WO2015137409A1 - アンチセンス核酸 - Google Patents

アンチセンス核酸 Download PDF

Info

Publication number
WO2015137409A1
WO2015137409A1 PCT/JP2015/057180 JP2015057180W WO2015137409A1 WO 2015137409 A1 WO2015137409 A1 WO 2015137409A1 JP 2015057180 W JP2015057180 W JP 2015057180W WO 2015137409 A1 WO2015137409 A1 WO 2015137409A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antisense oligomer
seq
exon
antisense
dystrophin gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/057180
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
達志 若山
春奈 瀬尾
洋平 佐藤
武田　伸一
永田　哲也
Original Assignee
日本新薬株式会社
独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to MYPI2016703281A priority Critical patent/MY193708A/en
Priority to EP18205909.7A priority patent/EP3514234A1/en
Priority to AU2015227733A priority patent/AU2015227733B2/en
Priority to CA2939948A priority patent/CA2939948A1/en
Priority to RU2016139108A priority patent/RU2702424C2/ru
Priority to ES15761392T priority patent/ES2710802T3/es
Application filed by 日本新薬株式会社, 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター filed Critical 日本新薬株式会社
Priority to UAA201610167A priority patent/UA120849C2/uk
Priority to CN201580012727.4A priority patent/CN106459955B/zh
Priority to MX2016011538A priority patent/MX2016011538A/es
Priority to PL15761392T priority patent/PL3118311T3/pl
Priority to RS20190188A priority patent/RS58573B1/sr
Priority to JP2016507800A priority patent/JP6606488B2/ja
Priority to DK15761392.8T priority patent/DK3118311T3/en
Priority to US15/122,435 priority patent/US9988629B2/en
Priority to SG11201607095RA priority patent/SG11201607095RA/en
Priority to EP15761392.8A priority patent/EP3118311B1/en
Priority to SI201530597T priority patent/SI3118311T1/sl
Priority to NZ724836A priority patent/NZ724836A/en
Priority to LTEP15761392.8T priority patent/LT3118311T/lt
Priority to KR1020167027723A priority patent/KR102335801B1/ko
Priority to BR112016020618-5A priority patent/BR112016020618B1/pt
Publication of WO2015137409A1 publication Critical patent/WO2015137409A1/ja
Priority to ZA2016/05864A priority patent/ZA201605864B/en
Priority to IL247663A priority patent/IL247663B/en
Priority to PH12016501761A priority patent/PH12016501761B1/en
Priority to US15/902,231 priority patent/US20180179538A1/en
Priority to HRP20190235TT priority patent/HRP20190235T1/hr
Priority to CY20191100184T priority patent/CY1121322T1/el
Priority to US16/437,130 priority patent/US11053497B2/en
Priority to AU2020200679A priority patent/AU2020200679B2/en
Priority to US17/364,618 priority patent/US20220162604A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3535—Nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Definitions

