro700 및 pBDUpuro800을 각각 만들었다.
항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 G418 또는 퓨로마이신-저항 양방향성 UCOE 벡터를 리포펙타민 또는 DMRIE-C (Invitrogen)를 이용해 CHO-K1 및 CHO-S 세포에 제조업자의 설명서에 따라 각각 트랜스펙션하고, 500㎍/㎖ G418 (neo 벡터) 또는 12.5 ㎍/㎖ 퓨로마이신 (puro 벡터)로 선택하였다. 풀을 선택하고 항체 생성율을 CHO 세포에서 항체 발현을 위한 적절한 프로모터와 선택이능한 마커 조합을 결정하기 위해 다른 구조물 사이에 비교하였다.
CHO-S 현탁 세포에서 발션 연구의 결과를 표 2에 나타내었다. 이들 자료는 쥐의 CMV 프로모터로부터 발현된 경쇄를 포함하는 벡터가 최상의 항체 발현을 보인다는 것을 입증했다. 퓨로마이신 또는 G418-저항성 마커를 포함하는 벡터를 사용하였다. 추가적으로, 두 양방향 벡터, 퓨로마이신-저항성 마커를 포함하는 하나와 G418-저항성 마커를 포함하는 하나를 코-트랜스펙션하였다. 풀을 선택하고 항체 생성율을 결정하였다. 각각 G418 또는 퓨로마이신-저항 트랜스펙턴트 풀은 유사한 생성율을 보였으나, 코-트랜스펙션된 풀의 생성율은 현저하게 높았다. 이는 다른 선택이능한 마커들을 유지하는, 항체 발현 벡터의 두 카피를 가짐으로써 생성율을 증가시키는 것이 가능할 수 있다는 것을 제시한다. 높은 수준의 퓨로마이신 (25-50㎍/㎖ 대 12.5㎍/㎖)을 가진 풀을 선택하는 것은 증가된 생성과 관련이 없었다.
클로날계(clonal line)을 pBDUpuro421을 갖는 퓨로마이신-저항성 풀로부터 단리하였다. 22 클로날 세포주 중 15가 측정가능한 항체량을 발현하였다. 처기 생성률 결정은 세포주가 16pg/세포/일까지 항체 분비율을 갖는다는 것을 알려주었다(표 3). 써던 블롯 분석은 13pg/세포/일의 생성률을 갖는 적어도 한 클론을 동정하였고, 거의 벡터 DNA 단독 카피(클론 S421.7)를 가졌다. 이 풀로부터의 클론은 3-18pg/세포/일의 생성율로 단리되었다. 약 5pg/세포/일을 발현하는 클론을 초기 발효 실험에 이용하였다.
양방향성 UCOE 벡터로부터 hAb1(IgG4)의 발현
벡터 H3 프로모터 K1 프로모터 생성률(pg/세포/일)
pBDUneo112pBDUneo121pBDUneo212pBDUneo221pBDUpuro312pBDUpuro321pBDUpuro412pBDUpuro421코-트랜스펙션**pBDUneo221pBDUpuro421pBDUneo221+pBDUpuro421 뮤린 CMV인간 CMV뮤린 CMV인간 베타-액틴뮤린 CMV인간 CMV뮤린 CMV인간 베타-액틴인간 CMV인간 베타-액틴인간 베타-액틴인간 베타-액틴 인간 CMV뮤린 CMV인간 베타-액틴뮤린 CMV인간 CMV뮤린 CMV인간 베타-액틴뮤린 CMV인간 CMV뮤린 CMV뮤린 CMV뮤린 CMV 0.31.50.061.30.51.40.052.30.71.315
