UA120849C2 - Антисенсовий олігомер - Google Patents

Антисенсовий олігомер Download PDF

Info

Publication number
UA120849C2
UA120849C2 UAA201610167A UAA201610167A UA120849C2 UA 120849 C2 UA120849 C2 UA 120849C2 UA A201610167 A UAA201610167 A UA A201610167A UA A201610167 A UAA201610167 A UA A201610167A UA 120849 C2 UA120849 C2 UA 120849C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antisense oligomer
pharmaceutically acceptable
hydrate
acceptable salt
exon
Prior art date
Application number
UAA201610167A
Other languages
English (en)
Inventor
Татсуші Вакаяма
Татсуши Вакаяма
Харуна СЕО
Харуна Сэо
Юхеі Сатоу
Юхеи Сатоу
Сініті Такеда
Синити ТАКЕДА
Тетсуя Нагата
Original Assignee
Ніппон Шин'Яку Ко., Лтд.
Ниппон Шиньяку Ко., Лтд.
Нешенел Сентер Оф Ньюроледжі Енд Сайкаіетрі
Нешенэл Сентер Оф Ньюроледжи Энд Сайкаиэтри
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ніппон Шин'Яку Ко., Лтд., Ниппон Шиньяку Ко., Лтд., Нешенел Сентер Оф Ньюроледжі Енд Сайкаіетрі, Нешенэл Сентер Оф Ньюроледжи Энд Сайкаиэтри filed Critical Ніппон Шин'Яку Ко., Лтд.
Publication of UA120849C2 publication Critical patent/UA120849C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3535—Nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується антисенсового олігонуклеотиду або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату, який має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіну людини. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить як активний інгредієнт даний антисенсовий олігомер, способу лікування м'язової дистрофії та застосування антисенсового олігомера у виробництві фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується антисенсового олігонуклеотиду або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату, який має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіну людини. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить як активний інгредієнт даний антисенсовий олігомер, способу лікування м'язової дистрофії та застосування антисенсового олігомера у виробництві фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії.
Галузь техніки
Представлений винахід стосується антисенсового олігомери, який викликає пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини, та фармацевтичної композиції, яка містить олігомер.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
М'язова дистрофія Дюшенна (ОМО) є найбільш частою формою спадкової прогресуючої м'язової дистрофії, яка вражає одного з приблизно З 500 новонароджених хлопчиків. Хоча моторні функції в них рідко відрізняються від здорових людей в немовляцтві та дитинстві, м'язова слабкість спостерігається у таких дітей в віці від близько 4 до 5 років. Потім м'язова слабкість прогресує та призводить до втрати здатності пересуватися у віці приблизно 12 років та смерті через серцеву або дихальної недостатності у віці двадцяти років та старше. ОМО є таке важке захворювання. На даний час, не існує ефективної терапії щодо існуючого ОМО, тому дуже необхідним є розробити новий терапевтичний агент.
РМО як відомо, є обумовленою мутацією в гені дистрофіна. Ген дистрофіна знаходиться на
Х-хромосомі та представляє собою величезний ген, що складається з 2,2 мільйона пар нуклеотидів ДНК. ДНК транскрибується в попередники мРНК, та інтрони видаляються шляхом сплайсингу, щоб синтезувати мРНК з 11 058 основ, в яких 79 екзонів з'єднуються один з одним.
Дана мРНК транслюється в З 685 амінокислот, продукуючи протеїн дистрофіну. Протеїн дистрофіну пов'язують зі збереженням стабільності мембран в м'язових клітинах та з необхідністю робити м'язові клітини менш ламкими. Ген дистрофіна у пацієнтів з ОМО містить мутацію та, таким чином, протеїн дистрофіну, який є функціональним в клітинах м'язів, рідко експресується. Таким чином, структура м'язових клітин не може підтримуватися в організмі пацієнтів, які страждають на ЮОМО, що призводить до великого надходження іонів кальцію в м'язові клітини. Внаслідок цього, відбувається реакція подібна до запалення, що сприяє фіброзу таким чином, що м'язові клітини можуть регенеруватися тільки з великими труднощами.
М'язова дистрофія Беккера (ВМО) також спричиняється мутацією в гені дистрофіна.
Симптоми включають слабкість м'язів, яка супроводжується атрофією м'язів, але, як правило, з помірним та повільним прогресуванням м'язової слабкості, в порівнянні з ОМО. В багатьох випадках, його початок припадає на зрілий вік. Вважається, що відмінності в клінічних симптомах між ОМО та ВМО, які є властивими або рамці зчитування для амінокислот при
Зо трансляції мРНК дистрофіна в протеїн дистрофіну, перериваються мутацією або ні (не патентний документ 1). Більш конкретно, в ОМО, наявність мутації зміщує рамку зчитування амінокислот таким чином, що експресія функціонального протеїну дистрофіну усувається, в той час як при ВМО протеїн дистрофіну, який функціонує, хоча недосконало, продукується, оскільки зберігається амінокислотна рамка зчитування в той час як частина екзонів є видаленою мутацією.
Пропуск екзонів, як очікується, служить як спосіб лікування ЮОМО. Даний спосіб включає модифікацію сплайсингу для відновлення амінокислотної рамки зчитування мРНК дистрофіну та індукування експресії протеїну дистрофіну, який має функцію частково відновленого (не патентний документ 2). Частина амінокислотної послідовності, яка є мішенню для пропуску екзона, буде втраченою. З цієї причини, протеїн дистрофіну, який експресується шляхом такої обробки стає коротшим, ніж звичайним протеїн, але оскільки амінокислотна рамка зчитування зберігається, функція стабілізації м'язових клітин частково зберігається. Внаслідок цього, очікується, що пропуск екзонів призводитиме ЮОМО до симптомів, аналогічних до тих, що при
ВМО, яке є більш м'яким. Підхід щодо пропуску екзону пройшов дослідження на тваринах з використанням мишей або собак, та на даний момент поточно оцінюється в клінічних випробуваннях на пацієнтах-людях з ОМО.
Пропуск екзону може бути індукованим шляхом зв'язування антисенсових нуклеїнових кислот, які націлені або на 5", або на 3' сплайс-сайт, або на обидва сайти, або на внутрішні сайти екзону. Екзон буде включеним тільки в мРНК, коли обидва їх сайти сплайсингу розпізнаються сплайсосомним комплексом. Таким чином, пропуск екзону може бути індукований націлюванням сайтів сплайсингу з антисенсовими нуклегсновими кислотами. Крім того, зв'язування протеїну 5К з екзонним енхансером сплайсингу (ЕЗЕ) вважається необхідним для того, щоб екзон розпізнавався механізмом сплайсингу. Відповідно, пропуск екзону також може бути індукований націлюванням Е5Е.
Оскільки мутація гена дистрофіна може варіюватися в залежності від пацієнтів з ОМО, антисенсові нуклеїнові кислоти повинні бути розроблені на основі сайту або типу відповідної генетичної мутації. У минулому, антисенсові нуклеїнові кислоти, які індукують пропуск екзону для всіх 79 екзонів, були отримані біеме Умійоп, еї аїЇ., Опімегейу ої УМУевієгп Аийзвігаїйа (не патентний документ 3), та антисенсові нуклеїнові кислоти, які індукують пропуск екзону для 39 бо екзонів, були отримані АппетіеКе Аагізта-Кив, еї а!., Меїпегіапаз (не патентний документ 4).
Вважається, що приблизно 13 95 всіх пацієнтів з ОМО можуть лікуватися пропуском екзону 51 (далі в даному документі зазначається як "екзон 51"). В останні роки, безліч науково- дослідних організацій повідомляли про дослідження, в яких екзон 51 в гені дистрофіна був націлений на пропуск екзону (патентні документи 1-6; не патентні документи 5-6). Проте, методика пропуску екзона 51 з високою ефективністю до сих пір не встановлена.
ДОКУМЕНТ ПОПЕРЕДНЬОГО РІВНЯ ТЕХНІКИ
Патентний документ
Патентний документ 1: Міжнародна публікація МО 2004/048570
Патентний документ 2: Міжнародна публікація МО 2002/024906
Патентний документ 3: Міжнародна публікація УУО 2010/048586
Патентний документ 4: Міжнародна публікація М/О 2010/050801
Патентний документ 5: 05 2010/0168212
Не патентний документ 1: Мопасо А. Р. еї аї., Сепотісв 1988; 2: р. 90-95
Не патентний документ 2: Маїхицо М., Вгаіп Оем 1996; 18: р. 167-172
Не патентний документ 3: Умійкоп 5. Ю., еї а!., Моїесшаг! Тнегару 2007: 15: р. 1288-96
Не патентний документ 4: АппетіеКе Аагізта-Киз еї а!., (2002) Меиготизсшіаг Оізогаегв 12:
З7/1-577
Не патентний документ 5: Аокі У., еї аІ., Моїесшаг (Тегару 2010: 18: р.1995-2005
Не патентний документ 6: МаКапо 5., єї а!., Редіаїкг Ійї. 2011: 53: 524-429
РОЗКРИТТЯ ВИНАХОДУ
Проблеми, які вирішуються за допомогою винаходу
За зазначених вище обставин, потрібними є антисенсовий олігомери, які індукують пропуск екзону 51 в гені дистрофіна з високою ефективністю, та терапевтичні засоби для лікування м'язової дистрофії, які містять їх олігомери.
СПОСОБИ ВИРІШЕННЯ ПРОБЛЕМИ
В результаті детальних досліджень технічного змісту зазначених вище документів та структури гена дистрофіну, автори представленого винаходу виявили, що пропуск екзону 51 може бути індукованим з високою ефективністю шляхом введення антисенсового олігомеру, який має нуклеотидні послідовності, представлені 5ЗЕО ІЮО МО: 1 та 2. На основі даного відкриття, автори представленого винаходу здійснили представлений винахід.
Тобто, представлений винахід полягає в наступному.
ПЇ Антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, що складається з (а)-(д), зазначених нижче: (а) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1 або 2; (б) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має делецію, заміщення, вставку та/або додавання від 1 до 5 нуклеотидів в нуклеотидній послідовності ЗЕО
ІО МО: 1 або 2, та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини; (с) антисенсовий олігомер, який має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 80 9о ідентичність з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1 або 2 та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини; та (а) антисенсовий олігомер, який гібридизується в жорстких умовах до олігонуклеотиду, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності ЕС
ІО МО: 1 або 2 та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини.
І2Ї Антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, яка складається з (е)-(й), зазначених нижче: (є) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1 або 2; () антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має делецію, заміщення, вставку та/або додавання від 1 до З нуклеотидів в нуклеотидній послідовності ЗЕО
ІО МО: 1 або 2, та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини; (9) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 80 95 ідентичність з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1 або 2 та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини; та (п) антисенсовий олігомер, який гібридизується в дуже жорстких умовах до олігонуклеотиду, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності
ЗЕО ІЮО МО: 1 або 2 та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини.
ІЗ|Ї Антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, яка складається з (1І)-(), зазначених нижче: () антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1 або 2; та () антисенсовий олігомер, який має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичність з нуклеотидною послідовністю ЗЕСО І МО: 1 або 2 та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини.
ІЇ4| Антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного з |11-(3)Ї, зазначених вище, який представляє собою олігонуклеотид.
ІЗ) Антисенсовий олігомер відповідно до |4|, зазначеного вище, в якому цукровий фрагмент та/або зв'язуюча фосфат ділянка, щонайменше, одного нуклеотиду, з якого складається олігонуклеотид, є модифікованим.
І6|Ї Антисенсовий олігомер відповідно до І4| або І5)Ї, зазначених вище, в якому цукровий фрагмент, щонайменше, одного нуклеотиду, з якого складається олігонуклеотид, представляє собою рибозу, в якому 2'-ОН група заміщується на будь-яку групу, вибрану з групи, яка складається з ОК, К, ЕОР, 5Н, ЗК, МН», МНА, МВ», М», СМ, Е, СІ, Вг та І (в якому К представляє собою алкіл або арил, та ЕК" представляє собою алкілен).
Ї/|Ї Антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного з І41-(6Ї, зазначених вище, в якому зв'язуюча фосфат ділянка, щонайменше, одного нуклеотидна, з якого складається олігонуклеотид, представляє собою будь-яку ділянку, вибрану з групи яка складається з фосфоротіоатного зв'язку, фосфородитіоатного зв'язку, алкілфосфонатного зв'язку, фосфорамідатного зв'язку та боранофосфатного зв'язку.
ІВ Антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного з |11-(3)Ї, зазначених вище, який представляє собою морфоліноолігомер.
ІЗ Антисенсовий олігомер відповідно до |І8В)Ї, зазначеного вище, в якому морфоліновий кільцевий фрагмент, зв'язуюча фосфат ділянка, 3'-кінець та/або 5'-кінець, щонайменше одного морфоліну, з якого складається морфоліноолігомер, є модифікованим. 19) Антисенсовий олігомер відповідно до |9| або (10), зазначених вище, в якому зв'язуюча фосфат ділянка, щонайменше, одного морфоліно, з якого складається морфоліноолігомер, представляє собою будь-яку ділянку, вибрану з фосфородіамідатного зв'язку,
Зо фосфоротіоатного зв'язку, фосфородитіоатного зв'язку, алкілфосфонатного зв'язку, фосфорамідатного зв'язку та боранофосфатного зв'язку.
