JP7138349B2 - 核酸化合物およびオリゴヌクレオチド - Google Patents

核酸化合物およびオリゴヌクレオチド Download PDF

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Description

本発明は、非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対を形成し難い核酸化合物と、当該核酸化合物を含み、標的核酸以外の核酸との非特異的結合が低減されているオリゴヌクレオチドに関するものである。
染色体は、ＤＮＡ二重鎖で構成されていることがＷａｔｓｏｎとＣｒｉｃｋにより明らかにされている。また、ｍＲＮＡ分子内でも、一部で二重鎖が形成されている。さらに近年、核酸間の相互作用を利用した治療方法が種々開発されている。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、疾病に関係するＲＮＡの一本鎖部分に結合して二重鎖を形成し、その作用を阻害するものである。代表的には、ｍＲＮＡの一本鎖部分に相補的なＤＮＡを結合させて二重鎖を形成させ、ＲＮａｓｅＨによりその部分を加水分解して切断させる方法が知られている。
その他、疾病に関係する遺伝子に相補的なアンチジーンと、当該遺伝子のＤＮＡ二重鎖とで三重鎖を形成させ、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を阻害する方法も知られている。また、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により特異的に標的ｍＲＮＡを切断する。
上記の核酸鎖間の相互作用は、核酸塩基間の水素結合に基づく。例えば、アデノシンのアデニンとチミジンのチミンとの相互作用を以下に示す。
Figure 0007138349000001
しかし、以下に示すチミンとグアニンとの間の相互作用も熱力学的に比較的安定であることから、ゆらぎ（Ｗｏｂｂｌｅ）塩基対と呼ばれる非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対が形成されることがある。かかるゆらぎ塩基対は、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド等が本来の標的核酸以外の核酸へ結合する原因となり得、予想外の遺伝子の発現や、重要な遺伝子の発現抑制につながるおそれがある。このような現象はオフターゲット効果といわれ、重篤な副作用の原因となり得る（非特許文献１）。
Figure 0007138349000002
そこで、チミンの２位カルボニル基をチオカルボニル基に官能基変換することにより、グアニンとの水素結合力を低減し、Ｇ－Ｔ非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対の形成を抑制できることが明らかにされている（非特許文献２）。
ところで、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸医薬は、特異性が高いという利点を有するが、ヌクレアーゼの基質となるために生体内での安定性が十分でないという問題を有する。また、核酸中のヌクレオシド部分はＮ型またはＳ型の構造を取り、かかる構造が核酸塩基間の相互作用にも影響を与える。そこで本発明者らの研究グループは、核酸の２’位と４’位を架橋し、核酸のコンフォメーションを安定化して、ヌクレアーゼ耐性を高め、且つ標的核酸に対する親和性を高める技術を開発している（特許文献１～５）。
国際公開第２０１１／０５２４３６号パンフレット 国際公開第２０１４／０４６２１２号パンフレット 国際公開第２０１４／１１２４６３号パンフレット 国際公開第２０１５／１２５７８３号パンフレット 国際公開第２０１６／０１７４２２号パンフレット
Ｏｂｉｋａ，Ｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７，ｐｐ．１２２５－１２３８（２００９） Ｈｅｒｍａｎ．Ｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２８，ｐｐ．３９６－３９７（２００６）
上述したように、チミンの２位カルボニル基をチオカルボニル基に官能基変換することにより、Ｇ－Ｔ非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対の形成を抑制できることは知られていた。しかし非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対は核酸医薬による副作用の原因の一つとも考えられており、非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対の形成をより一層抑制する方法が求められていた。
そこで本発明は、非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対を形成し難い核酸化合物と、当該核酸化合物を含み、標的核酸以外の核酸との非特異的結合が低減されているオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、核酸鎖中の核酸化合物における２’位と４’位との架橋は、相補的核酸鎖との親和性を向上する方向に働くが、チミンの２位カルボニル基の修飾に加えて２’位と４’位を架橋することにより、意外にも非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対の形成をかえって抑制できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
［１］ 下記式（Ｉ）または下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とする核酸化合物またはその塩。
Figure 0007138349000003
［式中、
Ｘ1とＸ2は、独立してＳまたはＳｅを示し、
Ｙは下記式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、且つ、Ｚは単結合もしくはＣ1-4アルキレン基を示すか、
Figure 0007138349000004
（式中、Ｒ5～Ｒ18は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-10シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２－シアノエチルオキシカルボニル基を示す）、または、
Ｙは、Ｏ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ19）－基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ20）－基（Ｒ19とＲ20は、独立して、ＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）を示し、且つ、Ｚは下記式（ＶＩＩ）で表されるシクロプロピル基を示すか、
Figure 0007138349000005
（式中、Ｒ21とＲ22は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基を示すか、または、Ｒ21とＲ22が一緒になってＣ1-4アルキレン基を形成してもよい）、または、
ＹとＺは、一緒になって－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基もしくは－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ20）－基（Ｒ20は、ＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）を示し、
Ｒ1は、ＨまたはＣ1-6アルキル基を示し、
Ｒ2とＲ3は、独立して、Ｈ、水酸基の保護基、または、下記式（ＶＩＩＩ）で表されるリン酸基を示し、
Figure 0007138349000006
（式中、ＱはＯまたはＳを示し、Ｒ23は、Ｈ、水酸基、またはシアノ基で置換されていてもよいＣ1-6アルコキシ基を示し；Ｒ24は、水酸基、シアノ基で置換されていてもよいＣ1 -6アルコキシ基またはＮＲ25Ｒ26基（式中、Ｒ25とＲ26は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基または２－シアノエチル基を示す）を示し；ｎは０または１を示す）
Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基または２－シアノエチル基を示す。］
［２］ ＹがＯであり、且つ、Ｚが上記式（ＶＩＩ）で表されるシクロプロピル基である上記［１］に記載の核酸化合物またはその塩。
［３］ Ｒ1がメチル基である上記［１］または［２］に記載の核酸化合物またはその塩。
［４］ １以上の核酸残基が下記式（ＩＸ）で表される構造を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
Figure 0007138349000007
［式中、
Ｘ1は、ＳまたはＳｅを示し、
Ｙは下記式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、且つ、Ｚは単結合もしくはＣ1-4アルキレン基を示すか、
Figure 0007138349000008
（式中、Ｒ5～Ｒ18は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-10シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２－シアノエチルオキシカルボニル基を示す）、または、
Ｙは、Ｏ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ19）－基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ20）－基（Ｒ19とＲ20は、独立して、ＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）を示し、且つ、Ｚは下記式（ＶＩＩ）で表されるシクロプロピル基を示すか、
Figure 0007138349000009
（式中、Ｒ21とＲ22は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基を示すか、または、Ｒ21とＲ22が一緒になってＣ1-4アルキレン基を形成してもよい）、または、
ＹとＺは、一緒になって－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基もしくは－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ20）－基（Ｒ20は、ＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）を示し、
Ｒ1は、ＨまたはＣ1-6アルキル基を示す。］
［５］ ＹがＯであり、且つ、Ｚが上記式（ＶＩＩ）で表されるシクロプロピル基である上記［４］に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
［６］ Ｒ1がメチル基である上記［４］または［５］に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
本開示において「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。
「Ｃ3-10シクロアルキル基」は、炭素数３以上、１０以下の環状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、ジメチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル等である。好ましくはＣ3-6シクロアルキル基である。
「アミノ基の保護基」としては、例えば、ｔ－ブトキシカルボニル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル等のアルコキシカルボニル系保護基；ベンジルオキシカルボニル、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル、ｏ－ニトロベンジルオキシカルボニル等のアリールメトキシカルボニル系保護基；ベンジル、４－メトキシベンジル、トリフェニルメチル等のアリールメチル系保護基；ホルミルやアセチル等のアルカノイル系保護基；ベンゾイル等のアロイル系保護基；２，４－ジニトロベンゼンスルホニル、ｏ－ニトロベンゼンスルホニル等のアリールスルホニル系保護基などを挙げることができる。
「Ｃ1-4アルキレン基」は、炭素数１以上、４以下の直鎖状または分枝鎖状の二価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチレン、エチレン、メチルメチレン、ｎ－プロピレン、メチルエチレン、ｎ－ブチレン、メチルプロピレン、ジメチルエチレン等である。好ましくはＣ1-2アルキレン基であり、より好ましくはメチレンである。
「水酸基の保護基」としては、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル等のアルカノイル系保護基；ベンジル、ｐ－メトキシベンジル、ｐ－ニトロベンジル等のアラルキル系保護基；トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル等のシリル系保護基；トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル等のトリチル系保護基；メトキシメチル等のアルコキシアルキル系保護基；テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）等のエーテル系保護基などを挙げることができる。
「Ｃ1-6アルコキシ基」とは、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基をいう。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、ｎ－ヘキソキシ等であり、好ましくはＣ1-4アルコキシ基であり、より好ましくはＣ1-2アルコキシ基である。シアノ基で置換されていてもよいＣ1-6アルコキシ基としては、２－シアノエトキシ基が好ましい。
「核酸化合物の塩」としては、特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；マグネシウム塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩などの無機アミン塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩などの有機アミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などの低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩やｐ－トルエンスルホン酸塩などのアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸塩などを挙げることができる。
「薬理学上許容される塩」は、生体に対して無害であるか又は害が少ないものであれば特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；マグネシウム塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩などの無機アミン塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩などの有機アミン塩；塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などの低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などのアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸塩を挙げることができる。
なお、上記式（ＶＩＩＩ）において、Ｑ＝Ｓで且つＲ23またはＲ24の少なくとも一方が水酸基である場合、当該水酸基は－Ｏ-であってもよく、また、＞Ｐ（＝Ｓ）Ｏ-は＞Ｐ（＝Ｏ）Ｓ-と等価である。
