KR20210120013A - 핵산 전달 복합체 - Google Patents

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KR20210120013A
KR20210120013A KR1020217025988A KR20217025988A KR20210120013A KR 20210120013 A KR20210120013 A KR 20210120013A KR 1020217025988 A KR1020217025988 A KR 1020217025988A KR 20217025988 A KR20217025988 A KR 20217025988A KR 20210120013 A KR20210120013 A KR 20210120013A
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pmo
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타카시 오카다
히로미 킨오
요시츠구 아오키
신이치 타케다
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고쿠리쯔겡뀨가이하쯔호징 고꾸리쯔 세이신ㆍ신께이 이료겡뀨센따
각꼬호우징 닛뽄 이까다이가꾸
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Abstract

핵산을 포함하는 나노입자와, 비피막 바이러스의 중공입자를 포함하는 복합체, 당해 복합체의 제조방법, 및 당해 복합체를 포함하는 의약 조성물이 제공된다.

Description

핵산 전달 복합체
본 발명은 핵산을 전달하기 위한 복합체 및 그 제조방법, 및 당해 복합체를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
안티센스 핵산이 1970년대 후반에 보고되고 나서, 핵산 분자를 약제로서 응용하는 것을 목표로 하는 많은 연구 및 개발이 이루어져 왔다. 특히, 2000년대 초반에는 포유류 세포에서 RNA 간섭을 유도하는 small interfering RNA(siRNA)가 보고되고, 핵산 의약품의 개발에 박차를 가하고 있다. 최근에는 micro RNA(miRNA)이나 long non-coding RNA(lncRNA) 등 비번역성 RNA의 생물학적 기능 및 그 중요성이 밝혀지고, 핵산 의약품의 새로운 표적으로서, 또 miRNA에 대해서는 그것 자체도 핵산 의약품으로서 주목을 받고 있다.
예를 들면, 뒤센형 근디스트로피(DMD)는 대부분의 경우 디스트로핀 유전자의 결실 돌연변이를 의한 프레임시프트가 원인이 되고, 진행성의 근력 저하ㆍ근육 위축을 나타내는 치명적인 유전성 질환이다. 현재, DMD 모델 동물을 대상으로 프레임시프트 돌연변이에 의한 아미노산 리딩 프레임의 이동을, 안티센스ㆍ모르폴리노 핵산을 사용한 엑손 스킵핑에 의해 수정하는 기술의 개발이 진행되고 있다(비특허문헌 1).
지금까지, 핵산 의약품은 생체 내에서의 분해의 문제가 지적되어 왔지만, 변형 핵산 기술이나 약제 전달계(DDS) 기술의 현저한 발전에 따라서 안정되고 유효성이 높은 후보품이 차례차례로 개발되고 있다. 예를 들면, 비바이러스성의 아데노 관련 바이러스(AAV)의 중공입자의 내부에 핵산을 도입하는 DDS는 안전성이 높고 장기 지향성이 있는 기술로서 확립되고 있다(특허문헌1).
또, 핵산 의약품의 표적 장기에 대한 치료효과를 높이고, 안전성과 코스트를 개선하기 위해서, 높은 세포막 투과성을 가지는 펩타이드 부가 모르폴리노의 개발도 진행되고 있다(비특허문헌 2). 그렇지만, 더욱 안전성이 높고, 장기/조직 특이성을 가지고, 높은 치료효과를 겸비하는 획기적인 DDS를 확립하는 것이 소망되고 있다.
국제공개 제2012/144446호 팸플릿
Komaki H. et al., Sciencet ranslational medicine, vol.10, Issue 437, eaan0713, 2018 Ezzat K, et al., NANO LETTERS, vol.15, pp4364, 2015
본 발명은 안전성이 높고, 장기/조직 특이성을 가지고, 높은 치료효과를 겸비하는 DDS를 확립하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 예의 연구를 거듭한 결과, 핵산 의약품의 담체로서 비피막 바이러스의 조제 시에 발생하는 중공입자를 활용하고, 핵산 의약을 포함하는 나노입자와 중공입자가 정전기적으로 결합한 복합체를 조제하는 것에 성공했다. 이 복합체는 안전성, 장기/조직 특이성을 가지고, 높은 치료효과를 겸비하는 DDS인 것을 확인했다. 본 발명은 이것들의 지견과 결과에 의거하는 것으로, 이하를 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 핵산을 포함하는 나노입자와, 비피막 바이러스의 중공입자를 포함하는 복합체.
[2] 상기 [1]에서, 핵산이 포스포로디아미데이트화 모르폴리노 올리고머(PMO), 펩타이드 부가 PMO(P-PMO), 트리사이클로DNA(tcDNA) 및 2’O메틸올리고머(2’OMe)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵산 유도체인 복합체.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에서, 핵산 유도체가 서열번호 1또는 서열번호 2에 기재된 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 P-PMO인 복합체.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에서, 가장 긴 부분이 50∼1000nm인 복합체.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 중공입자가 아데노 관련 바이러스의 중공입자인 복합체.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 핵산이 디스트로핀 유전자의 안티센스 핵산인 복합체.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에서, 나노입자가 핵산이 집합해서 형성되어 있는 복합체,
[8] 이하의 공정을 포함하는 핵산을 포함하는 나노입자와 캡시드 바이러스를 포함하는 복합체의 제조방법;
(i) 핵산을 포함하는 나노입자를 제조하는 공정,
(ii) 비피막 바이러스의 중공입자를 제조하는 공정, 및
(iii) (i)의 나노입자와 (ii)의 비피막 바이러스의 중공입자를 혼합하는 공정.
[9] 상기 [8]에서, (iii)의 공정에서, 핵산과 중공입자를, 중공입자 1에 대하여 핵산이 150∼1500의 몰비로 혼합하는 제조방법.
[10] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 복합체를 포함하는 의약 조성물.
[11] 상기 [10]에서, 뒤센형 근디스트로피(DMD) 치료용인 의약 조성물.
[12] 상기 [10] 또는 [11]에서, 경정맥 전신 투여용인 의약 조성물.
[13] 상기 [10] 또는 [11]에서, 전신 투여용인 의약 조성물.
[14] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 복합체를 대상으로 투여하는 것을 포함하는 질환의 예방 또는 치료방법.
[15] 상기 [13]에서, 뒤센형 근디스트로피(DMD)를 치료하기 위한 방법.
[16] 상기 [14] 또는 [15]에서, 복합체가 대상으로 전신 투여되는 방법.
[17] 상기 [16]에서, 복합체가 대상에게 경정맥 전신 투여되는 방법.
[18] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나 1항에 기재된 복합체의 DDS로서의 사용.
[19] 상기 [18]에서, DDS가 전신 투여용인 사용.
[20] 상기 [19]에서, DDS가 경정맥 전신 투여용인 사용.
[21] 핵산 의약의 담체로서의 비피막 바이러스의 중공입자 사용.
