WO2018155450A1 - アンチセンスオリゴ核酸 - Google Patents

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WO2018155450A1
WO2018155450A1 PCT/JP2018/006061 JP2018006061W WO2018155450A1 WO 2018155450 A1 WO2018155450 A1 WO 2018155450A1 JP 2018006061 W JP2018006061 W JP 2018006061W WO 2018155450 A1 WO2018155450 A1 WO 2018155450A1
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nucleic acid
antisense oligonucleic
oligonucleic acid
hepatotoxicity
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PCT/JP2018/006061
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聡 小比賀
玲子 脇
井上　貴雄
徳幸 吉田
邦彦 森廣
勇矢 笠原
敦士 三上
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国立大学法人大阪大学
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    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/53—Methods for regulating/modulating their activity reducing unwanted side-effects

Definitions

  • the present invention relates to an antisense oligonucleic acid with low liver toxicity.
  • Nucleic acid drugs unlike conventional drugs, can suppress the expression of specific genes in cells, and are expected to lead to the creation of innovative drugs for diseases that have been difficult to treat.
  • an antisense oligonucleic acid complementary to a part of mRNA related to a disease is introduced from the outside to form a double strand, thereby inhibiting the translation process of pathogenic mRNA and treating the disease.
  • Antisense methods have been developed for prevention.
  • antisense oligonucleic acids have the disadvantage of being easily degraded by nucleases in vivo. Moreover, it is necessary to further improve the binding affinity and specificity for the target mRNA. Therefore, our research group has developed a nucleic acid molecule that crosslinks the 2 'and 4' positions in order to improve nuclease resistance and binding affinity and specificity to the target mRNA by stabilizing the three-dimensional structure. (Patent Documents 1 to 5), and using such cross-linked nucleic acids, an oligonucleotide useful as a therapeutic agent for dyslipidemia having excellent binding affinity to the PCSK9 gene has been developed (Patent Document 6).
  • a prime example is “avoidance of the potential toxicity of artificial oligonucleotides”.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 are only nt2 or nt3, and it may be difficult to design an antisense oligonucleic acid that does not contain such a short base sequence.
  • mRNA has a self-structure such as a loop structure or a double strand for stabilization, and an antisense oligonucleic acid should be designed to hybridize to a single strand of the target mRNA. There is a limit.
  • an object of the present invention is to provide an antisense oligonucleic acid with reduced hepatotoxicity.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems. As a result, in particular, the present inventors have found that hepatic toxicity can be reduced while maintaining activity by modifying the base of a nucleic acid residue at a specific portion in an antisense oligonucleic acid, thereby completing the present invention.
  • the present invention will be described.
  • the base length is 7 nt or more and 30 nt or less, Nucleic acid residues from 1 nt to 5 nt from both ends are 2 ′, 4′-crosslinked nucleic acids, A non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residue between both ends; An antisense oligonucleic acid, wherein the base of one or more nucleic acid residues among the non-2 ', 4'-bridged nucleic acid residues is modified.
  • the modified base is 5-hydroxycytosine, 4-acetylcytosine, 3-C 1-6 alkylcytosine, 5-C 1-6 alkylcytosine, 2-thiocytosine, 2-thiothymine, dihydrothymine , Pseudothymine, 2-thiouridine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uridine, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluridine, dihydrouridine, pseudouridine, 5-methylaminomethyluridine, 5-methyl Aminomethyl-2-thiouridine, 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine, 5-methoxycarbonylmethyluridine, 5-methoxyuridine, 8-aminoguanine, 8-halogenoguanine, 7-deaza-7- (2-phenylethynyl) ) Guanine, - deaza-7- (2-pyridylethynyl) guanine, 7-deaza-7- [2-
  • X 1 represents O, S,> N (R 3 ) group, —C ( ⁇ O) —O— group or —C ( ⁇ O) —N (R 4 ) — group (R 3 and R 4 are And independently represents H or a C 1-6 alkyl group)
  • X 2 represents any guanidino group represented by the following formulas (IV) to (VII):
  • R 5 to R 18 independently represent H, a C 1-6 alkyl group, a C 3-10 cycloalkyl group, an amino protecting group or a 2-cyanoethyloxycarbonyl group
  • X 3 represents O, S,> N (R 19 ) group, —C ( ⁇ O) —O— group or —C ( ⁇ O) —N (R 20 ) — group
  • R 19 and R 20 are And independently represents H or a C 1-6 alkyl group
  • Y 1 ⁇ Y 3 are independently O - or S - indicates
  • Base indicates a nucleobase group
  • R 1 and R 2 independently represent H, C 1-6 alkyl group, or R 1 and R 2 together may form a C 1-4 alkylene group
  • n represents an integer of 0 or more and 2 or less]
  • C 1-6 alkyl group refers to a linear or branched monovalent saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a C 1-4 alkyl group is preferable, a C 1-2 alkyl group is more preferable, and methyl is most preferable.
  • the “C 2-6 alkenyl group” is a linear or branched monounsaturated aliphatic hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms and having at least one carbon-carbon double bond.
  • ethenyl vinyl
  • 1-propenyl 2-propenyl (allyl)
  • isopropenyl 2-butenyl
  • 3-butenyl isobutenyl
  • pentenyl isopentenyl
  • the “C 2-6 alkynyl group” is a linear or branched monounsaturated aliphatic hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms and having at least one carbon-carbon triple bond.
  • ethynyl 1-propynyl, 2-propynyl (propargyl), 2-butynyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl and the like.
  • a C 2-4 alkynyl group is preferable, and a C 2-3 alkynyl group is more preferable.
  • C 6-12 aryl group refers to a monovalent aromatic hydrocarbon group having 6 to 12 carbon atoms.
  • phenyl, naphthyl, indenyl, biphenyl and the like are examples of aromatic hydrocarbon groups having 6 to 12 carbon atoms.