本発明に係る核酸化合物は、チミジンまたはウリジンの誘導体であり、アデノシンに対する親和性が維持されている一方で、グアノシンに対する親和性が顕著に低減されていることから、非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対を形成し難い。その結果、本発明に係る核酸化合物を含むオリゴヌクレオチドは、その相補鎖以外の核酸鎖と結合し難い。よって本発明に係るオリゴヌクレオチドは、アンチセンス法のアンチセンスオリゴヌクレオチド等として利用する場合にオフターゲット効果による副作用を起こし難く、核酸医薬の有効成分として有用である。
図１は、後記の実施例でＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２は、後記の実施例でＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図３は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
当業者であれば、本発明に係る核酸化合物を公知化合物から合成することができる。例えば、チミンまたはウラシルの２位カルボニル基は、Ｓｅｋｉｎｅ，Ｍら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６８，ｐｐ．９９７１－９９８２（２００３）を参照して、下記スキームによりチオカルボニル基に変換することができる。
Figure 0007138349000010
［式中、Ｙ、ＺおよびＲ1は前記と同義を示し、Ｒ27とＲ28は、独立して、Ｈまたは水酸基の保護基を示し；Ｒ29は、水酸基の保護基を示す］
３’位水酸基および５’位水酸基が無保護、並びに、３’位水酸基および５’位水酸基のうち少なくとも一方が保護されている上記核酸化合物（Ｘ）は、例えば、ＷＯ２０１４／０４６２１２号公報やＷＯ／２０１５／１２５７８３号公報などに記載されている公知化合物である。先ず、上記核酸化合物（Ｘ）中のピリミジン部分の４位カルボニル基を、アセトニトリルなどの溶媒中、２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド（ＴＰＳＣｌ）で処理して選択的にＴＰＳ化した後、塩基と２，６－ジメチルフェノールなどを用いて４位を選択的に保護することにより核酸化合物（ＸＩ）を得る。なお、この際には、３’位水酸基と５’位水酸基が共に保護されている核酸化合物（Ｘ）を用いることが好ましい。次に、ローソン試薬を用いれば核酸化合物（ＸＩ）のピリミジン部分の２位カルボニル基のみをチオカルボニル基に変換することができる。最後にピリミジン部分の４位水酸基の保護基を除去することにより、ピリミジン部分の２位がチオカルボニル化された核酸化合物（ＸＩＩＩ）を得ることができる。
また、ピリミジン部分のチオカルボニル基をセレン化する方法としては、例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｚら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３２，ｐｐ．２１２０－２１２１（２０２０）を参照し、以下のスキームを挙げることができる。
Figure 0007138349000011
［式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ1、Ｒ27およびＲ28は前記と同義を示し、Ｒ30はＣ1-6アルキル基を示す］
核酸化合物（ＸＩＩＩ）としては、５’位水酸基が保護されていないとＳ－アルキル化の際にアルキル化されてしまうおそれがあり得るため、少なくとも５’位水酸基が保護されているものが好ましい。核酸化合物（ＸＩＩＩ）の２位チオカルボニル基は、Ｗｏｏｌｌｉｎｓ試薬を使ってセレノカルボニル基へ直接官能基変換する方法もあり得るが、４位カルボニル基がセレノカルボニル化される可能性があり得るため、２つの窒素原子に隣接しており４位カルボニル基の酸素原子よりもマイナスに分極し易くなっている２位チオカルボニル基を選択的にアルキル化して核酸化合物（ＸＩＶ）を得ることが好ましい。かかるアルキル化によって、２位硫黄原子が脱離し易くなる。次いで、核酸化合物（ＸＩＶ）にホウ素化水素ナトリウムなど比較的弱い還元剤と共にセレンを反応させることにより、核酸化合物（ＸＶ）を得ることができる。
さらに、セレノカルボニル基はチオカルボニル基に比べて不安定であり反応性が高いため、３’位にリン酸基を導入する際などには下記式の通り保護しておくことが好ましい。勿論、２位チオカルボニルを保護してもよい。なお、本開示においては、便宜上、亜リン酸基もリン酸基に含める。
Figure 0007138349000012
［式中、Ｙ、Ｚ、Ｒ1、Ｒ27およびＲ28は前記と同義を示し、Ｒ31はＣ1-6アルキル基または２－シアノエチル基を示す。］
さらに、３’位水酸基へホスホロアミダイト基を導入した核酸化合物は、オリゴヌクレオチドの自動合成のためのモノマーとして用いることができる。ホスホロアミダイト基としては、例えば、－Ｐ（ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）2）基や－Ｐ（ＯＣＨ2ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）2）基［式中、ｉＰｒはイソプロピル基を示す］が挙げられる。なお、２位チオカルボニル基や２位セレノカルボニル基の保護基として２－シアノエチル基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ基）を用いれば、オリゴヌクレオチドの自動合成において、リン酸基の保護基を除去する際に同時に脱保護することができる。
なお、本発明の核酸化合物を合成するに当たっては、当業者公知の方法により官能性官能基を適時選択的に保護したり脱保護したり、或いは保護基を交換したりしてもよい。
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、例えば、３’位にホスホロアミダイトが導入された上記核酸化合物をモノマーとして用いること以外、通常の核酸の自動合成により合成することができる。但し、核酸残基の５’位と３’位を結合する基は、一般的なリン酸基の他、亜リン酸基やチオリン酸基など、オリゴヌクレオチドで用いられるものであれば特に制限されない。
本発明に係るオリゴヌクレオチドをアンチセンス法で用いる場合、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、その配列中の少なくとも１以上のチミジンまたはウリジンが、本発明に係る上記核酸化合物により導入されているため、Ｔ－ＧまたはＵ－Ｇの非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対の形成が抑制されており、オフターゲット効果による副作用の発生が抑制されている。アンチセンス法で用いる場合には、オリゴヌクレオチドの塩基配列は標的ｍＲＮＡと相補的にすることが好ましい。但し、オリゴヌクレオチドのチミジンまたはウリジンのうちの１以上を本発明に係る核酸化合物で導入する、即ち、チミンまたはウラシルの２位カルボニル基を硫黄またはセレンで官能基変換し且つ２’位と４’位を架橋する。
本発明に係るオリゴヌクレオチドの塩基長としては、７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下が好ましい。塩基長が７ｎｔ以上であれば、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性や特異性を十分に確保することができる。一方、塩基長が３０ｎｔ以下であれば抗原性が十分に抑制され、また、合成もし易い。当該塩基長としては、１０ｎｔ以上が好ましく、１２ｎｔ以上がより好ましく、また、２５ｎｔ以下が好ましく、２０ｎｔ以下が好ましい。なお、塩基長が１７ｎｔのオリゴ核酸は４17＝１．７×１０10種あり、ヒトゲノムの全塩基数である２×３×１０9を超えるため、特異性の向上のため当該塩基長を１７ｎｔ以上にすることも可能である。
オリゴヌクレオチドでは、両末端部分の核酸残基が２’，４’－架橋型核酸であることが好ましい。両末端部分における核酸が２’，４’－架橋されていることにより、生体内において各種ヌクレアーゼによる攻撃を受け難くなっており、生体への投与後、生体内に長時間存在することができる。また、２’，４’－架橋により構造が安定化されていることから、標的ｍＲＮＡと二重鎖を形成し易い。２’，４’－架橋型核酸で構成すべき両末端部分の長さは適宜調整すればよいが、例えば、各両末端からそれぞれ独立して１ｎｔ以上、５ｎｔ以下とすることができる。各両末端部分における修飾塩基の数としては、各両末端部分における２’，４’－架橋型核酸残基にもよるが、５ｎｔ以下または４ｎｔ以下が好ましく、３ｎｔ以下がより好ましく、１ｎｔまたは２ｎｔがよりさらに好ましい。