**코-트랜스펙션은 4kb UCOE CMV 벡터(히그로마이신과 네오마이신 선택)로부터 각각 유도된 동일한 항체 유전자를 사용하여 미리 실시되었다.
pBDUpuro421로 트랜스펙션된 클로날 CHO-S 세포주에서의 hAb1의 발현
퓨로마이신R세포주 생성률(pg/세포/일)
S421.2S421.3S421.4S421.7S421.8S421.9S421.12S421.14S421.15S421.16S421.17S421.18S421.20S421.21S421.22 5.40.50.513.45.40.041.46.70.37.250.81.20.316
실시예 5
RNP UCOE 결실 분석
본 실시예는 재조합 단백질의 개선된 발현에 대한 RNP UCOE 플라즈미드 벡터내의 폴리뉴클레오티드 결실을 기재한다. 간단히 말하면, 8kb RNP UCOE 내의 일련의 결실이 UCOE 기능에 영향을 미침 없이 제거될 수 있는 중요한 기능적 요소들 및 영역을 동정하기 위해 제조되었다.
녹색 형광 단백질 유전자(GFP)를 플라즈미드 CET720(Cobra Therapeutics)로 암호화하였고, 결실은 순차적으로 UCOE 영역으로 도입하였다(도 14). 이들 결실의 첫번째 세트를 CHO-S 세포로 트랜스펙션시키고, GFP를 발현하는 능력에 대해 시험하였다. 단기분석(트랜스펙션 후 2일)에서, 모든 플라즈미드는 형광분석으로 분석한 바에 따르면 GFP를 발현할 수 있었다. 그리고 나서, 다른 구성물을 전달하는 안정한 풀(pool)이 선택되었고 GFP 발현을 FACS로 측정하였다. 트랜스펙션 한달 후, 모든 결실이 UCOE를 함유하지 않는 대조 플라즈미드보다 더 많은 백분률의 양성세포와, UCOE를 함유하지 않는 대조 벡터보다 양성 군집에 대해 더 높은 형광을 나타내었다(표 4).
이들 데이타는 완전 활성에 요구되는 인간 RNP UCOE의 더욱 정확한 영역을 정의하며 완전 활성을 갖는 더 짧은(약 7kb) UCOE 요소를 동정한다. 이들 새로운 7kb UCOE 요소는 결실 ΔRV에 의해 정의되며 도 14의 뉴클레오티드 2225-9254로부터 연장되었다.
8kb RNP UCOE내 결실을 함유하는 플라즈미드로부터 GFP 발현
플라즈미드 선택영역 양성 백분률 양성군집의 평균형광
CET720GFP(8kb UCOE)CET700GFP(UCOE없음)ΔBS(4kb UCOE)ΔEcoNIΔEX2ΔEMΔMXΔMluIΔRV 없음nt. 2225-10525nt. 2225-6341nt. 3875-6916nt. 6916-7053nt. 6916-7209nt. 7053-7209nt. 7209-8293nt. 9254-10342 681061655366665872 516136370439384423464448548
벡터 CET720GFP(SEQ ID NO:9, 8kb 인간 RNP UCOE 함유)를 EcoRV, MluI, EcoNI, BamHI plus SalI로 소화하고, 말단은 T4 DNA 폴리머라제로 무디게하고 재결찰하여 각각, 벡터 deltaRV, delta MluI, delta EcoNI 및 deltaBS를 생산하였다. CET720은 PflMI로 소화시키고 T4 DNA 폴리머라제로 무디게 하고 BamHI로 절단하였다. BamHI에 대한 블런트를 pBluecsript Ⅱ SK(+)의 EcoRV에서 BamHI의 부위로 암호화하여 pPB720을 얻었다. pPB720을 EcoNI와 MluI, MluI와 XhoI(일부), 또는 EcoNI와 XhoI(일부)로 소화시키고, 말단은 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고 재순환시켰다. 각각의 생성 벡터로부터 PshAI 단편을 CET720 GFP의 PshAI 부위로 암호화하여 각각, delta EM, delta X 및 delta MX 벡터들을 얻었다.
실시예 6
RNP UCOE의 추가 결실 분석
상기 실시예들을 결실분석으로 동정하였다. 벡터 CET720GFP(SEQ ID NO:9) 뉴클레오티드 2225-6916 및 9254-10342 UCOE 영역은 UCOE 활성의 손실없이 제거될 수 있다(실시예 5 참조). 이 실시예에서, 8kb RUP UCOE의 활성에 중요한 최소 영역을 더욱 확인하였다. 중요하기는, 이 분석은 완전 활성을 유지하는 인간 RNP UCOE의 4.1kb 영역을 더욱 정확히 정의한다.