  • the present invention relates to an antisense oligomer that enables skipping of the 51st exon of the human dystrophin gene and a pharmaceutical composition containing the oligomer.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • DMD is known to be caused by mutations in the dystrophin gene.
  • the dystrophin gene exists on the X chromosome and is a huge gene consisting of 2.2 million bases of DNA.
  • the mRNA that is transcribed from DNA to the mRNA precursor, and then the intron is removed by splicing to which 79 exons are bound becomes 11,058 bases.
  • This mRNA is translated into 3,685 amino acids to produce dystrophin protein.
  • Dystrophin protein is involved in maintaining the membrane stability of muscle cells, and is necessary to make muscle cells difficult to break. Since the dystrophin gene of DMD patients has a mutation, dystrophin protein having a function in muscle cells is hardly expressed. Therefore, in the DMD patient body, the structure of muscle cells cannot be maintained, and a large amount of calcium ions flow into the muscle cells. As a result, a reaction similar to inflammation occurs and fibrosis advances, making it difficult for muscle cells to regenerate.
  • Becker muscular dystrophy is also caused by mutations in the dystrophin gene, but its symptoms are generally weaker than those of DMD, although the symptoms are weaker than muscular atrophy.
  • the difference in clinical symptoms between DMD and BMD is thought to be due to whether the amino acid reading frame when dystrophin mRNA is translated into dystrophin protein due to mutation is destroyed or maintained (non-patented) Reference 1).
  • DMD has a mutation that shifts the amino acid reading frame, so that almost no functional dystrophin protein is expressed, but in BMD, a part of the exon is deleted due to the mutation, but the amino acid reading frame is maintained. Therefore, a dystrophin protein having a function although it is incomplete is produced.
  • Exxon skipping is expected as a treatment method for DMD.
  • This method restores the amino acid reading frame of dystrophin mRNA by modifying splicing and induces the expression of dystrophin protein partially restored in function (Non-patent Document 2).
  • the part of the amino acid sequence targeted for exon skipping will be lost.
  • the dystrophin protein expressed by this treatment is shorter than the normal one, but the function of stabilizing muscle cells is partially retained because the amino acid reading frame is maintained.
  • exon skipping is expected to cause DMD to exhibit symptoms similar to milder BMD.
  • the exon skipping method has been tested in human DMD patients through animal experiments using mice and dogs.
  • Exon skipping can be induced by binding of antisense nucleic acids targeting either or both 5 'or 3' splice sites, or the interior of exons. Exons are only included in mRNA if both splice sites are recognized by the spliceosome complex. Thus, exon skipping can be induced by targeting the splice site with an antisense nucleic acid. In addition, it is thought that the binding of SR protein to the exon splicing enhancer (ESE) is necessary for the exon to be recognized by the splicing mechanism. Targeting ESE can also induce exon skipping. it can.
  • ESE exon splicing enhancer
  • Non-patent Document 3 Since the mutation of the dystrophin gene varies depending on the DMD patient, an antisense nucleic acid corresponding to the location and type of the gene mutation is required. So far, antisense nucleic acids that induce exon skipping for all 79 exons have been created by Steve Wilton et al. Of the University of Western Australia (Non-patent Document 3), and 39 types by Annemieke Aartsma-Rus et al. Of the Netherlands. An antisense nucleic acid that induces exon skipping of exons has been produced (Non-patent Document 4).
  • Exon 51 About 13% of all DMD patients are thought to be treatable by skipping the 51st exon (hereinafter referred to as “Exon 51”).
  • Exon 51 the 51st exon
  • Patent Documents 1 to 6 and Non-Patent Documents 5 to 6 a technique for skipping exon 51 with high efficiency has not yet been established.
  • an antisense oligomer that induces skipping of exon 51 of dystrophin gene with high efficiency and a therapeutic agent for muscular dystrophy containing the oligomer are desired.
  • the present inventors have obtained highly efficient human administration by administering an antisense oligomer having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2. We found that skipping of exon 51 of the dystrophin gene can be induced. The present inventors have completed the present invention based on this finding.
  • the antisense oligomer according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (d): (A) an antisense oligomer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2; (B) It consists of a base sequence in which 1 to 5 bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and has an activity of skipping exon 51 of the human dystrophin gene Antisense oligomers; (C) an antisense oligomer having a base sequence having 80% or more sequence identity to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of skipping exon 51 of the human dystrophin gene; (D) An antisense oligomer that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and has an activity of skipping exon 51 of
  • the sugar moiety of at least one nucleotide constituting the oligonucleotide has a 2′-position —OH group, OR, R, R′OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F
  • the phosphate binding part of at least one morpholino constituting the morpholino oligomer comprises a phosphorodiamidate bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphoramidate bond, and a boranophosphate bond.
  • the antisense oligomer according to [9] or [10] which is any one selected from the group.
  • the antisense oligomer according to [10] above which is a phosphorodiamidate morpholino oligomer.
  • a pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy comprising the antisense oligomer according to any one of the above [1] to [12], a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof.
  • the pharmaceutical composition according to the above [13] further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for treating muscular dystrophy comprising a step of administering the antisense oligomer according to any one of [1] to [12] or the pharmaceutical composition according to [13] or [14] to a muscular dystrophy patient.
  • the muscular dystrophy patient is in exon 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50, or 47-50 of the dystrophin gene.
  • the method according to [15] above which is a patient having a nucleotide deletion.
  • a muscular dystrophy patient may have exons 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50, or 47 of the dystrophin gene.
  • the antisense oligomer of the present invention can induce skipping of exon 51 of the human dystrophin gene with high efficiency. Moreover, the symptoms of Duchenne muscular dystrophy can be effectively reduced by administering the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Antisense oligomer The present invention provides an antisense oligomer (hereinafter referred to as “the antisense oligomer of the present invention”) that skips the 51st exon of the human dystrophin gene with high efficiency.
  • “gene” includes cDNA, mRNA precursor and mRNA in addition to genomic genes.
  • the gene is an mRNA precursor, ie pre-mRNA.
  • the human dystrophin gene is present at locus Xp21.2.
  • the human dystrophin gene has a size of 2.2 million base pairs and is the largest known human gene.
  • the coding region of the human dystrophin gene is only 14 kb, and the coding region is dispersed in the dystrophin gene as 79 exons (Roberts, RG., Et al., Genomics, 16: 536-538 ( 1993)).
  • Pre-mRNA a transcript of the human dystrophin gene, is spliced to produce a 14 kb mature mRNA.
  • the base sequence of the human wild-type dystrophin gene is known (GenBank Accession No. NM_004006).
  • the base sequence of exon 51 of the human wild type dystrophin gene is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the antisense oligomer of the present invention is produced for the purpose of modifying a protein encoded by the DMD dystrophin gene into a BMD dystrophin protein by skipping exon 51 of the human dystrophin gene. Therefore, exon 51 of the dystrophin gene to be subjected to exon skipping of the antisense oligomer includes not only the wild type but also the mutant type.
  • the antisense oligomer of the present invention is specifically the antisense oligomer described in any one selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • C an antisense oligomer having a base sequence having a sequence identity of 80% or more with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of skipping exon 51 of the human dystrophin gene; and
  • the antisense oligomers (b) to (d) are specifically mutants of the antisense oligomer (a) and are intended to cope with mutations (for example, polymorphisms) in the patient's dystrophin gene. It is what I put.
  • the antisense oligomer of the present invention is specifically the antisense oligomer described in any one selected from the group consisting of the following (k) to (n).
  • Antisense oligomers of (l) to (n) are specifically mutants of the antisense oligomer of (k), and are mutated in the patient's dystrophin gene (for example, multiple Type) etc. in mind.
  • the antisense oligomer of the present invention is the antisense oligomer according to any one selected from the group consisting of the following (o) to (r).
  • an antisense oligomer consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 6 to 33
  • an antisense oligomer that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, a colony using as a probe all or part of an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Hybridization methods include, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Manual Vol. Can be used.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • Medium stringent conditions include, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. or 5 ⁇ SSC, 1% 1SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7. 5) 50% formamide at 42 ° C.
  • “High stringent conditions” means, for example, (1) 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., (2) 0.2 x SSC, 0.1% SDS, 60 ° C. ( 3) 0.2 x SSC, 0.1% SDS, 62 °C, (4) 0.2 x SSC, 0.1% SDS, 65 °C, or (5) 0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65 °C, but not limited to this Is not to be done. Under these conditions, it can be expected that antisense oligomers having higher sequence identity can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • factors affecting the stringency of hybridization include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. By doing so, it is possible to achieve the same stringency. .
  • Antisense oligomers that can hybridize other than the above are 90% or more and 91% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, when calculated by homology search software such as FASTA and BLAST using the default parameters. More than 92%, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, Antisense oligomers having 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more can be mentioned.
  • the identity of the base sequence is FASTA (Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)) or the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993).
  • Programs called blastn, blastx, tblastn and tblastx based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program.
  • “Enabling skipping of the 51st exon of the human dystrophin gene” means that the antisense oligomer of the present invention binds to a site corresponding to exon 51 of a transcript (eg, pre-mRNA) of the human dystrophin gene.
  • a transcript eg, pre-mRNA
  • the base sequence corresponding to the 3 ′ end of exon 50 is the base sequence corresponding to the 5 ′ end of exon 53. It means that a mature mRNA is formed which is ligated and no codon frame shift occurs.
  • the “binding” means that when the antisense oligomer of the present invention and the transcript of the human dystrophin gene are mixed, they hybridize to form a double strand under physiological conditions.
  • the “physiological condition” means a condition adjusted to a pH, salt composition, and temperature similar to those in a living body. For example, the conditions are 25 to 40 ° C., preferably 37 ° C., pH 5 to 8, preferably pH 7.4, and the sodium chloride concentration is 150 ⁇ m.
  • skipping efficiency was determined by introducing the antisense oligomer of the present invention into a dystrophin-expressing cell (for example, human rhabdomyosarcoma cell), and from the total RNA of the dystrophin-expressing cell, human dystrophin
  • the region around exon 51 of the gene mRNA can be confirmed by performing RT-PCR amplification and performing nested PCR or sequence analysis on the PCR amplification product.
  • the skipping efficiency was determined by recovering mRNA of the human dystrophin gene from the test cell, and among the mRNA, the amount of polynucleotide in the band exon 51 skipped and the amount of polynucleotide in the band exon 51 not skipped.
  • the antisense oligomer of the present invention is an exon having an efficiency of 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more.
  • Skip 51 For calculation of skipping efficiency, International Publication No. 2012/029986 can be referred to.
  • antisense oligomer of the present invention examples include oligonucleotides, morpholino oligomers, and peptide nucleic acid (Peptide Nucleic Acid: PNA) oligomers having a length of 16 to 35 bases. A length of 19 to 32 bases, 20 to 31 bases, 21 bases or 30 bases is preferable, and a morpholino oligomer is preferable.
  • the oligonucleotide (hereinafter referred to as “the oligonucleotide of the present invention”) is the antisense oligomer of the present invention having nucleotide as a structural unit, and the nucleotide may be any of ribonucleotide, deoxyribonucleotide or modified nucleotide. Good.
  • Modified nucleotides are those in which all or part of the nucleobase, sugar moiety, and phosphate binding moiety constituting ribonucleotide or deoxyribonucleotide are modified.
  • examples of the nucleobase include adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine, uracil, and modified bases thereof.
  • modified bases include pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosine (eg, 5-methylcytosine), 5-alkyluracil (eg, 5-ethyluracil), 5-halouracil (5 -Bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (6-methyluracil), 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl -2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyl
  • modification of the sugar moiety examples include modification of the 2 ′ position of ribose and modification of other parts of the sugar.
  • modification at the 2 ′ position of ribose examples include, for example, the —OH group at the 2 ′ position of ribose is OR, R, R′OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl , Br and I can be substituted.
  • R represents alkyl or aryl.
  • R ′ represents alkylene.
  • modifications of other parts of the sugar include, for example, those in which 4'-position O of ribose or deoxyribose is replaced with S, and those in which the 2'-position and 4'-position of the sugar are cross-linked, such as LNA (Locked Nucleic Acid ) Or ENA (2′-O, 4′-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids), etc., but is not limited thereto.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • ENA (2′-O, 4′-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids
  • Examples of the modification of the phosphate binding moiety include phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond, alkylphosphonate bond, phosphoramidate bond, boranophosphate bond (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008 , 18, 9154-9160) (see, for example, Patent Republished Publication Nos. 2006/129594 and 2006/038608).
  • the alkyl is preferably a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl and isohexyl. It is done.