本発明においては、上記両末端部分における１以上の２’，４’－架橋型核酸残基のうちチミジンまたはウリジンを、本発明に係る核酸化合物により導入することが好ましい。
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、２’，４’－架橋型核酸残基で構成される両末端部分の間に、１以上の非２’，４’－架橋型の核酸残基を有することが好ましい。以下、本開示においては、上記両末端部分以外の部分を「中間部分」ということがある。中間部分の非２’，４’－架橋型核酸残基は、２’位－４’位間が架橋されていなければＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸誘導体、およびこれら２以上の組合わせであってもよい。核酸誘導体としては、例えば、２’－ハロゲノ核酸、２’－アセトキシ核酸などの２’－Ｃ1-6アルキルカルボニルオキシ核酸、２’－メトキシ核酸などの２’－Ｃ1-6アルキルオキシ核酸、２’－トリメチルシリルオキシ核酸などの２’－トリＣ1-6アルキルシリルオキシ核酸などを挙げることができる。しかし、上記中間部分の核酸がすべてＤＮＡであることが好ましい。中間部分の核酸がすべてＤＮＡである場合、標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡ－ＤＮＡ二本鎖が形成され、当該二本鎖がＲＮＡｓｅＨの基質となり、標的ｍＲＮＡが切断される。ＲＮＡｓｅＨの基質の観点から、上記中間部分の長さとしては４ｎｔ以上が好ましく、５ｎｔ以上がより好ましく、６ｎｔ以上がよりさらに好ましい。一方、上記中間部分の長さとしては、抗原性の観点から、１０ｎｔ以下が好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製できる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒト以外の動物およびヒトに投与することができる。その投与量は、患者の年齢、性別、体重、状態、疾患の種類、重篤度、予防的な使用であるか或いは治療的な使用であるかなどに応じて適宜調整すればよいが、例えば、成人のヒトに対する１回当たり及び体重１ｋｇ当たりの投与量として、０．０１μｇ以上、１００ｇ以下とすることができる。当該量としては、０．１μｇ以上または１．０μｇ以上が好ましく、１０μｇ以上または１００μｇ以上がより好ましく、１ｍｇ以上がよりさらに好ましく、また、１０ｇ以下または１．０ｇ以下が好ましく、１００ｍｇ以下または１０ｍｇ以下がより好ましく、５ｍｇ以下がよりさらに好ましい。また、投与回数としては、１ヶ月に１回から１日当たり３回以下程度の間で適宜調整すればよい。
本願は、２０１７年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１７－３０４９０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１７－３０４９０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
実施例１： ｓｃｐＢＮＡ－Ｓ2Ｔの合成
Figure 0007138349000013
（１） 化合物２の合成
化合物１（３２ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで共沸脱水した後、無水ピリジン（１．１ｍＬ）、４－ジメチルアミノピリジン（７ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）と無水酢酸（３０．５μＬ，０．３２ｍｍｏｌ）を窒素気流下で順次加え、室温で４０分間撹拌した。反応終了後に水を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水で洗浄後、溶媒を減圧留去し、トルエン共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，酢酸エチル：ヘキサン＝２：１）により精製し、化合物２（収量：４０ｍｇ，収率：定量的）を白色個体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．７７－１．０２（ｍ，４Ｈ），１．９６（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３Ｈ），２．１４（ｓ，３Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），４．０３（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．６９（ｓ，１Ｈ），４．９９（ｓ，１Ｈ），５．８０（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），８．９３（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．４，９．７，１３．１，２０．８，２０．９，５８．１，６８．３，７２．５，７８．１，８５．９，８７．１，１１０．８，１３４．１，１４９．８，１６３．５，１７０．１，１７０．１
ＩＲ（ＫＢｒ）：３０２２，２８４０，１７４６，１７０４，１２３９，１２１２，１０５２ｃｍ-1
［α］D 23 ＋２８．４０（ｃ１．００，ＣＨＣｌ3）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ） Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ17Ｈ20Ｎ2Ｏ8Ｎａ ［Ｍ＋Ｎａ］+：４０３．１１１２，Ｆｏｕｎｄ：４０３．１１１３
（２） 化合物３の合成
化合物２（２７０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）を五酸化二リン存在下で減圧乾燥した後、無水アセトニトリル（７．１ｍＬ）に溶解させた。窒素気流下、２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（２７９ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）と乾燥させた炭酸カリウム（４９０ｍｇ，３．５４ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で２．５時間撹拌した。原料消失後、反応溶液を室温まで放冷し、２，６－ジメチルフェノール（１２１ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）と１，４－ジアザビシクロ－２，２，２－オクタン（２４ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１時間撹拌した。反応溶液を０℃に冷却した飽和塩化アンモニウム水溶液へ滴下し、酢酸エチルで抽出した。有機相を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）により精製し、化合物３（収量：３３７ｍｇ，収率：定量的）を白色個体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．７７－１．０１（ｍ，４Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，６Ｈ），４．０３（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７７（ｓ，１Ｈ），５．０３（ｓ，１Ｈ），５．８６（ｓ，１Ｈ），７．０５（ｓ，３Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ）
13Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．３，９．６，１３．１，１６．６，１６．７，２０．８，２０．９，５８．２，６８．２，７２．３，７７．９，８５．９，８７．９，１０４．２，１２６．０，１２８．８，１３９．７，１４９．４，１５５．２，１７０．１，１７０．２