간단히 말하자면, 8kb RNP UCOE의 단편을 무디게하고, HindⅢ 링커로 결찰하고, HindⅢ로 소화시키고 소화된 HindⅢ와 송아지-내장 알칼리성 포스파타제-처리된 벡터 CET700GFP에 결찰하였다. 벡터들을 DMRIE-C(인비트로겐)을 이용하여 CHO-S 세포에 트랜스펙션하였고, 여기서 모든 구성물들은 단기분석에서 GFP를 발현할 수 있었다(자료는 도시하지 않음). 퓨로마이신 선택 2주 후, 양성 군집의 입체 평균 형광을 FACS로 결정하고, 대조 백분률로 발현시키고, 그 결과를 아래 표 5에 나타내었다. CET720GFP의 뉴클레오티드 잔기 5152-9254에 해당하는 FP720RNP UCOE의 4.1.kb MfeI 에서 EcoRV 단편을 함유하는 벡터700FRV는 CET720 GFP의 뉴클레오티드 잔기 2225-10525의 8kb UCOE 영역과 비교하여 완전한 UCOE 활성을 유지한다. 그러므로, 이 4.1kb UCOE 단편은 완전 8kb UCOE 요소의 경우와 비교할 수 있는 수준으로 활성을 유지하는 새로운 최소 UCOE 요소를 나타낸다.
플라즈미드 UCOE 영역 존재 대조 백분률
CET720GFP(8kb UCOE) 뉴클레오티드 2225-10525 100
CET700GFP(UCOE 없음) 없음 10
delta RV 뉴클레오티드 2225-9254뉴클레오티드 10342-10525 99
700HRV.R 뉴클레오티드 2240-9254 121
700FRV.R 뉴클레오티드 5152-9254 122
700BRV.R 뉴클레오티드 6341-9254 73
또한, 700HRV.R, 700FRV.R 및 700BRV.R 내에 함유하는 세개의 UCOE 단편에 대해 활성을 결정하고, UCOE 단편들로 반대 배향으로 삽입하여 각각 플라즈미드 700HRV.F, 700 FRV.F 및 700BRV.F를 얻었다. 다시, 모든 플라즈미드는 단기분석에서 GFP를 발현할 수 있었다. 퓨로마이신 선택 3주 후, 양성 군집의 입체 평균 형광을 FACS로 결정하고, 대조(CET720GFP)의 백분률로 표시하고 그 결과를 아래의 표 6에 나타내었다.
플라즈미드 UCOE 영역 존재 대조백분률
CET720GFP(8kb UCOE) 뉴클레오티드 2225-10525 100
CET700GFP(UCOE 없음) 없음 6
700HRV.R 뉴클레오티드 2240-9254 59
700FRV.R 뉴클레오티드 5152-9254 43
700BRV.R 뉴클레오티드 6341-9254 30
실시예 7
추가 예시 양방향 UCOE 벡터의 제조
상기 실시예들은 많은 예시 UCOE 벡터들의 제조 및 평가를 기재하고 있다. 이 실시예에서, 추가의 UCOE 벡터들을 구성하였다. 예를 들면, 벡터 pBDUpuro350(SEQ.ID.NO:28)과 pBDUpuro450(SEQ ID NO:28)를 제조하여 상기 벡터 pBDUpuro300 및 pBDUpuro400과 동등하도록 하였고, 다만 퓨로마이신 내성 유전자 이후의 polyA 부위를 SV40 polyA 부위로 대체하였다(도 15 및 16 참조). 여러 추가벡터들은 완전 UCOE 활성을 유지하기 위해 결실 분석에 의해 동정된 4.1kb MfeI-EcoRV 단편으로 8kb RNP UCOE 요소를 대체할 것이다. pBDU 퓨로 벡터 시리즈의 퓨로마이신 내성 카세트의 polyA 부위를 변경시키기 위해, SV40 polyA 부위를 pBSneo.23으로부터 폴리머라제 변경 반응에 의해 증폭시켰고 반응 생성물은 NsⅡ와 XbaI로 소화시키고 pORTpuroF의 NsⅡ에서 XbaⅠ부위로 삽입하여 BGH polyA 부위를 대체하였다. 