П11) Антисенсовий олігомер відповідно до |10), зазначеного вище, який представляє собою фосфородіамідатний морфоліноолігомер. 121) Антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного з (91-(11|, зазначених вище, в якому 5' кінець представляє собою будь-яку групу з хімічних формул (1)-(3), зазначених нижче:
С тр
Л СНз м о-в-М інн ОК
Фосна Фон (1) (2) (3) (13) Фармацевтична композиція для лікування м'язової дистрофії, яка містить, як активний інгредієнт, антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного з |11-(12|, зазначених вище, або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат. 14 Фармацевтична композиція відповідно до (13), зазначеного вище, що містить фармацевтично прийнятний носій. 51 Спосіб лікування м'язової дистрофії, який включає введення пацієнту з м'язовою дистрофією антисенсового олігомеру відповідно до будь-якого одного з |11-(12), зазначених вище, або фармацевтичної композиції відповідно до (131 або (14), зазначених вище.
І16Ї Спосіб лікування відповідно до (15), зазначеного вище, в якому пацієнт з м'язовою дистрофією є пацієнтом з делеціями нуклеотидів в межах екзонів 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 або 47-50.
І171| Спосіб лікування відповідно до (15) або |16Ї, зазначених вище, в якому пацієнтом є людина.
І18| Застосування антисенсового олігомера відповідно до будь-якого одного з (111-121, зазначених вище, у виробництві фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії. 119) Антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного з (11-12), зазначених вище, для застосування в лікуванні м'язової дистрофії.
І20| Антисенсовий олігомер відповідно до |19|, зазначеного вище, в якому пацієнт з м'язовою дистрофією в зазначеному лікуванні представляє собою пацієнта з делеціями нуклеотидів в межах екзонів 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 або 47-50. (21) Антисенсовий олігомер відповідно до (191 або (20), зазначених вище, в якому пацієнтом є людина.
ЕФЕКТ ВИНАХОДУ
Антисенсовий олігомер за представленим винаходом може індукувати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини з високою ефективністю. Крім того, симптоми м'язової дистрофії
Дюшенна можуть бути ефективно частково зняті шляхом введення фармацевтичної композиції за представленим винаходом.
Короткий опис креслень
ФІГ. 1 показує ефективність пропуску екзона 51 в гені дистрофіна людини в клітинній лінії рабдоміосаркоми людини (КО клітини).
СПОСІБ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ
Далі в даному документі, представлений винахід описується детально. Варіанти здійснення, описані нижче, призначені для того, щоб бути представленими як приклад лише для того, щоб описати винахід, але при цьому не обмежуючись тільки наступними варіантами здійснення.
Представлений винахід може бути здійснено різними способами, не виходячи за межі суті винаходу. 1. Антисенсовий олігомер
Представлений винахід передбачає антисенсовий олігомер (далі в даному документі зазначається як "антисенсовий олігомер за представленим винаходом"), який викликає пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини з високою ефективністю.
ІЕкзон 51 в гені дистрофіна людини)
В представленому винаході, термін "ген" є призначеним для позначення геномного гена та також включає попередник кКДНК, мРНК та мРНК. Переважно, ген представляє собою попередник мРНК, тобто пре-мРНК.
В геномі людини ген дистрофіна людини знаходиться в локус Хр21.2. Ген дистрофіна людини має розмір 2,2 мільйона пар нуклеотидів та є найбільшим геном серед відомих генів людини. Однак, кодуючі ділянки гена дистрофіна людини становлять лише 14 тисяч пар основ, розподілених як 79 екзонів по всьому гену дистрофіна людини (Кобегі5, КО, еї аіІ., зепотісв, 16: 536-538 (1993)). Пре-мРНК, яка є транскриптом гена дистрофіна людини, піддається сплайсингу для формування зрілої мРНК з 14 тисяч пар основ. Нуклеотидну послідовність немутантного гена дистрофіна людини є відомою (бСепеВапк Номер доступу Мо ММ 004006).
Нуклеотидна послідовність екзона 51 в немутантному гені дистрофіна людини є представленою 5ЕО ІЮ МО: 3.
І(антисенсовий олігомері
Антисенсовий олігомер за представленим винаходом є призначеним, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини, тим самим, модифікуючи протеїн, кодований типом ЮОМО гена дистрофіна в типі ВМО протеїну дистрофіна. Відповідно, екзон 51 в гені дистрофіна, який є мішенню пропуску екзону антисенсовим оолігомером, включає як немутантний так і мутантний типи.
Антисенсовий олігомер за представленим винаходом представляє собою виключно антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, яка складається з (а)-(4), зазначених нижче. (а) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1 або 2; (б) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має делецію, заміщення, вставку та/або додавання від 1 до 5 нуклеотидів в нуклеотидну послідовність ХЕО
ІО МО: 1 або 2, та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіна людини; (с) антисенсовий олігомер, який має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 80 9о ідентичність з нуклеотидною послідовністю 5ЕО І МО: 1 або 2, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини; та (4) антисенсовий олігомер, який гібридизує в жорстких умовах до олігонуклеотида, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності ЕС
ІО МО: 1 або 2, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини.
Антисенсові олігомери від (Б) до (а), зокрема, представляють собою мутантів антисенсового олігомеру (а), та є призначеними відповідати мутаціям гена дистрофіна у пацієнтів, наприклад, поліморфізм.
Як інший варіант здійснення, антисенсовий олігомер за представленим винаходом представляє собою виключно антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, яка складається з (К)-(п), зазначених нижче. (К) Антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, показану будь-якою однією з БЕО ІЮ МОБ: 6-33; () Антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має делецію, заміщення, вставку та/або додавання від їЇ до 5 нуклеотидів в нуклеотидну послідовність, показану будь-якою однією з БЕО ІЮО МО: 6-33, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини; (т) Антисенсовий олігомер, який має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 80 9о ідентичність з нуклеотидною послідовністю будь-якої одної з 5ЕО ІЮ МО: 6-33, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини; та (п) Антисенсовий олігомер, який гібридизує в жорстких умовах до олігонуклеотиду, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, показаної будь-яким одним з ЗЕО ІЮ МО: 6-33, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини.
Антисенсові олігомери від (І) до (п) зокрема, представляють собою мутантів антисенсового олігомеру (К), та є призначеними відповідати мутаціям гена дистрофіна у пацієнтів, наприклад, поліморфізм.
Крім того, антисенсовий олігомер за представленим винаходом представляє собою антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, яка складається з (0)-(г), зазначених нижче. (о) Антисенсовий олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, показаної будь- якою однією з БЕО ІЮ МО: 6-33; (р) Антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має делецію, заміщення, вставку та/або додавання від 1 до З нуклеотидів в нуклеотидній послідовності, показаної будь-якою однією з ЗЕО ІЮ МО: 6-33, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини; (д) Антисенсовий олігомер, який має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 80 95 ідентичність з нуклеотидною послідовністю будь-якої одної з 5БЕО ІЮ МО: 6-33, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини; та (у) Антисенсовий олігомер, який гібридизує в дуже жорстких умовах до олігонуклеотида, яка складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, показаної будь-якою однією з ЗЕО ІЮ МО: 6-33, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини.
Крім того, антисенсовий олігомер за представленим винаходом представляє собою антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, яка складається з (І)-(Ї), зазначених нижче: () антисенсовий олігомери, який складається з нуклеотидної послідовності будь-якої одної з
ЗЕО І МО: 6-33; або () антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 90 95 ідентичність з нуклеотидною послідовністю будь-якої одної з ЗЕО ІЮ МО: 6-33, та має активність, щоб викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини.
Як використовується в даному документі, термін "антисенсовий олігомер який гібридизує в жорстких умовах" стосується, наприклад, антисенсовий олігомер, отриманий за методикою гібридизації колоній, гібридизації бляшок, саузерн-гібридизації або аналогічною, з використанням як зонда всього або частини олігонуклеотида, що складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 1.
БО Спосіб гібридизації, який може бути використаний, включає способи, описані в, наприклад, "затргоок 4. ВиззеїЇ, Моїесшіаг Сіопіпод: А І арогаїогу Мапиаї Мої. 3, Соїд Зріїпд Нагбог, І арогайогу
Ргезз 2001," "Аивиреї, Сцтепі Ргоїосоїв іп МоІесшаг Віоіоду, Чопп УМіІеу є Зопв5 1987-1997," тощо.
Як використовується в даному документі, термін "жорсткі умови" може означати будь-які з мінімальних жорстких умов, помірних жорстких умов або дуже жорстких умов. Термін "мінімальні жорсткі умови" означає, наприклад, 5х 550 (стандартний сольовий розчин), 5х розчин Денхардта, 0,595 505 (додецилсульфат натрію), 50 96 формамід при 32 "С. Термін "помірні жорсткі умови" означає, наприклад, 5 х 55С, 5 х розчин Денхардта, 0,5 95 505, 50 95 формамід при 42 "С, або 5 х 55С, 1 95 505, 50 мМ Тті5-НОЇ (рН 7,5), 50 96 формамід при 42 С.
Термін "дуже жорсткі умови" означає, наприклад, (1) 5 х З55С, 5 х розчин Денхардта, 0,5 95 505, 60 50 96 формамід при 50 "С, (2) 0,2 х 55С, 0,195 505 при 60 "С, (3) 0,2 х 55С, 0,1 95 505 при
62"С, (4) 0,2х 55С, 0195 505 при 65"С, або (5) 0,1 х 55С, 0,195 505 при 65 "С, але не обмежується цим. За даних умов, очікується, що антисенсовий олігомер з більш високою гомологічністю ефективно будуть отримувати при більш високих температурах, хоча декілька чинників беруть участь в жорсткості гібридизації, включаючи температуру, концентрацію зонда, довжину зонда, іонну силу, час, концентрацію солі та інші, та кваліфіковані фахівці в даній галузі можуть приблизно вибирати дані чинники, щоб досягти аналогічну жорсткість.
Коли комерційно доступні набори використовують для гібридизації, використаною може бути, наприклад, система прямого мічення АІКрпо5 та детектування (СЕ Неайївсаге). В даному випадку, відповідно до приведеного протоколу, після культивування з міченим зондом протягом ночі, мембрану промивають первинним буфером для промивання, який містить 0,1 95 (мас./об.) 5О5 при 55 "С, тим самим, детектуючи гібридизований антисенсовий олігомер. Альтернативно, коли зонд є міченим дігоксигеніном (0105) з використанням комерційно доступного реагенту (наприклад, ПЛР мічена суміш (Коспе Оіадповіїс5), тощо) в продукуванні зонду, що грунтується на всій або частині комплементарної послідовності до нуклеотидної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 3, гіоридизація може бути детектованою з використанням набору для детектування нуклеїнової кислоти БІС (Коспе Оіадповііс5).
На додаток до антисенсового олігомера, описаного вище, інший антисенсовий олігомери, який може бути гібридизованим, включає антисенсові олігомери, які мають 90 95 або більш високу, 91 95 або більш високу, 92 95 або більш високу, 93 95 або більш високу, 94 95 або більш високу, 95 95 або більш високу, 96 95 або більш високу, 97 95 або більш високу, 98 95 або більш високу, 99 95 або більш високу, 99,1 95 або більш високу, 99,2 95 або більш високу, 99,3 95 або більш високу, 99,4 95 або більш високу, 99,5 95 або більш високу, 99,6 96 або більш високу, 99,7 95 або більш високу, 99,8 95 або більш високу, та 99,9 95 або більш високу ідентичність з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1 або 2, як розраховано з використанням програмного забезпечення щодо пошуку гомологічності, такого як ЕАЗТА та ВІ А5Т, використовуючи за замовченням значення параметрів.
Ідентичність між нуклеотидними послідовностями може бути визначена з використанням
ЕА5ТА (5сіепсе 227 (4693): 1435-1441, (1985)) або алгоритму ВІ А5Т (Вабвіс І оса! АїЇїдптепі зЗеагсі Тоої) Кагійп та Ай5спиї (Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 872264-2268, 1990; Ргос. Маї!. Асад. 5сі.
Зо ИБА 90: 5873, 1993). Програми, названі Біавіп, ріавзіх, (ріазіп та (Фіавзіх, які грунтуються на алгоритмі ВГА5Т, були розроблені (Айбспи! 5, еї а: 9. Мої. Віої. 215: 403, 1990). Коли нуклеотидну послідовність секвенують, використовуючи бБіазіп, параметри є, наприклад, бал-100 та довжина слова-12. Коли використовують програми ВІ А5Т та Саррей ВІ А5Т, для кожної програми використовуються параметри за замовчуванням.
Термін "викликати пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини" призначений означати, що шляхом зв'язування антисенсового олігомера за представленим винаходом із сайтом, що відповідає екзону 51 транскрипта (наприклад, пре-мРНК) гена дистрофіна людини, наприклад, нуклеотидна послідовність, яка відповідає 5' кінцю екзона 53 сплайсується в нуклеотидну послідовність, яка відповідає 3' кінцю екзона 50 у пацієнтів з ОМО з делецією екзона 52, коли транскрипт піддається сплайсингу, таким чином, призводячи в результаті до формування зрілої
МРНК, яка є вільною від зсуву кодону рамки.
В даному документі, термін "зв'язування", описаний вище, є призначеним означати, що коли антисенсовий олігомер за представленим винаходом змішують з транскриптом гена дистрофіна людини, обидва є гібридизованими в фізіологічних умовах з утворенням подвійного ланцюга нуклеїнової кислоти. Термін "в фізіологічних умовах" стосується умов, встановлених для імітації навколишнього середовища іп мімо з точки зору рН, сольового складу та температури. Умови, наприклад, представляють собою від 25 до 40 "С, переважно 37 "С, рН від 5 до 8, переважно рн 7,4 та 150 мМ концентрація хлориду натрію.