  • halogeno group examples include a fluoro group, a chloro group, a bromo group, and an iodo group, and a chloro group or a bromo group is preferable.
  • C 3-10 cycloalkyl group refers to a cyclic monovalent saturated aliphatic hydrocarbon group having 3 to 10 carbon atoms.
  • it is a C 3-6 cycloalkyl group.
  • amino-protecting group examples include alkoxycarbonyl-based protecting groups such as t-butoxycarbonyl group, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group; benzyloxycarbonyl group, p-methoxybenzyloxycarbonyl group, p-nitrobenzyl Arylmethoxycarbonyl protecting groups such as oxycarbonyl group and o-nitrobenzyloxycarbonyl group; arylmethyl protecting groups such as benzyl group, 4-methoxybenzyl group and triphenylmethyl group; alkanoyl groups such as formyl group and acetyl group Protecting groups; aroyl protecting groups such as benzoyl groups; arylsulfonyl protecting groups such as 2,4-dinitrobenzenesulfonyl groups and o-nitrobenzenesulfonyl groups.
  • alkoxycarbonyl-based protecting groups such as t-butoxycarbonyl group, methoxycarbonyl group,
  • C 1-6 alkylene group refers to a linear or branched divalent saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a C 1-4 alkylene group is preferred, a C 1-2 alkylene group is more preferred, and methylene is even more preferred.
  • C 1-7 alkanoyl group refers to the remaining atomic group obtained by removing OH from an aliphatic carboxylic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • formyl, acetyl, ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, isopropylcarbonyl, n-butylcarbonyl, isobutylcarbonyl, t-butylcarbonyl, n-pentylcarbonyl, n-hexylcarbonyl, etc. preferably C 1-4 alkanoyl A group, more preferably acetyl.
  • the hepatotoxicity of the antisense oligonucleic acid according to the present invention is significantly reduced. Furthermore, it can be said that the antisense oligonucleic acid according to the present invention has a high binding affinity for the target mRNA and is stable and resistant to attack by nucleases in vivo. Therefore, the antisense oligonucleic acid of the present invention has very high utility value in the industry as it can be a highly practical nucleic acid medicine.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and the GR gene expression-suppressing activity in Examples described later.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of the antisense oligonucleic acid and the GR gene expression-suppressing activity in Examples described later.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 3
  • FIG. 5 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and the activity of suppressing the expression of Rps6kb2 gene in Examples described later.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acids in the examples described later.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of the antisense oligonucleic acid and the GR gene expression-suppressing activity in Examples described later.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and GR gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and the GR gene expression-suppressing activity in Examples described later.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression-suppressing activity in Examples described later.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and the activity of suppressing the expression of Rps6kb2 gene in Examples described later.
  • FIG. 21 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 22 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and the activity of suppressing the expression of Rps6kb2 gene in Examples described later.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and GR gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression inhibitory activity in Examples described later.
  • FIG. 25 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and PCSK9 gene expression-suppressing activity in Examples described later.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and GR gene expression suppression activity in Examples described later.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of evaluation of hepatotoxicity of anti
  • FIG. 26 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 27 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and the GR gene expression inhibitory activity in Examples described later.
  • FIG. 28 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid and the PCSK9 gene expression inhibitory activity in Examples described later.
  • FIG. 29 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid in the examples described later.
  • FIG. 30 is a graph showing the results of evaluating the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acids in the examples described later.
  • the antisense oligonucleic acid according to the present invention has a base length of 7 nt or more and 30 nt or less; nucleic acid residues of 1 nt or more and 5 nt or less from both ends are 2 ′, 4′-bridged nucleic acids; Having a non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residue between them; the base of one or more of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues is modified It is characterized by that.
  • the base sequence of the antisense oligonucleic acid according to the present invention is not particularly limited as long as it can hybridize with high binding affinity to the target mRNA and the base of one or more nucleic acid residues in a specific portion is modified.
  • the original base sequence before base modification may be determined by a conventional method according to the target mRNA.
  • an antisense oligonucleic acid with high translation inhibitory activity may be designed.
  • mRNA may form a hairpin loop structure or a double-stranded structure in the molecule, and the binding target site is preferably a single-stranded structural site kinetically and thermodynamically.
  • the secondary structure of mRNA can be predicted by calculation, and a site predicted to be a single-stranded structure can be selected as a binding target site.
  • the nucleobase in the antisense oligonucleic acid according to the present invention may be a general adenine, guanine, uracil, thymine or cytosine other than the modified base.
  • methylcytosine can be easily synthesized from thymine, methylcytosine may be used instead of cytosine.
  • the antisense oligonucleic acid according to the present invention may be an S-oligonucleic acid.
  • S-oligonucleic acid In normal oligonucleic acids, ribose is linked by a phosphodiester bond, but the resistance of the oligonucleic acid to exonuclease and endonuclease is improved by binding the ribose by a phosphorothioate bond.
  • it may be a complete S oligo oligonucleic acid in which all phosphate groups are converted to S, or a chimeric S oligo oligo nucleic acid in which some phosphate groups are converted to S.
  • the base length of the antisense oligonucleic acid according to the present invention is preferably 7 nt or more and 30 nt or less. If the base length is 7 nt or more, sufficient binding affinity and specificity for the target mRNA can be ensured. On the other hand, if the base length is 30 nt or less, the antigenicity is sufficiently suppressed and the synthesis is easy.
  • nucleic acid residues of 1 nt to 5 nt independently from both ends are 2 ', 4'-bridged nucleic acids. Since the nucleic acids at least at both terminal sites are 2 ′, 4′-crosslinked, they are less susceptible to attack by various nucleases in the living body, and can be present in the living body for a long time after administration to the living body. . In addition, since the structure is stabilized by 2 ', 4'-crosslinking, it is easy to form a duplex with the target mRNA.