이 새로운 벡터, pORTpuroF'는 순차적으로 BamHI 및 SalI로 소화되었고, HUCMV(뮤린 CMV 프로모터에 의한 혼성 UCOE)의 BamHI에서 SalI 부위로 암호화되어, 플라즈미드 pBDUpuro350(SEQ ID NO:27; 도 15 참조)를 생성하거나 또는 pUCOEact3(액틴 프로모터 중에 ATG 코돈의 부위 결정 돌연변이 유발에 의한 혼성 UCOE)의 BamHI 부위로 암호화되어 pBDUpuro450(SEQ ID NO:28; 도 16 참조)을 생성한다. 추가의 UCOE 벡터를 인간 베타-액틴과 플라즈미드 pUCOEact3 및 pUCOEact3hCMV 내의 RNP UCOE 단편 사이의 경계에서 KpnI 부위의 장소에서 HindⅢ 부위를 삽입하여 제조하였다. RNP UCOE를 전달하는 4kb HindⅢ 단편을 제거하고 700FRV.R.로부터 4.1kb RNP UCOE 단편으로 대체하였다. SalⅠ에서 BamHⅠ(일부) 단편을 pORTneoF 및 pORTpuroF'의 SalⅠ에서 BamHⅠ부위로 암호화하여, pBDUpuro1200(SEQ ID NO:29; 도17 참조), pBDUpuro1450(SEQ ID NO:30, 도 18 참조), pBDUneo1600(SEQ ID NO:31; 도 19참조) 및 pBDUpuro1800(SQE ID NO:32, 도 20 참조)를 생성하였다.
실시예 8
양방향성 UCOE 활성을 위한 벡터 특징의 평가
1. CHO-S 세포에서 항체 생성률에 대한 양방향 UCOE 벡터 카피수의 효과
CHO-S 세포주 S421.7는 hAb1(IgG4) 벡터 pBDUpuro421의 단일 카피를 함유하는 것으로 나타났다. 추가의 벡터 카피들이 항체 발현 수준을 증가시킬 수 있는지를 결정하기 위해, S421.7을 hAb1도 발현하는 벡터 pBDUneo221로 트랜스펙션하였다. 클로날 세포주를 분리하고 생성률을 분석하였다(도 21).
많은 세포주는 부모계 S421.7 보다 더 높은 생성률을 갖는 것으로 나타났고, 이것은 추가 벡터 카피가 생성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 초기 카피수 분석은 세포주 S7.16, S7.20 및 S7.23이 벡터 pBDUneo221의 1-2 카피를 함유하는 것을 나타내었다(도시하지 않음).
2. CHO-S세포에서 항체 생성에 대한 혼성 UCOE 방향과 프로모터 선택의 효과
hAb1을 발현하는 다양한 양방향 UCOE 벡터를 전달하는 CHO-S 세포의 안정한 풀을 분석하여 항체 유전자에 대한 혼성 UCOE의 배향의 효과, 및 항체 발현 속도에 대한 다른 프로모터의 효과를 평가하였다. CHO-S 세포를 hAb1(IgG4)를 발현하는 양방향성 UCOE 벡터 시리즈로 트랜스펙션하였고, 안정한 풀은 퓨로마이신 12.5 ㎍/㎖또는 G418 500 ㎍/㎖로 선택하였다. 혼성 UCOE 요소(액틴 말단 대 RNP 말단)과 사용한 프로모터에 대한 중쇄(H)과 경쇄(L) 위치는 아래 표 7에 나타내었다. 항체 생성률을 ELISA로 측정하였고, 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 상층액(supe) 대 세포 여액 (lysate) 중의 경쇄와 중쇄의 분포를 측정하였다. 혼성 UCOE의 배향은 항체 발현 수준에 오직 미세한 영향만을 나타냈으나, 프로모터 혼합물의 선택은 생성률에 어느정도 차이를 가져왔다. 가장 높은 생성률은 인간 베타-액틴 프로모터로부터중쇄, 및 뮤린 CMV 또는 인간 CMV 프로모터로부터의 경쇄(예를 들면, pBDUpuro454 및 pBDUpuro804)을 발현하는 예시 벡터를 사용한 실시예들에서 얻어졌다.