  • the alkyl may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • the cycloalkyl is preferably a cycloalkyl having 5 to 12 carbon atoms. Specific examples include cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclodecyl, and cyclododecyl.
  • examples of the halogen include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • Alkoxy includes linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms, for example, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n- Examples include pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy and the like. In particular, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • the aryl is preferably an aryl having 6 to 10 carbon atoms. Specific examples include phenyl, ⁇ -naphthyl, and ⁇ -naphthyl. Particularly preferred is phenyl.
  • the aryl may be substituted, and examples of the substituent include alkyl, halogen, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • the alkylene is preferably a linear or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms.
  • examples of acyl include linear or branched alkanoyl or aroyl.
  • alkanoyl include formyl, acetyl, 2-methylacetyl, 2,2-dimethylacetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pentanoyl, 2,2-dimethylpropionyl, hexanoyl and the like.
  • Examples of aroyl include benzoyl, toluoyl, and naphthoyl. Such aroyl may be substituted at substitutable positions and may be substituted with alkyl.
  • the oligonucleotide of the present invention preferably has a group represented by the following general formula in which the —OH group at the 2′-position of ribose is substituted with methoxy and the phosphate bond portion is a phosphorothioate bond. This is an antisense oligomer.
  • Base represents a nucleobase.
  • the oligonucleotide of the present invention can be easily synthesized using various automatic synthesizers (for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)), or a third party (for example, Promega, It can also be produced by consigning to Takara or Japan Bioservices).
  • automatic synthesizers for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)
  • a third party for example, Promega, It can also be produced by consigning to Takara or Japan Bioservices.
  • the morpholino oligomer of the present invention is the antisense oligomer of the present invention having a group represented by the following general formula as a structural unit. (Wherein Base is as defined above; W represents a group represented by any of the following formulas.
  • X represents —CH 2 R 1 , —O—CH 2 R 1 , —S—CH 2 R 1 , —NR 2 R 3 or F;
  • R 1 represents H, alkyl;
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents H, alkyl, cycloalkyl, or aryl;
  • Y 1 represents 0, S, CH 2 or NR 1 ;
  • Y 2 represents 0, S or NR 1 ;
  • Z represents 0 or S.
  • the morpholino oligomer is preferably an oligomer (a phosphorodiamidate morpholino oligomer (hereinafter referred to as “PMO”)) having a group represented by the following formula as a structural unit. (In the formula, Base, R 2 and R 3 are as defined above.)
  • the morpholino oligomers of the present invention include those in which all or part of the nucleobase, morpholino ring portion, phosphate binding portion, 3 ′ end and / or 5 ′ end constituting the oligomer is modified.
  • Examples of the modification of the phosphate binding moiety include phosphorodiamidate bond, phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond, alkylphosphonate bond, phosphoramidate bond, boranophosphate bond (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry , 2008, 18, 9154-9160) (see, for example, Patent Reissue Publication Nos. 2006/129594 and 2006/038608).
  • the morpholino oligomer can be produced, for example, according to International Publication No. 1991/009033 or International Publication No. 2009/064471.
  • PMO can be produced according to the method described in International Publication No. 2009/064471, or can be produced according to the method described below.
  • PMO manufacturing method As one embodiment of PMO, for example, a compound represented by the following general formula (I) (hereinafter referred to as PMO (I)) can be mentioned.
  • PMO (I) a compound represented by the following general formula (I) (hereinafter referred to as PMO (I))
  • PMO (I) a compound represented by the following general formula (I) (hereinafter referred to as PMO (I))
  • n is any integer within the range of 1 to 99, preferably any integer within the range of 24 to 34, 27 to 31 or 28 to 30, and preferably 29. ]
  • PMO (I) can be produced according to a known method, and can be produced, for example, by carrying out an operation in the following steps.
  • the compounds and reagents used in the following steps are not particularly limited as long as they are generally used in the production of PMO.
  • all the following steps can be performed by a liquid phase method or a solid phase method (using a manual or a commercially available solid phase automatic synthesizer).
  • a method using an automatic synthesizer is desirable from the viewpoint of simplification of operation procedures and accuracy of synthesis.
  • Process A By reacting an acid with a compound represented by the following general formula (II) (hereinafter referred to as compound (II)), a compound represented by the following general formula (III) (hereinafter referred to as compound (III)) )).
  • a compound represented by the following general formula (III) hereinafter referred to as compound (III))
  • n, R 2 and R 3 are as defined above;
  • Each BP independently represents an optionally protected nucleobase;
  • T represents a trityl group, a monomethoxytrityl group, or a dimethoxytrityl group;
  • L represents hydrogen, acyl, or a group represented by the following general formula (IV) (hereinafter referred to as group (IV)).
  • group (IV) group represented by the following general formula (IV)
  • nucleobase related to BP include the same “nucleobase” as Base.
  • amino group or hydroxyl group of the nucleobase according to BP may be protected.
  • the amino-protecting group is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for nucleic acids. Specifically, for example, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl Phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, (dimethylamino) methylene.
  • hydroxyl-protecting group examples include 2-cyanoethyl, 4-nitrophenethyl, phenylsulfonylethyl, methylsulfonylethyl, trimethylsilylethyl, substituted with 1 to 5 electron-withdrawing groups at any substitutable position.
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier that can be used for a solid phase reaction of nucleic acid.
  • a reagent that can be used for the synthesis of a morpholino nucleic acid derivative for example, dichloromethane, acetonitrile, tetrazole, N-methylimidazole, pyridine, acetic anhydride, lutidine, trifluoroacetic acid
  • chemically stable to reagents that can be used to synthesize morpholino nucleic acid derivatives (iii) chemical modification (Iv) can be loaded with the desired morpholino nucleic acid derivative, (v) has sufficient strength to withstand the high pressures applied during processing, and (vi) has a certain particle size range and distribution.
  • swellable polystyrene for example, aminomethylpolystyrene resin 1% divinylbenzene crosslinked (200 to 400 mesh) (2.4 to 3.0 mmol / g) (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), Aminomethylated Polystyrene Resin ⁇ HCl [divinylbenzene 1 %, 100-200 mesh] (Peptide Laboratories)), non-swellable polystyrene (eg, Primer Support (GE Healthcare)), PEG chain-linked polystyrene (eg, NH 2 -PEG resin (Watanabe Chemical) ), TentaGel resin), controlled pore glass (CPG) (for example, manufactured by CPG), oxalylated-constant glass (for example, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.
  • CPG controlled pore glass
  • oxalylated-constant glass for example, Alul et
  • This step can be carried out by allowing an acid to act on compound (II).
  • Examples of the “acid” that can be used in this step include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, and trichloroacetic acid.
  • the amount of the acid used is, for example, suitably in the range of 0.1 molar equivalent to 1000 molar equivalents, preferably in the range of 1 molar equivalent to 100 molar equivalents, relative to 1 mole of compound (II).
  • an organic amine can be used together with the acid. Although it does not specifically limit as an organic amine, For example, a triethylamine can be mentioned.
  • the amount of the organic amine to be used is, for example, suitably in the range of 0.01 molar equivalent to 10 molar equivalents, preferably in the range of 0.1 molar equivalents to 2 molar equivalents with respect to 1 mole of the acid.
  • a salt or a mixture of trifluoroacetic acid and triethylamine can be mentioned, and more specifically, with respect to 2 equivalents of trifluoroacetic acid. Examples thereof include a mixture of 1 equivalent of triethylamine.
  • the acid that can be used in this step can be used by diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration within the range of 0.1% to 30%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, and mixtures thereof.
  • the reaction temperature in the above reaction is, for example, preferably within the range of 10 ° C. to 50 ° C., more preferably within the range of 20 ° C. to 40 ° C., and even more preferably within the range of 25 ° C. to 35 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of acid used and the reaction temperature, but it is usually within the range of 0.1 minute to 24 hours. Preferably, it is within the range of 1 minute to 5 hours.
  • a base can be added.
  • the “base” is not particularly limited, and examples thereof include diisopropylamine.
  • the base can be used by diluting with a suitable solvent so that the concentration is within the range of 0.1% (v / v) to 30% (v / v).
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, or a mixture thereof.
  • the reaction temperature is, for example, preferably within the range of 10 ° C to 50 ° C, more preferably within the range of 20 ° C to 40 ° C, and even more preferably within the range of 25 ° C to 35 ° C. While the reaction time varies depending on the type of base used and the reaction temperature, it is usually within the range of 0.1 minute to 24 hours, and preferably within the range of 1 minute to 5 hours.
  • Step 1 The process of manufacturing the compound (henceforth a compound (VI)) represented by the following general formula (VI) by making an acylating agent act on the compound represented by the following general formula (V).
  • B P , T and the linker are as defined above;
  • R 4 represents a hydroxyl group, a halogen, a carboxyl group, or amino.
  • This step can be carried out by introducing a known linker using compound (V) as a starting material.
  • the compound represented by the following general formula (VIa) can be produced by carrying out a method known as an esterification reaction using compound (V) and succinic anhydride. [Wherein, B P and T are as defined above. ]
  • Step 2 A step of producing a compound (IIa) by reacting with a solid phase carrier by allowing a condensing agent or the like to act on the compound (VI).
  • a condensing agent or the like to act on the compound (VI).
  • This step can be produced by a method known as a condensation reaction using compound (VI) and a solid support.
  • n 2 to 99 (preferably any integer within the range of 25 to 35, 28 to 32, or 29 to 31, preferably 30,), and L is a group
  • the compound represented by the following general formula (IIa2), which is (IV), is a compound (IIa) as a starting material, and repeats Step A and Step B relating to the production method of PMO described herein for a desired number of times. It can manufacture by implementing.
  • n ′ is 1 to 98 (in certain embodiments, n ′ is 1 to 34, 1 to 33, 1 to 32, 1 to 31, 1 to 30, 1 to 29, 1 to 28, 1 to 27, 1 to 26, 1-25, 1-24). ]
  • Process B A step of producing a compound represented by the following general formula (VII) (hereinafter referred to as compound (VII)) by allowing a morpholino monomer compound to act on compound (III) in the presence of a base.
  • VII general formula
  • each of B P , L, n, R 2 , R 3 , and T has the same meaning as described above.
  • This step can be carried out by reacting compound (III) with a morpholino monomer compound in the presence of a base.
  • Examples of the morpholino monomer compound include a compound represented by the following general formula (VIII). [Wherein, B P , R 2 , R 3 and T are as defined above. ]
  • Examples of the “base” that can be used in this step include diisopropylamine, triethylamine, and N-ethylmorpholine. The amount of the base used is, for example, suitably in the range of 1 molar equivalent to 1000 molar equivalents, and preferably in the range of 10 molar equivalents to 100 molar equivalents, relative to 1 mole of compound (III).
  • the morpholino monomer compound and base that can be used in this step can also be used after diluting with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.1% to 30%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include N, N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone, DMF, dichloromethane, acetonitrile, terahydrofuran, and mixtures thereof.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 0 ° C. to 100 ° C., more preferably in the range of 10 ° C. to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of base used and the reaction temperature, it is usually within the range of 1 minute to 48 hours, and preferably within the range of 30 minutes to 24 hours.
  • an acylating agent can be added as necessary.
  • the “acylating agent” include acetic anhydride, acetic chloride, and phenoxyacetic anhydride.
  • the acylating agent can be used by diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration within the range of 0.1% to 30%, for example.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, and mixtures thereof.
  • a base such as pyridine, lutidine, collidine, triethylamine, diisopropylethylamine, N-ethylmorpholine can be used together with an acylating agent.
  • the amount of the acylating agent used is preferably in the range of 0.1 molar equivalent to 10,000 molar equivalents, and more preferably in the range of 1 molar equivalent to 1000 molar equivalents.
  • the amount of the base used is, for example, suitably in the range of 0.1 molar equivalent to 100 molar equivalents, and preferably in the range of 1 molar equivalent to 10 molar equivalents per mole of acylating agent.
  • the reaction temperature of this reaction is preferably within the range of 10 ° C to 50 ° C, more preferably within the range of 10 ° C to 50 ° C, more preferably within the range of 20 ° C to 40 ° C, and even more preferably. Is in the range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the reaction time varies depending on, for example, the type of acylating agent used and the reaction temperature, but is usually within the range of 0.1 minute to 24 hours, preferably within the range of 1 minute to 5 hours.
  • Process C A step of producing a compound represented by the general formula (IX) by removing a protecting group in the compound (VII) produced in the step B using a deprotecting agent.
  • Base, B P , L, n, R 2 , R 3 and T are as defined above.
  • This step can be carried out by allowing a deprotecting agent to act on compound (VII).
  • Examples of the “deprotecting agent” include concentrated aqueous ammonia and methylamine.
  • the “deprotecting agent” that can be used in this step is, for example, diluted with water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, tetrahydrofuran, DMF, N, N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone, or a mixed solvent thereof. It can also be used. Of these, ethanol is preferred.
  • the amount of the deprotecting agent to be used is, for example, suitably in the range of 1 molar equivalent to 100,000 molar equivalents, preferably in the range of 10 molar equivalents to 1000 molar equivalents, relative to 1 mole of compound (VII). It is.
  • the reaction temperature is, for example, suitably in the range of 15 ° C. to 75 ° C., preferably in the range of 40 ° C. to 70 ° C., more preferably in the range of 50 ° C. to 60 ° C.