[22] 상기 [21]에서, 핵산 의약이 포스포로디아미데이트화 모르폴리노올리고머(PMO), 펩타이드 부가 PMO(P-PMO), 트리사이클로DNA(tcDNA) 및 2’O 메틸올리고머(2’OMe)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵산 유도체를 포함하는 사용.
[23] 상기 [22]에서, 핵산 유도체가 서열번호 1또는 서열번호 2에 기재된 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 P-PMO인 사용.
[24] 상기 [21] 내지 [23] 중 어느 하나에서, 핵산 의약과 중공입자가 복합체를 형성하고, 해당 복합체의 가장 긴 부분이 50∼1000nm인 사용.
[25] 상기 [21] 내지 [24] 중 어느 하나에서, 중공입자가 아데노 관련 바이러스의 중공입자인 사용.
[26] 상기 [21] 내지 [25] 중 어느 하나에서, 핵산 의약이 디스트로핀 유전자의 안티센스 핵산을 포함하는 사용.
[27 상기 [21] 내지 [26] 중 어느 하나에서, 핵산 의약이 핵산이 집합해서 형성된 나노입자를 포함하는 한, 사용.
[28] 상기 [21] 내지 [27] 중 어느 하나에서, 핵산 의약이 전신 투여되는 사용.
[29] 상기 [28]에서, 핵산 의약이 경정맥 전신 투여되는 사용.
본 발명에 의해, 안전성이 높고, 장기/조직 특이성을 가지고, 높은 치료효과를 겸비하는 DDS가 제공된다.
도 1은 본 발명의 복합체, AAV 중공입자 및 P-PMO의 DLS(동적광산란)법에 의한 입자경 분포를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 복합체 및 P-PMO의 겔 이동분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 복합체 및 P-PMO의 각각에 의한 엑손 51 스킵핑의 효율을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 복합체 및 P-PMO의 각각을 투여한 마우스의 근육 중의 디스트로핀 양성 근섬유 수 및 형광강도를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 복합체 및 P-PMO의 각각을 투여한 마우스의 근육 중의 디스트로핀량을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 복합체 및 P-PMO의 각각을 투여한 마우스의 각종 근육 중의 디스트로핀량을 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 복합체의 1예를 나타내는 2D 모식도이다.
(1) 본 발명의 복합체
본 발명의 복합체는 핵산을 포함하는 나노입자와, 비피막 바이러스의 중공입자를 포함하는 복합체이다.
본 명세서에서 「핵산」은 천연형 핵산, 핵산 유도체 및 그것들의 조합을 포함한다. 「천연형 핵산」이란 자연계에 존재하는 천연형 뉴클레오타이드 만이 연결되어 있는 DNA 및 RNA를 말한다. 단, 본 실시형태의 천연형 핵산은 복합체를 구성하는 중공입자가 유래하는 비피막 바이러스 및 복합체를 투여하는 생체에 대하여 외인성의 핵산이다.
핵산 유도체는 화학 변형 핵산, 핵산 유사체, 인공 핵산 및 그것들의 조합을 포함한다. 「화학 변형 핵산」이란 인공적으로 화학변형을 한 핵산을 말한다. 예를 들면, 메틸포스포네이트형 DNA/RNA, 포스포로티오에이트형 DNA/RNA, 포스포라미데이트형 DNA/RNA, 2’-O-메틸형 DNA/RNA 등을 들 수 있다. 「핵산 유사체」란 천연형 핵산에 유사한 구조 및/또는 성질을 가지는 인공적으로 구축된 고분자 화합물을 말한다. 예를 들면, 펩타이드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid), 포스페이트기를 가지는 펩타이드 핵산(PHONA), 가교화 핵산(BNA/LNA: Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid), 모르폴리노 핵산(포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머: PMO를 포함한다) 등을 들 수 있다. 모르폴리노올리고머는 모르폴리노 서브 유닛(단량체)이 중합한 올리고머를 가리키는 것이다. 모르폴리노 서브 유닛은 RNA의 구성단위인 리보뉴클레오타이드의 리보오스(구성당) 전체가 모르폴리노 환으로 치환되어 구조를 가진다. 「인공핵산」이란 인위적으로 제작된 천연에는 존재하지 않는 핵산을 말하고, 천연형 핵산의 일부에 비천연형 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 또는 비천연형 뉴클레오타이드 만이 연결해서 이루어지는 핵산을 포함한다. 여기에서 말하는 「비천연형 뉴클레오타이드」란 상기 천연형 뉴클레오타이드에 유사한 성질 및/또는 구조를 가지는 인공적으로 구축된 또는 인공적으로 화학 변형된 자연계에 존재하지 않는 뉴클레오타이드를 말한다. 비천연형 뉴클레오타이드에는 상기의 화학 변형 핵산, 핵산 유사체에 해당하는 것도 포함된다.
본 발명에 사용되는 핵산은 필요에 따라서, 인산기, 당 및/또는 염기가 표지되어 있을 수도 있다. 표지는 당해 분야에서 공지의 표지물질을 이용할 수 있다. 예를 들면, 방사성동위원소(예를 들면, 32P, 3H, 14C), DIG, 비오틴, 형광색소(예를 들면, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA), 또는 발광물질(예를 들면, 아크리디늄에스터)을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 핵산은 임의의 유전자, mRNA 혹은 그 단편, 또는 이것들의 상보 서열을 가지는 핵산, 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다. 당해 핵산은 생체 내 또는 세포 내에서, 바람직하게는 세포 내에서, 특정한 생물학적 기능, 예를 들면, 효소기능, 촉매기능 또는 생물학적 저해 혹은 항진 기능(예를 들면, 전사, 번역의 저해 또는 항진)을 가지는 핵산일 수도 있고, 기능성 핵산으로 부르는 경우가 있다. 구체적으로는 예를 들면, RNA 간섭제, 핵산 압타머(RNA 압타머 및 DNA 압타머를 포함한다), 데코이, 안티센스 핵산(안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 안티센스 RNA/DNA), 리보자임(데옥시리보자임을 포함한다), U1 어댑터, 분자ㆍ비콘, 리보 스위치, 또는 전사인자 결합 영역 등을 들 수 있다. 특히 안티센스 DNA나 RNA 간섭제는 본 발명에서의 「핵산」으로 바람직하게 적용할 수 있다. 여기에서, 「RNA 간섭제」란 생체 내서 RNA간섭(RNA inteference: RNAi)을 유도하고, 표적으로 하는 유전자의 전사 산물의 분해를 통해서 그 유전자의 발현을 억제(사일런싱)할 수 있는 물질을 말한다. 예를 들면, siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 miRNA(micro RNA)(pri-miRNA 및 pre-miRNA를 포함한다)를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 핵산의 염기 길이는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 10∼10,000염기, 바람직하게는 12∼200염기, 더욱 바람직하게는 15∼50염기이다.