벡터 액틴말단 RNP말단 중쇄(supe) 중쇄(lysate) 카파쇄(supe) 카파쇄(lysate) 생성률(pg/세포/일)
pBDUpuro352pBDUpuro354pBDUpuro452pBDUpuro454pBDUpuro702pBDUpuro704pBDUpuro802pBDUpuro804 hCMV-KhCMV-H액틴-K액틴-HhCMV-KhCMV-H액틴-K액틴-H mCMV-HmCMV-KmCMV-HmCMV-KmCMV-HmCMV-KmCMV-HmCMV-K +++/-+++++++/-+++ ++++++++++++++++ +++++/-++++++++/-+++ -+-++++/--++ 0.1590.2560.00560.6570.3910.1700.0200.608
3. CHO-S 세포에서 전사 대 생성률
클로날 세포주를 pBDUpuro452, pBDUpuro454 및 pBDUpuro804를 전달하는 퓨로마이신 내성 풀로부터 분리하였다. pBDUpuro454 및 pBDUpuro804를 전달하는 세포주의 약 2/3이 1 내지 10 pg/세포/일의, 벡터 pBDUpuro421에서 얻을 수 있는 기존 결과(데이타는 나타내지 않음)와 유사한, 측정가능한 항체생성률을 가졌다. 게놈성 DNA 샘플에 대한 TaMan 분석은 세포주 S452.3, S454.5 및 S804.4가 각각, 양방향성 UCOE 벡터 pBDUpuro452, pBDUpuro454 및 pBDUpuro804의 단일 카피를 전달한다는 것을 제안한다. 앞에서 서든 분석으로 pBDUpuro421(인간 액틴 프로모터로부터 발현된 중쇄, 및 뮤린 CMV 프로모터로부터의 경쇄을 갖는 pBDUpuro400) 단일 카피를 갖는다고 나타난, 세포주 D421.7은 대조로서 포함되었다. 생성률과 항체 사슬의 전사와의 상관관계를 연구하기 위해, TaqMan RT-PCR 분석을 이들 세포주에 대해 실시하였도, 그 결과는 아래의 표 8에 요약하였다. 세포주 S452.3 의 중쇄 및 경쇄 RNA 수준은, 항체를 잘 발현하는 것으로 나타난, 대조계 D6 및 S421.7에서 관찰된 것과 비교하여 상당히 낮았다. 그러나, 세포주 S454.5 및 S804.4는 양성 대조계와 유사한 생성 수준 뿐만 아니라 RNA 수준을 가졌다. 웨스턴 블롯 분석과 함께(자료는 나타내지 않음), 이들 결과는 이들 세포주에서 관찰된 항체 중쇄와 경쇄의 RNA 수준은 관찰된 생성률과 관계됨을 나타낸다.
세포주 생성률(pg/세포/일) 경쇄(Ct) 중쇄(Ht)
CHO-S 0 40 40
D6 5.5 20.39 22.86
S421.7 4.57 21.91 23.90
S454.5 3.52 22.12 23.96
S804.4 3.62 22.40 24.11
S452.3 0.07 29.62 26.47
Ct, 순환회수 역; CHO-S, 모세포주; D6, hAb1의 경우 경쇄와 hCMV 프로모터로부터 발현된 중쇄의 4-8 카피를 발현하는 벡터의 두 종류를 전달하는 클로날 세포주; S421.7, pBDUpuro421의 단일 카피를 전달하는 클로날 세포주; S454.5, pBDUpuro454의 단일 카피를 전달하는 클로날 세포주; S804.4, pBDUpuro804의 단일 카피를 전달하는 클로날 세포주; S452.3, pBDUpuro452의 단일 카피를 전달하는 클로날 세포주.