Чи викликається пропуск екзона 51 в гені дистрофіна людини, чи ні, може бути підтверджено шляхом введення антисенсового олігомера за представленим винаходом в клітину експресії дистрофіну (наприклад, в клітини рабдоміосаркоми людини), ампліфікуючи ділянку, яка оточує екзон 51 мРНК гена дистрофіна людини, із загальної РНК клітини експресії дистрофіну за допомогою ОТ-ПЛР, та виконуючи гніздовий ПЛР або аналіз послідовності на ПЛР ампліфікованому продукті.
Ефективність пропуску може бути визначена наступним чином. мРНК для гена дистрофіна людини збирають з досліджуваних клітин; в МРНК вимірюють рівень полінуклеотиду "А" групи, де пропуск екзона 51 пропускається, та рівень полінуклеотиду "В" групи, де екзон 51 не пропускається. За допомогою даних виміряних значень "А" та "В, " ефективність обчислюється за наступним рівнянням: бо Ефективність пропуску (95) - АДЛАжВ) х 100
Переважно, антисенсовий олігомер за представленим винаходом спричиняє пропуск екзона 51 з ефективністю 10 95 або вище, 20 95 або вище, 30 95 або вище, 40 95 або вище, 50 95 або вище, 60 95 або вище, 70 95 або вище, 80 95 або вище, та 90 95 або вище.
Для розрахунку ефективності пропуску можна послатись на Міжнародну публікацію УМО 2012/029986.
Антисенсовий олігомер за представленим винаходом включає, наприклад, олігонуклеотид, морфоліноолігомер або пептидну нуклеїнову кислоту (РМА), яка має довжину від 16 до 35 нуклеотидів. Довжина переважно становить від 19 до 32, від 20 до 31, 21 або 30 нуклеотидів, та морфоліноолігомери є переважними.
Олігонуклеотид, описаний вище (далі в даному документі зазначається як "олігонуклеотид за представленим винаходом") представляє собою антисенсовий олігомер за представленим винаходом, який складається з нуклеотидів, як складових одиниць. Такі нуклеотиди можуть представляти собою будь-які з рибонуклеотидів, дезоксирибонуклеотидів та модифікованих нуклеотидів.
Модифікований нуклеотид стосується нуклеотиду, який має повністю або частково модифіковані нуклеїнові основи, цукрові фрагменти та/або зв'язуючі фосфат ділянки, які складають рибонуклеотид або дезоксирибонуклеотид.
В представленому винаході, нуклеїнова основа включає, наприклад, аденін, гуанін, гіпоксантин, цитозин, тимін, урацил та їх модифіковані основи. Приклади таких модифікованих основ включають, але не обмежуються цим, псевдоурацил, З-метилурацил, дигідроурацил, 5- алкілцитозини (наприклад, 5-метилцитозин), 5-алкілурацили (наприклад, 5-етилурацил), 5- галогенурацили (5-бромурацил), б-азапіримідин, б-алкілпіримідини (б-метилурацил), 2- тіоурацил, 4-тіоурацил, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигідроксиметил)урацил, 5- карбоксиметиламінометил-2-тіоурацил, 5-карбоксиметиламінометилурацил, 1-метиладенін, 1- метилгіпоксантин, 2,2-диметилгуанін, З-метилцитозин, 2-метиладенін, 2-метилгуанін, Мб- метиладенін, 7-метилгуанін, 5-метоксіамінометил-2-тіоурацил, 5-метиламінометилурацил, 5- метилкарбонілметилурацил, 5-метилоксіурацил, 5-метил-2-тіоурацил, 2-метилтіо-Мб- ізопентеніладенін, урацил-5-оксіоцтову кислоту, 2-тіоцитозин, пурин, 2,6-діамінопурин, 2- амінопурин, ізогуанін, індол, імідазол, ксантин, тощо.
Зо Модифікація цукрового фрагмента може включати, наприклад, модифікації в 2'-положенні рибози та модифікації в інших положеннях цукру. Модифікація в 2'- положенні рибози включає заміщення 2'-ОН рибози на ОВ, В, ЕКОН, 5Н, 58, МН», МНА, МА», Мз, СМ, РЕ, СІ, Вг або І, де Кк представляє собою алкіл або арил, та ЕК" представляє собою алкілен.
Модифікація в інших положеннях цукру включає, наприклад, заміщення О в 4" положенні рибози або дезоксирибози на 5, зв'язування між 2' та 4" положеннями цукру, наприклад, І МА (з'єднана нуклеїнова кислота) або ЕМА (2-0, 4-б-етилен-місткові нуклеїнові кислоти), але не обмежується цим.
Модифікація зв'язуючої фосфат ділянки включає, наприклад, модифікацію заміщення фосфодискладноефірного зв'язку на фосфоротіоатний зв'язок, фосфородитіоатний зв'язок, алкілфосфонатний зв'язок, фосфорамідатний зв'язок або боранофосфатний зв'язок (Епуа еї аї.:
Віоогдапіс 4. Медісіпа! Спетівігу, 2008, 18, 9154-9160) (дивіться, наприклад, дарап ботевіїс Не-
Рибіїсацнопв5 ої РСТ Арріїсайоп МоМо 2006/129594 та 2006/038608).
В даному винаході, алкіл переважно представляє собою лінійний або розгалужений алкіл, який має від 1 до 6 атомів вуглецю. Конкретні приклади включають метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, ізопентил, неопентил, трет- пентил, н-гексил та ізогексил. Алкіл необов'язково може бути заміщеним. Приклади таких замісників включають галоген, алкокси, ціано та нітро. Алкіл може бути заміщеним від 1 до З замісниками.
В даному винаході, циклоалкіл переважно представляє собою циклоалкіл, який має від 5 до 12 атомів вуглецю. Конкретні приклади включають циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклодецил та циклододецил.
В даному винаході, галоген включає фтор, хлор, бром та йод.
Алкокси представляє собою лінійний або розгалужений алкокси, який має від 1 до 6 атомів вуглецю, такі як метокси, етокси, н-пропокси, ізопропокси, н-бутокси, ізобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентилокси, ізопентилокси, н-гексилокси, ізогексилокси, тощо. Серед інших, переважним є алкокси, який має від 1 до З атомів вуглецю.
В даному винаході, арил переважно представляє собою арил, який має від 6 до 10 атомів вуглецю. Конкретні приклади включають феніл, с-нафтил та В-нафтил. Серед іншого, переважним є феніл. Арил може бути необов'язково заміщеним. Приклади таких замісників включають алкіл, галоген, алкокси, ціано та нітро. Арил може бути заміщеним від одного до трьох таких замісників.
В даному винаході, алкілен переважно представляє собою лінійний або розгалужений алкілен, який має від 1 до 6 атомів вуглецю. Конкретні приклади включають метилен, етилен, триметилен, тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен, 2-(етилутриметилен та 1- (метил)тетраметилен.
В даному винаході, ацил включає лінійний або розгалужений алканоїл або ароїл. Приклади алканоїла включає форміл, ацетил, 2-метилацетил, 2,2-диметилацетил, пропіоніл, бутирил, ізобутирил, пентаноїл, 2,2-диметилпропіоніл, гексаноїл, тощо. Приклади ароїла включають бензоїл, толуоїл та нафтоїл. Ароїл може бути необов'язково заміщеним в положеннях, які здатні для заміщення, та може бути заміщеним алкілом(ами).
Переважно, олігонуклеотид за представленим винаходом представляє собою антисенсовий олігомер за представленим винаходом, який містить складову одиницю, представлену загальною формулою, зазначеною нижче, в якій -ОН група в положенні 2' рибози є заміщеною метокси, та зв'язуюча фосфат ділянка представляє собою фосфоротіоатний зв'язок: ше ще а о мим, Основа
У - фанів й х й в якій основа представляє собою нуклеїнову основу. ї
Олігонуклеотид за представленим винаходом може бути легко синтезований з використанням різних автоматизованих синтезаторів (наприклад, АКТА оїїдоріїї ріи5 10/100 (СЕ
Неанйсаге)). Альтернативно, синтез може бути також покладено на організацію третьої сторони (наприклад, Рготеда Іпс., Такага Со., або дарап Віо бегмісе Со.), тощо.
Морфоліноолігомер за представленим винаходом представляє собою антисенсовий олігомер за представленим винаходом, який містить складову одиницю, представлену загальною формулою, зазначеною нижче: дл
М
.
З о Основа 4 І 3 р
Ї ли де основа таке саме значення, як визначено вище, та,
МУ представляє собою групу, показану за допомогою будь-якої з наступних груп:
гли лллие лялаАлиИ | ж р | дптрі---Х ши | ' Ї А лллг лллг лялле лллг де Х представляє собою -СНеВ", -0-СНеВ'", -5-СНеВ", -МА2ВЗ або Е;
В' представляє собою Н або алкіл;
В? та РУ, які можуть бути однаковими або різними, кожен представляє собою Н, алкіл, циклоалкіл або арил;
У: представляє собою 0, 5, СНг або МЕ";
Уг представляє собою 0, 5 або МЕ"; 2 представляє собою О або 5.
Переважно, морфоліноолігомер представляє собою олігомер, який містить складову одиницю, представлену загальною формулою, зазначеною нижче (фосфородіамідатний морфоліноолігомер (далі в даному документі зазначається як ""МО")). бра в ОО
Мо
В Мо. «Основна
М
Е де, К2 та ЕЗ мають такі самі значення, як визначено вище.
Морфоліноолігомер за представленим винаходом включає морфоліноолігомер, який містить повністю або частково модифіковані нуклеїнові основи, морфолінові кільцеві фрагменти, зв'язуючі фосфат ділянки, 3'-кінець та/або 5'-кінець, які складають морфоліноолігомер.
Модифікація зв'язуючої фосфат ділянки включає, наприклад, модифікацію заміщення з фосфородіамідатним зв'язком, фосфоротіоатним зв'язком, фосфородитіоатним зв'язком, алкілфосфонатним зв'язком, фосфорамідатним зв'язком та боранофосфатним зв'язком (Епуа еї а).: Віоогдапіс в Медісіпа! Снетівігу, 2008, 18, 9154-9160) (дивись, наприклад, місцева японська перепублікація заявок РСТ МеМо 2006/129594 та 2006/038608).
Морфоліноолігомер може бути отриманий відповідно до, наприклад, М/О 1991/009033 або
УМО 2009/064471. Зокрема, РМО може бути отриманий відповідно до процедури, описаної в УМО 2009/064471 та отриманий за способом, показаним нижче.
ІСпосіб отримання РМО)
Варіант здійснення РМО представляє собою, наприклад, сполуку, представлену загальною формулою (І), зазначеною нижче (далі в даному документі РМО (1)). й Що зе ся еНОВОа що в М Основа м 13 В де основа, К: та ЕЗ мають такі самі значення, як визначено вище; та,
п дорівнює цілому числу від 1 до 99, переважно цілому числу від 24 до 34, від 27 до 31 або від 28 до 30, переважно 29.
РМО (І) можуть отримувати відповідно до відомого способу, наприклад, можуть отримувати шляхом виконання процедур, описаних в наступних стадіях.
Сполуки та реагенти, використовувані в описаних нижче стадіях, не мають особливих обмежень, оскільки вони загальноприйнято використовуються для отримання РМО.
Крім того, всі наступні стадії можуть бути виконані, застосовуючи рідинофазний спосіб або твердофазний спосіб (з використанням посібників або комерційно доступних твердофазних автоматичних синтезаторів). При отриманні РМО застосовуючи твердофазний спосіб, бажаним є використовувати автоматизовані синтезатори, приймаючи до уваги прості процедури роботи та точність синтезу. (1) Стадія А:
Сполуку, представлена загальною формулою (І), зазначеною нижче, (далі в даному документі зазначається, як сполука (ІЇ)) піддають взаємодії з кислотою з утворенням сполуки, представленою загальною формулою (Ії), зазначеною нижче (далі в даному документі зазначається, як сполука (ПІ):
І (В) |В (8) у чу шву рн о М-В й киспота м д й -6О и що "и ва зу то ши й
Що м (1 ! (т) й в якому п, К2 та ЕЗ мають такі самі значення, як визначено вище; кожен ВР незалежно представляє собою нуклеїнову основу, який може бути необов'язково захищеним;
Т представляє собою тритил, монометокситритил або диметокситритил; та,
Ї представляє собою водень, ацил або групу, представлену загальною формулою (ІМ), зазначеною нижче (далі в даному документі зазначається як група (ІМ)). ах) "Нуклеїнова основа" для ВР включає таку саму "нуклеїнову основу" як в основі, за умови, що аміно або гідрокси група в нуклеїновій основі, показаній як ВР, можуть бути захищеними.