나노입자란 일반적으로는 입자경이 나노미터(nm) 오더의 미세입자를 가리킨다. 본 발명의 복합체에는 직경이 1∼1000nm인 나노입자를 사용할 수 있다. 적합하게는 10∼200nm 직경의 입자, 더 적합하게는 30∼90nm 직경의 입자를 사용할 수 있다. 본 발명의 복합체에 포함되는 나노입자는 그 표면전체 혹은 부분이 양전하 또는 음전하를 가지는 것으로서 핵산을 포함하고 있으면 모든 형상 및 모든 형태를 가질 수 있고, 통상은 구상이지만, 당해 나노입자의 성상이나 용도에 따라서 다른 형태가 가능하다. 나노입자로서는 리포솜, 알부민 나노입자, 미셀, 덴드리머, 나노 에멀젼, 금속 나노입자, 폴리락트산ㆍ글리콜산 공중합체(PLGA)가 예시된다. 또, 본 발명에는, 입자 내에 2종 이상의 기능성 핵산을 포함하는 나노입자를 사용할 수 있다.
리포솜은 지질 이중막으로 구성되는 지질 나노입자다. 세포막은 주로 인 지질 이중막으로 구성되어 있기 때문에, 리포솜은 생체 적합성의 면에서 우수하다. 본 발명에서, 핵산은 리포솜의 내부에 봉입되고, 리포솜의 표면에 결합시키고, 또는 리포솜의 지질 이중막에 삽입된다. 리포솜은 표면에 변형을 실시하는 것에　의해, 여러가지 기능을 부여할 수 있다. 예를 들면, 리포솜에 PEG 변형을 실시함으로써 혈중 안정성을 개선할 수 있고, 특정한 수용체에 대한 리간드나 특정한 세포(예를 들면 암)에 대한 항체(또는 항체 단편)를 리포솜 표면에 부가하는 것에 의해 표적 지향성을 제공할 수 있다. 여기에서, 리포솜을 구성하는 막 성분에 특별하게 한정은 없고, 예를 들면, 인 지질, 글리세로 당지질, 스핀고 당지질 등을 들 수 있다. 특히 인 지질로서 DPPC, DSPE-PEG, DSPE-PEG-NHS, EPC, POPC, DSPC, DSPE, PS, PG, PI, DMPG, DMPC 등을 들 수 있다.
미셀은 친수성 부분과 소수성 부분을 가지는 양친매성 분자의 집합체(회합체)이다. 미셀은 소수성 코어 또는 친수성 코어를 가질 수 있다. 예를 들면, 인 지질로 이루어지는 친수성 부분과 지방산으로부터 이루어지는 소수성 부분을 가지는 분자가, 수성 용매 중에서 소수성 코어를 가지는 미셀을 형성한다. 미셀은 폴리머를 포함할 수도 있다. 어떤 형태에 있어서, 미셀은 호모폴리머를 포함할 수도 있다. 전형적인 호모폴리머는 폴리(알킬렌글리콜)(예를 들면, 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 등), 폴리(아미노산)(예를 들면, 폴리(아스파라긴산) 및 폴리(글루탐산)(PGA) 등), 폴리-(γ-L-글루타밀글루타민)(PGGA), 폴리(페닐렌옥사이드)(PPO), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 및 폴리(락트산)을 포함한다. 어떤 형태에 있어서, 미셀 담체는 폴리-(γ-L-글루타밀글루타민)(PGGA)을 포함해도 좋다. 다른 형태에 있어서, 미셀은 코폴리머, 예를 들면 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)을 포함할 수도 있다. 일부의 형태에 있어서, 미셀은 블록 코폴리머를 포함할 수도 있다. 전형적인 블록 코폴리머는 디블록 코폴리머이다. 일부의 형태에 있어서, 디블록 코폴리머는 비극성 반복단위와 극성 반복단위를 포함할 수도 있다. 전형적인 극성 반복단위는 알킬렌글리콜(예를 들면 에틸렌글리콜 등), 알킬렌옥사이드(예를 들면 에틸렌옥사이드 등), 및 친수성 아미노산을 포함한다. 전형적인 비극성 반복단위는 γ-L-글루타밀글루타민, 글루탐산, 락트산-코-글리콜산, 페닐렌옥사이드, ε-카프로락톤, 락트산, 스티렌, 부틸렌옥사이드, 탄화수소, 및 소수성 아미노산, 예를 들면 아스파라긴산 등을 포함한다. 2종을 넘는 다른 반복단위를 가지는 다른 블록 코폴리머, 예를 들면 트리블록 코폴리머 등을 사용할 수도 있다.
본 발명에서 상기 미셀은 그 표면이 양전하 혹은 음전하를 가지는 것과 같은 구조를 취하는 것이 바람직하고, 이를 위한 올리고 펩티드 또는 그 유도체와 같은 전하 부여 기능을 가지는 물질을 포함할 수도 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 본 발명에 1형태로서, 지향성을 가지는 캡시드와 당해 미셀의 조합에서는 당해 캡시드 표면이 음전하라면 상기 미셀 표면은 양전하가 되도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 1형태로서, 핵산은 미셀 내부에 포함된다. 또, 별도의 형태로서, 양친매성 분자가 되도록 변형된 핵산이 집합해서 미셀을 형성한다. 본 발명에 1형태로서, 미셀을 형성하도록 핵산에 펩타이드를 부가할 수 있다. 핵산에 부가하는 펩타이드로서는 핵산과 결합해서 양친매성 분자가 되는 것이라면 무엇이든지 좋고, 추가로 나노입자에 세포 지향성 및/또는 세포 투과성을 부여하는 펩타이드를 사용할 수 있다. 당해 펩타이드는 예를 들면 링커 부분을 통해서 핵산에 결합된다. 링커 부분은 아미드 링커가 예시되고, 임의로 치환된 피페라지닐 부분을 포함할 수도 있고, β알라닌 및/또는 6-아미노헥산산 서브 유닛을 추가로 포함할 수도 있다. 또 펩타이드는 링커 부분 없이 핵산에 직접 결합시킬 수도 있다. 펩타이드의 결합은 핵산의 3’말단일 수도, 5’말단일 수도 있다.
본 발명에서, 나노입자는 핵산이 집합해서 형성될 수 있다. 본 발명에 1형태로서, 나노입자는 포스포로디아미데이트화 모르폴리노 올리고머(PMO) 및/또는 펩타이드 부가 PMO(P-PMO)가 자기집합한 나노입자다. P-PMO는 모르폴리노 핵산에 펩타이드가 결합한 핵산 유도체이다. P-PMO에 포함되는 펩타이드는 세포막 투과성을 가지는 펩타이드를 호적하게 사용할 수 있고, 예를 들면 서열번호 1의 서열을 가지는 Pip6a 또는 서열번호 2의 서열을 가지는 B펩타이드를 사용할 수 있다. 또, 본 발명이 다른 1형태로서 나노입자는 트리사이클로 DNA(tcDNA), 예를 들면 포스포로티오에이트화 tcDNA가 자기집합한 나노입자다. 또, 본 발명이 다른 1형태로서 나노입자는 2’O메틸올리고머(2’OMe)가 자기집합한 나노입자이다.