  • the deprotection reaction time varies depending on the type of compound (VII), the reaction temperature, etc., but is suitably in the range of 10 minutes to 30 hours, preferably in the range of 30 minutes to 24 hours, more preferably 5 Within the range of hours to 20 hours.
  • Process D A step of producing PMO (I) by allowing an acid to act on compound (IX) produced in Step C. [Wherein, Base, n, R 2 , R 3 , T are as defined above. ]
  • This step can be performed by adding an acid to compound (IX).
  • Examples of the “acid” that can be used in this step include trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, acetic acid, phosphoric acid, and hydrochloric acid.
  • the amount of acid used is, for example, suitably so that the pH of the solution is in the range of 0.1 to 4.0, more preferably in the range of 1.0 to 3.0.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile, water, and mixed solvents thereof.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 10 ° C to 50 ° C, more preferably in the range of 20 ° C to 40 ° C, and still more preferably in the range of 25 ° C to 35 ° C.
  • the deprotection reaction time varies depending on the type of compound (IX), reaction temperature, etc., but is suitably in the range of 0.1 minute to 5 hours, preferably in the range of 1 minute to 1 hour, more preferably 1 Within minutes to 30 minutes.
  • PMO (I) is a conventional separation and purification means from the reaction mixture obtained in this step, for example, extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, C 8 to C 18 reverse phase column chromatography, It can be obtained by using means such as cation exchange column chromatography, anion exchange column chromatography, gel filtration column chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis, and ultrafiltration, alone or in combination, and the desired PMO (I ) Can be isolated and purified (see, for example, International Publication No. WO1991 / 09033).
  • a mixed solution of 20 mM triethylamine / acetic acid buffer and acetonitrile can be used as an elution solvent.
  • a mixed solution of 1M saline and 10 mM aqueous sodium hydroxide can be used.
  • a peptide nucleic acid is the antisense oligomer of the present invention having a group represented by the following general formula as a structural unit. (In the formula, Base is as defined above.)
  • Peptide nucleic acids can be produced, for example, according to the following literature. 1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992) 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994) 4) L.
  • the 5 ′ end may be any group represented by the following chemical formulas (1) to (3).
  • the groups represented by the above (1), (2) and (3) are referred to as “group (1)”, “group (2)” and “group (3)”, respectively.
  • a pharmaceutical composition comprising the antisense oligomer of the present invention can be used in a DMD patient (a patient having a mutation that in-frames with exon 51 skipping, such as an exon 29-50 deletion patient, an exon 50 deletion patient, an exon 45- 50 deletion patients, exon 48-50 deletion patients, exon 49-50 deletion patients, exon 52 deletion patients, exon 52-63 deletion patients, 13-50 deletion patients, 19-50 deletion patients, 43 -50 deficient patients or 47-50 deficient patients), it is predicted that the symptoms of muscular dystrophy can be alleviated with high efficiency.
  • a DMD patient a patient having a mutation that in-frames with exon 51 skipping, such as an exon 29-50 deletion patient, an exon 50 deletion patient, an exon 45- 50 deletion patients, exon 48-50 deletion patients, exon 49-50 deletion patients, exon 52 deletion patients, exon 52-63 deletion patients, 13-50 deletion patients, 19-50 deletion patients, 43 -50 deficient patients or 47-50 deficient patients
  • the pharmaceutical composition containing the antisense oligomer of the present invention when used, the same level of therapeutic effect can be obtained even with a small dose as compared with the oligomer according to the prior art, so that side effects can be reduced and the economy can be reduced.
  • a pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy hereinafter referred to as “the composition of the present invention” comprising the antisense oligomer of the present invention, a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating muscular dystrophy comprising the step of administering the antisense oligomer of the present invention to a DMD patient.
  • the antisense oligomer of the present invention may be administered as the pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy. Furthermore, the present invention provides the use of the antisense oligomer of the present invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of muscular dystrophy, and the antisense oligomer of the present invention for use in the treatment of muscular dystrophy.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the antisense oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, calcium salt and magnesium salt.
  • the dosage form of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable dosage form, and can be selected depending on the treatment method. From the viewpoint of ease of delivery to muscle tissue, intravenous administration is possible. Internal administration, intraarterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, intratissue administration, transdermal administration and the like are preferred.
  • the dosage form that the composition of the present invention can take is not particularly limited, and examples thereof include various injections, oral preparations, instillations, inhalants, ointments, lotions and the like.
  • the composition of the invention can include a carrier that facilitates delivery of the oligomer to muscle tissue.
  • a carrier is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include cationic carriers such as cationic liposomes and cationic polymers, and carriers utilizing a virus envelope.
  • cationic liposome for example, a liposome formed with 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipid as essential components (hereinafter referred to as “liposome A”).
  • Oligofectamine (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), Lipofectin (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine 2000 (registered trademark) (manufactured by Invitrogen) ), DMRIE-C (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), GeneSilencer (registered trademark) (manufactured by Gene Therapy Systems), TransMessenger (registered trademark) (manufactured by QIAGEN), TransIT TKO (registered trademark) (manufactured by Mirus) And Nucleofector II (Lonza).
  • liposome A is preferred.
  • the cationic polymer include JetSI (registered trademark) (manufactured by Qbiogene) and Jet-PEI (registered trademark) (polyethyleneimine, manufactured by Qbiogene).
  • the carrier using the virus envelope include GenomeOne (registered trademark) (HVJ-E liposome, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.).
  • a pharmaceutical device described in Japanese Patent No. 2924179, and a cationic carrier described in Japanese Patent Publication No. 2006/129594 and Japanese Patent Publication No. 2008/096690 can be used.
  • a pharmaceutical device described in Japanese Patent No. 2924179, and a cationic carrier described in Japanese Patent Publication No. 2006/129594 and Japanese Patent Publication No. 2008/096690 can be used.
  • US Pat. Nos. 4,235,871, 4,737,323, WO 96/14057 “New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990)
  • the concentration of the antisense oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention varies depending on the type of carrier and the like, but is suitably in the range of 0.1 nM to 100 ⁇ M, and preferably in the range of 100 nM to 10 ⁇ M.
  • the weight ratio of the antisense oligomer of the present invention to the carrier contained in the composition of the present invention varies depending on the properties of the oligomer, the type of the carrier, etc. A range of 100 is appropriate, and a range of 0.1 to 10 is preferable.
  • the composition of the present invention can optionally contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • emulsification aids for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran), stabilizers (for example, cholesterol, phosphatidic acid), and isotonicity.
  • Agents for example, sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose
  • pH adjusters for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine.
  • the content of the additive in the composition of the present invention is suitably 90% by weight or less, preferably 70% by weight or less, and more preferably 50% by weight or less.
  • the composition of the present invention can be prepared by adding the antisense oligomer of the present invention to a carrier dispersion and stirring appropriately.
  • the additive can be added in an appropriate step before or after the addition of the antisense oligomer of the present invention.
  • the aqueous solvent that can be used when the antisense oligomer of the present invention is added is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include electrolyte solutions such as water for injection, distilled water for injection, and physiological saline. And sugar solutions such as glucose solution and maltose solution. In addition, conditions such as pH and temperature in such a case can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention can be, for example, a solution or a lyophilized preparation thereof.
  • the lyophilized preparation can be prepared by lyophilizing the composition of the present invention having a liquid form according to a conventional method. For example, after appropriate sterilization of the composition of the present invention in the form of a liquid agent, a predetermined amount is dispensed into a vial and pre-freezing for about 2 hours at about ⁇ 40 to ⁇ 20 ° C. And primary drying under reduced pressure at about 0-10 ° C., followed by secondary drying under reduced pressure at about 15-25 ° C. and lyophilization. In general, the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized preparation of the composition of the present invention.
  • the freeze-dried preparation of the composition of the present invention can be used by re-dissolving generally by adding any appropriate solution (re-dissolving solution).
  • re-dissolving solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of the redissolved solution varies depending on the use and the like and is not particularly limited. However, an amount of 0.5 to 2 times the amount of the solution before lyophilization or 500 mL or less is appropriate.
  • the dose when administering the composition of the present invention is based on the type of antisense oligomer of the present invention, dosage form, patient condition such as age and weight, administration route, nature and degree of disease.
  • the amount of the antisense oligomer of the present invention for adults is generally within the range of 0.1 mg to 10 g / human, preferably within the range of 1 mg to 1 kg / human. It is. This value may vary depending on the type of target disease, dosage form, and target molecule. Therefore, in some cases, a lower dose may be sufficient, and conversely, a higher dose may be required. Moreover, it can be administered once to several times a day or at intervals of 1 day to several days.
  • composition of the present invention there can be mentioned a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a vector capable of expressing the oligonucleotide of the present invention and the above-mentioned carrier.
  • Such an expression vector may be capable of expressing a plurality of the oligonucleotides of the present invention.
  • a pharmaceutically acceptable additive can be added to the composition.
  • concentration of the expression vector contained in the composition varies depending on the type of carrier and the like, but is suitably in the range of 0.1 to 100 ⁇ M, and preferably in the range of 100 to 10 ⁇ M.
  • the weight ratio of the expression vector to the carrier (carrier / expression vector) contained in the composition varies depending on the nature of the expression vector, the type of carrier, etc., but is suitably in the range of 0.1 to 100, 0.1 to 10 Within the range of is preferable.
  • the content of the carrier contained in the composition is the same as that of the composition of the present invention containing the antisense oligomer of the present invention, and the preparation method thereof is also the case of the composition of the present invention. It is the same.
  • Step 2 4- ⁇ [(2S, 6R) -6- (4-Benzamido-2-oxopyrimidin-1-yl) -4-tritylmorpholin-2-yl] methoxy ⁇ -4 supported on aminopolystyrene resin
  • oxobutanoic acid 4- ⁇ [(2S, 6R) -6- (4-benzamido-2-oxopyrimidin-1 (2H) -yl) -4-tritylmorpholin-2-yl] methoxy ⁇ -4-oxobutane 4.0 g of acid was dissolved in 200 mL of pyridine (dehydrated), and 0.73 g of 4-DMAP and 11.5 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride were added.
  • the resin was collected by filtration, washed with pyridine, methanol and dichloromethane in this order, and dried under reduced pressure to obtain 26.7 g of the desired product.
  • the loading amount of the target product was determined by measuring the UV absorbance at 409 nm of the molar amount of trityl per gram of resin using a known method. The loading amount of the resin was 129.2 ⁇ mol / g.
  • UV measurement conditions Equipment: U-2910 (Hitachi) Solvent: Methanesulfonic acid Wavelength: 265 nm ⁇ value: 45000
  • PMOs shown in PMO Nos. 1 to 3 in Table 1 were synthesized.
  • the synthesized PMO was dissolved in water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory).
  • a dichloromethane solution containing 3% (w / v) trifluoroacetic acid was used.
  • As a neutralization / washing solution 35% (v / v) of N, N-diisopropylethylamine is 10% (v / v) and tetrahydrofuran is 5% (v / v).
  • Those dissolved in a dichloromethane solution containing acetonitrile were used.
  • the coupling solution A a morpholino monomer compound dissolved in tetrahydrofuran so as to have a concentration of 0.10 M was used.
  • As coupling solution B 2 N, N-diisopropylethylamine was used.
  • the aminopolystyrene resin carrying PMO synthesized above was recovered from the reaction vessel and dried under reduced pressure at room temperature for 2 hours or more.
  • PMO supported on the dried aminopolystyrene resin was placed in a reaction vessel, 5 mL of 28% aqueous ammonia-ethanol (1/4) was added, and the mixture was stirred at 55 ° C. for 15 hours.
  • the aminopolystyrene resin was filtered off and washed with 1 mL of water-ethanol (1/4). The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in 10 mL of a mixed solvent (4/1) of 20 mM acetic acid-triethylamine buffer (TEAA buffer) and acetonitrile and filtered through a membrane filter.
  • TEAA buffer 20 mM acetic acid-triethylamine buffer
  • the resulting filtrate was purified by reverse phase HPLC. The conditions used are as shown in Table 3 below.
  • One-Step RT-PCR was performed on 400 ng of the extracted total RNA using Qiagen One Step RT-PCR Kit (manufactured by Qiagen). A reaction solution was prepared according to the protocol attached to the kit. As the thermal cycler, PTC-100 (manufactured by MJ Research) was used.
  • the RT-PCR program used is as follows. 50 ° C, 30 minutes: reverse transcription reaction 95 ° C, 15 minutes: heat denaturation [94 ° C, 30 seconds; 60 ° C, 30 seconds; 72 ° C, 60 seconds] x 35 cycles: PCR amplification 72 ° C, 10 minutes: last Elongation reaction
  • forward primer 5'-CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Reverse primer 5'-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • skipping efficiency A / (A + B) x 100
  • the antisense oligomer of the present invention skips exon 51 in RD cells with extremely high efficiency. Therefore, the antisense oligomer of the present invention is very useful in the treatment of DMD.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンを、高効率にスキッピングさせる薬剤の提供。本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーを提供する。