ＩＲ（ＫＢｒ）：２９２７，１７４８，１６６９，１５３７，１２１８，１０４８ｃｍ-1［α］D 24 ＋８６．１９（ｃ１．００，ＣＤＣｌ3）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ） Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ25Ｈ28Ｎ2Ｏ8Ｎａ ［Ｍ＋Ｎａ］+：５０７．１７３８，Ｆｏｕｎｄ：５０７．１７４０
（３） 化合物４の合成
窒素気流下、化合物３（４２２ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）の無水トルエン溶液（８．７ｍＬ）にローソン試薬（３５２ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）を加え、１時間加熱還流した。反応終了後、０℃まで冷却し、沈殿物を濾過した。濾液を減圧濃縮した後、得られた黄色個体の化合物４（６５６ｍｇ，ｃｒｕｄｅ）は、それ以上精製することなく即座に次の反応に用いた。
（４） 化合物５の合成
化合物４（６５６ｍｇ，ｃｒｕｄｅ）を無水トルエンで共沸脱水した後、無水アセトニトリル（８．７ｍＬ）、乾燥させた炭酸カリウム（７２２ｍｇ，５．２３ｍｍｏｌ）とｓｙｎ－ｏ－ニトロベンズアルドオキシム（４３４ｍｇ，２．６１ｍｍｏｌ）を窒素気流下で順次加え、５０℃で１７．５時間撹拌した。その後メタノール（８．７ｍＬ）を加え、５０℃で２０分間撹拌した。反応終了後室温まで冷却し、沈殿物を濾過した。濾液を減圧濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，クロロホルム：メタノール＝１２：１）により精製し、化合物５（２ステップでの収量：１７３ｍｇ，収率：６４％）を茶色個体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ０．７３－０．９３（ｍ，４Ｈ），１．９４（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｓ，１Ｈ），４．６３（ｓ，１Ｈ），６．１６（ｓ，１Ｈ）７．９８（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ）
13Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ５．０，９．９，１２．９，５６．６，６８．６，７１．７，８０．６，９０．６，９１．３，１１６．０，１３８．２，１６３．３，１７５．５
ＩＲ（ＫＢｒ）：３０７６，２９４２，１６８１，１４９６，１２７３，１０４０ｃｍ-1［α］D 25 －９．５（ｃ１．００，ＭｅＯＨ）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ） Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ13Ｈ16Ｎ2Ｏ5ＮａＳ ［Ｍ＋Ｎａ］+：３３５．０６７２，Ｆｏｕｎｄ：３３５．０６５６
（５） 化合物６の合成
化合物５（１６５ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで共沸脱水した後、窒素気流下、無水ピリジン（１０．６ｍＬ）と４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（２６８ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５時間撹拌した。反応終了後に水を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水で洗浄し、溶媒の減圧留去とトルエン共沸を行なった。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，０．５％トリエチルアミン含有、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）により精製し、化合物６（収量：３１１ｍｇ，収率：９６％）を白色個体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．５１－０．５５（ｍ，１Ｈ），０．７１－０．７４（ｍ，１Ｈ），０．８９－０．９８（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），２．２６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．１８（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），４．３２（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７７（ｓ，１Ｈ），６．２３（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ），７．２４－７．３６（ｍ，７Ｈ），７．４３－７．４６（ｍ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），９．７９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．４，９．７，１２．９，５５．４，５７．７，６７．８，７２．７，７９．２，８７．２，８８．８，９０．１，１１３．５，１１６．２，１２７．３，１２８．２，１２８．２，１３０．２，１３０．２，１３５．１，１３５．３，１３６．０，１４４．３，１５８．９，１６０．７，１７３．６
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４３２，２９５６，１６８１，１５０８，１２５３，１１７７，１０４６，８３３，７６６ｃｍ-1
［α］D 25 －３８．０（ｃ１．００，ＣＤＣｌ3）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ） Ｃａｌｃｄ． Ｆｏｒ Ｃ34Ｈ34Ｎ2Ｏ7ＮａＳ ［Ｍ＋Ｎａ］+：６３７．１９７９，Ｆｏｕｎｄ：６３７．１９７２
（６） 化合物７の合成
化合物６（４１ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）を無水トルエンで共沸脱水した後、無水アセトニトリル（０．７ｍＬ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３４．５μＬ，０．２０ｍｍｏｌ）と２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロクロリダート（２２．５μＬ，０．１０ｍｍｏｌ）を窒素気流下で順次加え、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，０．５％トリエチルアミン含有、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）により精製し、化合物７（収量：４３ｍｇ，収率：７８％）を白色固体として得た。
31Ｐ ＮＭＲ（１２１．７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４８．７，１４９．２
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ） Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ43Ｈ51Ｎ4Ｏ8ＮａＰＳ ［Ｍ＋Ｎａ］+：８３７．３０５７，Ｆｏｕｎｄ：８３７．３０５５
実施例２： ｓｃｐＢＮＡ－Ｓｅ2Ｔの合成
Figure 0007138349000014
（１） 化合物８の合成