본 발명의 복합체는, 비피막 바이러스의 중공입자를 포함한다. 바이러스 입자(virion)에 있어서, 바이러스 핵산 또는 코어를 둘러싸는 복수의 단위 단백질(캡소미어: capsomere)로 이루어지는 외피(coat) 또는 쉘(shell)을 캡시드라고 한다. 본 명세서에서는 단지 「캡시드」라고 표기했을 경우에는 당해 구조체를 의미한다. 또, 캡시드에 있어서, 그 내부에 바이러스 핵산, 코어 또는 다른 물질을 포함하지 않는 캡시드 단백질만으로 구성된 것을, 본 명세서에서는 「중공입자」라고 부른다. 이에 대하여 그 내부에 바이러스 핵산이나 코어를 포함하는 것을 「뉴클레오캡시드(nucleocapsid)」라고 부른다.
중공입자는 본 발명의 복합체를 투여하는 생물종에 맞추어서 선택하면 좋다. 예를 들면, 투여하는 생물종을, 동물로 하는 경우에는 동물 바이러스 유래의 중공입자를, 식물로 하는 경우에는 식물 바이러스 유래의 중공입자를, 각각 사용하면 좋다. 캡시드는 대별하면 정이십면체형과 나사형이 알려져 있지만, 본 발명의 복합체에 사용되는 중공입자의 캡시드는 어느 쪽의 형태일 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비피막 바이러스의 중공입자 유래에는 특별하게 한정은 없고, RNA 바이러스 또는 DNA 바이러스를 묻지 않는다. 동물 바이러스 유래의 중공입자로서는 예를 들면, RNA 바이러스라면, 피코르나바이러스과, 칼리시바이러스과, 아스트로바이러스과, 레오바이러스과 또는 버나바이러스과에 속하는 바이러스 유래의 중공입자를 들 수 있다. 또, DNA 바이러스라면, 아데노바이러스과, 이리도바이러스과, 써코바이러스과, 파르보바이러스과, 또는 파보바이러스과에 속하는 바이러스 유래의 중공입자를 들 수 있다. RNA 바이러스 군의 피코르나바이러스과에 속하는 바이러스나, DNA바이러스 군의 아데노바이러스과 또는 파르보바이러스과에 속하는 바이러스 유래의 중공입자는 본 발명에 호적하게 사용할 수 있다. 아데노바이러스과의 아데노바이러스, 또는 파르보바이러스과의 AAV에 유래하는 중공입자는 본 발명에 특히 호적하게 사용할 수 있다.
식물 바이러스 유래의 중공입자로서는, 예를 들면, RNA 바이러스라면, TENUIVIRUS속, 토바모바이러스군, 포티바이러스과, 디안토바이러스군, 브로모바이러스군, 쿠쿠모바이러스군, 레오바이러스과 또는 크립틱바이러스(Cryptic Virus)군에 속하는 바이러스 유래의 중공입자를 들 수 있다. 또, DNA 바이러스라면, 칼리모바이러스속, 바드나바이러스속 또는 제미니바이러스속의 어느 쪽의 바이러스 유래의 중공입자를 들 수 있다.
중공입자의 캡시드를 구성하는 캡소미어는 캡시드를 구성 가능한 범위에 있어서 돌연변이를 포함할 수도 있다. 여기에서 말하는 「돌연변이」란 캡소미어를 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 1∼여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입되어 있는 것을 말한다. 아미노산 치환의 경우, 유사 아미노산 사이에서의 치환이 바람직하다. 「유사 아미노산」이란 아미노산을 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질에 의거하여 분류했을 경우에, 동일한 집단에 속하는 아미노산을 말한다. 이러한 집단에는 예를 들면, 염기성 아미노산군(아르기닌, 리신, 히스티딘), 산성 아미노산군(아스파라긴산, 글루탐산), 비극성 아미노산군(글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 메티오닌, 트립토판), 극성 무전하 아미노산군(세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 타이로신, 시스테인), 분지쇄 아미노산군(로이신, 이소로이신, 발린), 방향족 아미노산군(페닐알라닌, 타이로신), 이절 환상 아미노산군(히스티딘, 트립토판, 프롤린), 지방족 아미노산군(글리신, 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린)을 들 수 있다. 특정한 세포나 조직에 대한 지향성을 가지는 여러 돌연변이 캡소미어가 알려져 있지만, 본 발명에는 이들을 포함하는 중공입자를 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 중공입자는 변형되어 있을 수 있다. 여기에서 말하는 변형은 기능상의 변형 또는 표지로서의 변형을 포함한다. 「기능상의 변형」이란 중공입자와 그 표적세포 사이의 특이적인 결합활성을 증강 또는 안정화시키는데 있어서 유용한 변형을 말한다. 예를 들면, 캡시드의 글리코실화, 탈(脫)글리코실화, PEG화 등을 들 수 있다. 「표지로서의 변형」이란 본 발명의 복합체 또는 그 표적세포를 in vivo에서 검출하는데 있어서 유용한 변형을 말한다. 예를 들면, 형광색소(플루오레세인, 로다민, Texas 레드, Cy3, Cy5, Alexa Fluor(등록상표) 등), 형광 단백질(예를 들면, PE, APC, GFP, Venus, YFP, DsRed, Sirius 등), 효소(예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제, 글루코스옥시다아제 등), 방사성 동위원소(예를 들면, 3H, 14C, 35S 등) 또는 비오틴 혹은(스토렙토)아비딘에 의한 캡시드의 표지를 들 수 있다. 캡시드의 변형은 단백질로의 변형이 가능하며, 동시에 캡시드가 가지는 바이러스의 초기감염 활성에 영향을 끼치지 않는 방법이라면, 특별하게 한정은 하지 않는다. 또, 시판하고 있는 변형 키트를 사용해도 된다. 예를 들면, Alexa Fluor 568 Protein Labeling Kit(A10238)(Molecular Probes사)를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 중공입자는 그 표면에 이온결합을 형성할 수 있는 것과 같은 양전하 또는 음전하의 전하가 분포되어 있으면 천연형 캡시드 또는 인공형 캡시드의 어느 것을 가지는 것이더라도 호적하게 사용할 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만 예를 들면 캡시드 표면에 아미노산을 부가함으로써 당해 캡시드 표면의 제타 전위를 조제하는 것에 의해 임의의 전하를 분포시킬 수 있다. 또 임의의 전하를 강약 시키는 것에　의해, 쿨롱 힘을 조정해서 본 발명의 복합체 안정성을 제어할 수 있다.