Description

アンチセンス核酸
　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマー及び該オリゴマーを含む医薬組成物に関する。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は出生男子約3,500人に1人が発症する最も頻度の高い遺伝性進行性筋萎縮症である。乳幼児期には正常のヒトとほとんど変わらない運動機能を示すが、4～5歳頃から筋力低下がみられる。その後筋力低下は進行し12歳頃までに歩行不能になり、20歳代で心不全または呼吸器不全により死に至る重篤な疾患である。現在、DMDに対する有効な治療法はなく、新たな治療薬の開発が強く求められている。
　DMDはジストロフィン遺伝子の変異が原因であることが知られている。ジストロフィン遺伝子はX染色体に存在し、220万塩基のDNAから成る巨大な遺伝子である。DNAからmRNA前駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれ79のエクソンが結合したmRNAは11,058塩基になる。このmRNAから3,685のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィンタンパク質が生成される。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与しており、筋細胞を壊れにくくするために必要である。DMD患者のジストロフィン遺伝子は変異を有するため、筋細胞において機能を持つジストロフィンタンパク質が殆ど発現されない。そのため、DMD患者体内では、筋細胞の構造を維持できなくなり、多量のカルシウムイオンが筋細胞内に流れ込む。その結果、炎症に似た反応が生じ、線維化が進むために筋細胞が再生されにくくなる。
　ベッカー型筋ジストロフィー（BMD）もジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、その症状は筋萎縮による筋力低下を呈するものの一般にDMDと比較して軽く、筋力低下の進行も遅く、多くの場合、成人期に発症する。DMDとBMDとの臨床症状の違いは、変異によりジストロフィンのmRNAがジストロフィンタンパク質へと翻訳される際のアミノ酸読み取り枠が破壊されるか、あるいは維持されるかによるものと考えられている（非特許文献1）。つまり、DMDでは、アミノ酸読み取り枠がずれる変異を有することにより、機能を持つジストロフィンタンパク質がほとんど発現しないが、BMDでは変異によりエクソンの一部は欠失しているが、アミノ酸読み取り枠は維持されているために不完全ながらも機能を有するジストロフィンタンパク質が産生される。
　DMDの治療法として、エクソンスキッピング法が期待されている。この方法は、スプライシングを改変することでジストロフィンのmRNAのアミノ酸読み取り枠を修復し、部分的に機能を回復したジストロフィンタンパク質の発現を誘導する方法である（非特許文献2）。エクソンスキッピングの対象となるアミノ酸配列部分は失われることになる。そのためこの治療で発現されるジストロフィンタンパク質は正常のものより短くなるが、アミノ酸読み取り枠が維持されるために筋細胞を安定化する機能が部分的に保持される。従って、エクソンスキッピングにより、DMDは、より軽症のBMDと同じような症状を呈するようになると期待されている。エクソンスキッピング法は、マウスやイヌによる動物実験を経て、ヒトDMD患者に対する臨床試験が行われている。
　エクソンスキッピングは、5’又は3’スプライス部位のいずれか若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とするアンチセンス核酸の結合により誘導することができる。エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみmRNAに包含される。従って、スプライス部位をアンチセンス核酸でターゲッティングすることにより、エクソンスキッピングを誘導することができる。また、エクソンがスプライシングの機構に認識されるためにはエクソンスプライシングエンハンサー（ESE）へのSRタンパク質の結合が必要であると考えられており、ESEをターゲッティングすることでもエクソンのスキッピングを誘導することができる。
　ジストロフィン遺伝子の変異はDMD患者によって異なるため、遺伝子変異の場所や種類に応じたアンチセンス核酸が必要になる。これまでに、西オーストラリア大学のSteve Wiltonらによって79個全てのエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作製されており（非特許文献3）、オランダのAnnemieke Aartsma-Rusらによって39種類のエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作られている（非特許文献4）。
　全DMD患者の13％程度は、第51番目のエクソン（以下、「エクソン51」という）をスキッピングすることで治療可能と考えられている。近年では、ジストロフィン遺伝子のエクソン51をエクソンスキッピングのターゲットとした研究について、複数の研究機関から報告がなされている（特許文献1～6及び非特許文献5～6）。しかしながら、エクソン51を高効率にスキッピングさせる技術は、いまだに確立されていない。
国際公開公報第2004/048570号 国際公開公報第2002/024906号 国際公開公報第2010/048586号 国際公開公報第2010/050801号 米国特許公開公報第2010/0168212号
Monaco A. P. et al., Genomics 1988; 2: p. 90-95 Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: p. 167-172 Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96 Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Aoki Y., et al., Molecular therapy 2010: 18:  p. 1995-2005 Nakano S., et al., Pediatr Int. 2011: 53:  524-529
　上記のような状況において、ジストロフィン遺伝子のエクソン51 のスキッピングを高効率に誘導するアンチセンスオリゴマー及びそのオリゴマーを含む筋ジストロフィー治療薬が望まれている。
　本発明者らは、上記文献に記載の技術内容及びジストロフィン遺伝子の構造などを詳細に研究した結果、配列番号1及び2に示す塩基配列を有するアンチセンスオリゴマーを投与することにより、高効率にヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングを誘導できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
　以下の（a）～（d）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
（a）配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（b）配列番号1又は2の塩基配列において1～5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（c）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（d）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
［２］
　以下の（e）～（h）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
（e）配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（f）配列番号1又は2の塩基配列において1～3個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（g）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（h）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー      
［３］
　以下の（i）及び（j）より選ばれるアンチセンスオリゴマー。
（i）配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（j）配列番号1又は2の塩基配列に対して、90％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
［４］
　オリゴヌクレオチドである、前記［1］～［3］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。 
［５］
　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、前記［4］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［６］
　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記［４］または［５］に記載のアンチセンスオリゴマー。
（上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。）
［７］
　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記［４］～［６］のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［８］
　モルホリノオリゴマーである、前記［1］～［3］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［９］
　前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのモルホリノ環部分、リン酸結合部分、３’末端及び/又は５’末端が修飾されている、前記［8］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１０］
前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのリン酸結合部分が、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記［9］又は［10］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１１］
　ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記［10］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１２］
　5’末端が、下記化学式（1）～（3）のいずれかの基である、前記［9］～［11］のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［１３］
　前記［1］～［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
［１４］
　さらに医薬的に許容可能な担体を含む、前記［13］に記載の医薬組成物。
［１５］
　前記［1］～［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー又は前記［13］もしくは［14］に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
［１６］
　前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、前記［15］に記載の治療方法。
［１７］
　前記患者がヒトである、前記［15］又は前記［16］に記載の治療方法。
［１８］
　筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における前記［1］～［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマーの使用。
［１９］
　筋ジストロフィー治療に使用するための前記［1］～［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［２０］
　前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、前記［19］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［２１］
　前記患者がヒトである、前記［19］又は［20］に記載のアンチセンスオリゴマー。
　本発明のアンチセンスオリゴマーにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングを高効率に誘導することが可能である。また、本発明の医薬組成物を投与することにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状を、効果的に軽減することができる。
ヒト横紋筋肉腫（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子エクソン51のスキッピング効率を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
1．アンチセンスオリゴマー
　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンを高効率にスキッピングするアンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のアンチセンスオリゴマー」という）を提供する。
[ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソン]
　本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、cDNA、mRNA前駆体及びmRNAも含まれる。好ましくは、遺伝子は、mRNA前駆体、即ち、pre-mRNAである。
　ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Xp21.2に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、220万塩基対のサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか14kbに過ぎず、該コード領域は79個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)）。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるpre-mRNAは、スプライシングを受けて14kbの成熟mRNAを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である（GenBank Accession No. NM_004006）。
　ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン51の塩基配列を配列番号3に示す。
［アンチセンスオリゴマー］
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングにより、DMD型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、BMD型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って、アンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン51には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、具体的には以下の（a）～（d）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（a）配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（b）配列番号1又は2の塩基配列において1～5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（c）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（d）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
　（b）～（d）のアンチセンスオリゴマーは、具体的には（a）のアンチセンスオリゴマーの変異体であり、患者のジストロフィン遺伝子の変異（例えば、多型）などに対応することを念頭に置いたものである。
　別の態様としては、本発明のアンチセンスオリゴマーは、具体的には以下の（k）～（n）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（k）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（l）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列において1～5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（m）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（n）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
　（l）～（n）のアンチセンスオリゴマーは、具体的には（k）のアンチセンスオリゴマーの変異体であり、患者のジストロフィン遺伝子の変異（例えば、多型）などに対応することを念頭に置いたものである。
また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、以下の（o）～（r）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（o）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（p）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列において1～3個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（q）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（r）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー       
さらにまた、本発明のアンチセンスオリゴマーは、以下の（i）及び（j）より選ばれるアンチセンスオリゴマーである。
（i）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（j）配列番号６～３３のいずれか１つの塩基配列に対して、90％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
　本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマー」とは、例えば、配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるアンチセンスオリゴマーをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell， Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」とは、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」とは、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃又は5×SSC、1％ SDS、50 mM Tris－HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（1）5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃、（2）0.2 x SSC、0.1％ SDS、60℃、（3）0.2 x SSC、0.1％ SDS、62℃、（4）0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃、又は（5）0.1 x SSC、0.1％ SDS、65℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。　　　　
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたアンチセンスオリゴマーを検出することができる。あるいは、配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1又は2の塩基配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアンチセンスオリゴマーをあげることができる。
　なお、塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。blastnを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　「ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、pre-mRNA）のエクソン51に相当する部位に本発明のアンチセンスオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン52が欠失したDMD患者の場合、エクソン50の3’末端に相当する塩基配列にエクソン53の5’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟mRNAが形成されることを意味する。
　ここで、前記「結合」は、本発明のアンチセンスオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物とを混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のpH、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、25～40℃、好ましくは37℃、pH 5～8、好ましくは、pH 7.4であって、塩化ナトリウム濃度が150 mMの条件が挙げられる。
　ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のアンチセンスオリゴマーを導入し、前記ジストロフィン発現細胞のtotal RNAから、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAのエクソン51の周辺領域をRT-PCR増幅し、該PCR増幅産物に対してnested PCR又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。
　スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAを被検細胞から回収し、該mRNAのうち、エクソン51がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン51がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定し、これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
 
　　スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100
 
　好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上の効率でエクソン51をスキッピングする。
　スキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照することができる。
　本発明のアンチセンスオリゴマーとしては、例えば、16～35 塩基の長さを有する、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid:PNA）オリゴマーを挙げることができる。19～32塩基、20～31塩基、21塩基又は30塩基の長さが好ましく、モルホリノオリゴマーが好ましい。
　前記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）は、ヌクレオチドを構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。
　修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
　本発明において、核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、3-メチルウラシル,ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン（例えば、5-メチルシトシン）、5-アルキルウラシル（例えば、5-エチルウラシル）、5-ハロウラシル（5-ブロモウラシル）、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン（6-メチルウラシル）、2-チオウラシル、4-チオウラシル、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル) ウラシル、5'-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2,2-ジメチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、2-チオシトシン、プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　糖部分の修飾としては、例えば、リボースの2’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの2’位の修飾としては、例えば、リボースの2’位の-OH基をOR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br、Iに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Rはアルキル又はアリールを表す。R’はアルキレンを表す。
　糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの4’位のOをSに置換したもの、糖の 2' 位と 4' 位を架橋したもの、例えば、LNA（Locked Nucleic Acid）又はENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160 ）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第2006/129594号及び第2006/038608号を参照）。
　本発明において、アルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1～6のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが1～3個置換されていてもよい。
　本発明において、シクロアルキルとしては、炭素数5～12のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
　本発明において、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
　アルコキシとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1～6のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数1～3のアルコキシが好ましい。
　本発明において、アリールとしては、炭素数6～10のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α-ナフチル、β-ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが1～3個置換されていてもよい。
　本発明において、アルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1～6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、2-（エチル）トリメチレン、1-（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
　本発明において、アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２－メチルアセチル、２，２－ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２－ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボースの2’位の-OH基がメトキシで置換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Baseは、核酸塩基を表す。）
　本発明のオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、AKTA oligopilot plus 10 / 100（GE Healthcare））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Promega社、Takara社、又は日本バイオサービス社）等に委託して作製することもできる。
　本発明のモルホリノオリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Baseは、前記と同義であり；
　Wは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 (式中、Xは、-CH2R1、-O-CH2R1、-S-CH2R1、-NR2R3又はFを表し；
　R1は、H、アルキルを表し；
　R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し；
　Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し；
　Y2は、0、S又はNR1を表し；
　Zは、0又はSを表す。))
　モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「PMO」という））である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Base、R2、R3は、前記と同義である。）
 
