JPWO2015137409A1 - アンチセンス核酸 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
以下の(a)〜(d)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
(a)配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー;
(b)配列番号1又は2の塩基配列において1〜5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(c)配列番号1又は2の塩基配列に対して、80%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(d)配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
[2]
以下の(e)〜(h)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
(e)配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー;
(f)配列番号1又は2の塩基配列において1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(g)配列番号1又は2の塩基配列に対して、80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(h)配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
[3]
以下の(i)及び(j)より選ばれるアンチセンスオリゴマー。
(i)配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー;
(j)配列番号1又は2の塩基配列に対して、90%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
[4]
オリゴヌクレオチドである、前記[1]〜[3]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
[5]
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、前記[4]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[6]
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記[4]または[5]に記載のアンチセンスオリゴマー。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。)
[7]
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記[4]〜[6]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
[8]
モルホリノオリゴマーである、前記[1]〜[3]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
[9]
前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのモルホリノ環部分、リン酸結合部分、3’末端及び/又は5’末端が修飾されている、前記[8]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[10]
前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのリン酸結合部分が、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記[9]又は[10]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[11]
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記[10]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[12]
5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、前記[9]〜[11]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
前記[1]〜[12]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
[14]
さらに医薬的に許容可能な担体を含む、前記[13]に記載の医薬組成物。
[15]
前記[1]〜[12]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー又は前記[13]もしくは[14]に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
[16]
前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、前記[15]に記載の治療方法。
[17]
前記患者がヒトである、前記[15]又は前記[16]に記載の治療方法。
[18]
筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における前記[1]〜[12]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマーの使用。
[19]
筋ジストロフィー治療に使用するための前記[1]〜[12]のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
[20]
前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、前記[19]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[21]
前記患者がヒトである、前記[19]又は[20]に記載のアンチセンスオリゴマー。
本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンを高効率にスキッピングするアンチセンスオリゴマー(以下、「本発明のアンチセンスオリゴマー」という)を提供する。
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、cDNA、mRNA前駆体及びmRNAも含まれる。好ましくは、遺伝子は、mRNA前駆体、即ち、pre-mRNAである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Xp21.2に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、220万塩基対のサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか14kbに過ぎず、該コード領域は79個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している(Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993))。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるpre-mRNAは、スプライシングを受けて14kbの成熟mRNAを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である(GenBank Accession No. NM_004006)。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン51の塩基配列を配列番号3に示す。
本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングにより、DMD型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、BMD型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って、アンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン51には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。
(a)配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー;
(b)配列番号1又は2の塩基配列において1〜5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(c)配列番号1又は2の塩基配列に対して、80%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;および
(d)配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
別の態様としては、本発明のアンチセンスオリゴマーは、具体的には以下の(k)〜(n)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
(k)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー;
(l)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列において1〜5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(m)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列に対して、80%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;および
(n)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
(l)〜(n)のアンチセンスオリゴマーは、具体的には(k)のアンチセンスオリゴマーの変異体であり、患者のジストロフィン遺伝子の変異(例えば、多型)などに対応することを念頭に置いたものである。
また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、以下の(o)〜(r)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
(o)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー;
(p)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列において1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(q)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列に対して、80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(r)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
さらにまた、本発明のアンチセンスオリゴマーは、以下の(i)及び(j)より選ばれるアンチセンスオリゴマーである。
(i)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー;
(j)配列番号6〜33のいずれか1つの塩基配列に対して、90%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAを被検細胞から回収し、該mRNAのうち、エクソン51がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン51がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定し、これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
スキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照することができる。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの4’位のOをSに置換したもの、糖の 2' 位と 4' 位を架橋したもの、例えば、LNA(Locked Nucleic Acid)又はENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、シクロアルキルとしては、炭素数5〜12のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