본 명세서 및/또는 출원 데이타에 언급된 미국특허, 미국특허출원공보, 미국특허출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허공보는 본 명세서에 참조로서 기재되었다. 비록 본 발명의 특정 구현예가 설명을 목적으로 기재되었으나 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남 없이 여러가지 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 것을 제외하고는 한정되지 않는다.

Claims (48)

  1. 고수준, 대규모 단백질 및/또는 폴리펩티드 발현을 얻기 위한 조성물로서, 상기 조성물은
    (a)배양물에서 연속 성장이 가능한 불멸화된 숙주 세포주, 여기서 상기 숙주 세포주는 무-혈청 현탁배양에서 성장할 수 있고;
    (b)재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 과발현을 유지하기 위한 벡터를 포함하고,
    여기서 상기 숙주 세포주는 상기 벡터로 트랜스펙션되어 있는 것인 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 불멸화된 숙주 세포주가 16시간 이하의 배가시간(doubling time)을 갖는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 배가시간이 12시간 이하인 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 트랜스펙션 효율이 70%이상인 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 트랜스펙션 효율이 75%이상인 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 트랜스펙션 효율이 85%이상인 조성물.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 트랜스펙션 효율이 95%이상인 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포주가 히그로마이신, G418 및 퓨로마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택제에 민감한 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포주가 상기 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 gal-gal 글리코실화가 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포주는 CHO-S, 293-F, 293-H, COS-7L, D.Mel-2, Sf21 및 Sf9로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 추가로, (a) 불멸화 숙주 세포주에서 고수준, 대규모 발현을 용이하게 하는 하나 이상의 요소를 함유하는 것, 및 (b) 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 억제에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성을 갖는 것인 조성물.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 추가로 하나 이상의 만능 크로마틴 개방요소 (UCOEs)를 포함하는 것인 조성물.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 배양물 리터 당 50㎎이상의 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현수준을 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 조성물이 배양물 리터 당 100㎎이상의 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현수준을 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 조성물이 배양물 리터 당 200㎎이상의 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현수준을 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 100리터 규모로 대형화될 수 있고, 여기서 상기 조성물은 1g이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 산출할 수 있는 것인 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 조성물이 10g이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 산출할 수 있는 것인 조성물.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 조성물이 20g이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 산출할 수 있는 것인 조성물.
  19. 단백질 및/또는 폴리펩티드를 고수준, 대규모로 제조하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    (a) 현탁액 중에서 성장할 수 있는 불멸화 숙주 세포주를 얻는 단계;
    (b) 상기 불멸화 숙주 세포주를 무혈청 배지에서의 성장에 적응시키는 단계;
    (c)상기 무혈청 배지에 적응된 불멸화 세포주를, 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 고수준 발현에 알맞는 벡터로 트랜스펙션하는 단계로 이루어지는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 불멸화 숙주 세포주는 16시간이하의 배가시간을 갖는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 불멸화 숙주 세포주는 12시간이하의 배가시간을 갖는 방법.
  22. 제 19항에 있어서, 트랜스펙션 효율이 70%이상인 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 트랜스펙션 효율이 75%이상인 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 트랜스펙션 효율이 85%이상인 방법.
  25. 제 22항에 있어서, 트랜스펙션 효율이 95% 이상인 방법.
  26. 제 19항에 있어서, 상기 숙주 세포주가 히그로마이신, G418 및 퓨로마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택제에 민감한 방법.