본 발명의 복합체는 핵산을 포함하는 나노입자와 비피막 바이러스의 중공입자를 포함하고, 이것들은 예를 들면 정전기적 또는 화학적(공유결합 또는 이온결합)으로 결합해서 복합체를 형성하고 있다. 본 발명의 복합체 모식도를 도 7에 나타낸다. 도 7의 모식도는 일례이며, 본 발명의 복합체는 도 7에 나타나는 형태에 한정되지 않는다. 또, 본 발명의 복합체에 포함되는 나노입자는 1개인 것에 한정되지 않고, 복수의 나노입자와 복수의 중공입자를 포함하는 복합체, 복수의 나노입자와 1개의 중공입자를 포함하는 복합체도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 복합체의 사이즈는 투과형 전자현미경(TEM) 또는 동적광산란법(DLS), 예를 들면, 광자상관 분광법, 레이저 회절, 저각 레이저광 산란(LALLS) 및 중각 레이저 광산란(MALLS), 광차폐법(예를 들면, Coulter 분석법)에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 복합체를 TEM으로 측정했을 경우의 가장 긴 부분의 길이(장축 직경)는 예를 들면 50∼1000nm, 바람직하게는 80∼800nm, 더 바람직하게는 100∼500nm이다. 본 발명의 복합체의 사이즈는 어떤 범위에 분포하기 때문에 상기의 값은 복합체 전체의 평균값 혹은 최빈값이다.
(2) 본 발명의 복합체 제조방법
본 발명은 상기 (1)에 기재하는 본 발명의 복합체 제조방법을 제공하고, 이하의 공정을 포함한다.
(i) 핵산을 포함하는 나노입자를 제조하는 공정,
(ii) 비피막 바이러스의 중공입자를 제조하는 공정, 및
(iii) (i)의 나노입자와 (ii)의 비피막 바이러스의 중공입자를 혼합하는 공정.
본 발명에 1형태로서, 나노입자로서 리포솜을 제조할 때는, 주지의 리포솜 제조방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 용매의 주입, 지질의 수화, 역증발, 동결과 융해의 반복에 의한 동결건조에 의해 조제할 수 있다. 리포솜은 다중상, 또는 소형 단층 소포체(SUV)를 포함하는 단층상으로 할 수 있다(Methods in Biochemical Analysis, 33:337, 1988). 핵산을 포함하는 리포솜은 주지의 방법에 의해 리포솜에 핵산을 도입해서 제조할 수 있다.
본 발명이 다른 1형태로서, 나노입자로서 미셀을 제조할 때는, 미셀을 제조하는 주지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 당업자는 많은 미셀 담체가, 그 양친매성 분자로부터, 임계 미셀 농도(cmc) 및 임계 미셀 온도(cmt)에서 자체 조직화할 수 있음을 이해하고 있다. 핵산을 포함하는 미셀은 주지의 방법에 의해 미셀 담체와 핵산을 혼합해서 제조할 수 있다. 또, 핵산이 양친매성 분자인 경우에는 핵산을 자기 집합시켜서 미셀을 제조할 수 있다. 예를 들면, P-PMO 및 tcDNA의 미셀은 비특허문헌 2를 참조해서 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 비피막 바이러스의 중공입자는 중공입자가 유래하는 바이러스에 감염된 숙주세포로부터 직접 조제할 수 있다. 또, 중공입자만 얻는 것을 목적으로 하는 경우, 재조합 캡시드로서 조제할 수도 있다. 이것들의 조제 방법은 특허문헌 1에 기재되어 있다. 중공입자는 통상, 바이러스에 감염된 숙주세포 내에서 바이러스가 증식하고, 딸 바이러스(daughter virus) 입자가 구축될 때에, 동시에 형성된다. 따라서 중공입자는 바이러스에 감염된 숙주세포의 추출액으로부터, 또는 바이러스 입자의 방출 혹은 출아 후의 배양액으로부터 직접 조제할 수 있다. 이 경우, 숙주세포의 추출액 또는 배양액에는 중공입자와 함께 바이러스 입자도 혼재하고 있다. 따라서 숙주세포의 추출액 또는 배양액으로부터 바이러스 입자를 분리하고, 또는 불활성화시켜서, 중공입자를 정제하는 것이 바람직하다. 이것들은 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 입자의 분리와 중공입자의 조제 방법은 염화 세슘을 사용한 밀도 기울기 원심법, 및 일본 공개특허공보 2007-117003호에 기재된 이온교환막을 사용하는 방법을 들 수 있다. 중공입자만을 재조합 캡시드로서 조제하는 경우, 소망하는 바이러스 Cap 유전자를 포함하는 발현 벡터를, 적당한 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, AAV의 재조합 중공입자를 필요로 하는 것이라면, 소망하는 혈청형 AAV의 Cap 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드를 적당한 발현 벡터에 삽입하면 충분한다. Cap 유전자를 숙주세포 내에서 발현시킨 후에, 그 숙주세포를 파쇄한 세포 추출액으로부터, 또는 그 숙주세포의 배양액으로부터, 재조합 중공입자를 얻을 수 있다. 세포 추출액이나 배양액으로부터의 회수방법은 당해 분야에서 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다.
세포 파쇄물로부터 AAV 유래의 중공입자를 정제하는 방법은 당해 분야에서 공지의 방법에 의거하여 정제할 수 있다. 예를 들면, 일반적인 방법인 세슘 밀도 기울기 초원심법에 의해 정제할 수 있다. 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 각종 크로마토그래피를 사용한 정제 방법을 이용해서 정제할 수도 있다. 또, 이온교환막을 사용해서 중공입자와 바이러스 입자를 분리, 정제하는 방법을 이용할 수도 있다.
나노입자와 비피막 바이러스의 중공입자를 혼합하는 공정에는, 추가로, 혼합액을 교반하는 공정 및/또는 방치하는 공정을 포함할 수 있다. 교반하는 공정 및 방치하는 공정은 각각 1∼60분 실시되고, 적합하게는 각각 5∼30분 실시된다. 또, 이것들의 공정은 각각 0∼40℃에서 실시되고, 적합하게는 각각 4℃∼실온에서 실시된다.
나노입자와 비피막 바이러스의 중공입자를 혼합하는 공정에서, 혼합하는 핵산과 중공입자의 몰비는 예를 들면 50∼10000:1, 바람직하게는 100∼8000:1, 더 바람직하게는 150∼5000:1이다.
본 발명의 방법은 그 용도에 따라서, 추가로, 나노입자 및/또는 복합체의 크기를 조정하는 공정을 포함할 수 있다. 당해 조정 방법은 예를 들면, 엑스트루더를 사용하고, 구멍 직경이 다른 필터를 통과시키는 것에　의해서, 크기의 조절이 가능하다.
(3) 본 발명의 의약 조성물
본 발명의 의약 조성물은 상기 (2)의 복합체를 유효성분으로서 포함한다. 의약 조성물의 투여 형태는 의약적으로 허용 가능한 투여 형태라면 특별하게 제한되지 않고, 치료방법에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 전신 투여, 근육내 투여, 피하투여, 경구투여, 조직내 투여, 경피투여 등의 국소투여가 바람직하다. 또, 본 발명의 조성물이 취할 수 있는 제형으로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 각종 주사제, 경구제, 점적제, 흡입제, 연고제, 로션제 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 복합체 농도는 0.1nM∼1000㎛의 범위 내가 적당하고, 1nM∼500㎛의 범위 내가 바람직하고, 10nM∼100㎛의 범위 내가 더 바람직하다. 본 발명의 조성물을 생체에 투여할 때의 용량으로서는 함유되는 본 발명의 복합체에 함유되는 핵산의 종류, 제형, 연령이나 체중 등의 환자 상태, 투여경로, 질환의 성질과 정도를 고려한 후에 조제하는 것이 바람직하지만, 성인에 대하여 본 발명의 복합체량으로서, 1일당 0.1mg∼10g/인간의 범위 내가, 바람직하게는 1mg∼1g/인간의 범위 내가 일반적이다. 이 수치는 표적으로 하는 질환의 종류, 투여 형태, 표적분자에 의해서도 다른 경우가 있다. 따라서 경우에 따라서는 이것 이하로도 충분하고, 또 반대로 이것 이상의 용량을 필요로 할 때도 있다. 또 1일 1회로부터 수회의 투여, 또는 1일에서 수일 간격으로 반복 투여할 수 있다.