本発明において、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
アルコキシとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1〜6のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数1〜3のアルコキシが好ましい。
本発明において、アルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、2-(エチル)トリメチレン、1-(メチル)テトラメチレンを挙げることができる。
本発明において、アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、2−メチルアセチル、2,2−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、2,2−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。
Wは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
R1は、H、アルキルを表し;
R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し;
Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し;
Y2は、0、S又はNR1を表し;
Zは、0又はSを表す。))
本発明モルホリノオリゴマーは、かかるオリゴマーを構成する核酸塩基、モルホリノ環部分、リン酸結合部分、3‘末端及び/又は5’末端の全部又は一部が修飾されているものを含む。
モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第1991/009033号、又は国際公開公報第2009/064471号に従って製造することができる。特に、PMOは、国際公開公報第2009/064471号に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。
PMOの1つの態様として、例えば、次の一般式(I)で表される化合物(以下、PMO(I)という。)を挙げることができる。
[式中、各Base、R2、R3は、前記と同義であり;
nは、1〜99の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、24〜34 、27〜31又は28〜30の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、29である。]
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、PMOの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法(マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる)で実施することができる。固相法でPMOを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
次の一般式(II)で表される化合物(以下、化合物(II)という。)に酸を作用させることによって、次の一般式(III)で表される化合物(以下、化合物(III)という。)を製造する工程。
各BPは,独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し;
Tは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し;
Lは、水素、アシル、又は次の一般式(IV)で表される基(以下、基(IV)という。)を表す。]
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブチルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、(ジメチルアミノ)メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、4−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で1〜5個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、1-ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、4-(tert-ブチルカルボキシ)ベンジル、4-[(ジメチルアミノ)カルボキシ]ベンジル、4-(フェニルカルボキシ)ベンジルを挙げることができる(例えば、国際公開公報第2009/064471号公報参照)。
「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、3-アミノプロピル、スクシニル、2,2’-ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ(LCAA)を挙げることができる。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸1モルに対して、0.01モル当量〜10モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、0.1モル当量〜2モル当量の範囲内である。
本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸2当量に対してトリエチルアミン1当量を混合したものを挙げることができる。
本工程に使用しうる酸は、0.1%〜30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当である。好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
次の一般式(V)で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式(VI)で表される化合物(以下、化合物(VI)という。)を製造する工程。
R4は、水酸基、ハロゲン、カルボキシル基、又は、アミノを表す。]
特に、次の一般式(VIa)で表される化合物は、化合物(V)と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
化合物(VI)に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物(IIa)を製造する工程。
本工程は、化合物(VI)と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
化合物(II)において、n=2〜99(好ましくは25〜35 、28〜32又は29〜31の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、30である)であって、Lが基(IV)である、次の一般式(IIa2)で表される化合物は、化合物(IIa)を出発原料とし、本明細書に記載のPMOの製法にかかる工程A及び工程Bを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
n’は、1〜98(特定の態様ではn’は、1〜34、1〜33、1〜32、1〜31、1〜30、1〜29、1〜28、1〜27、1〜26、1〜25、1〜24)を表す。]
化合物(III)に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式(VII)で表される化合物(以下、化合物(VII)という。)を製造する工程。
本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、又は、N-エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物(III)1モルに対して、1モル当量〜1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モル当量〜100モル当量の範囲内である。
本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、0.1%〜30%の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン、DMF、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常1分〜48時間の範囲内が適当であり、好ましくは、30分〜24時間の範囲内である。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、0.1モル当量〜10000モル当量の範囲内が好ましく、1モル当量〜1000モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤1モルに対して、0.1モル当量〜100モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量〜10モル当量の範囲内である。
本反応の反応温度は、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分から5時間の範囲内である。
工程Bにおいて製造される化合物(VII)において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式(IX)で表される化合物を製造する工程。
工程Cにおいて製造される化合物(IX)に酸を作用させることによって、PMO(I)を製造する工程。
逆相クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば20mMのトリエチルアミン/酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、例えば、1Mの食塩水と10mMの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
1)P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt,Science, 254, 1497 (1991)
2)M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg,Jacs., 114, 1895 (1992)
3)K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt,J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
4)L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm,O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
5)T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
本発明のアンチセンスオリゴマーは、従来技術に係るアンチセンスオリゴマーと比較して、高効率にエクソン51のスキッピングを可能にする。従って、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物をDMD患者(エクソン51スキッピングでin-frame化する変異を有する患者、例えば、エクソン29-50欠失患者、エクソン50欠失患者、エクソン45-50欠失患者、エクソン48-50欠失患者、エクソン49-50欠失患者、エクソン52欠失患者、エクソン52-63欠失患者、13-50欠失患者、19-50欠失患者、43-50欠失患者、又は47-50欠失患者)に投与することにより、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を用いる場合、従来技術に係るオリゴマーと比べて少量の投与量でも同程度の治療効果を得られるため、副作用を軽減することができ、かつ経済的
である。
そこで、別の実施態様として、本発明のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物(以下、「本発明の組成物」という)を提供する。
また、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴマーを、DMD患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法を提供する。
当該治療方法において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、前記筋ジストロフィー治療用医薬組成物として投与してもよい。
さらに、本発明は、筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における本発明のアンチセンスオリゴマーの使用、及び筋ジストロフィー治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴマーを提供する。
塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N, N' -ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N-ベンジル-フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩のような有機アミン塩;弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩;硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩;メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩;ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩;酢酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩;グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。
詳細については米国特許第4,235,871号、同第4,737,323号、国際公開公報第96/14057号、”New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pages 33-104”等を参照することができる。
ゴマー)は、該オリゴマーの性質及び該担体の種類等によって異なるが、0.1〜100の範囲内が適当であり、0.1〜10の範囲内が好ましい。
きる。
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
工程1:4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、N−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミド3.44gと4−ジメチルアミノピリジン(4−DMAP)1.1gをジクロロメタン50mLに懸濁し、無水コハク酸0.90gを加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノール10mLを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、4.0gの目的物を得た。
4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸4.0gをピリジン(脱水)200mLに溶解し、4−DMAP0.73g、1−エチル−3‐(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩11.5gを加えた。次いで、アミノポリスチレン樹脂 Primer support 200 amino(GE Healthcare Japan社製、17-5214-97)25.0g、トリエチルアミン8.5mLを加え、室温で4日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン(脱水)200mL、無水酢酸15mL、2,6−ルチジン15mLを加え、室温で2時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、26.7gの目的物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、129.2μmol/gであった。
UV測定条件
機器:U-2910(日立製作所)
溶媒:メタンスルホン酸
波長:265 nm
ε値:45000
PMO No.1
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例1)0.2g(26μmol)をフィルター付きカラムに充填し、核酸合成機(AKTA Oligopilot 10 plus)を使用して、下記合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各カップリングサイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した(下記表2を参照)。
0%(v/v)になるように、かつテトラヒドロフランを10%(v/v)になるように、アセトニトリルで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、アセトニトリルに対して20%(v/v)の無水酢酸と30%(v/v)の2,6−ルチジンを溶解したものを使用した。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記表4に示す通りである。
ESI−TOF−MS 計算値:10021.46
測定値:10021.91
PMO No.2
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:9916.71
測定値:9916.43
PMO No.3
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:9949.46
測定値:9949.41
In vitro アッセイ
PMO No.1、2の本発明のアンチセンスオリゴマー及びPMO No.3のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下の表6に示す。
導入後、細胞を、10%ウシ胎児仔血清(FCS)(インビトロジェン社製)を含むEagle's minimal essential medium(EMEM)培地(シグマ社製、以下同じ。) 2mL中、37℃、5%CO2条件下で3日間培養した。細胞をPBS(ニッスイ社製、以下同じ。)で洗浄した後、ISOGEN II(ニッポンジーン社製)500 μl を細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をEppendorfチューブに回収した。ISOGENに添付のプロトコルに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000(エル・エム・エス社製)を用いて測定した。
抽出したtotal RNA 400 ngに対し、Qiagen One Step RT-PCR Kit(Qiagen社製)を用いてOne-Step RT-PCRを行った。キットに添付のプロトコルに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはPTC-100(MJ Research社製)を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りである。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:熱変性
[94℃、30秒間;60℃、30秒間;72 ℃、60秒間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、10分間:最後の伸長反応
フォワードプライマー:5’-CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’ (配列番号5)
リバースプライマー:5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’ (配列番号6)
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図1に示す。本実験により、本発明のアンチセンスオリゴマーは、PMO No.3と比較して、著しく高い効率でエクソン 51 をスキッピングさせることが判明した。
[実施例3]
PMO No.4−6
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。各種アンチセ
ンスオリゴマーの配列を表7に示す。
配列番号9−33に記載の2’-O-メトキシ-ホスホロチオエート体
標記の各種アンチセンスオリゴマーを日本バイオサービス社に委託して製造した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を表8に示す。
Claims (21)
- 以下の(a)〜(d)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
(a)配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー;
(b)配列番号1又は2の塩基配列において1〜5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(c)配列番号1又は2の塩基配列に対して、80%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;および
(d)配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー - 以下の(e)〜(h)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
(e)配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー;
(f)配列番号1又は2の塩基配列において1〜3個の塩基が欠失、置換、
挿入、及び/又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;
(g)配列番号1又は2の塩基配列に対して、80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー;および
(h)配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー - 以下の(i)及び(j)より選ばれるアンチセンスオリゴマー。
(i)配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー;および
(j)配列番号1又は2の塩基配列に対して、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー - オリゴヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項4に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項4又は5に記載のアンチセンスオリゴマー。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。) - 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項4〜6のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
- モルホリノオリゴマーである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのモルホリノ環部分、リン酸結合部分、3’末端及び/又は5’末端が修飾されている、請求項8に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのリン酸結合部分が、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項9又は10に記載のアンチセンスオリゴマー。
- ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項10に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、請求項9〜11のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
- さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー又は請求項13もしくは14に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
- 前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、請求項15に記載の治療方法。
- 前記患者がヒトである、請求項15又は16に記載の治療方法。
- 筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における請求項1〜12のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマーの使用。
- 筋ジストロフィー治療に使用するための請求項1〜12のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、請求項19に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記患者がヒトである、請求項19又は20に記載のアンチセンスオリゴマー。
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