窒素気流下、化合物６（４１２ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（６．７ｍＬ）にヨードメタン（４２０μＬ，６．７５ｍｍｏｌ）と１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（１５０μＬ，１．００ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間撹拌した。反応終了後に水を過剰量加え、沈殿物を濾取した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，酢酸エチル：メタノール＝１３：１）により精製し、化合物８（収量：３３６ｍｇ，収率：８０％）を淡黄色個体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．５３－０．６３（ｍ，１Ｈ），０．７７－０．９１（ｍ，３Ｈ），１．７８（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），３．０９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２０（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４０（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），４．３８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｓ，１Ｈ），５．８０（ｓ，１Ｈ），６．８２－６．８５（ｍ，４Ｈ），７．２１－７．３５（ｍ，７Ｈ），７．４４－７．４７（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）
13Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．５，９．８，１４．２，１４．７，５５．４，５７．９，６８．３，７２．２，８０．１，８７．１，８８．３，１１３．５，１１８．８，１２７．３，１２８．１，１２８．２，１３０．１，１３０．２，１３３．７，１３５．１，１３５．３，１４４．３，１５８．８，１６０．２，１６９．５
ＩＲ（ＫＢｒ）：２９３３，１６４０，１６０９，１５０９，１４８６，１２５４，１１７７，１０４６，７５５ｃｍ-1
［α］D 21 －２５．３２（ｃ１．００，ＣＨＣｌ3）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ35Ｈ36Ｎ2Ｏ7ＮａＳ ［Ｍ＋Ｎａ］+：６５１．２１３５，Ｆｏｕｎｄ：６５１．２１３４
（２） 化合物９の合成
窒素気流下、無水エタノール（４．５ｍＬ）にセレン（１０７ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム（６２ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を加え、透明の溶液になるまで０℃で３０分間撹拌した。生成したＮａＳｅＨのエタノール溶液を、あらかじめ無水トルエンで共沸脱水した化合物８（２６１ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）へ空気に触れさせずに、窒素気流下、０℃で加えた。３日間室温で撹拌した後、水を加えセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。抽出液を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧蒸留した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）により精製し、化合物９（収量：２３０ｍｇ，収率：８４％）を淡黄色個体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．４９－０．５７（ｍ，１Ｈ），０．６８－０．７６（ｍ，１Ｈ），０．８６－１．０４（ｍ，２Ｈ），１．６３（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，３Ｈ），２．０９（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３３（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），４．３３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．８８（ｓ，１Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），６．８４－６．８７（ｍ，４Ｈ），７．２３－７．４６（ｍ，９Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），９．９１（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．４，９．７，１３．１，５５．４，５７．６，６７．８，７２．６，７９．６，８７．２，８９．１，９２．２，１１３．５，１１８．０，１２７．４，１２８．１，１２８．２，１３０．２，１３０．２，１３５．１，１３５．２，１３６．２，１４４．３，１５８．９，１６０．０，１７３．５
ＩＲ（ＫＢｒ）：２９３６，１６８２，１５０９，１２５５，１１７８，１０５３，１０３８，７５７，６０６ｃｍ-1
［α］D 20 －５２．５６（ｃ１．００，ＣＨＣｌ3）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ） Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ34Ｈ34Ｎ2Ｏ7ＮａＳｅ ［Ｍ＋Ｎａ］+：６８５．１４２３，Ｆｏｕｎｄ：６８５．１４２９
（３） 化合物１０の合成
窒素気流下、化合物９（９８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）と３－ヨードプロピオニトリル（２００μＬ，２．２５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１．５ｍＬ）にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３８０μＬ，２．２２ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。０℃で４０分間撹拌した後、原料が消失するまでさらに３－ヨードプロピオニトリルとＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを加え撹拌した。原料消失後、水を加え、酢酸エチルで抽出し、抽出液を水と飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧蒸留した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2，酢酸エチル：メタノール＝１：０→１２：１）により精製し、化合物１０（収量：９９ｍｇ，収率：９４％）を淡黄色個体として得た。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．５４－０．５８（ｍ，１Ｈ），０．７７－０．９６（ｍ，３Ｈ），１．７８（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，３Ｈ），２．５１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．０１－３．０６（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４２－３．５５（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），４．３９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｓ，１Ｈ），５．６９（ｓ，１Ｈ），６．８２－６．８７（ｍ，４Ｈ），７．２５－７．４６（ｍ，９Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）
13Ｃ ＮＭＲ（７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ５．５，９．８，１４．２，１８．９，２３．８，５５．４，５７．７，６８．３，７２．２，８０．３，８７．２，８８．５，８９．４，１１３．５，１１８．８，１１９．９，１２７．３，１２８．１，１２８．３，１３０．１，１３０．２，１３４．２，１３５．１，１３５．２，１４４．３，１５４．８，１５８．９，１６８．９
ＩＲ（ＫＢｒ）：３００６，２９５１，１６３４，１６０９，１５０８，１４８５，１２５３，１１７７，１０５３，１０３９，８３４，７５２，５８１ｃｍ-1