　本発明モルホリノオリゴマーは、かかるオリゴマーを構成する核酸塩基、モルホリノ環部分、リン酸結合部分、３‘末端及び／又は５’末端の全部又は一部が修飾されているものを含む。
　リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160 ）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第2006/129594号及び第2006/038608号を参照）。
　モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第1991/009033号、又は国際公開公報第2009/064471号に従って製造することができる。特に、PMOは、国際公開公報第2009/064471号に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。
[PMOの製法]
　PMOの１つの態様として、例えば、次の一般式(I)で表される化合物（以下、PMO(I)という。）を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
［式中、各Base、R2、R3は、前記と同義であり；
　nは、1～99の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、24～34 、27～31又は28～30の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、29である。］
　PMO（I）は、公知の方法に従い製造することができるが、例えば、下記工程の操作を実施することにより製造することができる。
　下記工程に使用されている化合物及び試薬は、PMOの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
　また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる）で実施することができる。固相法でPMOを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
（１）工程A：
　次の一般式（II）で表される化合物（以下、化合物（II）という。）に酸を作用させることによって、次の一般式（III）で表される化合物（以下、化合物（III）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  ［式中、n、R2、R3は、前記と同義であり；
　各BPは，独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；
　Tは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し；
　Lは、水素、アシル、又は次の一般式（IV）で表される基（以下、基（IV）という。）を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　BPに係る「核酸塩基」としては、Baseと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、BPに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
　かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブチルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、(ジメチルアミノ)メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、４－ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で1～5個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、1-ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、4-（tert-ブチルカルボキシ）ベンジル、4-[(ジメチルアミノ)カルボキシ]ベンジル、4-(フェニルカルボキシ)ベンジルを挙げることができる（例えば、国際公開公報第2009/064471号公報参照）。
　「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、（i）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、N-メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ii）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（iii）化学修飾ができ、（iv）望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（v）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、（vi）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂　1%ジビニルベンゼン架橋（200～400メッシュ）（2.4～3.0mmol/g）（東京化成社製）、Aminomethylated Polystyrene Resin・HCl［ジビニルベンゼン1%，100～200メッシュ］（ペプチド研究所社製））、非膨潤性ポリスチレン（例えば、Primer Support(GE Healthcare社製））、PEG鎖結合型ポリスチレン（例えば、NH2-PEG resin（渡辺化学社製）、TentaGel resin）、定孔ガラス（controlled pore glass;CPG）（例えば、CPG社製）、オキサリル化－定孔ガラス（例えば、Alulら，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991)を参照）、TentaGel支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Wrightら，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993)を参照）、Poros-ポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
　「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、3-アミノプロピル、スクシニル、2,2’-ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（LCAA）を挙げることができる。
　本工程は、化合物（II）に酸を作用させることにより実施することができる。
　本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物（II）1モルに対して0.1モル当量～1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量～100モル当量の範囲内である。
　また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸1モルに対して、0.01モル当量～10モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、0.1モル当量～2モル当量の範囲内である。
　本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸2当量に対してトリエチルアミン1当量を混合したものを挙げることができる。
　本工程に使用しうる酸は、0.1%～30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
　上記反応における反応温度は、例えば、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃～40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃～35℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分～24時間の範囲内が適当である。好ましくは、1分～5時間の範囲内である。
　また、本工程が終了した後、必要に応じて、系中に存在する酸を中和するために塩基を添加することができる。「塩基」としては、特に限定されないが、例えば、ジイソプロピルアミンが挙げられる。塩基は、0.1%（v/v）～30%（v/v）の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。
　本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃～40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃～35℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分～24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分～5時間の範囲内である。
　なお、化合物（II）において、n=1であって、Lが基（IV）である、次の一般式（IIa）で表される化合物（以下、化合物（IIa）という。）は、以下の方法に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、BP、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
工程１：
　次の一般式（V）で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式（VI）で表される化合物（以下、化合物（VI）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、BP、T、リンカーは、前記と同義であり；
　R4は、水酸基、ハロゲン、カルボキシル基、又は、アミノを表す。］
　本工程は、化合物（V）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施することができる。
　特に、次の一般式（VIa）で表される化合物は、化合物（V）と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、BP、Tは、前記と同義である。］
工程２：
　化合物（VI）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（IIa）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式中、BP、R4、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
　本工程は、化合物(VI)と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
　化合物(II)において、n=2～99（好ましくは25～35 、28～32又は29～31の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、30である）であって、Lが基(IV)である、次の一般式(IIa2)で表される化合物は、化合物(IIa)を出発原料とし、本明細書に記載のPMOの製法にかかる工程A及び工程Bを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ［式中、BP、R2、R3、T、リンカー、固相担体は、前記と同義であり；
　n’は、1～98（特定の態様ではn’は、1～34、1～33、1～32、1～31、1～30、1～29、1～28、1～27、1～26、1～25、1～24）を表す。］
（２）工程B：
　化合物（III）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式（VII）で表される化合物（以下、化合物（VII）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［式中、各BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（III）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることにより実施することができる。
　モルホリノモノマー化合物としては、例えば、次の一般式（VIII）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［式中、BP、R2、R3、Tは前記と同義である。］
　本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、又は、N-エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物（III）1モルに対して、1モル当量～1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モル当量～100モル当量の範囲内である。
　本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、0.1%～30%の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン、DMF、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。
　反応温度は、例えば、0℃～100℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃～50℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常1分～48時間の範囲内が適当であり、好ましくは、30分～24時間の範囲内である。
　さらに本工程の終了後、必要に応じて、アシル化剤を添加することができる。「アシル化剤」としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロライド、フェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。アシル化剤は、例えば、0.1%～30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
　また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、0.1モル当量～10000モル当量の範囲内が好ましく、1モル当量～1000モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤１モルに対して、0.1モル当量～100モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量～10モル当量の範囲内である。
　本反応の反応温度は、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃～40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃～35℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分～24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分から5時間の範囲内である。
（３）工程C：
　工程Bにおいて製造される化合物（VII）において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式（IX）で表される化合物を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 ［式中、Base、BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（VII）に脱保護剤を作用させることにより実施することができる。
　「脱保護剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「脱保護剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、DMF、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。脱保護剤の使用量としては、例えば、化合物（VII）1モルに対して、例えば、1モル当量～100000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モル当量～1000モル当量の範囲内である。
　反応温度は、例えば、15℃～75℃の範囲内が適当であり、好ましくは40℃～70℃の範囲内であり、より好ましくは50℃～60℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（VII）の種類、反応温度等によって異なるが、10分～30時間の範囲内が適当であり、好ましくは30分～24時間の範囲内であり、より好ましくは5時間～20時間の範囲内である。
（４）工程D：
　工程Cにおいて製造される化合物（IX）に酸を作用させることによって、PMO（I）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 ［式中、Base、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（IX）に酸を加えることによって実施することができる。
　本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸、リン酸及び塩酸等を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、溶液のpHが0.1～4.0の範囲内になるように使用するのが適当であり、より好ましくは1.0～3.0の範囲内になるように使用する。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　反応温度は、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃～40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃～35℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（IX）の種類、反応温度等によって異なるが、0.1分～5時間の範囲内が適当であり、好ましくは1分～1時間の範囲内であり、より好ましくは1分～30分の範囲内である。
　PMO(I)は、本工程で得られた反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、C8からC18の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより得ることができ、所望のPMO(I)を単離精製することができる（例えば、国際公開公報WO1991/09033を参照）。
　逆相クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば20mMのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
　また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、例えば、1Mの食塩水と10mMの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
　ペプチド核酸は、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、Baseは、前記と同義である。）
　ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
１）P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)
２）M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，Jacs., 114, 1895 (1992)
３）K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
４）L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
５）T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
　また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、5’末端が、下記化学式（1）～（3）のいずれかの基であってもよい。好ましくは(3)-OHである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　以下、上記(1)、(2)及び(3)で示される基を、それぞれ「基(1)」、「基(2)」及び「基(3)」と呼ぶ。
2．医薬組成物
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、従来技術に係るアンチセンスオリゴマーと比較して、高効率にエクソン51のスキッピングを可能にする。従って、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物をDMD患者（エクソン51スキッピングでin-frame化する変異を有する患者、例えば、エクソン29-50欠失患者、エクソン50欠失患者、エクソン45-50欠失患者、エクソン48-50欠失患者、エクソン49-50欠失患者、エクソン52欠失患者、エクソン52-63欠失患者、13-50欠失患者、19-50欠失患者、43-50欠失患者、又は47-50欠失患者）に投与することにより、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を用いる場合、従来技術に係るオリゴマーと比べて少量の投与量でも同程度の治療効果を得られるため、副作用を軽減することができ、かつ経済的
である。
　そこで、別の実施態様として、本発明のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物（以下、「本発明の組成物」という）を提供する。
　また、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴマーを、DMD患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法を提供する。
　当該治療方法において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、前記筋ジストロフィー治療用医薬組成物として投与してもよい。
　さらに、本発明は、筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における本発明のアンチセンスオリゴマーの使用、及び筋ジストロフィー治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴマーを提供する。
　本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーの医薬的に許容可能な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩;アンモニウム塩；t-オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N-メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン
塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N， N' -ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N-ベンジル-フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩のような有機アミン塩;弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩;メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩;グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。
　本発明の組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができるが、筋組織への送達容易性の観点から、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が好ましい。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴマーを筋ジストロフィー患者に投与する場合、本発明の組成物は、該オリゴマーの筋組織への送達を促進する担体を含むことができる。このような担体は、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、その例として、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リポソームとしては、例えば、2-O-（2-ジエチルアミノエチル）カルバモイル-1,3-O-ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリポソーム（以下、「リポソームA」という）、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Invitrogen社製）、リポフェクチン（登録商標）（Invitrogen社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Invitrogen社製）、Lipofectamine 2000（登録商標）（Invitrogen社製）、DMRIE-C（登録商標）（Invitrogen社製）、GeneSilencer（登録商標）（Gene Therapy Systems社製）、TransMessenger（登録商標）（QIAGEN社製）、TransIT TKO（登録商標）（Mirus社製）、Nucleofector II（Lonza）を挙げることができる。それらの中で、リポソームAが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、JetSI（登録商標）（Qbiogene社製）、Jet-PEI（登録商標）（ポリエチレンイミン、Qbiogene社製）を挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、GenomeOne（登録商標）（HVJ-Eリポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。あるいは、特許2924179号に記載の医薬デバイス、特許再公表公報第2006/129594号及び特許再公表公報第2008/096690号に記載のカチオン性担体を用いることもできる。
　詳細については米国特許第4,235,871号、同第4,737,323号、国際公開公報第96/14057号、”New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pages 33-104”等を参照することができる。
　本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーの濃度は、担体の種類等によって異なるが、0.1 nM～100 μMの範囲内が適当であり、100 nM～10 μMの範囲内が好ましい。また、本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーと担体との重量比（担体/本発明のアンチセンスオリ
ゴマー）は、該オリゴマーの性質及び該担体の種類等によって異なるが、0.1～100の範囲内が適当であり、0.1～10の範囲内が好ましい。
　本発明の組成物には、本発明のアンチセンスオリゴマーと上述した担体以外に、任意に医薬的に許容可能な添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数6～22の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、pH調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、90重量％以下が適当であり、70重量％以下が好ましく、50重量％以下がより好ましい。
　本発明の組成物は、担体の分散液に本発明のアンチセンスオリゴマーを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明のアンチセンスオリゴマーの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明のアンチセンスオリゴマーを添加させる際に用い得る水性溶媒としては、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のpH及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することがで
きる。
　本発明の組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明の組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明の組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－40～－20℃の条件で予備凍結を2時間程度行い、約0～10℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約15～25℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　本発明の組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の0.5～2倍量、又は500 mL以下が適当である。
　本発明の組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明のアンチセンスオリゴマーの種類、剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明のアンチセンスオリゴマーの量として、1日当たり0.1mg～10g/ヒトの範囲内が、好ましくは1 mg～1 g/ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また1日1回から数回の投与又は1日から数日間の間隔で投与することができる。
　本発明の組成物の別の態様として、本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るベクターと上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数の本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るものであってもよい。当該組成物には、本発明のオリゴマーを含有する本発明の組成物と同様に、医薬的に許容可能な添加剤を添加することができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なるが、0.1 nM～100 μMの範囲内が適当であり、100 nM～10 μMの範囲内が好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担体/発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、0.1～100の範囲内が適当であり、0.1～10の範囲内が好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明のアンチセンスオリゴマーを含有する本発明の組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明の組成物の場合と同様である。
　以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
［参考例1］
アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸
工程1：4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1（2H）－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸の製造
　アルゴン雰囲気下、N－｛1－［（2R，6S）－6－（ヒドロキシメチル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］－2－オキソ－1，2－ジヒドロピリミジン－4－イル｝ベンズアミド3.44gと4－ジメチルアミノピリジン（4－DMAP）1.1gをジクロロメタン50mLに懸濁し、無水コハク酸0.90gを加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノール10mLを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、4.0gの目的物を得た。
工程2：アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸の製造
　4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1（2H）－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸4.0gをピリジン（脱水）200mLに溶解し、4－DMAP0.73g、1－エチル－3‐（3－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩11.5gを加えた。次いで、アミノポリスチレン樹脂　Primer support 200 amino（GE Healthcare　Japan社製、17-5214-97）25.0g、トリエチルアミン8.5mLを加え、室温で4日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン（脱水）200mL、無水酢酸15mL、2，6－ルチジン15mLを加え、室温で2時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、26.7gの目的物を得た。
　当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、129.2μmol/gであった。
 
       UV測定条件
       機器：U-2910（日立製作所）
       溶媒：メタンスルホン酸
       波長：265 nm
       ε値：45000
　　　　　　　　　　　　　 
　以下の実施例1、2及び比較例1の記載に従い、表1 のPMO No.1～3に示すPMOを合成した。合成したPMOを注射用水（大塚製薬工場社製）で溶解した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［実施例1］
PMO　No．1
　アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1（2H）－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸（参考例1）0.2g（26μmol）をフィルター付きカラムに充填し、核酸合成機（AKTA Oligopilot 10 plus）を使用して、下記合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各カップリングサイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した(下記表2を参照)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　なお、デブロック溶液としては、3％（w/v）トリフルオロ酢酸を含有するジクロロメタン溶液を用いた。中和・洗浄溶液としては、N，N－ジイソプロピルエチルアミンを10％（v/v）になるように、かつテトラヒドロフランを5％（v/v）になるように、35％（v/v）のアセトニトリル含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。カップリング溶液Aとしては、モルホリノモノマー化合物を0.10Mになるように、テトラヒドロフランで溶解したものを用いた。カップリング溶液Bとしては、N，N－ジイソプロピルエチルアミンを2
0％（v/v）になるように、かつテトラヒドロフランを10％（v/v）になるように、アセトニトリルで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、アセトニトリルに対して20％（v/v）の無水酢酸と30％（v/v）の2，6－ルチジンを溶解したものを使用した。
上記で合成したPMOが担持されたアミノポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、2時間以上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノポリスチレン樹脂に担持されたPMOを反応容器に入れ、28％アンモニア水－エタノール（1/4）5mLを加え、55℃で15時間撹拌した。アミノポリスチレン樹脂をろ別し、水－エタノール（1/4）1mLで洗浄した。得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を20mMの酢酸－トリエチルアミン緩衝液（TEAA緩衝液）とアセトニトリルの混合溶媒（4/1）10mLに溶解し、メンブレンフィルターでろ過した。得られたろ液を逆相HPLCにて精製した。使用した条件は、以下の表3に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　各フラクションを分析して、目的物を回収し、減圧濃縮した。濃縮残渣に2Mのリン酸水溶液0.5mLを加え、15分間攪拌した。さらに、2Mの水酸化ナトリウム水溶液2mLを加えてアルカリ性とし、メンブレンフィルター（0.45μm）でろ過した。
　得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記表4に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　各フラクションを分析（HPLC）し、目的物を水溶液として得た。得られた水溶液に0.1Mのリン酸緩衝液（pH 6.0）を添加し中和した。次いで、下記表5に示す条件で逆相HPLCにて脱塩した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　目的物を回収し、減圧濃縮した。得られた残渣を水に溶かし、凍結乾燥して、白色綿状固体として目的化合物を得た。
 