Така захисна група для аміно не обмежується конкретними представниками, оскільки вона використовується як захисна група для нуклеїнової кислоти. Конкретні приклади включають бензоїл, 4-метоксибензоїл, ацетил, пропіоніл, бутирил, ізобутирил, фенілацетил,
Зо феноксиацетил, 4-трет-бутилфеноксіацетил, 4-ізопропілфеноксіацетил та (диметиламіно)метилен. Конкретні приклади захисних груп для гідрокси групи включають 2- ціаноетил, 4-нітрофенетил, фенілсульфонілетил, метилсульфонілетил та триметилсилілетил, та феніл, які можуть бути заміщеним від 1 до 5 електронакцепторними групами в необо'язково прийнятних для заміщення положеннях, дифенілкарбамоїл, диметилкарбамоїл, дієтилкарбамоїл, метилфенілкарбамоїл, 1-піролідинілкарбамоїл, морфолінокарбамоїл, 4-(трет- бутилкарбокси)бензил, 4-І((диметиламіно)карбокси|бензил та 4-(фенілкарбокси)бензил, (дивись, наприклад, УМО 2009/064471). "Твердий носій" не обмежується конкретними представниками, оскільки він представляє собою носій прийнятний для реакції в твердій фазі нуклеїнових кислот. Бажаним для твердих носіїв є мати наступні властивості: наприклад, (ії) є помірно розчинними в реагентах, які можуть бути використані для синтезу морфолінових похідних нуклеїнових кислот (наприклад, дихлорметан, ацетонітрил, тетразол, М-метилімідазол, піридин, оцтовий ангідрид, лютидин, трифтороцтова кислота); (ії) є хімічно стабільними до реагентів, прийнятних для синтезу морфолінових похідних нуклеїнової кислоти; (ії) може бути хімічно модифікованими; (їм) може бути наповненим бажаними морфоліновими похідними нуклеїнової кислоти; (м) має міцність, достатню, щоб витримувати високий тиск через обробки; та (м) має однаковий діапазон та розподіл діаметра частинок. Зокрема, здатний до розбухання полістирол (наприклад, амінометилполістирольна смола 1 95 дивінілбензол перехресно зшиті (200-400 меш) (2,4-3,0 ммоль/г) (виробництва компанії ТоКуо СПпетіса! Іпдивігу), амінометильована полістирольна смола: НСІ Ідивінілбензол 1 95, 100-200 мещі (виробництва компанії Реріїде Іпвійшіе, Іпс.)), не здатний до розбухання полістирол (наприклад, Ріітег Биррогі (виробництва компанії СЕ
Неансаге)), полістирол з приєднаним ПЕГ ланцюгом (наприклад, МНо-ПЕТ смола (виробництва компанії Ууаїапаре Спетісаї Со.), Тепіасеї! смола), скло з контрольованим розміром пор (скло з контрольованими порами; СРО) (виробництва компанії, наприклад, СРО), скло з оксаліл- контрольованим розміром пор (дивись, наприклад, А|їмиї еї аї., Мисієїс Асід5 Кезеагсі, Мої. 19, 1527 (1991)), Тепіасе! підложка-амінополіетиленгліколь-деріватізірована підложка (наприклад,
Умгідні ей аї., сї., Теїрапедгоп Іейцег5, Мої. 34, 3373 (1993)) та співполімер Рого5 - полістирол/дивінілбензол. "Лінкер", який може бути використаний, представляє собою відомий лінкер, який широко використовується для з'єднання нуклеїнові кислоти або морфолінових похідних нуклеїнової кислоти. Приклади включають З-амінопропіл, сукциніл, 2,2'-дієтанолсульфоніл "та довголанцюговий алкіламіно (І САА).
Дана стадія може виконуватись шляхом взаємодії сполуки (ІЇ) з кислотою. "Кислота", яка може бути використана на даній стадії включає, наприклад, трифтороцтову кислоту, дихлороцтову кислоту та трихлороцтову кислоту. Кислота, яка використовується, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні, наприклад, від 0,1 молярного еквівалента до 1000 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль сполуки (Ії), переважно в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 100 молярних еквівалентів в розрахунку на 1 моль сполуки (І).
Органічний амін може використовуватись в комбінації з кислотою, описаною вище.
Органічний амін не обмежується конкретними представниками та включає, наприклад, триетиламін. Кількість органічного аміну, який використовується, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від, наприклад, 0,01 молярного еквівалента до 10 молярних еквівалентів, та переважно в діапазоні від 0,1 молярного еквівалента до 2 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль кислоти.
Коли на даній стадії використовують сіль або суміш кислоти та органічного аміну, сіль або
Зо суміш включає, наприклад, сіль або суміш трифтороцтової кислоти та триетиламіну, та більш конкретно, суміш з 1 еквівалента триетиламіну та 2 еквівалентів трифтороцтової кислоти.
Кислота, яка може бути використана на даній стадії, крім того, може бути використаною у вигляді розбавлення відповідним розчинником в концентрації від 0,1 95 до 30 95. Розчинник не обмежується конкретними представниками, оскільки він є інертним щодо реакції, та включає, наприклад, дихлорметан, ацетонітрил, та спирт (етанол, ізопропанол, трифторетанол, тощо), воду, або їх суміш.
Температура реакції в реакції, описаній вище, знаходиться, переважно, в діапазоні від, наприклад, 10 "С до 50 "С, більш переважно, в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та найбільш переважно, в діапазоні від 25 "С до 35 760.
Час реакції може варіювати в залежності від виду кислоти, яку використовують, та температури реакції, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 хвилини до 24 годин в цілому, та переважно в діапазоні від 1 хвилини до 5 годин.
Після завершення даної стадії можуть додавати основу, за необхідністю, щоб нейтралізувати залишкову кислоту в системі. "Основа" не обмежується конкретними представниками та включає, наприклад, діїзопропіламін. Основа, крім того, може бути використаною у вигляді розбавлення відповідним розчинником в концентрації від 0,1 95 (06./06.) до 30 95 (06./06.).
Розчинник, який використовується на даній стадії не обмежується конкретними представниками, оскільки він є інертним по відношенню до реакції, та включає дихлорметан, ацетонітрил, спирт (етанол, ізопропанол, трифторетанол, тощо), воду, та їх суміш. Температура реакції переважно знаходиться в діапазоні від, наприклад, 10 "С до 50 "С, більш переважно, в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та найбільш переважно, в діапазоні від 25 "С до 35 С.
Час реакції може варіювати в залежності від виду основи, яку використовують, та температури реакції, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 хвилини до 24 годин в цілому, та переважно в діапазоні від 1 хвилини до 5 годин.
В сполуці (І), сполуку загальної формули (Іа), зазначеної нижче (далі в даному документі сполука (ІПа)), в якій п дорівнює 1 та Ї представляє собою групу (ІМ), можуть отримувати за наступною процедурою.
твердий косій о
Її є в ж т ще "м ке
Ще й де ВР, Т, лінкер та твердий носій мають такі самі значення, як визначено вище.
Стадія 1:
Сполуку, представлену загальною формулою (МУ), зазначеною нижче, піддають взаємодії з ацилюючим агентом, отримуючи сполуку, представлену загальною формулою (МІ), зазначеною нижче (далі в даному документі зазначається як сполука (МІ)). он ве--(вінкер|--0
Е Р в М ов --- І т і
Т Т
Мі «МІ де ВР, Т та лінкер мають такі самі значення, як визначено вище; та,
В" представляє собою гідрокси, галоген, карбоксильну групу або аміно.
Дана стадія може бути здійснена за відомими способами введення лінкерів, з використанням сполуки (М), як вихідного матеріалу.
Зокрема, сполука, представлена загальною формулою (Міа), зазначеною нижче, можуть отримувати шляхом здійснення способу, відомого як етерифікація, використовуючи сполуку (М) та бурштиновий ангідрид. (в) но то о у її т (У І а) де ВР та Т мають такі самі значення, як визначено вище.
Стадія 2:
Сполуку (МІ) піддають взаємодії з твердим носієм з використанням конденсуючого агента, отримуючи сполуку (Па). ве--Дпінкер|--о Евердні носій; (лінкер|-о зу М о. ве пт Ж С "М М ! І т т
СМІХ І та) 20 . . . . де ВР, В", Т, лінкер та твердий носій мають такі самі значення, як визначено вище.
Дана стадія може виконуватись з використанням сполуки (МІ) та твердого носія відповідно до способу, відомого як реакції конденсації.
В сполуці (ІІ), сполуку, представлену загальною формулою (аг), зазначеною нижче, в якій п дорівнює від 2 до 99 (переважно надане ціле число від 25 до 35, від 28 до 32, або від 29 до 31, переважно 30) та Ї являє собою групу, представлену загальною формулою (ІМ), можуть отримувати шляхом використання сполуки (Іа), як вихідного матеріалу, та повторення стадії А та стадії В способу отримання РМО, описаного в описі, потрібної кількості разів.
о щу ва ди - (В)
КЕ Ї е о К в й 1 «ІІаг); де ВР, Ве, ВУ, Т, лінкер та твердий носій мають такі самі значення, як визначено вище; та, п' представляє собою від 1 до 98 (в конкретному варіанті здійснення, п' дорівнює від 1 до 34, від 1 до 33, від 1 до 32, від 1 до 31, від 1 до 30, від 1 до 29, від 1 до 28, від 1 до 27, від 1 до 26, від 1 до 25, від 1 до 24). (2) Стадія В
Сполуку (ІП) піддають взаємодії з морфоліновою мономерною сполукою в присутності основи, отримуючи сполуку, представлену загальною формулою (МІЇ), зазначеною нижче (далі в даному документі зазначається як сполука (МІЇ)):
Ї В Г. а
ОВ о. ОВ
Т моофолінОоВва маономерна спопука Т
М -ШИШИНиНиНнНнНнН9Н86 6 6 6 ЯЯЯ Я Я ЯЯь Ж5ЗЬ352 З -52ООХх ї ІЧ
Гн. їкя йон о дам о в в 0 еру з "ру
І А ІМ
(111) Н Пом-в-о ам о ве
ІМІЇЇ йо! 1 де ВР, І, п, В2, ВЗ та Т мають такі самі значення, як визначено вище.
Дана стадія може виконуватись шляхом взаємодії сполуки (ІІІ) з морфоліновою мономерною сполукою в присутності основи.
Морфолінова мономерна сполука включає, наприклад, сполуки, представлені загальною формулою (МІЙ), зазначеною нижче: вай 37 М7РнОо т о чу" її т (МІТІ) де ВР, В, ВЗ та Т мають такі самі значення, як визначено вище. "Основа", яка може бути використана на даній стадії, включає, наприклад, діїзопропіламін, триеєтиламін та М-етилморфолін. Кількість основи, яку використовують, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 1000 молярних еквівалентів в розрахунку на 1 моль сполуки (ІІ), переважно, від 10 молярних еквівалентів до 100 молярних еквівалентів в розрахунку на 1 моль сполуки (1).
Морфолінова мономерна сполука та основа, які можуть бути використані на даній стадії, крім того, можуть бути використані у вигляді розбавлення відповідним розчинником в концентрації від 0,195 до 3095. Розчинник не обмежується конкретними представниками,
оскільки він є інертним по відношенню до реакції, та включає, наприклад, М, М- диметилімідазолідон, М-метилпіперидон, ДМФ, дихлорметан, ацетонітрил, тетрагідрофуран, або їх суміш.
Температура реакції переважно знаходиться в діапазоні від, наприклад, 0 "С до 100 "С, та більш переважно, в діапазоні від 10 "С до 50 "С.
Час реакції може варіювати в залежності від виду основи, яку використовують, та температури реакції, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 1 хвилини до 48 годин, в цілому, та переважно в діапазоні від 30 хвилин до 24 годин.
Крім того, після завершення даної стадії, можуть додавати адилюючий агент, якщо це необхідно. "Ацилюючий агент" включає, наприклад, оцтовий ангідрид, ацетилхлорид та феноксіоцтовий ангідрид. Ацилюючий агент, крім того, може використовуватись у вигляді розбавлення відповідним розчинником в концентрації від 0,195 до 3095. Розчинник не обмежується конкретними представниками, оскільки він є інертним по відношенню до реакції, та включає, наприклад, дихлорметан, ацетонітрил, тетрагідрофуран та спирт(и) (етанол, ізопропанол, трифторетанол, тощо), воду, або їх суміш.
За необхідності, основа, така як піридин, лютидин, коллідин, триетиламін, діізопропілетиламін, М-етилморфолін, тощо, крім того, можуть використовуватись в комбінації з ацилюючим агентом. Кількість адилюючого агента знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 молярного еквівалента до 10000 молярних еквівалентів, та переважно в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 1000 молярних еквівалентів. Кількість основи знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від, наприклад, 0,1 молярного еквівалента до 100 молярних еквівалентів, та переважно в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 10 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль ацилюючого агента.
Температура реакції в даній реакції переважно знаходиться в діапазоні від 10 "С до 50 "С, більш переважно, в діапазоні від 10 "С до 50 "С, ще більш переважно, в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та найбільш переважно, в діапазоні від 25 "С до 35 "С. Час реакції може варіювати в залежності від виду ацилюючого агента, який використовують, та температури реакції, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 хвилини до 24 годин в цілому, та переважно в діапазоні від 1 хвилини до 5 годин.
Зо (3) Стадія С:
В сполуці (МІ), отриманій на стадії В, захисну групу видаляють використовуючи агент зняття захисту, отримуючи сполуку, представлену загальною формулою (ІХ). й т . щи й Є. ОО. кОснова ; нка : зві : ши: в зичу Ше ав М см. «Основа жд, М ще я м й в 111) КЕ ЖІ й де основа, В", І, п, В2, ВЗ та Т мають такі самі значення, як визначено вище.