본 발명에 1형태로서, 의약 조성물은 추가로 의약적으로 허용 가능한 첨가제를 포함한다. 첨가제로서 예를 들면, 유화 보조제(예를 들면, 탄소 수 6∼22의 지방산이나 그 의약적으로 허용 가능한 염, 알부민, 덱스트란), 안정화제(예를 들면, 콜레스테롤, 포스파티딘산), 등장화제(예를 들면, 염화나트륨, 글루코스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스), pH 조정제(예를 들면, 염산, 황산, 인산, 아세트산, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 트리에탄올아민), 및 이것들의 조합을 들 수 있다. 본 발명의 조성물 중의 당해 첨가제의 함유량은 90중량% 이하가 적당하고, 70중량% 이하가 바람직하고, 50중량% 이하가 더 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물이 적용할 수 있는 질병에는 특별하게 한정은 없다. 그 치료(증상의 완화를 포함한다) 혹은 예방에 유효한 핵산 의약품이 알려져 있는 여러 질병에 대해서, 당해 핵산 의약품을 포함하는 본 발명의 복합체를 조제하는 것에　의해, 이것을 치료약ㆍ예방약으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 암(고형암, 혈액암 등), 감염증, 유전성 질환, 염증성 질환, 순환기 질환, 메타볼릭신드롬 등으로의 적용이 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 의약 조성물이 적용할 수 있는 대상에 대해서도 특별하게 한정은 없다. 본 발명의 복합체에 포함되는 핵산 의약의 적용대상 또는 치료 혹은 예방이 필요한 대상일 수 있고, 예를 들면, 인간 및 비인간 포유동물을 들 수 있다.
본 발명에 1형태로서, 본 발명에 사용되는 핵산은 DMD 환자(또는 DMD 질환동물)의 디스트로핀 유전자 상의 스플라이싱 촉진 부위를 포함하는 영역에 대해서, 상보적인 (안티센스) 염기서열을 가지는 핵산(안티센스 핵산)이다. 스플라이싱 촉진 부위는 mRNA 전구체고부터 스플라이싱에 의해서 인트론이 절단될 때에 기능하는 영역이다. 당해 부위는 인트론과 엑손의 양쪽에 존재한다. 당해 안티센스 핵산은 디스트로핀 유전자의 mRNA 전구체의 스플라이스 촉진 부위에 하이브리다이즈함으로써, 스플라이소솜 복합체의 형성을 저해하고, 서열 특이적으로 엑손 스킵핑을 유도한다. 그리고 최종적으로, 스플라이싱 과정에서, 스톱 코돈을 가지고 DMD의 원인이 되는 엑손을 스킵핑시키고, 디스트로핀 단백질의 발현을 가능하게 하는 성숙 mRNA가 생성된다. DMD의 원인이 되는 엑손으로서는 구체적으로는, 인간의 디스트로핀 유전자에서의 엑손 2, 8, 23, 43∼46, 50∼53 등을 올릴 수 있다. 본 발명에 1형태로서 엑손 51의 서열번호 3의 서열을 표적으로 하는 안티센스 핵산이 예시된다.
디스트로핀 유전자의 엑손 스킵핑의 발생여부는 디스트로핀 발현 세포(예를 들면, 인간 횡문 근육종 세포)에 본 발명의 복합체를 접촉시키고, 상기 디스트로핀 발현 세포의 Total RNA로부터, 디스트로핀 유전자의 mRNA의 표적으로 하는 엑손의 주변영역을 RT-PCR에 의해 증폭하고, PCR 증폭 산물에 대하여 nested PCR 또는 시퀀싱 해석을 실시하는 것에 의해 확인할 수 있다. 스킵핑 효율은 디스트로핀 유전자의 mRNA 가운데, 엑손 스킵핑한 폴리뉴클레오타이드량 「A」와, 엑손 스킵핑하지 않은 폴리뉴클레오타이드량 「B」를 측정하고, 이것들 「A」 및 「B」의 측정값에 의거해서 이하의 식에 따라서 계산할 수 있다.
스킵핑 효율(%) = A/(A+B)×100
바람직하게는 본 발명의 의약 조성물은 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 효율로 엑손 스킵핑한다.
실시예
이하에 본 발명을 실시예에 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: AAV 중공입자의 제조와 물성 측정
(1) 8형 및 9형 AAV 중공입자의 제조
국제공개 팜플렛 WO2012/144446기재에 293EB세포 4×108개를, 10% FBS+/DMEM/F12 배지를 포함하는 225cm2 플라스크28개(또는 6320cm2의 10단 플라스크1개)에 접종하고, 5% CO2하 37℃에서 배양했다. 배양 48시간 후에 회수한 세포에, AAV의 ITR과 그 사이에 삽입된 eGFP 유전자를 보유하는 AAV 벡터 플라스미드, 8형 AAV(AAV8) 또는 9형 AAV(AAV9)의 rep 및 cap 유전자를 보유하는 AAV 헬퍼 플라스미드, 및 2형 아데노바이러스의 E2A, E4, VARNA 유전자를 보유하는 아데노바이러스 헬퍼플라스미드를 각각 650㎍씩 칼슘 인산염법에 의해 도입했다. 그대로 배양을 계속하고, AAV 입자 및 AAV 중공입자를 해당 세포 내에서 복제시켰다. 플라스미드 도입 72시간 후에 세포를 원심에서으로 회수하고, 세포 펠릿을 30㎖의 트리스 완충 생리식염수(TBS)로 현탁했다. 이 현탁액의 동결 융해를 4∼6회 반복하고, 융해 시에 매회 볼텍스 조작에 의해 현탁액을 충분하게 혼합했다.
동결융해 후의 세포 현탁액에 150㎕의 1M MgCl2과 20㎕의 250U/㎕ Benzonase(Merck Millipore Corporation.)를 첨가하고, 37℃에 30분간 인큐베이션한 후, 300㎕의 0.5M EDTA를 첨가해서 반응을 정지시켰다. 그 후에 세포 현탁액에 900㎕의 5M NaCl을 첨가해서 잘 혼화하고, 4℃에서 10,000×g, 10분간 원심해서 상청액을 회수했다.
또, 수득된 상청액을 50℃에 30분간 가열하고, 이열성(열에 민감한) 단백질을 변성시킨 후, 4℃에서 10,000×g, 10분간 원심해서 상청액을 회수했다.