       ESI－TOF－MS　計算値：10021.46
       　　　　　　　測定値：10021.91
 
［実施例2］
PMO　No．２
　実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
 
       ESI－TOF－MS　計算値：9916.71
       　　　　　　 測定値：9916.43
 
［比較例１］
PMO　No．３
　実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
 
       ESI－TOF－MS　計算値：9949.46
       　　　　　　 測定値：9949.41
 
 [試験例1]
In vitro アッセイ
　PMO No.1、2の本発明のアンチセンスオリゴマー及びPMO No.3のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下の表6に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　RD細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）3.5×105個に対して、PMO No. 1及び2の本発明のアンチセンスオリゴマー並びにPMO. No. 3のアンチセンスオリゴマーを0.3, 1, 3, 10 μMずつAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II（Lonza）により導入した。プログラムはT-030を用いた。
　導入後、細胞を、10％ウシ胎児仔血清（FCS）（インビトロジェン社製）を含むEagle's minimal essential medium(EMEM)培地（シグマ社製、以下同じ。） 2mL中、37℃、5％CO2条件下で3日間培養した。細胞をPBS（ニッスイ社製、以下同じ。）で洗浄した後、ISOGEN II（ニッポンジーン社製）500 μl を細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をEppendorfチューブに回収した。ISOGENに添付のプロトコルに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。
　抽出したtotal RNA  400 ngに対し、Qiagen One Step RT-PCR Kit（Qiagen社製）を用いてOne-Step RT-PCRを行った。キットに添付のプロトコルに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはPTC-100（MJ Research社製）を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りである。
 
　　50℃、30分間：逆転写反応
　　95℃、15分間：熱変性
　　[94℃、30秒間；60℃、30秒間；72 ℃、60秒間]x 35サイクル：PCR増幅
　　72℃、10分間：最後の伸長反応
 
　RT-PCRに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
 
フォワードプライマー：5’-CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’　（配列番号5）
リバースプライマー：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’ 　（配列番号6）
 
　上記RT-PCRの反応産物1 μlをBioanalyzer（アジレント社製）を用いて解析した。エクソン51 がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン51がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
 
　　スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100
 
実験結果
　結果を図１に示す。本実験により、本発明のアンチセンスオリゴマーは、PMO No.3と比較して、著しく高い効率でエクソン 51 をスキッピングさせることが判明した。
 
［実施例３］
PMO No．４－６
　実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。各種アンチセ
ンスオリゴマーの配列を表７に示す。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
 ［実施例４］
配列番号9－33に記載の2’-O-メトキシ-ホスホロチオエート体
　標記の各種アンチセンスオリゴマーを日本バイオサービス社に委託して製造した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を表８に示す。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　試験例に示す実験結果から、本発明のアンチセンスオリゴマーは、RD細胞において、著しく高い効率でエクソン51をスキッピングさせることが示された。従って、本発明のアンチセンスオリゴマーは、DMDの治療において、非常に有用である。

Claims (21)

  1. 　以下の（a）～（d）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
    （a）配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
    （b）配列番号1又は2の塩基配列において1～5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
    （c）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
    （d）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
  2. 　以下の（e）～（h）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
    （e）配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
    （f）配列番号1又は2の塩基配列において1～3個の塩基が欠失、置換、
    挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
    （g）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
    （h）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
  3. 　以下の（i）及び（j）より選ばれるアンチセンスオリゴマー。
    （i）配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；および
    （j）配列番号1又は2の塩基配列に対して、90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
  4. 　オリゴヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  5. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項４に記載のアンチセンスオリゴマー。
  6. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項４又は５に記載のアンチセンスオリゴマー。
    （上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。）
  7. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項４～６のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
  8. 　モルホリノオリゴマーである、請求項1～３のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  9. 　前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのモルホリノ環部分、リン酸結合部分、３’末端及び/又は５’末端が修飾されている、請求項８に記載のアンチセンスオリゴマー。
  10. 　前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのリン酸結合部分が、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項９又は１０に記載のアンチセンスオリゴマー。
  11. 　ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴマー。
  12. 　5’末端が、下記化学式（1）～（3）のいずれかの基である、請求項９～１１のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  13. 　請求項1～１２のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
  14. 　さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　請求項1～１２のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー又は請求項１３もしくは１４に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
  16. 　前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、請求項１５に記載の治療方法。
  17. 　前記患者がヒトである、請求項１５又は１６に記載の治療方法。
  18. 　筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における請求項1～１２のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマーの使用。
  19. 　筋ジストロフィー治療に使用するための請求項1～１２のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
  20. 　前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、請求項１９に記載のアンチセンスオリゴマー。
  21. 　前記患者がヒトである、請求項１９又は２０に記載のアンチセンスオリゴマー。  

     
PCT/JP2015/057180 2014-03-12 2015-03-11 アンチセンス核酸 WO2015137409A1 (ja)

Priority Applications (30)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/122,435 US9988629B2 (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acids
AU2015227733A AU2015227733B2 (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acids
CA2939948A CA2939948A1 (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acids
RU2016139108A RU2702424C2 (ru) 2014-03-12 2015-03-11 Антисмысловые нуклеиновые кислоты
ES15761392T ES2710802T3 (es) 2014-03-12 2015-03-11 Acido nucleico antisentido
EP15761392.8A EP3118311B1 (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acid
UAA201610167A UA120849C2 (uk) 2014-03-12 2015-03-11 Антисенсовий олігомер
CN201580012727.4A CN106459955B (zh) 2014-03-12 2015-03-11 反义核酸
MX2016011538A MX2016011538A (es) 2014-03-12 2015-03-11 Acidos nucleicos antisentido.
PL15761392T PL3118311T3 (pl) 2014-03-12 2015-03-11 Antysensowny kwas nukleinowy
EP18205909.7A EP3514234A1 (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acid
JP2016507800A JP6606488B2 (ja) 2014-03-12 2015-03-11 アンチセンス核酸
DK15761392.8T DK3118311T3 (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acid
SG11201607095RA SG11201607095RA (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acids
RS20190188A RS58573B1 (sr) 2014-03-12 2015-03-11 Antisensna nukleinska kiselina
MYPI2016703281A MY193708A (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acids
SI201530597T SI3118311T1 (sl) 2014-03-12 2015-03-11 Protismiselna nukleinska kislina
NZ724836A NZ724836A (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acids
LTEP15761392.8T LT3118311T (lt) 2014-03-12 2015-03-11 Priešprasminė nukleorūgštis
KR1020167027723A KR102335801B1 (ko) 2014-03-12 2015-03-11 안티센스 핵산
BR112016020618-5A BR112016020618B1 (pt) 2014-03-12 2015-03-11 Oligômero antissentido, composição farmacêutica, e, uso de um oligômero antissentido
ZA2016/05864A ZA201605864B (en) 2014-03-12 2016-08-23 Antisense nucleic acids
IL247663A IL247663B (en) 2014-03-12 2016-09-06 Antisense oligomers for skipping exon 51 in the human dystrophin gene
PH12016501761A PH12016501761B1 (en) 2014-03-12 2016-09-07 Antisense nucleic acids
US15/902,231 US20180179538A1 (en) 2014-03-12 2018-02-22 Antisense nucleic acids
HRP20190235TT HRP20190235T1 (hr) 2014-03-12 2019-02-05 Antisensna nukleinska kiselina
CY20191100184T CY1121322T1 (el) 2014-03-12 2019-02-12 Αντινοηματικο νουκλειϊκο οξυ
US16/437,130 US11053497B2 (en) 2014-03-12 2019-06-11 Antisense nucleic acids
AU2020200679A AU2020200679B2 (en) 2014-03-12 2020-01-30 Antisense nucleic acids
US17/364,618 US20220162604A1 (en) 2014-03-12 2021-06-30 Antisense nucleic acids

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-048897 2014-03-12
JP2014048897 2014-03-12

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/122,435 A-371-Of-International US9988629B2 (en) 2014-03-12 2015-03-11 Antisense nucleic acids
US15/902,231 Continuation US20180179538A1 (en) 2014-03-12 2018-02-22 Antisense nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015137409A1 true WO2015137409A1 (ja) 2015-09-17

Family

ID=54071850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/057180 WO2015137409A1 (ja) 2014-03-12 2015-03-11 アンチセンス核酸

Country Status (30)

Country Link
US (4) US9988629B2 (ja)
EP (2) EP3118311B1 (ja)
JP (1) JP6606488B2 (ja)
KR (1) KR102335801B1 (ja)
CN (2) CN106459955B (ja)
AU (2) AU2015227733B2 (ja)
BR (1) BR112016020618B1 (ja)
CA (1) CA2939948A1 (ja)
CY (1) CY1121322T1 (ja)
DK (1) DK3118311T3 (ja)
ES (1) ES2710802T3 (ja)
HR (1) HRP20190235T1 (ja)
HU (1) HUE042283T2 (ja)
IL (1) IL247663B (ja)
LT (1) LT3118311T (ja)
MX (1) MX2016011538A (ja)
MY (1) MY193708A (ja)
NZ (1) NZ724836A (ja)
PH (1) PH12016501761B1 (ja)
PL (1) PL3118311T3 (ja)
PT (1) PT3118311T (ja)
RS (1) RS58573B1 (ja)
RU (2) RU2730681C2 (ja)
SG (1) SG11201607095RA (ja)
SI (1) SI3118311T1 (ja)
TR (1) TR201901939T4 (ja)
TW (2) TWI672314B (ja)
UA (1) UA120849C2 (ja)
WO (1) WO2015137409A1 (ja)
ZA (1) ZA201605864B (ja)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018005805A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomers for muscular dystrophy
WO2018118662A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2018118599A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2018118627A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2019059973A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Sarepta Therapeutics, Inc. OLIGOMERIC CONJUGATES FOR THE EXON JUMP FOR MUSCLE DYSTROPHY
WO2019067975A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
EP3485015A4 (en) * 2016-07-15 2020-07-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS OF MODULATION OF DYSTROPHINE TRANSCRIPT
WO2020158792A1 (ja) * 2019-01-30 2020-08-06 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 核酸送達複合体
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2021172498A1 (ja) 2020-02-28 2021-09-02 日本新薬株式会社 エクソン５１のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2730681C2 (ru) * 2014-03-12 2020-08-24 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Антисмысловые нуклеиновые кислоты
RS60493B1 (sr) 2015-09-15 2020-08-31 Nippon Shinyaku Co Ltd Antismisaona nukleinska kiselina
CR20180233A (es) 2015-10-09 2018-05-25 Wave Life Sciences Ltd Composiciones oligonucleotídicas y sus métodos
MX2019008199A (es) * 2017-01-06 2019-11-25 Avidity Biosciences Llc Composiciones de acido nucleico polipeptido y metodos de induccion de la omision de exon.
GB201711809D0 (en) * 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
EP3672601B1 (en) * 2017-09-25 2023-09-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers via fast-flow synthesis
WO2020028864A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
CA3108282A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CN113286887A (zh) * 2018-11-02 2021-08-20 比奥马林技术公司 用于肌营养不良蛋白外显子跳跃的双特异性反义低聚核苷酸
CN113383078A (zh) * 2018-12-06 2021-09-10 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸组合物及其方法
EP4330395A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Treatment methods for muscular dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
WO2023178230A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Phosphorodiamidate morpholino oligomer conjugates