Дана стадія може виконуватись шляхом взаємодії сполуки (МІ) з агентом зняття захисту. "Агент зняття захисту" включає, наприклад, конц. водний розчин аміаку та метиламін. "Агент зняття захисту", який використовують, на даній стадії, крім того, можуть використовуватись як розбавлення, наприклад, водою, метанолом, етанолом, ізопропіловим спиртом, ацетонітрилом, тетрагідрофураном, ДМФ, М, М-диметилімідазолідоном, М-метилпіперидоном, або сумішшю даних розчинників. Серед них, переважним є етанол. Кількість агента зняття захисту, який використовують, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від, 1 молярного еквівалента до 100000 молярних еквівалентів, та переважно в діапазоні від 10 молярних еквівалентів до 1000 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль сполуки (МІ).
Температура реакції знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 15 "С до 75 "С, переважно, в діапазоні від 40 "С до 70 "С, та більш переважно, в діапазоні від 50 "С до 60 "С.
Час реакції зняття захисту може варіювати в залежності від виду сполуки (МІ), температури реакції, тощо, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 10 хвилин до 30 годин, переважно від 30 хвилин до 24 годин, та більш переважно в діапазоні від 5 годин до 20 годин. (4) Стадія 0:
РМО (І) може бути отриманий шляхом взаємодії Сполуки (ІХ) отриманої на стадії С з кислотою:
Ї о. сбснова - Ко : ана і ! | ту дж ! | ! | тр «Оєнеана р У знллхнннннниюнн ньо фр | НІ во З ів М 0 Основа | От ші й -їВ | ! во в зер ук Зенова зва Н о по З де основа, п, Б, ВЗ та Т мають такі самі значення, як визначено вище.
Дана стадія може виконуватись шляхом додавання кислоти до сполуки (ІХ). "Кислота", яка може бути використана на даній стадії включає, наприклад, трихлороцтову кислоту, дихлороцтову кислоту, оцтову кислоту, фосфорну кислоту, соляну кислоту, тощо.
Кислота, яку використовують, відповідним чином, використовують для того, щоб розчин міг мати рН в діапазоні від 0,1 до 4,0, та більш переважно, в діапазоні від рН 1,0 до 3,0. Розчинник не обмежується конкретними представниками, оскільки він є інертним по відношенню до реакції, та включає, наприклад, ацетонітрил, воду, або суміш даних розчинників.
Температура реакції знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 10 "С до 50 "С, переважно, в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та більш переважно, в діапазоні від 25 "С до 35 "С.
Час реакції зняття захисту може варіювати в залежності від виду сполуки (ІХ), температури реакції, тощо, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від О0,ї хвилини до 5 годин, переважно від 1 хвилини до 1 години, та більш переважно в діапазоні від ї хвилини до 30 хвилин.
РМО (І) може бути отриманим шляхом обробки реакційної суміші, отриманої на даній стадії, загальноприйнятими способами розділення та очищення, такими як екстракція, концентрування, нейтралізація, фільтрування, центрифужне розділення, перекристалізація, хроматографія з оберненою фазою на колонці від Св до Сів, катіонообмінна колонкова хроматографія, аніонообмінна колонкова хроматографія, гель-фільтраційна колоночна хроматографія, високоефективна рідинна хроматографія, діаліз, ультрафільтрація, тощо, самостійно або їх комбінацією. Таким чином, потрібний РМО (І) може бути виділений та очищений (дивись, наприклад, УУО 1991/09033).
В процесі очищення РМО (І) з використанням хроматографії з оберненою фазою, наприклад, суміш розчинів 20 мМ триетиламін/«ацетатного буфера та ацетонітрилу може використовуватись як розчинник для елюювання.
В процесі очищення РМО (І) з використанням іонообмінної хроматографії, наприклад, суміш
Зо розчинів 1 М сольового розчину та 10 мМ водного розчину гідроксиду натрію може використовуватись як розчинник для елюювання.
Пептидна нуклеїнова кислота представляє собою олігомер за представленим винаходом, який має групу, представлену наступною загальною формулою, як складову одиницю:
Основа й м-4 ; ; о
Н ті о де основа має таке саме значення, як визначено вище.
Пептидну нуклеїнову кислоту можуть отримувати за посиланням, наприклад, наступні літературні джерела. 1) Р. Е. Мівівзеп, М. Едпо!т, В. Н. Вего, О. Виснагаї, бсіепсе, 254, 1497 (1991) 2) М. Еапо!т, 0. Виспагаї, Р. Е. Мів!Ізеп, В. Н. Вега, дасв., 114, 1895 (1992)
3) К. . Юепоїт, М. Едпоїт, С. ВеНнтгеп5, Ї. СНгівієпзеп, Н. ЕР. Напзеп, Т. Миїріив, К. Н.
Реїегзеп, В. Н. Вего, Р. Е. Мівівеп, О. ВисНагаї, 9. Огу. Снпет., 59, 5767 (1994) 4) У. Спгівіепзеп, В. Ейграйніск, В. сіїдеа, К. Н. Реїегзеп, Н. Е. Напзеп, Т. Коси, М. Едпої!т, 0.
Виснагаї, Р. Е. МівЇзеп, У). Соції, В. Н. Вего, у. Рері. 5сі., 1, 175 (1995) 5) Т. Кос, Н. Е. Напзеп, Р. Апаегзеп, Т. І агзеп, Н. а. Ваїг, К. ОНезоп, Н. Огит, у. Рері. Вев., 49, 80 (1997)
В олігомері за представленим винаходом, 5' кінець може бути будь-якою з хімічних структур (1)-(33), зазначених нижче, та переважно є (3)-ОН.
С ой
Н
МО сНз ХМ сн
Оо-Р-М Оо-Р-М: З
У ! СНз
Фо сн о он (1) (2) (3)
Далі в даному документі групи, показані в (1), (2) та (3) вище зазначаються як "Група (1),;" "Група (2)" та "Група (3)," відповідно. 2. Фармацевтичної композиція
Олігомер за представленим винаходом спричиняє пропуск екзона 51 з більш високою ефективністю в порівнянні з антисенсовими олігомерами з попереднього рівня техніки. Таким чином, очікується, що стани м'язової дистрофії можуть бути полегшені з високою ефективністю шляхом введення фармацевтичної композиції, яка містить олігомер за представленим винаходом, пацієнтам з ОМО, які мають мутацією перетворення в рамку зчитування шляхом пропуску екзона 51, наприклад, пацієнтів з делецією екзона 29-50, пацієнтів з делецією екзона 50, пацієнтів з делецією екзона 45-50, пацієнтів з делецією екзона 48-50, пацієнтів з делецією екзона 49-50, пацієнтів з делецією екзона 52, пацієнтів з делецією екзона 52-63, пацієнтів з делецією екзона 13-50, пацієнтів з делецією екзона 19-50, пацієнтів з делецією екзона 43-50, або пацієнтів з делецією екзона 47-50. Наприклад, коли використовують фармацевтичну композицію, яка містить олігомер за представленим винаходом, то такі самі терапевтичні ефекти можуть бути досягнуті навіть при дозах менших, ніж ті, що для олігомерів з попереднього рівня техніки. Відповідно, побічні ефекти можуть бути зниженими, та таке є економічним.
В іншому варіанті здійснення, представлений винахід передбачає фармацевтичну композицію для лікування м'язової дистрофії, яка містить як активний інгредієнт олігомер за представленим винаходом, його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат (далі в даному
Зо документі зазначається як "композиція за представленим винаходом").
Крім того, представлений винахід передбачає спосіб лікування м'язової дистрофії, який включає введення пацієнту з ОМО олігомера за представленим винаходом.
У зазначеному способі лікування, олігомер за представленим винаходом можуть вводити у вигляді фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії.
Крім того, представлений винахід передбачає застосування олігомера за представленим винаходом у виробництві фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії та застосування олігомер за представленим винаходом для лікування м'язової дистрофії.
Приклади фармацевтично прийнятної солі олігомера за представленим винаходом, що міститься в композиції за представленим винаходом, включають солі лужних металів, такі як солі натрію, калію та літію; солі лужноземельних металів, такі як солі кальцію та магнію; солі металів, такі як солі алюмінію, заліза, цинку, міді, нікелю, кобальту тощо; солі амонію; солі органічних амінів, такі як солі трет-октиламіну, дибензиламіну, морфоліну, глюкозаміну, алкілового складного ефіру фенілгліцину, етилендіаміну, М-метилглюкаміну, гуанідину, діетиламіну, триетиламіну, дициклогексиламіну, М, М'-дибензилетилендіаміну, хлорпрокаїну, прокаїну, діетаноламіну, М-бензилфенетиламіну, піперазину, тетраметиламонію, три(гідроксиметил)амінометану; гідрогалоїдні солі, такі як солі гідрофторидів, гідрохлоридів, гідробромідів та гідройодідів; солі неорганічної кислоти, такі як нітрати, перхлорати, сульфати, фосфати, тощо; нижчі алкансульфонати, такі як метансульфонати, трифторметансульфонати та етансульфонати; арилсульфонати, такі як бензолсульфонати та п-толуолсульфонати; солі органічної кислоти, такі як ацетати, малати, фумарати, сукцинати, цитрати, тартрати, оксалати,
малеати, тощо; та солі амінокислоти, такі як солі гліцину, лізину, аргініну, орнітину, глутамінової кислоти та аспарагінової кислоти. Дані солі можуть бути одержані за відомими способами.
Альтернативно, олігомер за представленим винаходом, який міститься в композиції за представленим винаходом може бути у вигляді свого гідрату.
Шляхи введення композиції за представленим винаходом не обмежується конкретними способами, оскільки вони є фармацевтично прийнятними шляхами введення, та можуть бути вибраними в залежності від способу лікування. З огляду на легкість доставки в м'язові тканини, переважним Є внутрішньовенне введення, внутрішньоартеріального введення, внутрішньом'язове введення, підшкірне введення, пероральне введення, введення в тканини, трансдермальне введення, тощо. Крім того, дозовані форми, які є доступними для композиції за представленим винаходом, не обмежується конкретними представниками, та включають, наприклад, різні ін'єкції, пероральні агенти, крапельні внутрішньовенні вливання, інгаляції, мазі, лосьйони, тощо.
При введенні олігомера за представленим винаходом пацієнтам з м'язовою дистрофією, композиція за представленим винаходом може містити носій, який сприяє доставці олігомера до м'язових тканин. Такий носій не обмежується конкретними представниками, оскільки він є фармацевтично прийнятним, та приклади включають катіонні носії, такі як катіонні ліпосоми, катіонні полімери, тощо, або носії, що використовують вірусну оболонку. Катіонні ліпосоми представляють собою, наприклад, ліпосоми, які складаються З 2-0-(2- діетиламіноетил)карабамоїл-1,3-О-діолеїлгліцерину, та фосфоліпіди як основних компонентів (далі в даному документі зазначається як "ліпосома А"), олігофектамін (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії Іпмйгодеп Согр.), ліпофектин (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії Іпмйгодеп Согр.), ліпофектамін (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії Іпмігодеп Согр.), ліпофектамін 2000 (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії Іпийгодеп Согр.), ОМАКЧЕ-С (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії Іпмігодеп Согр.), сСепезііепсег (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії
Сепе Тпегару бузієетв5), ТтапеМеззепдег (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії
ОІАСЕМ, Іпс.), Тгтап5ІТ ТКО (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії Міги5) та
Мисіеотесіог ІІ (Гоп7а). Серед іншого, переважним є ліпосома А. Приклади катіонних полімерів
Зо включають еїбі (зареєстрована торгова марка) (виробництва компанії ОБбіодепе, Іпс.) та Уеї-РЕЇ (зареєстрована торгова марка) (поліетиленамін, виробництва компанії ОБіодепе, Іпс.).
Прикладом носія з використанням вірусної оболонки є СепотеОпе (зареєстрована торгова марка) (НМО-Е ліпосома, виробництва компанії Ісєпіпага Запдуо). Альтернативно, медичні пристрої, описані в патенті Японії Мо 2924179 та катіонні носії, описані в японській місцевій перепублікації заявок РСТ МоМо 2006/129594 та 2008/096690, також можуть використовуватись.
Для отримання більш детальної інформації можна послатись на патент США Мо 4,235,871, патент США Мо 4,737,323, МО 96/14057, "Мем ККС, Гірозотев: А ргасіїса! арргоасиі, ІНІ Ргевв5,
Охгога (1990) радез 33-104", тощо.
Концентрація олігомера за представленим винаходом, який міститься в композиції за представленим винаходом, може варіювати в залежності від виду носія, тощо, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 нМ до 100 мкМ, переважно в діапазоні від 100 нМ до 10
МКМ. Масове співвідношення олігомера за представленим винаходом, який міститься в композиції за представленим винаходом, та носія (носій/«антисенсовий олігомер за представленим винаходом) може варіювати в залежності від властивості олігомеру, типу носія, тощо, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 до 100, переважно в діапазоні від 0,1 до 10.
На додаток до олігомер за представленим винаходом та носія, описаного вище, фармацевтично прийнятні добавки також можуть бути необов'язково включені в композицію за представленим винаходом. Приклади таких добавки включають емульгуючі допоміжні речовини (наприклад, жирні кислоти, які мають від 6 до 22 атомів вуглецю та їх фармацевтично прийнятні солі, альбумін та декстран), стабілізатори (наприклад, холестерин та фосфатидну кислоту), ізотонічні агенти (наприклад, хлориду натрію, глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу), та рН контролюючі агенти (наприклад, соляну кислоту, сірчану кислоту, фосфорну кислоту, оцтову кислоту, гідроксид натрію, гідроксид калію та триетаноламін). Одна або більше з даних добавок може використовуватись. Вміст добавок в композиції за представленим винаходом становить, відповідним чином, 90 мас. 95 або менше, переважно 70 мас. 95 або менше та більш переважно, 50 мас. 95 або менше.