［α］D 20 －３８．０８（ｃ１．００，ＣＨＣｌ3）
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ37Ｈ37Ｎ3Ｏ7ＮａＳｅ ［Ｍ＋Ｎａ］+：７３８．１６８９，Ｆｏｕｎｄ：７３８．１７０６
（４） 化合物１１の合成
化合物１０（１３９ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）を無水トルエンで共沸脱水した後、無水アセトニトリル（２．０ｍＬ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１００μＬ，０．５８ｍｍｏｌ）と２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロクロリダート（６５μＬ，０．２９ｍｍｏｌ）を窒素気流下で順次加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をジオールシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＩＯＬ－ＳｉＯ2，酢酸エチル：ヘキサン＝１：２→１：１０）により精製し、化合物１１（収量：１４４ｍｇ，収率：８１％）を白色固体として得た。
31Ｐ ＮＭＲ（１２１．７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４９．１，１４９．５
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ） Ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ Ｃ46Ｈ54Ｎ5Ｏ8ＮａＰＳｅ ［Ｍ＋Ｎａ］+：９３８．２７６７，Ｆｏｕｎｄ：９３８．２７７７
実施例３： オリゴヌクレオチドの合成
下記の試験例で用いたオリゴヌクレオチドは、以下の条件で合成した。上記実施例１，２で合成したアミダイトブロック（化合物７，１１）と市販のｄＧ（ｉＢｕ）、ｄＣ（Ｂｚ）、Ｔのホスホロアミダイトの０．１Ｍ無水アセトニトリル溶液を調製し、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ ｎＳ－８ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて、０．２μｍｏｌスケール、トリチルオン条件でオリゴヌクレオチドを合成した。活性化剤にはＡｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（０．２５Ｍアセトニトリル溶液）を用い、縮合時間はアミダイトブロックで８分間、天然のアミダイトブロックで３２秒間とした。酸化剤はｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（７：６０：３）を用い、酸化時間を１０分間とした。その他の操作は通常のホスホロアミダイト法に従った。合成完了後、２８％アンモニア水溶液を用い、室温下で１．５時間処理してカラム担体からの切り出しを行い、引き続き５５℃で３時間静置することで塩基部とリン酸ジエステル部の脱保護を行った。続いて簡易逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣにて精製した。
得られたオリゴヌクレオチドの構造の確認と定量は、以下の条件で行った。マトリックス（１０ｍｇ／ｍＬ ３－ヒドロキシピコリン酸水溶液：１ｍｇ／ｍＬ クエン酸二アンモニウム水溶液＝１：１，１μＬ）を乾燥させたアンカーチップ上に、各オリゴヌクレオチド水溶液（５０μＭ，１μＬ）を載せて再度乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによってオリゴヌクレオチドの分子量を確認した。分子量の測定はネガティブリフレクターモードで行い、オリゴチミジル酸（７ｍｅｒ、１５ｍｅｒおよび２３ｍｅｒ）を外部標準として用いた。また、オリゴヌクレオチドの定量は、吸光度測定器を用い、２５４ｎｍの紫外部吸収を測定することで行った。
試験例１： 相補鎖ＲＮＡとミスマッチ配列ＲＮＡに対する二重鎖形成能試験
株式会社ジーンデザインに、５’－ｒ（ＡＧＣＡＡＡＹＡＡＣＧＣ）－３’の配列を有するｓｓＲＮＡの合成を外注した。当該ｓｓＲＮＡ（５’－ｒ（ＡＧＣＡＡＡＹＡＡＣＧＣ）－３’）と、実施例１，２で合成した２’，４’－架橋核酸を含むオリゴヌクレオチド（５’－ｄ（ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ）－３’）と塩化ナトリウムを、それぞれ終濃度４μＭおよび１００ｍＭでリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．２，１３０μＬ）に加えて混合した後、沸騰水中に浴し、次いで室温までゆっくり冷却した。その後、窒素気流下で５℃まで冷却し、次に０．５℃／ｍｉｎで９０℃まで昇温するに当たり、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。温度に対する吸光度をプロットし、中線法によりＴm値を算出した。測定を３回行い、Ｔm値の平均値を算出した。結果を表１に示す。
Figure 0007138349000015
表１に示す結果の通り、２’，４’－架橋に加えてチミンの２位カルボニル基をチオカルボニル基またはセレノカルボニル基に変換した場合（実施例１，２）、チミジンの２’，４’位架橋を架橋したのみの場合（比較例１）に比べ、Ｔ－Ａ間のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対のＴm値は変わらない一方で、Ｔ－Ｇ間のゆらぎ塩基対のＴm値を明らかに低減することができた。このように本発明に係る核酸をオリゴヌクレオチドへ導入することにより、Ｔ－Ｇ間のミスマッチ塩基対形成を抑制し、オフターゲットを低減できることが実証された。
試験例２： 相補鎖ＤＮＡとミスマッチ配列ＲＮＡに対する二重鎖形成能試験
株式会社ジーンデザインに、上記試験例１で用いたｓｓＲＮＡと同一の塩基配列を有するｓｓＤＮＡの合成を外注した。上記試験例１において、ｓｓＲＮＡの代わりに当該ｓｓＤＮＡを用いた以外は同様にして、表２に示すオリゴヌクレオチドとのＴm値を求めた。結果を表２に示す。
Figure 0007138349000016
表２に示す結果の通り、ＤＮＡに対しても、本発明に係る核酸をオリゴヌクレオチドへ導入することにより、Ｔ－Ｇ間のミスマッチ塩基対形成を抑制し、オフターゲットを低減できることが実証された。
試験例３： マウスにおける遺伝子発現抑制効果
ＧＲ（Ｇｌｃｏｃｏｒｔｉｏｃｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）はステロイド受容体の一種であり、ステロイドホルモンであるヒドロコルチゾンに対する受容体として働く一方で、リガンド依存的に核内移行して転写因子としても働く。そこで、これを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１２（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表３に示す配列を有するＰｏｓｉ１２誘導体の合成を外注した。表３中、「（Ｌ）」は４’位と２’位が－ＣＨ2－Ｏ－で架橋されている構造を有することを示し、「＾」は５’位と３’位がチオリン酸基で結合されていることを示し、「５」は５－メチルシチジンを示し、「ｓｃｐＢＮＡ」は４’位と２’位が－シクロプロピルメチレン－Ｏ－で架橋されている構造を有することを示し、「Ｓ2Ｔ」はチミンの第２位が＝Ｓであることを示し、「ＡｍＮＡ」は４’位と２’位が－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（－ＣＨ3）－で架橋されている構造を有することを示し、小文字はＤＮＡであることを示す。
Figure 0007138349000017
各アンチセンスオリゴ核酸を生理食塩水（大塚製薬社製）に溶解して２ｍｇ／ｍＬ溶液とし、実験に用いるまで－３０℃で凍結保存した。