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004509622A (ja) * 2000-09-21 2004-04-02 アカデミス　ツィーケンホイス　ライデン 真核細胞におけるエキソンスキッピングの誘導
WO2004048570A1 (ja) * 2002-11-25 2004-06-10 Nonprofit Organization Translational Research Organization Of Duchenne Muscular Dystrophy ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬
US20100168212A1 (en) * 2008-09-11 2010-07-01 Royal Holloway, University Of London Oligomers
WO2012029986A1 (ja) * 2010-09-01 2012-03-08 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
JP2012506703A (ja) * 2008-10-24 2012-03-22 エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド Ｄｍｄのための複数のエキソンスキッピング組成物
JP2012506697A (ja) * 2008-10-27 2012-03-22 プロセンサ テクノロジーズ ベー．フェー． Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の効率的なスキッピングのための方法及び手段
WO2012150960A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Avi Biopharma, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
JP2013530154A (ja) * 2010-05-28 2013-07-25 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 修飾されたサブユニット間結合および／または末端基を有するオリゴヌクレオチドアナログ

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
DE69033986T2 (de) 1989-12-20 2003-03-13 Antivirals Inc Ungeladene, auf Morpholin basierende Polymere mit Chiralen, Phosphor enthaltenden Brücken zwischen den Untereinheiten
JP2924179B2 (ja) 1993-02-19 1999-07-26 日本新薬株式会社 グリセロール誘導体，デバイス及び医薬組成物
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
EP4272748A3 (en) * 2004-06-28 2024-03-27 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
WO2006038608A1 (ja) 2004-10-05 2006-04-13 Nippon Shinyaku Co., Ltd. オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物
AU2006237727B2 (en) * 2005-04-22 2012-06-28 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mRNA by interfering with the binding of SR proteins and by interfering with secondary RNA structure.
WO2006129594A1 (ja) 2005-05-30 2006-12-07 Nippon Shinyaku Co., Ltd. 核酸含有複合体製剤の製造方法
US8067571B2 (en) * 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
RU2418068C2 (ru) * 2005-08-17 2011-05-10 Сирна Терапьютикс, Инк. Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк
JP2009518006A (ja) * 2005-11-30 2009-05-07 ギルド アソシエイツ， インコーポレイテッド 化学薬品の検出および生分解のための識別的蛍光の酵母バイオセンサー
US8466255B2 (en) 2007-02-05 2013-06-18 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Polyethylene glycol derivative
EP2203173B1 (en) * 2007-10-26 2015-12-23 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
WO2009064471A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
US20110269665A1 (en) 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CN105838714B (zh) * 2009-11-12 2020-07-17 西澳大利亚大学 反义分子和治疗疾病的方法
IT1400425B1 (it) * 2010-06-08 2013-05-31 Amsterdam Molecular Therapeutics Bv Modified snrnas for use in therapy.
JP2014507143A (ja) * 2011-02-08 2014-03-27 ザ シャーロット−メクレンバーグ ホスピタル オーソリティ ドゥーイング／ビジネス／アズ キャロライナズ ヘルスケア システム アンチセンスオリゴヌクレオチド
CA2861247C (en) * 2011-12-28 2021-11-16 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids
RU2730681C2 (ru) * 2014-03-12 2020-08-24 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Антисмысловые нуклеиновые кислоты

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004509622A (ja) * 2000-09-21 2004-04-02 アカデミス　ツィーケンホイス　ライデン 真核細胞におけるエキソンスキッピングの誘導
WO2004048570A1 (ja) * 2002-11-25 2004-06-10 Nonprofit Organization Translational Research Organization Of Duchenne Muscular Dystrophy ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬
US20100168212A1 (en) * 2008-09-11 2010-07-01 Royal Holloway, University Of London Oligomers
JP2012506703A (ja) * 2008-10-24 2012-03-22 エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド Ｄｍｄのための複数のエキソンスキッピング組成物
JP2012506697A (ja) * 2008-10-27 2012-03-22 プロセンサ テクノロジーズ ベー．フェー． Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の効率的なスキッピングのための方法及び手段
JP2013530154A (ja) * 2010-05-28 2013-07-25 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 修飾されたサブユニット間結合および／または末端基を有するオリゴヌクレオチドアナログ
WO2012029986A1 (ja) * 2010-09-01 2012-03-08 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
WO2012150960A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Avi Biopharma, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AOKI Y ET AL.: "In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse", MOL. THER., vol. 18, no. 11, 2010, pages 1995 - 2005, XP055224044 *
ARECHAVALA-GOMEZA V ET AL.: "Comparative analysis of antisense oligonucleotide sequences for targeted skipping of exon 51 during dystrophin pre-mRNA splicing in human muscle", HUM. GENE THER., vol. 18, no. 9, 2007, pages 798 - 810, XP055038387 *
CIRAK S ET AL.: "Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study", LANCET, vol. 378, no. 9791, 2011, pages 595 - 605, XP009160164 *
INCITTI T ET AL.: "Exon skipping and duchenne muscular dystrophy therapy: selection of the most active U1 snRNA antisense able to induce dystrophin exon 51 skipping", MOL. THER., vol. 18, no. 9, 2010, pages 1675 - 1682, XP008131506 *
NAKANO S ET AL.: "Exon-skipping events in candidates for clinical trials of morpholino", PEDIATR. INT., vol. 53, no. 4, 2011, pages 524 - 529, XP055224048 *
See also references of EP3118311A4 *
TAKASHI SAITO ET AL.: "Development of Exon Skipping Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy Using Patient-Derived Cells", JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL PHARMACOLOGY AND THERAPEUTICS, vol. 43, no. 2, 31 March 2012 (2012-03-31), pages 91 - 92, XP008174733 *

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018005805A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomers for muscular dystrophy
EP3485015A4 (en) * 2016-07-15 2020-07-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS OF MODULATION OF DYSTROPHINE TRANSCRIPT
WO2018118627A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US11382981B2 (en) 2016-12-19 2022-07-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2018118599A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US11642364B2 (en) 2016-12-19 2023-05-09 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EP4122497A1 (en) 2016-12-19 2023-01-25 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EP4115908A1 (en) 2016-12-19 2023-01-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US10888578B2 (en) 2016-12-19 2021-01-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US11000600B2 (en) 2016-12-19 2021-05-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2018118662A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
TWI760402B (zh) * 2016-12-19 2022-04-11 美商薩羅塔治療公司 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物結合物
US11395855B2 (en) 2016-12-19 2022-07-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2019059973A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Sarepta Therapeutics, Inc. OLIGOMERIC CONJUGATES FOR THE EXON JUMP FOR MUSCLE DYSTROPHY
WO2019067975A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
US11491238B2 (en) 2018-05-29 2022-11-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US11338041B2 (en) 2018-05-29 2022-05-24 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US10765760B2 (en) 2018-05-29 2020-09-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
WO2020158792A1 (ja) * 2019-01-30 2020-08-06 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 核酸送達複合体
KR20220145865A (ko) 2020-02-28 2022-10-31 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 엑손 51의 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산
WO2021172498A1 (ja) 2020-02-28 2021-09-02 日本新薬株式会社 エクソン５１のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸
JP7292636B2 (ja) 2020-02-28 2023-06-19 日本新薬株式会社 エクソン５１のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸
US11781140B2 (en) 2020-02-28 2023-10-10 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51

Also Published As

Publication number Publication date
US20180179538A1 (en) 2018-06-28
AU2020200679A1 (en) 2020-02-20
EP3118311A4 (en) 2017-10-11
RU2702424C2 (ru) 2019-10-08
US9988629B2 (en) 2018-06-05
JPWO2015137409A1 (ja) 2017-04-06
PH12016501761A1 (en) 2016-11-07
SI3118311T1 (sl) 2019-05-31
UA120849C2 (uk) 2020-02-25
EP3118311A1 (en) 2017-01-18
RS58573B1 (sr) 2019-05-31
LT3118311T (lt) 2019-04-10
CN106459955A (zh) 2017-02-22
EP3118311B1 (en) 2018-12-26
CY1121322T1 (el) 2020-05-29
RU2019130513A (ru) 2019-10-10
JP6606488B2 (ja) 2019-11-13
KR20160132056A (ko) 2016-11-16
ZA201605864B (en) 2018-12-19
BR112016020618A8 (pt) 2021-07-13
MX2016011538A (es) 2017-04-13
US11053497B2 (en) 2021-07-06
IL247663B (en) 2020-06-30
RU2019130513A3 (ja) 2020-03-13
RU2730681C2 (ru) 2020-08-24
EP3514234A1 (en) 2019-07-24
PH12016501761B1 (en) 2016-11-07
AU2015227733A1 (en) 2016-10-20
BR112016020618A2 (pt) 2017-08-15
US20220162604A1 (en) 2022-05-26
ES2710802T3 (es) 2019-04-26
MY193708A (en) 2022-10-26
AU2015227733B2 (en) 2019-10-31
CA2939948A1 (en) 2015-09-17
AU2020200679B2 (en) 2022-03-10
PL3118311T3 (pl) 2019-09-30
CN110951732A (zh) 2020-04-03
PT3118311T (pt) 2019-02-15
RU2016139108A3 (ja) 2018-08-06
SG11201607095RA (en) 2016-10-28
IL247663A0 (en) 2016-11-30
TWI672314B (zh) 2019-09-21
HRP20190235T1 (hr) 2019-05-03
TW201540724A (zh) 2015-11-01
TR201901939T4 (tr) 2019-03-21
HUE042283T2 (hu) 2019-06-28
TW201945383A (zh) 2019-12-01
US20170067048A1 (en) 2017-03-09
BR112016020618B1 (pt) 2023-04-04
CN106459955B (zh) 2019-12-20
KR102335801B1 (ko) 2021-12-03
US20200149040A1 (en) 2020-05-14
RU2016139108A (ru) 2018-04-13
DK3118311T3 (en) 2019-03-11
NZ724836A (en) 2022-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6606488B2 (ja) アンチセンス核酸
JP7041879B2 (ja) アンチセンス核酸
JP6647430B2 (ja) アンチセンス核酸
JP6977998B2 (ja) アンチセンス核酸
WO2021172498A1 (ja) エクソン５１のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸
WO2021132591A1 (ja) エクソン５０のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15761392

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016507800

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2939948

Country of ref document: CA

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015761392

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015761392

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15122435

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 122020024711

Country of ref document: BR

Ref document number: 247663

Country of ref document: IL

Ref document number: MX/A/2016/011538

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12016501761

Country of ref document: PH

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20167027723

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201610167

Country of ref document: UA

Ref document number: NC2016/0002745

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016139108

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015227733

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20150311

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112016020618

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112016020618

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20160906