Композиція за представленим винаходом може бути отримана шляхом додавання олігомера за представленим винаходом до дисперсії носія та достатнього перемішування суміші. Добавки 60 можуть бути додані на відповідній стадії або перед або після додавання олігомера за представленим винаходом. Водний розчинник, який може використовуватись в додаванні олігомера за представленим винаходом, не обмежується конкретними представниками, оскільки він є фармацевтично прийнятним, та приклади включають воду для ін'єкцій або дистильовану воду для ін'єкцій, електролітні рідини, такі як фізіологічний сольовий розчин, тощо, та рідини, які містять цукри, такі як глюкозна рідина, мальтозна рідина, тощо.
Кваліфікований фахівець в даній галузі може, відповідним чином, вибрати умови щодо рнН та температури для такої речовини.
Композицію за представленим винаходом можуть отримувати, наприклад, в рідкій формі та як її ліофілізований препарат. Ліофілізований препарат можуть отримувати за рахунок ліофілізації композиції за представленим винаходом в рідкій формі за загальноприйнятим способом. Ліофілізація може виконуватись, наприклад, шляхом відповідної стерилізації композиції за представленим винаходом в рідкій формі, розливу аліквоти в ємність контейнера, здійснення попереднього заморожування протягом 2 годин за умов приблизно від -40 до -20 "С, здійснення первинного висушування при приблизно від 0 до 10 "С при зниженому тиску, та потім здійснення вторинного висушування при приблизно від 15 до 25 "С при зниженому тиску.
Загалом, ліофілізований препарат композиції за представленим винаходом може бути отриманим шляхом заміщення вмісту флакона на газоподібний азот та закупорювання.
Ліофілізований препарат композиції за представленим винаходом може використовуватись в цілому з моменту відновленні шляхом додавання необов'язкового прийнятного розчину (рідина для відновлення) та повторного розчинення препарату. Така рідина для відновлення включає воду для ін'єкції, фізіологічний сольовий розчин та інші інфузійні рідини. Об'єм рідини для відновлення може варіювати в залежності від призначеного застосування, тощо, не обмежується конкретними об'ємами, та становить відповідно від 0,5 до 2 рази більше, ніж об'єм перед ліофілізацією або не більше 500 мл.
Бажаним є контролювати дозу композиції за представленим винаходом, яка вводиться, шляхом прийняття до уваги наступних чинників: тип та дозована форма, що містить олігомер за представленим винаходом; стан пацієнтів, включаючи вік, масу тіла, тощо; шлях введення; та характеристики та ступінь захворювання. Добова доза розраховується як кількість антисенсового олігомера за представленим винаходом, яка, як правило, знаходиться в діапазоні від 0,1 мг до 10 г/людина, та переважно від 1 мг до 1 г/людина. Даний числовий діапазон може варіювати в деяких випадках в залежності від типу цільового захворювання, способу введення та цільової молекули. Таким чином, доза нижче, ніж діапазон, може бути достатньою в деяких випадках та навпаки в деяких випадках необхідною може бути доза вища, ніж діапазон. Композиція може вводитись від одного до декількох разів на день або з інтервалом від одного дня до декількох днів.
В ще одному варіанті варіант здійснення композиції за представленим винаходом, передбачається фармацевтична композиція, яка містить вектор, здатний експресувати олігонуклеотид за представленим винаходом та носій, описаний вище. Такий вектор експресії може представляти собою вектор здатний експресувати безліч олігонуклеотидів за представленим винаходом. Композиція може бути сформульованою з фармацевтично прийнятними добавками як у випадку композиції за представленим винаходом, яка містить олігомер за представленим винаходом. Концентрація вектора експресії, який міститься в композиції, може варіювати в залежності від типу носія, тощо, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 нМ до 100 мкМ, переважно в діапазоні від 100 нМ до 10 мкМ. Масове співвідношення вектора експресії, який міститься в композиції, та носія (носій/вектор експресії) може варіювати в залежності від властивості вектора експресії, типу носія, тощо, та знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 до 100, переважно в діапазоні від 0,1 до 10.
Вміст носія, який міститься в композиція, є таким самим як у випадку з композицією за представленим винаходом, яка містить олігомер за представленим винаходом, та спосіб її отримання також є таким самим, як у випадку з композицією за представленим винаходом.
Далі в даному документі, представлений винахід буде описаний більш детально з посиланням на приклади та приклади дослідження, зазначені нижче, але не слід вважати, що винахід обмежується ними.
ПРИКЛАДИ
ІПРИКЛАД ПОРІВНЯННЯ 11 4-Д(25,68)-6-(4-Бензамідо-2-оксопіримідин-1-іл)-4-тритилморфолін-2-іл|метокси)-4- оксобутанова кислота завантажена на амінополістирольну смолу
Стадія 1: Отримання 4-Щ(25,68)-6-(4-бензамідо-2-оксопіримідин-1 (2Н)-іл)-4- тритилморфолін-2-іл|метокси)-4-оксобутанової кислоти
В атмосфері аргону, 3,44 г М-1-(28,65)-6-(гідроксіметил)-4- тритилморфолін-2-іл|-2-оксо- 1,2-дигідропіримідин-4-іл)бензамід та 1,1 г 4-диметиламінопіридину (4-ЮОМАР) суспендували в 50 мл дихлорметану, та 0,90 г бурштинового ангідриду додавали до суспензії з наступним перемішуванням при кімнатній температурі протягом З годин. До реакційної суміші додавали 10 мл метанолу, та суміш концентрували при зниженому тиску. Залишок екстрагували, використовуючи етилацетат та 0,5 М водний розчин дигідрофосфату калію. Отриманий в результаті органічний шар промивали послідовно 0,5 М водним розчином дигідрофосфату калію, водою та насиченим сольовим розчином в зазначеному порядку. Отриманий в результаті органічний шар сушили над сульфатом натрію та концентрували при зниженому тиску, отримуючи 4,0 г продукту.
Стадія 2: Отримання 4-(25,6Н8)-6-(4-бензамідо-2-оксопіримідин-1-іл)-4- тритилморфолін-2- іл|Іметокси)-4-оксобутанової кислоти, завантаженої на амінополістирольну смолу.
Після того, як 4,0 г 4--К(25,68)-6-(4-бензамідо-2-оксопіримідин-1(2Н)-іл)-4- тритилморфолін- 2-іл|метокси)-4-оксобутанової кислоти розчиняли в 200 мл піридину (безводного), 0,73 г 4-ОМАР та 11,5 г 1-етил-3-(З-диметиламінопро- піл/укарбодіїміду гідрохлориду додавали до розчину.
Потім, 25,0 г амінополістирольної смоли первинної підложки 200 аміно (виробництва СЕ
Неайнсаге дарап Со., І а., 17-5214-97) та 8,5 мл триетиламіну додавали до суміші, з наступним перемішуванням при кімнатній температурі протягом 4-х днів. Після завершення реакції, смолу виймали застосовуючи фільтрацію. Отриману в результаті смолу промивали послідовно піридином, метанолом та дихлорметаном в зазначеному порядку, та сушили при зниженому тиску. До отриманої в результаті смоли додавали 200 мл тетрагідрофурану (безводного), 15 мл оцтового ангідриду та 15 мл 2,6-лютидину, та суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин. Смолу виймали застосовуючи фільтрацію, промивали послідовно піридином, метанолом та дихлорметаном в зазначеному порядку та сушили при зниженому тиску, отримуючи 26,7 г продукту.
Кількість завантаження продукту визначали з молярної кількості тритилу на г смоли шляхом вимірювання Уф-поглинання на 409 нм з використанням відомого способу. Кількість завантаження смоли становила 192,2 мкмоль/г.
Умови УФ вимірювання
Зо Пристрій: О-2910 (Нітасні, Па.)
Розчинник: метансульфонова кислота
Довжина хвилі: 265 нм є значення: 45000
Відповідно до опису в прикладах 1, 2 та прикладі порівняння 1, зазначених нижче, були синтезовані РМО, показані як РМО МоМо 1-3 в таблиці 1. Синтезовані РМО розчиняли у воді для ін'єкції (виробництва компанії Ої5зиКа Рпагтасеціїса! Расіогу, Іпс.).
Таблиця 1 ЛеРМО | о Зазначення.:.7/:. | 5ЕОЮМ: патентному документі 3, 5' кінець: група (3)
ІПриклад 1)
РМО Ме 1 02 г 4-((25,68)-6-(4-бензамід-2-оксопіримідин-1(2Н)-іл)-4- тритилморфолін-2-іл|метокси)-4- оксобутанової кислоти, нанесеної на амінополістирольну смолу (Приклад порівняння 1) (26 мкмоль) завантажували в колонку з фільтруючим мундштуком. Потім синтетичний цикл, зображений нижче починали, використовуючи установку з синтезу нуклеїнової кислоти (АКТА
Оіїдоріої 10 рій). Потрібну морфолінову мономерну сполуку додавали в кожному циклі сполучення, отримуючи нуклеотидну послідовність названої сполуки (дивись таблицю 2, наведену нижче).
Таблиця 2
ШЕ се нт СВНА НИЙ НВ Ш реагенти, які додавали на стадіях З та 4 06 | ацегонтрил.//////77777777777711111111Ї11111111201 0007 | розчиндлякепрування.//-:/ / | 81171120 08 | ацегонтрил./////777777777777771111111Ї11111111301 ЇЇ 201
Деблокуючий розчин, який використовували, представляв собою розчин дихлорметану, який містив З 95 (мас./об.) трифтороцтової кислоти. Розчин для нейтралізації та промивання, який використовували, представляв собою розчин, отриманий шляхом розчинення М, М- дізопропілетиламіну, щоб становити 10 95 (06./06.) та тетрагідрофурану, щоб становити 5 95 (об./06.) в дихлорметані, який містив 35 95 (06б./06.) ацетонітрилу. Розчин для сполучення А, який використовували, представляв собою розчин, отриманий шляхом розчинення морфолінової мономерної сполуки в тетрагідрофурані, щоб становити 0,10 М. Розчин для сполучення В, який використовували, представляв собою розчин, отриманий шляхом розчинення М, М- діїізопропілетиламіну, щоб становити 20 95 (об./06.) та тетрагідрофурану, щоб становити 10 95 (06./06.) в ацетонітрилі. Розчин для кепірування, який використовували, представляв собою розчин, отриманий шляхом розчинення 20 95 (0б./06.) оцтового ангідриду та
ЗО 95 (о6./06.) 2,6-лютидину в ацетонітрилі.
Амінополістирольну смолу, завантажену з РМО, синтезованим вище, виділяли з реакційної ємності та сушили при кімнатній температурі протягом щонайменше 2 годин при зниженому тиску. Висушений РМО, нанесений на амінополістирольну смолу, завантажували в реакційну ємність, та 5 мл суміші 28 95 водний аміак-етанол (1/4) додавали туди. Суміш перемішували при 55 "С протягом 15 годин. Амінополістирольну смолу відокремлювали фільтрацією та промивали 1 мл суміші вода-етанол (1/4). Отриманий в результаті фільтрат концентрували при зниженому тиску. Отриманий в результаті залишок розчиняли в 10 мл суміші розчинників з 20 мМ оцтової кислоти - триетиламінового буфера (ТЕАА буфер) та 10 мл ацетонітрилу (4/1) та фільтрували через мембранний фільтр. Отриманий фільтрат чистили, використовуючи ВЕРХ з оберненою фазою. Умови, які використовували, є такими, як показано в таблиці З нижче.
Таблиця З колонки
СУ: об'єм колонки
Кожну фракцію аналізували, та виділяли цільовий продукт та концентрували при зниженому тиску. До концентрованого залишку додавали 0,5 мл 2 М водного розчину фосфорної кислоти, та суміш перемішували протягом 15 хвилин. Крім того, додавали 2 мл 2 М водного розчину
Зо натрію гідроксиду, суміш стала лужної з подальшим фільтруванням через мембранний фільтр (0,45 мкм).
Отриманий в результаті водний розчин, який містить цільовий продукт чистили, використовуючи колонку з аніоннообмінною смолою. Умови, які використовують, є такими, як показано в таблиці 4 нижче.
Таблиця 4 боцгсе 150 (СЕ Неайнсаге, фі0х108 мм, 1 СМ-8,5 мл)
Температура колонки 10 мМ водний розчин натрію гідроксиду
Розчин В 10 мМ водний розчин натрію гідроксиду, 1 М водний розчин хлориду натрію (В) конц. 1-50 95 / 40СУ
Кожну фракцію аналізували (за ВЕРХ) та отримували цільовий продукт у вигляді водного розчину. До отриманого в результаті водного розчину додавали 0,1 М фосфатний буфер (рн 6,0) для нейтралізації. Далі, отриману суміш де мінералізували, використовуючи ВЕРХ з оберненою фазою в умовах, описаних в таблиці 5 нижче.
Таблиця 5
ХВгідде 5 мкм С8 (Умаїег5, ф10х50 мм, 1 СМ-4 мл)
Температура колонки сНніІСМ (В) конц. 0--50 95 / 20СУ
Цільовий продукт виділяли та суміш концентрували при зниженому тиску. Отриманий в результаті залишок розчиняли у воді. Отриманий водний розчин сушили при замороженні, отримуючи цільову сполуку у вигляді білої бавовноподібної твердої речовини.