  • the 2 ', 4'-crosslinked structures in two or more 2', 4'-crosslinked nucleic acid residues may be the same as or different from each other.
  • the 2 ', 4'-crosslinking structure is not particularly limited as long as it stabilizes the structure of the ribose moiety, and examples thereof include the structures of the above formulas (I) to (III).
  • the nucleobase in the 2 ', 4'-bridged nucleic acid residue may be general adenine, guanine, uracil, thymine or cytosine, or may be modified. However, since methylcytosine can be easily synthesized from thymine, methylcytosine may be used in place of cytosine, particularly at both terminal portions.
  • the number of modified bases at both terminal portions is preferably 5 or less, more preferably 4 or less, more preferably 3 or less, and more preferably 1 or 2 although it depends on the 2 ′, 4′-bridged nucleic acid residue at both ends. Further preferred. Examples of the modified base at both terminal portions can be the same as the modified base in the non-2 ', 4'-bridged nucleic acid residue.
  • the antisense oligonucleic acid according to the present invention has one or more non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues between both ends composed of 2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues. That is, the antisense oligonucleic acid according to the present invention is composed of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues except for both ends.
  • portions other than the both end portions of the antisense oligonucleic acid according to the present invention may be referred to as “intermediate portions”.
  • the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residue in the middle part may be RNA, DNA, a nucleic acid derivative, or a combination of two or more thereof, provided that the 2′-4 ′ position is not cross-linked .
  • the nucleic acid derivatives for example, 2'-halogeno acid, 2'-2'-C 1-6 alkylcarbonyloxy nucleic acid such as acetoxy nucleic acid 2'-C 1-6 alkyloxy nucleic acid such as 2'-methoxy nucleic acids, 2'-tri-C 1-6 alkylsilyloxy nucleic acid such as 2'-trimethylsilyloxy nucleic acid can be mentioned.
  • the nucleic acids in the intermediate portion are DNA.
  • the nucleic acid in the intermediate portion is all DNA, an RNA-DNA duplex is formed with respect to the target mRNA, the duplex becomes a substrate for RNAseH, and the target mRNA is cleaved.
  • the length of the intermediate portion is preferably 4 nt or more, more preferably 5 nt or more, and even more preferably 6 nt or more.
  • the length of the intermediate portion is preferably 10 nt or less from the viewpoint of antigenicity.
  • the base of one or more nucleic acid residues in the intermediate portion is modified. Since the original base sequence of the antisense oligonucleic acid of the present invention is complementary to the base sequence of the binding target site of the target mRNA and has a strong binding affinity for the binding target site, the target mRNA and the double strand It is considered that the binding affinity is maintained even when the base of the intermediate part to be formed is modified. On the other hand, the hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid is due to the interaction with compounds other than the target mRNA, and the binding affinity with such compounds is likely to be lower than that of the target mRNA. By modifying the base of one or more nucleic acid residues in the intermediate portion, it is believed that the interaction with such compounds is reduced to the extent that hepatotoxicity is reduced.
  • the number of nucleic acid residues whose bases are modified in the intermediate part is preferably 5 or less, depending on the number of nucleic acid residues constituting the intermediate part. The smaller the number, the more reliably the binding affinity for the target mRNA is maintained.
  • the number is more preferably 4 or less, 3 or less, still more preferably 2 or 1, and particularly preferably 1.
  • base modification examples include group substitution, functional group addition, and functional group removal.
  • substitution of the group may be not only substitution of the substituent bonded to the heterocyclic ring of the base but also substitution of a group forming the heterocyclic ring of the base.
  • substitute C ⁇ for ⁇ N— which forms a heterocyclic ring of a base.
  • ⁇ N— at the 7-position of adenine and guanine may be ⁇ N + ⁇ or ⁇ C ⁇ by addition of a functional group.
  • a preferred substituent introduction position is the 5-position.
  • substituent at the 5-position include C 1-6 alkyl group, C 2-6 alkenyl group, C 2-6 alkynyl group, C 6-12 aryl group, hydroxyl group, amino group, C 1-6 alkylamino group, di (C 1-6 alkyl) amino group, carboxy group, sulfonic acid group and the like can be mentioned.
  • One or two C 1-6 alkyl groups, C 2-6 alkenyl groups or C 2-6 alkynyl groups may be introduced into the 4-position amino group.
  • Suitable modifications of cytosine, thymine, and uracil include substitution of the 2-position carbonyl group with a thiocarbonyl group. Further, a C 1-6 alkyl group may be introduced into the 3-position amino group of thymine or uracil.
  • the preferred position for introducing a substituent includes the 8-position.
  • the substituent at the 8-position include a halogeno group in addition to a hydrophilic substituent such as an amino group, a C 1-6 alkylamino group, and a di (C 1-6 alkyl) amino group.
  • ⁇ N— at the 7-position may be converted to ⁇ C ⁇ and a phenylethynyl group may be introduced.
  • More specific modified bases include, for example, cytosine derivatives such as 5-hydroxycytosine, 4-acetylcytosine, 3-C 1-6 alkylcytosine, 5-C 1-6 alkylcytosine, 2-thiocytosine; 2-thiothymine , Thymine derivatives such as dihydrothymine and pseudothymine; 2-thiouridine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uridine, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluridine, dihydrouridine, pseudouridine, 5-methyl Uridine derivatives such as aminomethyluridine, 5-methylaminomethyl-2-thiouridine, 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine, 5-methoxycarbonylmethyluridine, 5-methoxyuridine; 8-aminoguanine, 8-halogenog Nin, 7-deaza-7- (2-phenylethynyl) guanine, 7-deaza-7- [2- (4-pyridyl)
  • R 31 represents H or a hydroxyl-protecting group selected from a silyl protecting group, a trityl protecting group, a carbamate protecting group, and a benzyl ether protecting group
  • R 32 and R 33 are independently halogeno group, a nitro group or a C 1-6 alkyl phenyl group which may be substituted or a group, a C 1-6 alkyl group optionally substituted with a cyano group, Indicates
  • R 34 represents an amino-protecting group
  • R 35 represents a halogeno group or R 36 —C ⁇ C— (R 36 represents a C 6-12 aryl group, a heteroaromatic group, a hydroxy-C 1-6 alkyl group, or a C 1-7 alkanoyloxy-C 1- 6 represents an alkyl group.