(2) 초원심에 의한 조정제(Crude Purification)
원심 튜브에 넣은 1.50g/㎖ 염화세슘 용액 상에 1.25g/㎖ 염화세슘 용액을 중층하고, 추가로 그 위에 상기 (1)에서 회수한 열처리 후의 상청액을 중층했다. 튜브를 16℃에서 25,000×g, 3시간 초원심 후, 내용액을 원심 튜브 아래 쪽에서 0.5㎖씩 회수했다. 각 분획의 굴절율(RI: refractive index:)을 측정하고, RI가 1.365∼1.368의 분획을 모으고, 그 용량의 약 100배량의 MHN 버퍼(3.33mM MES, 3.33mM HEPES(pH 6.5), 3.33mM NaOAc)에 대하여, 30분간 투석했다. 수득된 투석물을 그 용량의 약 5배량의 MHN 버퍼로 희석했다.
(3) 중공입자의 분리 및 정제
이온교환 담체로서 기재표면에 설폰산기를 보유하는 양이온 교환막 무스탕S Acrodisc(Pall Corporation.)를 사용했다. FPLC 시스템으로서, AKTA explorer1 00(GE Healthcare 사)을 사용하고, 이하에 나타내는 정제 조작을 실시했다. MHN 버퍼로 무스탕S Acrodisc를 평형화한 후, 유속 3㎖/분으로, 상기 (2)에서 얻은 투석 후의 희석액을 무스탕S Acrodisc에 로드하고, 중공입자를 막에 흡착시키는 동시에, AAV 입자를 분리, 제거했다. 10CV(디스크의 용량 10배량)의 MHN 버퍼로 무스탕S Acrodisc를 세정하고, 0∼2M NaCl/50CV의 농도 구배 조건으로 중공입자를 용출하고, 분획량 1㎖로 회수했다. 280nm에서의 흡광도의 피크 분획에 포함되는 중공입자를 모으고, 전자현미경에 의해, 중심에 검은 부분이 있는 바이러스 게놈이 들어가 있지 않는 중공입자임을 확인했다.
(4) AAV 중공입자의 물성 측정
(1)∼(3)에서 조제한 AAV8 및 AAV9의 중공입자를, 각각 PBS(-)(인산 완충 생리식염수)로 4×1013 v.p.상당/㎖의 농도로 조제하고, Viscotek 802(Malvern사)를 사용해서 동적광산란(DLS)법에 의해 입자경을 측정했다. 그 결과, AAV8 및 AAV9의 중공입자 순도는 각각 96.8%, 98.3%로, 입자경은 모두 28nm 정도였다. 추가로, Zetasizer nano(Malvern사)를 사용해서 제타전위를 측정했다. AAV8 및 AAV9의 중공입자 전기 전도율은 15mS/cm, 등전점은 pH 8.5부근임을 확인했다.
실시예 2 : P-PMO/AAV 중공입자 복합체의 제조
(1) P-PMO의 제조
펩타이드 변형형 PMO(peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholinool igomer: P-PMO)를 Ezzat K, et al., 2015, NANO LETTERS, vol.15, pp4364에 기재된 방법에 따라서 조제했다. 본 실시예에서 조제한 P-PMO는 Pip6a 펩타이드(서열번호1)와, 그 C말단에 아미드 링커에 의해 연결된 마우스 디스트로핀 유전자의 엑손 51의 서열번호 3에 기재되는 서열을 표적으로 하는 PMO 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다. P-PMO 용액을 PBS(-)를 사용해서 50㎛의 농도로 조제했다.
(2) P-PMO/AAV 중공입자 복합체의 제조
실시예 2(1)에서 조제한 P-PMO를, 실시예 1에서 조제한 AAV8 중공입자와, PBS(-) 또는 Opti-MEM 배지(ThermoFisherScientific사) 중에서, 1500:1, 750:1, 150:1의 몰비로 혼합하고, 실온에서 15분 방치했다.
P-PMO와 AAV8 중공입자를 1500:1의 몰비 (50㎛ P-PMO, 33.3nM AAV8 중공입자)로 혼합한 혼합액 중의 물질의 입자경을 Zetasizer Nano ZSP를 사용해서 DLS법에 의해 측정했다. 컨트롤로서, AAV8 중공입자 단독, P-PMO 단독의 입자경 분포를 각각 측정했다. DLS법에 의한 입자경 분포의 측정 결과를 도 1에 나타낸다. 또, 1500:1, 750:1의 몰비로 혼합한 혼합액을, 1.5% 아가로스겔, 100V, 10분의 조건으로 겔 이동분석을 실시했다. 컨트롤로서 P-PMO를 단독으로 겔 이동분석을 실시했다. 겔 이동분석의 결과를 도 2에 나타낸다.
도 1의 결과로부터, AAV 중공입자, P-PMO, 혼합액은 각각의 입자경의 피크를 가졌다. DLS법은 hydrodynamic size를 측정하기 위해서 수득되는 입자 크기는 실제의 입자경보다도 커지는 것이 알려져 있다. P-PMO는 직경 30∼90nm 정도의 미셀화 나노입자를 형성하는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 2). 혼합액 중에 포함되는 물질의 입자경은 AAV 중공입자 및 P-PMO 나노입자의 입자경보다도 크고, 혼합액 중에서는 P-PMO/AAV 중공입자의 복합체가 형성되고 있음이 확인되었다. 도 2에 나타내는 겔 이동분석에서도, P-PMO/AAV 중공입자 복합체는 전기적 성질이 P-PMO와 크게 다르는 것을 확인했다. 또, 투과형 전자현미경상(TEM)으로 5000:1의 몰비로 혼합한 P-PMO/AAV 중공입자 복합체를 관찰하고, 가장 긴 부분이 100∼500nm인 입자가 존재하는 것을 확인했다. 이 복합체를 95℃, 10분으로 가열처리한 후에 TEM 해석을 실시했을 경우에는, 이러한 구조체는 확인되지 않았다.
실시예 3: P-PMO/AAV 중공입자 복합체의 세포 도입효율
(1) H2K-mdx52 근아세포
근디스트로피의 모델 동물인 mdx 마우스 유래의 H2K 세포주(H2K-mdx52)(Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Aug 21;109(34):13763-13768.)의 세포 50,000개를 0.5㎖의 분화 배지(5% 말 혈청을 첨가한 DMEM 배지)에서 4일간 배양해서 근관세포로 분화시켰다. 그 후에 배지를 1500:1, 750:1 또는 150:1의 몰비 P-PMO/AAV 중공입자 복합체를 (P-PMO로서) 50㎛의 농도로 포함하는 Opti-MEM 배지(Thermo Fisher Scientific Inc.)로 교환하고, 트랜스펙션 시약을 첨가하지 않고 48시간 배양했다. 컨트롤로서, 복합체의 대신에 P-PMO만을 동일 농도로 포함하는 배지를 첨가한 세포를 사용했다. 배양한 세포로부터 TRIzol(Invitrogen사)을 사용해서 Total RNA를 추출했다. 이 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 4에 기재된 프라이머 Ex50F 및 서열번호 5에 기재된 프라이머 Ex53R을 사용해서 RT-PCR에 의해 디스트로핀 유전자의 엑손 50로부터 53을 증폭시켰다. 증폭 산물의 염기 길이를 MultiNA(Shimadzu사)에 의해 해석하고, 엑손 51 스킵핑 효율을 측정했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 또, 배양한 세포에 0.1% Triton-X100을 15㎕ 첨가해서 30분간 방치하고, 피펫팅으로 세포를 현탁시키고, 원심분리한 상청액 중의 유산 탈수소 효소(LDH)를 CytoSelect(등록상표) LDH 세포 독성 어세이 키트(CBL사)를 사용해서 세포막 장애 마커로서 측정했다.