５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌマウス（日本チャールス・リバー株式会社）を１週間検疫馴化した後、任意に４匹ずつ５群に分け、生理食塩水（大塚製薬社製）または各アンチセンスオリゴ核酸溶液を２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で尾静脈内に単回投与した。投与から４日目（９６時間後）に、マウスを２．０～４．０％のイソフルラン（ＤＳファーマアニマルヘルス社製）で吸入麻酔して、後大静脈腹部から可能な限り採血した。但し、Ｐｏｓｉ１２－ＬＮＡ－Ｔ投与群のうち２匹は３日目に高度の自発運動の低下が認められたため、３日目に採血した。採血した後、マウスを凍結安楽死させ、肝臓を摘出して重量を測定した。摘出した肝臓において肉眼的に異常のみられない部位から約１００ｍｇを試料として採取した。採取した試料の重量を測定後、液体窒素にて凍結させ、超低温フリーザーで保存した。凍結保存した肝臓試料を、氷冷下でホモジネーター（「Ｓｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ ａｕｔｏ」Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）とＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて可能な限りホモジナイズし、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡのＵＶ吸収スペクトルを、Ｎａｎｏ ＶｕｅあるいはＮａｎｏ Ｖｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いて測定し，ＲＮＡ濃度とＯ．Ｄ．２６０／Ｏ．Ｄ．２８０比から純度を算出した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡについてＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ）を用いて定量ＰＣＲを行い、生理食塩水投与群に対してアンチセンスオリゴ核酸投与群の標的遺伝子の発現比率を算出し、活性を評価した。なお、本開示の動物実験の飼育と実験は、株式会社新日本科学の動物実験規定に準じ、株式会社新日本科学安全性研究所の動物実験施設内で行った。結果を図１に示す。
図１に示す結果の通り、チミンの２位カルボニル基の修飾に加えて４’位と２’位が架橋された核酸残基を含む本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸（Ｐｏｓｉ１２－ｓｃｐＢＮＡ－Ｓ2Ｔ）も、他のアンチセンスオリゴ核酸と同様に標的遺伝子の発現を効果的に抑制できることが明らかにされた。
試験例４： マウスにおける遺伝子発現抑制効果
マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表４に示す配列を有するＰｏｓｉ１４誘導体の合成を外注した。
Figure 0007138349000018
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記試験例３と同様にしてＧＲ遺伝子に対する発現抑制活性を測定した。結果を図２に示す。
図２に示す結果の通り、別の塩基配列を有するアンチセンスオリゴ核酸であっても、チミンの２位カルボニル基の修飾に加えて４’位と２’位が架橋された核酸残基を含む本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸（Ｐｏｓｉ１４－ｓｃｐＢＮＡ－Ｓ2Ｔ）も、他のアンチセンスオリゴ核酸と同様にＧＲ遺伝子の発現を抑制できることが明らかにされた。
試験例５： 肝毒性評価
強い肝毒性を誘発する＃１２を選択し、株式会社ジーンデザインに、表５に示す配列を有する＃１２の誘導体の合成を外注した。
Figure 0007138349000019
５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌマウス（日本チャールス・リバー株式会社）を１週間検疫馴化した後、任意に４匹ずつ３群に分け、生理食塩水（大塚製薬社製）または各アンチセンスオリゴ核酸溶液を２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で尾静脈内に単回投与した。投与から４日目（９６時間後）に、マウスを２．０～４．０％のイソフルラン（ＤＳファーマアニマルヘルス社製）で吸入麻酔して、後大静脈腹部から可能な限り採血した。得られた血液を室温で２０～６０分静置後、１７００×ｇで５分間遠心分離して血清を得た。血液採取の際、血液量が分析に必要な量に達しない場合は注射用水を用いて希釈した後、分析に用いた。生化学自動分析装置（「ＪＣＡ－ＢＭ６０７０」日本電子社製）を用いて、得られた血清中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の濃度を測定した。結果を図３に示す。
図３に示す結果の通り、チミンの２位カルボニル基の修飾に加えて４’位と２’位が架橋された核酸残基を含む本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸（＃１２－ｓｃｐＢＮＡ－Ｓ2Ｔ）の肝毒性が低減されていることが明らかにされた。その理由としては、本発明に係る核酸残基により非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対の形成が抑制され、延いては標的核酸以外の核酸との非特異的結合が抑制されたことが考えられる。

Claims (4)

  1. 下記式（Ｉ）または下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とする核酸化合物またはその塩。
    Figure 0007138349000020
    ［式中、
    Ｘ１とＸ２は、独立してＳまたはＳｅを示し、
    Ｙは、Ｏを示し、且つ、Ｚは下記式（ＶＩＩ）で表されるシクロプロピレン基を示し、
    Figure 0007138349000021
    （式中、Ｒ２１とＲ２２は、独立して、Ｈ、Ｃ１－６アルキル基を示すか、または、Ｒ２１とＲ２２が一緒になってＣ１－４アルキレン基を形成してもよい）
    Ｒ １は、ＨまたはＣ１－６アルキル基を示し、
    Ｒ２とＲ３は、独立して、Ｈ、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ベンジル、ｐ－メトキシベンジル、ｐ－ニトロベンジル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、または、下記式（ＶＩＩＩ）で表されるリン酸基を示し、
    Figure 0007138349000022
    （式中、ＱはＯまたはＳを示し、Ｒ２３は、Ｈ、水酸基、またはシアノ基で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基を示し；Ｒ２４は、水酸基、シアノ基で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基またはＮＲ２５Ｒ２６基（式中、Ｒ２５とＲ２６は、独立して、Ｈ、Ｃ１－６アルキル基または２－シアノエチル基を示す）を示し；ｎは０または１を示す）
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル基または２－シアノエチル基を示す。］
  2. Ｒ１がメチル基である請求項１に記載の核酸化合物またはその塩。
  3. １以上の核酸残基が下記式（ＩＸ）で表される構造を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
    Figure 0007138349000023
    ［式中、
    Ｘ１は、ＳまたはＳｅを示し、
    Ｙ は、Ｏを示し、且つ、Ｚは下記式（ＶＩＩ）で表されるシクロプロピレン基を示し、
    Figure 0007138349000024
    （式中、Ｒ２１とＲ２２は、独立して、Ｈ、Ｃ１－６アルキル基を示すか、または、Ｒ２１とＲ２２が一緒になってＣ１－４アルキレン基を形成してもよい）
    Ｒ １は、ＨまたはＣ１－６アルキル基を示す。］
  4. Ｒ１がメチル基である請求項３に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
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