  • R 36 represents a C 6-12 aryl group, a heteroaromatic group, a hydroxy-C 1-6 alkyl group, or a C 1-7 al
  • sil protecting group examples include trimethylsilyl, triethylsilyl, triisopropylsilyl, dimethylisopropylsilyl, diethylisopropylsilyl, dimethyltexylsilyl, t-butyldimethylsilyl, t-butyldiphenylsilyl, tribenzylsilyl, tri-p -Xylylsilyl, triphenylsilyl, diphenylmethylsilyl, t-butylmethoxyphenylsilyl and the like.
  • trityl protecting group examples include triphenylmethyl, ⁇ -naphthyldiphenylmethyl, p-methoxyphenyldiphenylmethyl, Di (p-methoxyphenyl) phenylmethyl, tri (p-methoxyphenyl) methyl, 4- (4′-bromophenacyloxy) phenyldiphenylmethyl, 4,4 ′, 4 ′′ -tris (4,5-dichloro Phthalimidophenyl) methyl, 4,4 ′, 4 ′′ -tris (levulinoyloxyphenyl) methyl, 4,4 ′, 4 ′′ -tris (benzoyloxyphenyl) methyl, 3- (imidazolyl-1-ylmethyl) bis ( 4 ′, 4 ′′ -dimethoxyphenyl) methyl, 1,1-bis (4-methoxyphenyl) -1′-pyrenylmethyl and the like.
  • Examples of the “carbamate protecting group” include t-butoxycarbonyl, fluorene Nylmethyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl and the like can be mentioned.
  • Examples of the “benzyl ether protecting group” include benzyl, methoxybenzyl, nitrobenzyl, halobenzyl, phenylbenzyl and the like, and “alkanoyl protecting group” Formyl, acetyl, halogenated acetyl, Examples include valoyl and benzoyl.
  • Examples of the “amino-protecting group” include those described above.
  • Heteroaromatic ring group means a 5-membered aromatic heterocyclyl group, 6-membered aromatic heterocyclyl group or condensed ring aromatic heterocyclyl group having at least one heteroatom such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom. .
  • 5-membered heteroaromatic group such as pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thienyl, furyl, oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazole; 6-membered heteroaromatic group such as pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl; indolyl, isoindolyl, Mention may be made of condensed ring heteroaromatic groups such as quinolinyl, isoquinolinyl, benzofuranyl, isobenzofuranyl, chromenyl and the like. A heteroaromatic group containing a nitrogen atom is preferred, and pyridyl is more preferred.
  • the base to be modified is not particularly limited.
  • the base length of the antisense oligonucleic acid of the present invention is 7 nt or more and 30 nt or less, after determining the base sequence of the original antisense oligonucleic acid, the base is modified one by one to reduce liver toxicity A modified base having an excellent effect may be determined.
  • thymine, guanine or cytosine contained in the TGC or TCC sequence is modified, there is a tendency to have a good effect on reducing liver toxicity.
  • One guide can be to modify the base.
  • the hepatic toxicity of the antisense oligonucleic acid according to the present invention is reduced as compared to the antisense oligonucleic acid before modification, particularly by modifying the base of one nucleic acid residue.
  • serum concentrations after administration of antisense oligonucleic acid AST (aspartate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransferase), which are indicators of hepatotoxicity are the same except that the antisense oligonucleic acid before modification is used.
  • the measured serum concentration is preferably 60% or less or 50% or less, more preferably 40% or less or 20% or less, still more preferably 10% or less, and even more preferably 5% or less.
  • the serum concentration of AST after administration of the antisense oligonucleic acid according to the present invention is preferably 100 IU / L or less, more preferably 40 IU / L or less, and the serum concentration of ALT is preferably 100 IU / L or less. , 40 IU / L or less is more preferable, and 20 IU / L or less is more preferable.
  • the serum concentration of AST and ALT is, for example, 70 or more hours after intravenous injection of antisense oligonucleic acid at a predetermined dose of about 10 mg / kg body weight or more and about 30 mg / kg body weight or less to a mouse or rat. Blood may be collected after elapse of a predetermined time of about 120 hours or less and measured from serum obtained by centrifugation.
  • the antisense oligonucleic acid according to the present invention can be produced by a conventional method.
  • the base length of the antisense oligonucleic acid of the present invention is 7 nt or more and 30 nt or less, it can be easily produced using an automatic nucleic acid synthesizer.
  • the antisense oligonucleic acid according to the present invention has a complementary base sequence to the target mRNA, it can strongly inhibit the translation of the target mRNA, and also has reduced liver toxicity as described above. Therefore, it is useful as a medicament for preventing or treating diseases involving target mRNA.
  • the antisense oligonucleic acid of the present invention contains, for example, adjuvants commonly used in the pharmaceutical formulation technical field such as excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrants, lubricants, and flavoring agents.
  • adjuvants commonly used in the pharmaceutical formulation technical field such as excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrants, lubricants, and flavoring agents.
  • it can be a parenteral preparation or a liposome preparation.
  • a topical preparation such as a solution, cream, ointment and the like can be prepared by blending a pharmaceutical carrier usually used in the art.
  • the antisense oligonucleic acid of the present invention can be administered to animals other than humans and humans.