도 3의 결과로부터, P-PMO 단독보다도 P-PMO/AAV 중공입자 복합체 쪽이, 엑손 51 스킵핑 효율이 높고, 세포도입효율이 높은 것이 나타났다. 또, LDH 활성을 세포막 장애의 지표로서 측정했지만, 어느 쪽의 샘플에서도 세포막 장애는 확인되지 않았다.
(2) mdx52 마우스(국소)
국립연구개발법인 국립정신ㆍ신경의료연구센터(NCNP)에서 사육ㆍ번식 중의 5주령의 mdx52 마우스(Biochem Biophys Res Commun. 1997; 238:492-497.)의 양측 전경골근에, 1500:1또는 150:1의 몰비 P-PMO/AAV 중공입자 복합체를, P-PMO의 양으로서 10㎍ 국소 근육내 투여하고, 2주일 후에 투여 부위의 골격근을 회수했다. 컨트롤로서 복합체의 대신에 P-PMO만 투여해서 얻은 골격근을 사용했다. 회수한 골격근에 대하여 항-디스트로핀 항체 NCL-DYS1(Leica Microsystems사)을 사용해서 디스트로핀 면역조직 화학염색을 실시하고, 근육의 횡단면적당의 디스트로핀 양성근섬유 수 및 형광강도를 측정했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 또, 회수한 골격근으로부터 Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail(Roche사)을 첨가한 RIPA 버퍼에 의해 단백질을 추출해서 웨스턴 블롯 해석을 실시하고, 하우스키핑(housekeeping) 단백질GAPDH에 대한 디스트로핀량의 비율을 측정했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
도 4 및 도 5의 결과로부터, P-PMO 단독보다도 P-PMO/AAV 중공입자 복합체 쪽이, 디스트로핀의 발현을 항진시키는 효과가 높다는 것이 나타났다.
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(3) mdx52 마우스(전신)
5주령의 mdx52 마우스에, 1500:1 또는 750:1의 몰비 P-PMO/AAV 중공입자 복합체를 3mg/kg 또는 6mg/kg로 경정맥 전신 투여하고, 2주일 후에 각 부위의 골격근을 회수했다. 컨트롤로서 P-PMO를 투여하지 않는 마우스의 (blank) 및 복합체의 대신에 P-PMO만 투여한 마우스를 사용했다. 회수한 골격근으로부터 단백질을 추출하고, 실시예 3(2)와 동일하게 웨스턴 블롯 해석을 실시했다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6의 결과로부터, 비복근, 횡격막, 심근에서, P-PMO 단독보다도 P-PMO/AAV 중공입자 복합체 쪽이, 디스트로핀의 발현을 더 높게 항진시키는 것이 나타났다.
서열목록 프리텍스트
SEQ ID NO: 1: Pip6a peptide
SEQIDNO: 2: B peptide
SEQIDNO: 3: mouse dystrophin gene exon 51 partial sequence
SEQIDNO: 4: Ex50F primer
SEQIDNO: 5: Ex53R primer
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL CENTER OF NEUROLOGY AND PSYCHIATRY NIPPON MEDICAL SCHOOL FOUNDATION <120> Nucleic acid delivery complex <130> 675263 <150> JP2019-014738 <151> 2019-01-30 <160> 5 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pip6a peptide <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> Xaa is aminohexanoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> bAla <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is aminohexanoic acid <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> Xaa is aminohexanoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> bAla <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> Xaa is aminohexanoic acid <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> May optionally comprise a linker at the C-terminal end, which may be one of BCys, XCys, GGCys, BBCys, BXCys or XBCys, X, XX, B, BB, BX, or XB wherein X is Ahx and B is bAla <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> bAla <400> 1 Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg Xaa 1 5 10 15 Arg Ala Arg Xaa Arg Ala 20 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B peptide <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> Xaa is aminohexanoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> bAla <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> Xaa is aminohexanoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> bAla <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> Xaa is aminohexanoic acid <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> May optionally comprise a linker at the C-terminal end, which may be one of BCys, XCys, GGCys, BBCys, BXCys or XBCys, X, XX, B, BB, BX, or XB wherein X is Ahx and B is bAla <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> bAla <400> 2 Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Xaa Arg Arg Ala Arg Xaa Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 ttgttttatc cataccttct gtttg 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ex50F primer <400> 4 gagtgggagg ctgtaaacca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ex53R primer <400> 5 acctgttcgg cttcttcctt 20

Claims (12)

  1. 핵산을 포함하는 나노입자와, 비피막 바이러스의 중공입자를 포함하는 복합체.
  2. 제1 항에 있어서,
    핵산이 포스포로디아미데이트화 모르폴리노 올리고머(PMO), 펩타이드 부가 PMO(P-PMO), 트리사이클로 DNA(tcDNA) 및 2’O 메틸올리고머(2’OMe)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵산 유도체인 복합체.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    핵산 유도체가 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 P-PMO인 복합체.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    투과형 전자현미경(TEM)으로 측정했을 경우의 가장 긴 부분의 길이가 50∼1000nm인 복합체.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중공입자가 아데노 관련 바이러스의 중공입자인 복합체.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산이 디스트로핀 유전자의 서열에 상보적인 안티센스 핵산인 복합체.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노입자가 핵산이 집합해서 형성되어 있는 복합체.
  8. 이하의 공정을 포함하는 핵산을 포함하는 나노입자와 캡시드 바이러스를 포함하는 복합체의 제조방법;
    (i) 핵산을 포함하는 나노입자를 제조하는 공정,
    (ii) 비피막 바이러스의 중공입자를 제조하는 공정, 및
    (iii)(i)의 나노입자와 (ii)의 비피막 바이러스의 중공입자를 혼합하는 공정.
  9. 제8 항에 있어서,
    (iii)의 공정에서, 핵산과 중공입자를 중공입자 1에 대하여 핵산이 150∼1500의 몰비로 혼합하는 제조방법.
  10. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 포함하는 의약 조성물.
  11. 제10 항에 있어서,
    뒤센형 근디스트로피(DMD) 치료용인 의약 조성물.
  12. 제10 항 또는 제11 항에 있어서,
    경정맥 전신 투여용인 의약 조성물.
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