Е5І-ТОБЕ-М5 Розраховано: 10021,46
Знайдено: 10021,91
ІПриклад 21
РМО Ме 2
Названу сполуку отримували відповідно до процедури з прикладу 1.
Е5І-ТОБЕ-М5 Розраховано: 9916,71
Знайдено: 9916,43
ІПРИКЛАД ПОРІВНЯННЯ 1)
РМО Мо. З
Названу сполуку отримували відповідно до процедури з прикладу 1.
Е5І-ТОБЕ-М5 Розраховано: 9949,46
Знайдено: 9949,41
ІПриклад дослідження 11)
Іп міго аналіз
Експерименти проводили, використовуючи антисенсові олігомери РМО МоМо 1 та 2 за представленим винаходом та антисенсовий олігомер РМО Ме 3. Послідовності різних антисенсових олігомерів наведені в таблиці б нижче.
Таблиця 6
Нуклеотидна послідовність 33111101 Мом
СОСТААСТТСТОТССТСААСОААСАТОССА
СТСАТАССТТСТОСТТСААССААСАТООСА
СТОСААСАТСААССААСАТСССАТТТСТАС
Зо
Використовуючи Атаха Сеї| І іпе Мисіеотесіог Кії І на Мисіеотесіог ІІ (Гопл7а), 0,3, 1, 3, 10 мкМ олігомерів РМО МоМо 1 та 2 за представленим винаходом та антисенсовий олігомер РМО Мо З були трансфіковані з 3,5х105 КО клітин (клітинна лінія рабдоміосаркоми людини).
Використовували програму Т-030.
Після трансфекції клітини культивували протягом трьох днів в 2 мл мінімального есенціального середовища Ігла (ЕМЕМ) (виробництва компанії Зідта, далі в даному документі те ж саме), яке містить 1095 фетальної телячої сироватки (ЕС5) (виробництва компанії
Іпийгодеп) в умовах 37 "С та 5 95 СО». клітини промивали РВЗ (виробництва компанії Мів5иі, далі в даному документі те ж саме) та 500 мкл ІЗОСЕМ ІІ (виробництва компанії Мірроп Сепе) додавали до клітин. Після того, як клітинам давали постояти при кімнатній температурі протягом декількох хвилин, щоб лізувати клітини, лізат збирали в пробірку Еппендорфа.
Загальну РНК екстрагували відповідно до протоколу, що додається до ІЗОСЕМ. Концентрацію екстрагованої загальної РНК визначали з використанням МапоЮгор МО-1000 (виробництва компанії ГМ5).
Одностадійний ОТ-ПЛР проводили з 400 нг екстрагованої загальної КМА, використовуючи набір Оіадеп для одностадійної ОТ-ПЛР (виробництва компанії Оіадеп). Реакційний розчин отримували відповідно до протоколу, що додається до набору. РТО-100 (виробництва компанії
М.) Кезеагсі) використовували як термічний пристрій для керування циклами. ОТ-ПЛР програма, яку використовують, є такою, як наведено далі. 50 "С, 30 хвилин: реакція зворотної транскрипції 95 "С, 15 хвилин: теплова денатурація
І94 "С, 30 секунд; 60 "С, 30 секунд; 72 "С, 60 секунді х 35 циклів: ПЛР ампліфікація 72 7С, 10 хвилин: кінцева елонгація.
Нуклеотидні послідовності прямого праймера та зворотного праймера, які використовують для ОТ-ПЛР наведені нижче.
Прямий праймер: 5- СтадатасАдассс(аТАААС-З3' (5ЕО І МО: 5)
Зворотний праймер: 5-- СОАДИТТТоАсасасСААстТСА-3' (ЗЕО ІЮ МО: 6)
Продукт реакції, 1 мкл ОТ-ПЛР, зазначеної вище, аналізували з використанням Віоапаїулег (виробництва компанії Адіепі Тесппоїодієв5, Іпс.). Вимірювали рівень полінуклеотиду "А" смуги з пропуском екзона 51 та рівень полінуклеотиду "В" смуги без пропуску екзона 51. На основі даних значень вимірювання "А" та "В", ефективність пропуску визначали за наступним рівнянням:
Ефективність пропуску (905) - А / (АВ) х 100
Зо Експериментальні результати
Результати показані на ФІГ. 1. Даний експеримент показав, що антисенсові олігомери за представленим винаходом можуть спричиняти пропуск екзона 51 з помітно більшою ефективністю, ніж антисенсовий олігомер РМО Мо 3.
ІПриклад З)
РМО МоМо 4-6
Названу сполуку отримували відповідно до методики з прикладу 1. Послідовності різних антисенсових олігомерів наведені нижче.
Таблиця 7 зо 0пелююют дон зе І // М.М. | Знайдено | МО 75 | ТОСААСАТСААОСААСАТОСС бо, БОБА? кет! 6 6 |АССТОСААСАТСААОСААСАТ |6912.91 | 6912.85 | Б'кінецььгрупа(3) | 9
ІПриклад 41 2"-Ю-метокси- фосфоротіоати, показані в ЗЕО ІЮО МО: з 9 до 33
Різні антисенсові олігомери з назви отримували шляхом аутсорсингу від дарап Віо Зегмісе
Со. Послідовності різних антисенсових олігомерів наведені в таблиці 8.
Таблиця 8
Мо послідовності Послідовність -
М.М. | Знайдено
ПРОМИСЛОВА ПРИДАТНІСТЬ
Експериментальні результати в прикладах досліджень демонструють, що олігомери за представленим винаходом спричиняють пропуск екзона 51 з помітно високою ефективністю в
КО клітинах. Таким чином, олігомери за представленим винаходом є надзвичайно корисними в лікуванні ОМО.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«Но МІБРОМ ЗМ АК СО МЛ
МАТІЮМАЇ, СЕМТЕВ ОК МЕШКОСОСУ АМО РЕУСНПАТКУ «120» АНТИСЕНСОВА НУКЛЕЇНОВА КИСЛОТА, «зе дО «150х ІРА Я485897 ера щи Ой «180» з «170» Ралі» уехвіюой 3,5 «102 «ії юЮ «1» ДиК кій» Штучна послідовність «ВО» «ЛУ» Синтетична нуклеїнова кнелота «Нюх і свеїваеВс цеосісаае риараствоса 30 «іо» «ВР 30 «12» ДНК «іх» Штучна послідовність «Ох «а3» Сицтетична нуклеїнона кислоти «о а сісагарей сівейсаав взаваїиса 30 «2102 3 -ї» 333 «12» ДиК «13». Ното зарієпе «НО» 3 сюесіансв дасцщасі секівасас ааесівівні тасневевав вецесцісї оо ссазасіана авгресвіст іссцвани греновіаос юсісікосв ан салос 0120
БиВецерас врансцасе расівноці сісівсйрдасварішаз авесасава 150
ВинінавЕї КрИТЕВОсІ вакрациса асраовівай свісяавосав вад 233
«0» 4 «Їх 30 «ай» ДиК «13» ПШітуУна посліДОВНіСТЬ «ее» «А Синтетична нуклеїнова кислота кох 4 сіссваса зарванояе вес 30 10» 5 «1» 20 кій» ДНК «213» Штучна послідовність «ай ка3» Синтетична нуклеїнова кислота ка» 5 сіварівная весиріаває 2 «210» 6 «Їх хо «ах» ДИК «13 Шеучиа послідовність «ай «аеї» Синтетична нуклеїнова кистта «6 вазвнісан виссаввсв 20 «0» 7 «їх і «і» ДНК «13» Штучна послідовність «ех «а» Синістична нуклсїнова кукхнуУєа «НН 7 засвіснави аараисщі я «10» 8 «ії і «аа» ДНК «2135 Штучна послідовність
«ог «дві» Сучтетична нуклеїнова кислота
НЮ» 8 їсснасвіса ароваратсв с зі «ка о «11» 8 «іа» ДиИК «21У» Штучна послідовність «А «раї» Свнтетична пуклеїнова кислота «Кр У зесісснаса їсвакояарзї щі «ді» їй «м А «іа» ДНК «813» Штучна послідовність «ва» «23» Свитетична цуклейзона кислоти «Що 10 гвризасвни справийова р і: «армаасвни сиравиврва р 21 «0» «ах ві
ДиК «213» Штучна послідовність «Ах «23» Синуєтична нуклеїнова кислота «НН привнсасся дайцавсавн с кі «Нр 15 «1 зі «і» ДНК «Ух Штучна восліловність кох своей» Синтетична нуклеїнова кислота «ад 12 вассасарру прввцсвсса В зі
«10 13 «а а «о» ДНЕ «13» Штучна послідовність «ад «Ах Сиватетична нуклеїнова кнелота 13 понесла аассасвврви й гі «а 14 «їз Я «0» ДНК «в13» Шзучна послідовність ка «3» Сицтстична нуклеїнова кислота «Не 14 парановсаи пиюесиваво а хі «ар» 15 «Дії» зі «ев» ДНК «АБУ» Штучна послідовність «вод» «3» Синтетична нуклеїнова кислета «Нюх 13 чисиариоце аванси м ді «105 16 «1 зі «142 ДНЕ 13» ЦПртучна послідовність «А «ей» Свнитетична нуклеїнова кнелота «ах 16 вадацносвои писовениие й і «10» і? «11» і «12» ДНК «2132 Штучна послідовність
«ах «843» Синтетична пуклейнова кислота «ЩЮ 17 адеацоваве парапосвови й зі «10 18 ка» ві «15» ДНК «132 Штучна послідовність «І «леї» Ститетична нуклейова кислота «НЮЄ авнивссиес ласансваво а пі «10» 19 «1» і «12» ДиК «1» Штучна послідовність «о» «вх» Синтетична нуклещшова кислота «ЩО» 19 сирессававе звенасенос й і «вій 20 «11» 8 «12» ДиИК вії» Штучна посвідовність «0 «ве» Синтетична нуклеїнова кислоти «ВН 20 сешивезааи спресадано а 2 «о» З «11» і «вія» ДНК «13» Штучна послідовність «адм «да Синтетична нуклеїова кислота «що» і идиссвансе свадуврадан с ші
-10з 82 «ії» і «12» ДНК «1Х» Штучна послідовність «ДК «9243» Сицтетичиа нуклеїнова кислота «г 32 севивариию вимосварос с ра! «10» 23 «1 ді «12» ДНК «13» Штучна послідовність «20 «дай» Синтетична нуклеїнова кисла «цО0» 23 цавздссани соводавице п ві «а» Уа «11» Зі «2» ДНЕ «215» Штучна послідовність «Ах «ва3» Синтетична нуклеїнова кнелота «За зисвзвсвоз ваадросави с зі «а 25 «1» «213» ДНК «21Х2 Штучна послідовність «Де «ау» Синтетична нуклеїнова кислота кО0» 25 пизопвасивче висаврсвеяй й зі «1» 26 «11 ді «1» ДиИК «13» Штучна послідовність
«ау ха» Севнтетична нуклеїнова кислота «й» об сисивиасаци навидасицр а кі «ій» 27 «ії» 8 «від» ДНК «13» ПЕкучна послідовність «Й «аа» Синтетична нуклеїнові кислота «щі» 37 сассвіисвес сиспцецвани и 2 «АН ов «ДР і «а» ДНК «15» Црручна посліловцість ни кдаа» Свитетачна пуклеїнова кислота «0» Як свадевсаре сассаисвос о 21 «ау за «їн і «12 ДНК «2132 Штучна послідовність «ах «223» Синтетична нУклейова кислота «КК» 29 нпиоранацеси сазвоасцос є хі «10 «11 2 «щі» ДНК -13» Штучна послідовність «ЙО «иа» Синтетична нуклеїнова кнелота «м 30 вацеанснев пивачацеси с 41
Зо
«10 3 «11» і «2122 ДНиНК «213» Птучна послідовність кро» «ай Синтетична нуклеїнова кислота «В» 3
Чепровирав еапсаиснсв о зі «10» 32 «11» зі «й ДиК «13» Штучна послідовність «де «аа» Сивтетична нуклеїнова кислота «00 33 висаницена пипнвосаваи в 21 «8102 33 «211» 2 «312» ДНК «213» Штучна послідовність «вед «же Синтетична нуклеїова кислота «НО» 33 сзаввазниви восанипена в 21 «10» 34 «вії» ві «а» ДНК «Ж» Цітучна послідовисть «а «аа» Синтетична нуклеїнсва кислота «Не 34 ссцуссацсво свассавряи гі

Claims (17)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антисенсовий олігомер, який вибирають з групи, яка складається з (є) та ()), зазначених нижче, або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат, де (є) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1 або 2; та (І) антисенсовий олігомер, який містить нуклеотидну послідовність, яка має делецію, заміщення, вставку та/або додавання від 1 до З нуклеотидів в нуклеотидну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1 або 2, та має активність, щоб викликати пропуск 51-ого екзону в гені дистрофіну людини.
2. Антисенсовий олігомер за пунктом 1, який являє собою олігонуклеотид або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат.
3. Антисенсовий олігомер за пунктом 2 або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат, в якому цукровий фрагмент та/або зв'язуюча фосфат ділянка щонайменше одного нуклеотиду, з якого складається олігонуклеотид, є модифікованими.
4. Антисенсовий олігомер за пунктом 2 або З або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат, в якому цукровий фрагмент щонайменше одного нуклеотиду, 3 якого складається олігонуклеотид, являє собою рибозу, в якій 2'-ОН-група заміщується на будь-яку групу, вибрану з групи, яка складається з ОК, К, К'ОК, 5Н, ЗК, МНег, МНЕ, МР», М3з, СМ, Е, СІ, Вг та І, де К являє собою алкіл або арил, та К' являє собою алкілен.