  • the dose may be appropriately adjusted according to the patient's age, sex, weight, condition, type of disease, severity, prophylactic use or therapeutic use, for example,
  • the dose per dose for an adult human and per kg of body weight can be 0.01 ⁇ g or more and 100 g or less.
  • the amount is preferably 0.1 ⁇ g or more or 1.0 ⁇ g or more, more preferably 10 ⁇ g or more or 100 ⁇ g or more, still more preferably 1 mg or more, and preferably 10 g or less or 1.0 g or less, 100 mg or less or 10 mg or less. Is more preferable, and 5 mg or less is still more preferable.
  • what is necessary is just to adjust suitably between about 3 times or less per day from once a month as a frequency
  • Example 1 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid (1) Selection and synthesis of antisense oligonucleic acid As a mechanism for inducing hepatotoxicity which is a problem in nucleic acid medicine, (i) suppression of expression of non-target gene, In addition to (ii) activation of innate immunity, (iii) signal pathways via biomolecules such as proteins related to nucleic acid drugs are conceivable. # 101 was selected as an antisense oligonucleic acid that avoids the mechanisms (i) and (ii) and induces particularly strong hepatotoxicity due to the contribution of the mechanism (iii). Gene Design Co., Ltd.
  • upper case 2 having the following structure ', 4'indicates crosslinked nucleic acid (LNA), small letters indicate the DNA, base in m C is 5-methyl cytosine bases in ⁇ 5 -Hydroxycytosine.
  • LNA crosslinked nucleic acid
  • Each antisense oligonucleic acid was dissolved in physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to give a 2 mg / mL solution, which was stored frozen at ⁇ 30 ° C. until used for experiments.
  • mice (Nippon Charles River Co., Ltd.) were quarantined for 1 week and then used in the experiment.
  • the mice are arbitrarily divided into 3 groups of 4 mice, and physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) or each antisense oligonucleic acid solution is administered at 10 mL / kg body weight (20 mg / kg body weight as the dosage of antisense oligonucleic acid).
  • physiological saline manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
  • each antisense oligonucleic acid solution is administered at 10 mL / kg body weight (20 mg / kg body weight as the dosage of antisense oligonucleic acid).
  • a single dose was administered in the tail vein.
  • mice On the 4th day (96 hours after administration), the mice were anesthetized with 2.0-4.0% isoflurane (DS Pharma Animal Health) and blood was collected from the posterior vena cava abdomen as much as possible. The obtained blood was allowed to stand at room temperature for 20 to 60 minutes, and then centrifuged at 1700 ⁇ g for 5 minutes to obtain serum. At the time of blood collection, when the amount of blood did not reach the amount required for analysis, it was diluted with water for injection and then used for analysis. The concentrations of aspartate transaminase (AST) and alanine transaminase (ALT) in the obtained serum were measured using a biochemical automatic analyzer (“JCA-BM6070” manufactured by JEOL Ltd.).
  • AST and ALT are enzymes that serve as indicators of liver dysfunction, and the serum concentrations of # 101 with particularly high hepatotoxicity are determined by comparing the serum concentrations of these enzymes with non-2 ′, 4′- It was possible to significantly reduce the cytosine of one of the cross-linked nucleic acid residues by simply changing it to 5-hydroxycytosine.
  • Example 2 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid
  • antisense oligonucleic acid # 101 instead of antisense oligonucleic acid # 101, strong hepatotoxicity is induced by the contribution of the hepatotoxicity induction mechanism (iii) # 12, # Hepatotoxicity was similarly evaluated except that 98, # 14, or derivatives thereof were used.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 12 is 4614.73 and the measured value is 4614.27
  • the theoretical value of the molecular weight of # 12-C2-10 is 4630.73
  • the measured value is 4627.86
  • the molecular weight of # 98 The theoretical value is 4613.75
  • the measured value is 4612.79
  • the theoretical value of the molecular weight of # 98-C2-7 is 4629.75
  • the measured value is 4631.10.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 14 is The actual measured value of 4606.71 was 4605.66, the theoretical value of the molecular weight of # 14-C2-6 was 4622.71, and the actual measured value was 4619.72.
  • the sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 2, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 2 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • cytosine is one of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate portion. It was possible to significantly reduce the concentrations of AST and ALT in the serum only by changing to 5 to hydroxycytosine. The serum concentrations of AST and ALT were reduced to several percent by the mutation, although not as high as # 101, which is particularly high in liver toxicity.
  • Example 3 Evaluation of Liver Toxicity and Activity of Antisense Oligonucleic Acid GR (Glucocorticoid Receptor) is a kind of steroid receptor, which acts as a receptor for steroid hormone hydrocortisone, but translocates into the nucleus in a ligand-dependent manner. It also works as a transcription factor. Therefore, Posi12 (Nucleic Acid Ther., 2012, 22, 5, 344-359) was selected as an antisense oligonucleic acid targeting this, and Posi12 having a sequence shown in Table 3 and its derivatives were selected by Gene Design Co., Ltd. The synthesis of Posi12-C2-11 was outsourced. The theoretical value of the molecular weight of Posi12 was 4611.71, and the actual measurement value was 4610.81. The theoretical value of the molecular weight of Posi12-C2-11 was 4627.71, and the actual measurement value was 4625.65.
  • Posi12 Nucleic Acid Ther., 2012, 22, 5, 344-35
  • mice were frozen and euthanized, the liver was removed, and the weight was measured. About 100 mg was collected as a sample from a site where no abnormalities were observed in the extracted liver. After measuring the weight of the collected sample, it was frozen in liquid nitrogen and stored in an ultra-low temperature freezer. The cryopreserved liver sample was homogenized as much as possible using a homogenator (Shake Master auto, Bio Medical Science Inc.) and TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific) under ice cooling, and total RNA was extracted.
  • a homogenator Sonic Master auto, Bio Medical Science Inc.