  27. 제 19항에 있어서, 상기 숙주 세포주가 상기 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 gal-gal 글리코실화가 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 19항에 있어서, 상기 숙주 세포주는 CHO-S, 293-F, 293-H, COS-7L, D.Mel-2, Sf21 및 Sf9로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제 19항에 있어서, 상기 벡터는 추가로, (a) 불멸화 숙주 세포주에서 고수준, 대규모 발현을 용이하게 하는 하나 이상의 요소를 함유하는 것, 및 (b) 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 억제에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성을 갖는 것인 방법.
  30. 제 19항에 있어서, 상기 벡터는 추가로 하나 이상의 만능 크로마틴 개방요소(UCOEs)를 포함하는 것인 방법.
  31. 제 19항에 있어서, 상기 방법이 배양물 리터 당 50㎎이상의 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현수준을 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 방법이 배양물 리터 당 100㎎이상의 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현수준을 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 방법이 배양물 리터 당 200㎎이상의 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 발현수준을 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 19항에 있어서, 상기 방법은 100리터 규모로 대형화될 수 있고, 여기서 상기 방법은 1g이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 산출할 수 있는 것인 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 방법은 10g이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 산출할 수 있는 것인 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 상기 방법은 20g이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 산출할 수 있는 것인 방법.
  37. 다중 서브유니트 단백질 및/또는 폴리펩티드의 고수준, 대규모 발현을 위한 양방향성 벡터로, 상기 벡터는
    (a)하나 이상의 UCOE 요소;
    (b)제 1 전사 프로모터; 및
    (c)제 2 전사 프로모터로 이루어지며;
    여기서 상기 UCOE 요소는 상기 제 1 및 제 2 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 상기 제 1 전사 프로모터는 상기 제 2 전사 프로모터에 대해 반대 방향으로 배향되어 있는 것인 양방향성 벡터.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 UCOE 요소는 RNP UCOE인 양방향성 벡터.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 제 1 전사 프로모터가 인간 CMV 프로모터, 뮤린 CMV 프로모터 및 인간 베타-액틴 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 양방향성 벡터.
  40. 고수준, 대규모 단백질 및/또는 폴리펩티드 발현을 얻기 위한 조성물로, 상기 조성물은
    (a) 배양물에서 연속 성장이 가능한 불멸화된 숙주 세포주, 여기서 상기 숙주 세포주는 무-혈청 현탁배양에서 성장할 수 있고, 그리고
    (b) 제 37항의 양방향성 벡터로 이루어지며,
    여기서 상기 숙주 세포주는 상기 벡터로 트랜스펙션되어 있는 조성물.
  41. 고수준, 대규모 단백질 및/또는 폴리펩티드 발현을 얻기 위한 방법으로, 상기 방법은
    (a) 연속 성장이 가능한 숙주 세포주를 얻는 단계;
    (b) 상기 숙주 세포주를 무혈청 배지에서의 성장에 적응시켜 무혈청 배지에서 연속 성장할 수 있는 세포주를 생성하는 단계;
    (c)무혈청 배지에서 연속 성장할 수 있는 상기 세포주를 제 37항의 벡터로 트랜스펙션시키는 단계로 이루어지는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 연속 성장할 수 있는 숙주 세포주는 또한 현탁액 중에서 성장할 수 있는 것인 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 현탁액 중 연속 성장할 수 있는 상기 숙주 세포주는 CHO-S 세포주인 방법.
  44. 다중 서브유니트 단백질 및/또는 폴리펩티드의 고수준, 대규모 발현을 위한 벡터로, 상기 벡터는
    (a)하나 이상의 UCOE 요소; 및
    (b)전사 프로모터로 이루어지며;
    상기 벡터는 표 4 및 도 14에 표시한 바와 같이 ΔBS, ΔEcoNI, ΔEM, ΔMluI 및 ΔRV로 이루어진 군으로부터 선택된 RNP UCOE의 영역 내에 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 것인 벡터.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 결실이 표 4 및 도 14에서 ΔAB로 표시된 RNP UCOE의 영역 내인 벡터.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 결실이 100bp이상인 벡터.
  47. 제 44항에 있어서, 상기 결실이 1,000bp이상인 벡터.
  48. 제 44항에 있어서, 상기 결실이 4,000bp이상인 벡터.
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