5. Антисенсовий олігомер за будь-яким одним з пунктів 2-4 або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат, в якому зв'язуюча фосфат ділянка щонайменше одного нуклеотиду, з якого складається олігонуклеотид, являє собою будь-яку ділянку, вибрану з групи, яка складається з фосфоротіоатного зв'язку, фосфородитіоатного зв'язку, алкілфосфонатного зв'язку, фосфорамідатного зв'язку та боранофосфатного зв'язку.
6. Антисенсовий олігомер за пунктом 71, який являє собою морфоліноолігомер, або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат.
7. Антисенсовий олігомер за пунктом 6б, який являє собою фосфородіамідатний морфоліноолігомер, або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат. Зо 8. Антисенсовий олігомер за будь-яким одним з пунктів б або 7 або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат, в якому 5'-кінець являє собою будь-яку ділянку з хімічних формул (1)-(3), зазначених нижче: оку я, рено прп мому он
М. Ос МН; ще т х і де сн М сн Огр-М Охр-МІ Ц У і СН а, СА о Он ;() (2) - (3)
9. Фармацевтична композиція для лікування м'язової дистрофії, яка містить як активний інгредієнт антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат за будь- яким одним з пунктів 1-8.
10. Фармацевтична композиція за пунктом 9, яка містить фармацевтично прийнятний носій.
11. Спосіб лікування м'язової дистрофії, який включає введення пацієнту з м'язовою дистрофією антисенсового олігомера за будь-яким одним з пунктів 1-38 або фармацевтичної композиції за пунктом 9 або 10.
12. Спосіб лікування за пунктом 11, в якому пацієнт з м'язовою дистрофією є пацієнтом з делеціями нуклеотидів в межах екзонів 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43- 50 або 47-50.
13. Спосіб лікування за пунктом 11 або 12, в якому пацієнтом є людина.
14. Застосування антисенсового олігомера або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату за будь-яким одним з пунктів 1-8 у виробництві фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії.
15. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за будь-яким одним з пунктів 1-8 для застосування в лікуванні м'язової дистрофії.
16. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за пунктом 15, де пацієнт з м'язовою дистрофією в зазначеному лікуванні є пацієнтом з делеціями нуклеотидів в межах екзонів 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 або 47-50.
17. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за пунктом 15 або 16, в якому пацієнтом є людина. Ефективність пропуску (Екзон В) ей т | у г
В в. Є ! ! позехм В і ; так и | Що Ж і : я зЗжкм в ча й ХІІ : вібшк і ! 5 !
ю. ! ЗК : Меоброблений ВМО Мо ї МО Ме 2 МО Ме З
Фіг. 1
UAA201610167A 2014-03-12 2015-03-11 Антисенсовий олігомер UA120849C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014048897 2014-03-12
PCT/JP2015/057180 WO2015137409A1 (ja) 2014-03-12 2015-03-11 アンチセンス核酸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120849C2 true UA120849C2 (uk) 2020-02-25

Family

ID=54071850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201610167A UA120849C2 (uk) 2014-03-12 2015-03-11 Антисенсовий олігомер

Country Status (30)

Country Link
US (4) US9988629B2 (uk)
EP (2) EP3514234A1 (uk)
JP (1) JP6606488B2 (uk)
KR (1) KR102335801B1 (uk)
CN (2) CN106459955B (uk)
AU (2) AU2015227733B2 (uk)
BR (1) BR112016020618B1 (uk)
CA (1) CA2939948A1 (uk)
CY (1) CY1121322T1 (uk)
DK (1) DK3118311T3 (uk)
ES (1) ES2710802T3 (uk)
HR (1) HRP20190235T1 (uk)
HU (1) HUE042283T2 (uk)
IL (1) IL247663B (uk)
LT (1) LT3118311T (uk)
MX (1) MX2016011538A (uk)
MY (1) MY193708A (uk)
NZ (1) NZ724836A (uk)
PH (1) PH12016501761A1 (uk)
PL (1) PL3118311T3 (uk)
PT (1) PT3118311T (uk)
RS (1) RS58573B1 (uk)
RU (2) RU2702424C2 (uk)
SG (1) SG11201607095RA (uk)
SI (1) SI3118311T1 (uk)
TR (1) TR201901939T4 (uk)
TW (2) TW201945383A (uk)
UA (1) UA120849C2 (uk)
WO (1) WO2015137409A1 (uk)
ZA (1) ZA201605864B (uk)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR201901939T4 (tr) * 2014-03-12 2019-03-21 Nat Center Neurology & Psychiatry Antisens nükleik asit.
MX2016016526A (es) 2014-06-17 2017-04-04 Nippon Shinyaku Co Ltd Acidos nucleicos antisentido.
WO2017047707A1 (ja) 2015-09-15 2017-03-23 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
AU2016334232B2 (en) 2015-10-09 2022-05-26 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
WO2018005805A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomers for muscular dystrophy
US20190330626A1 (en) * 2016-07-15 2019-10-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for use in dystrophin transcript
CA3037663A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Synthena Ag Mixed tricyclo-dna, 2'-modified-rna oligonucleotide compositions and uses thereof
MX2019006989A (es) 2016-12-19 2019-08-16 Sarepta Therapeutics Inc Conjugados de oligomeros de omision de exon para distrofia muscular.
PL3554552T3 (pl) 2016-12-19 2022-11-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Koniugaty oligomerów do pomijania egzonów dla dystrofii mięśniowej
DK3554553T3 (da) 2016-12-19 2022-09-19 Sarepta Therapeutics Inc Exon-overspringnings-oligomerkonjugat til muskeldystrofi
SG11201906200WA (en) 2017-01-06 2019-08-27 Avidity Biosciences Llc Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
GB201711809D0 (en) * 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
TWI812647B (zh) * 2017-09-25 2023-08-21 美商薩羅塔治療公司 經由速流合成以製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物之製程
JP2020536060A (ja) 2017-09-28 2020-12-10 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーを処置するための併用療法
US10765760B2 (en) 2018-05-29 2020-09-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2019240223A1 (ja) * 2018-06-13 2019-12-19 公益財団法人川崎市産業振興財団 数平均分子量が３ｋＤａ～１０ｋＤａであるＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、アンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む、ポリイオンコンプレックスミセル
EP3830259A4 (en) 2018-08-02 2022-05-04 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND THEIR USES FOR THE TREATMENT OF FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY
EP3829595A4 (en) 2018-08-02 2022-08-24 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND THEIR USES FOR THE TREATMENT OF DYSTROPHINOPATHIES
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
EP3874044A1 (en) * 2018-11-02 2021-09-08 BioMarin Technologies B.V. Bispecific antisense oligonucleotides for dystrophin exon skipping
CN113383078A (zh) * 2018-12-06 2021-09-10 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸组合物及其方法
JP7481694B2 (ja) * 2019-01-30 2024-05-13 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 核酸送達複合体
US20230140736A1 (en) 2020-02-28 2023-05-04 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51
WO2022232478A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Treatment methods for muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023127918A1 (ja) 2021-12-27 2023-07-06 日本新薬株式会社 オリゴ核酸化合物の製造方法
IL315280A (en) 2022-03-17 2024-10-01 Sarepta Therapeutics Inc Morpholino phosphorodiamidate oligomer conjugates
US12071621B2 (en) 2022-04-05 2024-08-27 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibody-PMO conjugates for inducing DMD exon 44 skipping

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
JP3398378B2 (ja) 1989-12-20 2003-04-21 アンチビラルス・インコーポレイテツド リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー
JP2924179B2 (ja) 1993-02-19 1999-07-26 日本新薬株式会社 グリセロール誘導体，デバイス及び医薬組成物
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
EP1191097A1 (en) * 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
ES2566632T3 (es) 2002-11-25 2016-04-14 Masafumi Matsuo Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm
EP2206781B1 (en) * 2004-06-28 2015-12-02 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
EP1811024A1 (en) 2004-10-05 2007-07-25 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Oligo double-stranded rna and medicinal composition
WO2006112705A2 (en) * 2005-04-22 2006-10-26 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the binding of sr proteins and by interfering with secondary rna structure.
US20090069260A1 (en) 2005-05-30 2009-03-12 Nippon Shinyaku Co., Ltd Method for producing a nucleic-acid-containing complex preparation
US8067571B2 (en) * 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
RU2418068C2 (ru) * 2005-08-17 2011-05-10 Сирна Терапьютикс, Инк. Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
EP1963538A2 (en) * 2005-11-30 2008-09-03 Guild Associates, Inc. Differentially fluorescent yeast biosensors for the detection and biodegradation of chemical agents
JP5347510B2 (ja) 2007-02-05 2013-11-20 日本新薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体
CN101896186A (zh) 2007-10-26 2010-11-24 莱顿教学医院 对抗肌肉病症的方式和方法
BRPI0819828A8 (pt) 2007-11-15 2022-12-27 Avi Biopharma Inc Processo de síntese de oligômeros de morfolino
US8084601B2 (en) * 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
SI3133160T1 (sl) * 2008-10-24 2019-05-31 Sarepta Therapeutics, Inc. Sestavki, ki preskakujejo ekson za DMD
DK2607484T3 (en) 2008-10-27 2016-03-07 Biomarin Technologies B V Methods and means for efficient skipping of exon 45 in Duchenne muscular dystrophy pre-MRNA
US20110269665A1 (en) 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
ES2693459T3 (es) * 2009-11-12 2018-12-11 The University Of Western Australia Moléculas antisentido y métodos para el tratamiento de patologías
TWI620756B (zh) * 2010-05-28 2018-04-11 薩羅塔治療公司 具有經修飾之單元間連結及／或末端基團之寡核苷酸類似物
IT1400425B1 (it) * 2010-06-08 2013-05-31 Amsterdam Molecular Therapeutics Bv Modified snrnas for use in therapy.
TWI541024B (zh) * 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
WO2012109296A1 (en) * 2011-02-08 2012-08-16 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Antisense oligonucleotides
KR102339196B1 (ko) 2011-05-05 2021-12-15 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 펩타이드 올리고뉴클레오타이드 접합체
EP2799548B1 (en) * 2011-12-28 2019-08-21 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acid
TR201901939T4 (tr) * 2014-03-12 2019-03-21 Nat Center Neurology & Psychiatry Antisens nükleik asit.

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015227733A1 (en) 2016-10-20
KR20160132056A (ko) 2016-11-16
BR112016020618B1 (pt) 2023-04-04
HRP20190235T1 (hr) 2019-05-03
US20180179538A1 (en) 2018-06-28
DK3118311T3 (en) 2019-03-11
EP3514234A1 (en) 2019-07-24
PH12016501761B1 (en) 2016-11-07
PT3118311T (pt) 2019-02-15
IL247663A0 (en) 2016-11-30
MY193708A (en) 2022-10-26
RU2730681C2 (ru) 2020-08-24
ZA201605864B (en) 2018-12-19
RU2702424C2 (ru) 2019-10-08
JPWO2015137409A1 (ja) 2017-04-06
PL3118311T3 (pl) 2019-09-30
RS58573B1 (sr) 2019-05-31
ES2710802T3 (es) 2019-04-26
CN106459955A (zh) 2017-02-22
EP3118311A4 (en) 2017-10-11
IL247663B (en) 2020-06-30
TWI672314B (zh) 2019-09-21
US20170067048A1 (en) 2017-03-09
NZ724836A (en) 2022-07-01
MX2016011538A (es) 2017-04-13
JP6606488B2 (ja) 2019-11-13
RU2016139108A (ru) 2018-04-13
RU2019130513A (ru) 2019-10-10
AU2020200679A1 (en) 2020-02-20
CN106459955B (zh) 2019-12-20
TW201540724A (zh) 2015-11-01
LT3118311T (lt) 2019-04-10
BR112016020618A2 (pt) 2017-08-15
US20220162604A1 (en) 2022-05-26
EP3118311A1 (en) 2017-01-18
SI3118311T1 (sl) 2019-05-31
CN110951732A (zh) 2020-04-03
WO2015137409A1 (ja) 2015-09-17
CA2939948A1 (en) 2015-09-17
TW201945383A (zh) 2019-12-01
BR112016020618A8 (pt) 2021-07-13
AU2020200679B2 (en) 2022-03-10
KR102335801B1 (ko) 2021-12-03
US9988629B2 (en) 2018-06-05
RU2016139108A3 (uk) 2018-08-06
SG11201607095RA (en) 2016-10-28
RU2019130513A3 (uk) 2020-03-13
AU2015227733B2 (en) 2019-10-31
US20200149040A1 (en) 2020-05-14
PH12016501761A1 (en) 2016-11-07
HUE042283T2 (hu) 2019-06-28
TR201901939T4 (tr) 2019-03-21
CY1121322T1 (el) 2020-05-29
US11053497B2 (en) 2021-07-06
EP3118311B1 (en) 2018-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120849C2 (uk) Антисенсовий олігомер
AU2021203383B2 (en) Antisense nucleic acid
US11028122B1 (en) Antisense nucleic acids
JP6977998B2 (ja) アンチセンス核酸
US20230073008A1 (en) Antisense nucleic acid that induces skipping of exon 50
NZ728103B2 (en) Antisense nucleic acids
AU2015203659A1 (en) Antisense nucleic acid