  • TRIzol reagent Thermo Fisher Scientific
  • the UV absorption spectrum of the extracted total RNA was measured using Nano Vue or Nano Vue Plus (GE Healthcare), and the RNA concentration and O.D. D. 260 / O. D. Purity was calculated from the 280 ratio.
  • quantitative PCR was performed on the target nucleic acid administered group using the One Gene SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) and Applied Biosystems 7500 (Life Technologies Japan Ltd) in the sense oligo group. The expression ratio was calculated and the activity was evaluated. The results are shown in FIG.
  • Posi12-induced hepatotoxicity is 40% when only one cytosine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part is changed to 5-hydroxycytosine.
  • FIG. 3 (2) even if cytosine of one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of Posi12 is changed to 5-hydroxycytosine, GR The gene expression suppressing activity was not changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 4 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid Posi14 (Nucleic Acid Ther., 2012, 22, 5, 344-359) was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse GR.
  • the design was outsourced to the synthesis of Posi14 having the sequence shown in Table 4 and its derivative Posi14-C2-6.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi14 was 4691.78, and the actual measurement value was 4691.10.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi14-C2-6 was 4707.78, and the actual measurement value was 4705.24.
  • hepatotoxicity due to Posi14 is 70% only by changing cytosine of one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate part to 5-hydroxycytosine.
  • the degree of reduction was 13% excluding abnormal measurement values.
  • FIG. 4 (2) even when cytosine of one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate part of Posi14 is changed to 5-hydroxycytosine, GR The gene expression suppressing activity was not changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 5 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid
  • PCSK9 Pro-protein Convertase Subtilisin Kexin 9
  • Posi15 was selected as an antisense oligonucleic acid targeting the mouse PCSK9 gene, and Posi15 having the sequences shown in Table 5 and its derivatives Posi15-C2-4 and Posi15-C2-11 were synthesized by Gene Design Co., Ltd. Was outsourced.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi15 is 4586.77, the measured value is 4586.73, the theoretical value of the molecular weight of Posi15-C2-4 is 4602.77, the measured value is 4600.61, and the measured value of Posi15-C2-11 The theoretical value of the molecular weight was 4602.77, and the actually measured value was 4602.09.
  • Posi15-induced hepatotoxicity is 40% when only one cytosine of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part is changed to 5-hydroxycytosine. Or reduced to 60%, and the reduction was 30% or 40% excluding abnormal measurements.
  • FIG. 5 (2) even if cytosine of one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate part of Posi15 is changed to 5-hydroxycytosine, PCSK9 The gene expression suppression activity was almost unchanged.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 6 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid
  • Posi17 was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse PCSK9, and it was Posi17 and its derivatives having the sequences shown in Table 6 at Gene Design Co., Ltd.
  • the synthesis of Posi17-C2-10 was outsourced.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi17 was 4300.54, and the actual measurement value was 4300.92.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi17-C2-10 was 4316.54, and the actual measurement value was 4314.46.
  • Posi17 hepatotoxicity is 50% only by changing cytosine of one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part to 5-hydroxycytosine.
  • FIG. 6 (2) even if cytosine of one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of Posi17 is changed to 5-hydroxycytosine, PCSK9 The gene expression suppression activity was almost unchanged.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 7 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid
  • Rps6kb2 Ribosomal protein S6 kinase beta-2
  • Rps6kb2 Ribosomal protein S6 kinase beta-2
  • 97 has a theoretical value of 4182.40 and an actual measurement value of 4183.06.
  • No. 97-C2-7 has a theoretical molecular weight of 4198.40 and an actual measurement of 4197.54.
  • No. 97-C2-9 has a theoretical molecular weight of 4198.40 and an actual measurement of 4196.60.
  • the theoretical value of the molecular weight of 97-C2-10 was 4198.40, and the measured value was 4199.40.
  • Hepatotoxicity due to 97 was reduced to 33%, 20% or 35% by simply changing one of the non-2 ', 4'-bridged nucleic acid residues in the middle part to 5-hydroxycytosine.
  • the result shown in FIG. Even when cytosine of one of the non-2 ', 4'-bridged nucleic acid residues in the middle part of 97 was changed to 5-hydroxycytosine, the expression suppression activity of the Rps6kb2 gene was hardly changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 8 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid
  • # 101-T6-5 was used as a derivative of antisense oligonucleic acid # 101.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 101-T6-5 was 4605.78, and the actual measured value was 4605.10.
  • the sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 8, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 8 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • the base in ⁇ is 2-thiocarbonylthymine, and ⁇ has the following structure.
  • Example 9 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid
  • # 98, # 14, or a derivative thereof was used instead of antisense oligonucleic acid # 101. did.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 98-T6-5 was 4629.81 and the measured value was 4631.05
  • the theoretical value of the molecular weight of # 14-T6-4 was 4622.77
  • the measured value was 4623.11.
  • the sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 9, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 9 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • serum can be obtained only by changing thymine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part to 2-thiocarbonylthymine.
  • concentration of AST and ALT in the medium could be significantly reduced.
  • Example 10 Evaluation of hepatic toxicity and activity of antisense oligonucleic acid Posi12 (Nucleic Acid Ther., 2012, 22, 5, 344-359) was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse GR.
  • the design was outsourced to the synthesis of Posi12 having the sequence shown in Table 10 and its derivative Posi12-T6-4.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi12-T6-4 was 4627.77, and the actual measured value was 4629.03.
  • hepatotoxicity caused by Posi12 can be achieved by changing only one thymine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part to 2-thiocarbonylthymine. %.
  • FIG. 10 (2) even if one thymine among the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of Posi12 is changed to 2-thiocarbonylthymine, The GR gene expression suppression activity was not changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 11 Evaluation of hepatic toxicity and activity of antisense oligonucleic acid Posi14 (Nucleic Acid Ther., 2012, 22, 5, 344-359) was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse GR.
  • the design was outsourced to the synthesis of Posi14 having the sequence shown in Table 11 and its derivative Posi14-T6-4.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi14-T6-4 was 4707.84, and the actual measured value was 4708.38.
  • hepatotoxicity caused by Posi14 can be achieved only by changing one thymine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part to 2-thiocarbonylthymine. %.
  • FIG. 11 (2) even if one thymine among the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of Posi14 is changed to 2-thiocarbonylthymine, The GR gene expression suppression activity was not changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 12 Evaluation of hepatic toxicity and activity of antisense oligonucleic acid Posi17 (Nucleic Acid Ther., 2012, 22, 5, 344-359) was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse PCSK9.
  • the design was outsourced to the synthesis of Posi17 having the sequence shown in Table 12 and its derivative Posi17-T6-4.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi17-T6-4 was 4316.60, and the actual measured value was 4316.08.
  • hepatotoxicity caused by Posi17 is obtained by changing one thymine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate portion to 2-thiocarbonylthymine. %.
  • FIG. 12 (2) even if one thymine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of Posi17 is changed to 2-thiocarbonylthymine, The PCSK9 gene expression-suppressing activity was hardly changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 13 Evaluation of hepatic toxicity of antisense oligonucleic acid
  • # 101-G3-6 was used as a derivative of antisense oligonucleic acid # 101.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 101-G3-6 was 4604.73, and the actual measured value was 4605.45.
  • the sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 13, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 13 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • the base in ⁇ is 8-aminoguanine, and ⁇ has the following structure.
  • one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of antisense oligonucleic acid # 101 having very high hepatotoxicity is changed to 8-aminoguanine. Alone, the concentration of AST and ALT in the serum could be reduced.
  • Example 14 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid
  • liver was similarly used except that # 12, # 98, # 14, or derivatives thereof were used instead of antisense oligonucleic acid # 101. Toxicity was assessed.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 12-G3-9 is 4629.74, the measured value is 4628.19, the theoretical value of the molecular weight of # 98-G3-6 is 4628.76, and the measured value is 4628.93.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 14-G3-5 was 4621.72, and the actually measured value was 4621.39.
  • the sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 14, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 14 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • Example 15 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid Hepatotoxicity was evaluated in the same manner as in Example 1 except that antisense oligonucleic acid # 101 or its derivative # 101-G4-6 was used. The theoretical value of the molecular weight of # 101-G4-6 was 4668.61, and the actual measured value was 4670.31. The sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 15, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 15 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • the base in ⁇ is 8-bromoguanine, and ⁇ has the following structure.
  • one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of antisense oligonucleic acid # 101 having very high hepatotoxicity is changed to 8-bromoguanine. Alone, the concentration of AST and ALT in the serum could be reduced.
  • Example 16 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid
  • liver was similarly used except that # 12, # 98, # 14, or a derivative thereof was used instead of antisense oligonucleic acid # 101.
  • Toxicity was assessed.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 12-G4-9 is 4693.62, and the measured value is 4692.50, the theoretical value of the molecular weight of # 98-G4-6 is 4692.64, and the measured value is 469.45.
  • the theoretical value of the molecular weight of # 14-G4-5 was 4865.60, and the actual measured value was 4683.86.
  • the sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 16, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 16 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • Example 17 Evaluation of hepatic toxicity and activity of antisense oligonucleic acid Posi14 (Nucleic Acid Ther., 2012, 22, 5, 344-359) was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse GR.
  • the design was outsourced to the synthesis of Posi14 having the sequence shown in Table 17 and its derivative Posi14-G4-10.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi14-G4-10 was 4770.67, and the actual measured value was 477.46.
  • Posi14-induced hepatotoxicity is 30% only by changing one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part to 8-bromoguanine.
  • FIG. 17 (2) even if one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of Posi14 is changed to 8-bromoguanine, GR The gene expression suppression activity was almost unchanged.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 18 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid Posi15 was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse PCSK9, and it was Posi15 having a sequence shown in Table 18 and its derivatives at Gene Design Co., Ltd. The synthesis of Posi15-G4-8 was outsourced. The theoretical value of the molecular weight of Posi15-G4-8 was 4665.66, and the actual measured value was 4666.01.
  • Example 19 Evaluation of hepatic toxicity and activity of antisense oligonucleic acid
  • Posi17 was selected as an antisense oligonucleic acid targeting mouse PCSK9, and it was Posi17 and its derivatives having the sequences shown in Table 19 at Gene Design Co., Ltd.
  • the synthesis of Posi17-G4-3, Posi17-G4-5 and Posi17-G4-8 was outsourced.
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi17-G4-3 is 4379.43
  • the measured value is 4378.54
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi17-G4-5 is 4379.43
  • the measured value is 4377.25
  • Posi17- The theoretical value of the molecular weight of G4-8 was 4379.43, and the measured value was 4378.34.
  • hepatotoxicity by Posi17 is obtained by changing only one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part to 8-bromoguanine. %, 9% or 20%.
  • the effect of Posi17-G4-8 on reducing hepatotoxicity decreased to 3% excluding abnormal measured values.
  • FIG. 19 (2) even if one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part of Posi17 is changed to 8-bromoguanine, PCSK9 The gene expression suppression activity was almost unchanged.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 20 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid No. 1 as an antisense oligonucleic acid targeting mouse Rps6kb2.
  • No. 97 was selected, and Gene Design Co., Ltd. 97 and its derivatives No. The synthesis of 97-G4-8 was outsourced.
  • No. 97-G4-8 had a theoretical molecular weight of 4261.29 and an actual measured value of 4261.11.
  • Hepatotoxicity due to 97 was significantly reduced to 9% by simply changing one guanine of the non-2 ', 4'-bridged nucleic acid residues in the middle part to 8-bromoguanine.
  • the result shown in FIG. Even when guanine of one of the non-2 ', 4'-bridged nucleic acid residues in the middle part of 97 was changed to 8-bromoguanine, the expression suppression activity of the Rps6kb2 gene was hardly changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 21 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid
  • Posi15-G6-8 which is a derivative of Posi15
  • the theoretical value of the molecular weight of Posi15-G6-8 was 4865.90, and the actual measured value was 4683.03.
  • the sequence of each antisense oligonucleic acid used in this example is shown in Table 21, and the measurement results of hepatotoxicity are shown in FIG. “*” In FIG. 21 indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • the base in ⁇ is 7-phenylethynylguanine, and ⁇ has the following structure.
  • hepatotoxicity by Posi15 was obtained by changing one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part to 7-phenylethynylguanine. Except for abnormal measurements, it was significantly reduced to 5%.
  • FIG. 21 (2) even if one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate part of Posi15 is changed to 7-phenylethynylguanine, The PCSK9 gene expression-suppressing activity was hardly changed.
  • hepatotoxicity can be reduced without reducing the activity of the antisense oligonucleic acid.
  • Example 22 Evaluation of the hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid No. 1 as an antisense oligonucleic acid targeting mouse Rps6kb2 and mouse GR No. 97 and Posi14 were selected, respectively, and No. having the sequences shown in Table 22 in Gene Design Co., Ltd. The synthesis of 97, Posi14, and derivatives in which one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part was changed to 8-aminoguanine was outsourced.
  • Posi15 and Posi17 were selected as antisense oligonucleic acids targeting the mouse PCSK9 gene, respectively, and Posi15 and Posi17 having the sequences shown in Table 22 and non-2 ′, 4′- in the middle part were selected by Gene Design Co., Ltd. The synthesis of a derivative in which one of the cross-linked nucleic acid residues was changed to 8-aminoguanine was outsourced.
  • Example 23 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid # 12 was selected as an antisense oligonucleic acid that induces strong hepatotoxicity, and # 12 having the sequence shown in Table 23 in Gene Design Co., Ltd. Synthesis of a derivative in which one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues was changed to a 7-substituted guanine having the following structure was outsourced. Since the compound used for introducing the 7-substituted guanosine derivative is novel, its synthesis method will be described later.
  • hepatotoxicity due to # 12 is effective only by introducing a substituent at the 7th position of guanine in one of the non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate part. Reduced to
  • Example 24 Evaluation of hepatotoxicity and activity of antisense oligonucleic acid Posi14 and Posi15 were selected as antisense oligonucleic acids targeting the mouse GR and mouse PCSK9 genes, respectively, and the sequences shown in Table 24 were used in Gene Design Co., Ltd. Synthesis of Posi14, Posi15, and derivatives in which one guanine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the middle part was changed to 7-substituted guanine was outsourced.
  • Example 25 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid # 101 was selected as an antisense oligonucleic acid that induces strong hepatotoxicity, and Gene Design Co., Ltd., # 101 having the sequence shown in Table 25, in the middle part The synthesis of derivatives in which one cytosine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues was changed to 5-hydroxycytosine was outsourced.
  • the ALT concentration in mouse serum was measured in the same manner as in Example 3 above. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 29, hepatotoxicity due to # 101 is effectively reduced only by changing to 5-hydroxycytosine of one cytosine of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate part. It was done.
  • Example 26 Evaluation of hepatotoxicity of antisense oligonucleic acid # 101 was selected as an antisense oligonucleic acid that induces strong hepatotoxicity, and Gene Design Co., Ltd., # 101 having the sequence shown in Table 26, in the middle part Of a derivative in which one to three bases of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues are changed to 5-hydroxycytosine ( ⁇ ), 2-thiocarbonylthymine ( ⁇ ) or 8-bromoguanine ( ⁇ ) The synthesis was outsourced.
  • hepatic toxicity due to # 101 is effectively reduced by changing one base of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the intermediate portion to a derivative. It was demonstrated that the effect of attenuating hepatotoxicity was further enhanced by changing two or more bases of non-2 ′, 4′-bridged nucleic acid residues in the moiety to derivatives.

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Abstract

本発明は、肝毒性が低減されたアンチセンスオリゴ核酸を提供することを目的とする。本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２'，４'－架橋型核酸であり、上記両末端の間に非２'，４'－架橋型の核酸残基を有し、上記非２'，４'－架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とする。

Description

アンチセンスオリゴ核酸
　本発明は、肝毒性が低いアンチセンスオリゴ核酸に関するものである。
　核酸医薬品は従来型の医薬品とは異なり、特定の遺伝子の発現を細胞内で抑制できることから、これまでは治療困難であった疾患に対する革新的な医薬品創出につながることが期待されている。核酸医薬品に関する技術として、例えば、疾病に関わるｍＲＮＡの一部と相補的なアンチセンスオリゴ核酸を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより病原ｍＲＮＡの翻訳過程を阻害して疾病の治療や予防を行うアンチセンス法が開発されている。
　しかし、アンチセンスオリゴ核酸は生体内でヌクレアーゼにより分解され易いという欠点を有する。また、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性や特異性をさらに向上させる必要がある。そこで本発明者らの研究グループは、ヌクレアーゼ耐性や、立体構造の安定化による標的ｍＲＮＡへの結合親和性と特異性の改善のために、２’位と４’位を架橋した核酸分子を開発し（特許文献１～５）、また、かかる架橋核酸を用い、ＰＣＳＫ９遺伝子への結合親和性などに優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを開発している（特許文献６）。
　ところが、ヒト臨床試験を見据えた核酸創薬研究が進展するにつれ、解決すべき新たな課題が顕在化している。その最たるものとして挙げられるのが、「人工オリゴヌクレオチドが潜在的に有する毒性の回避」である。
　例えばラットやマウスにアンチセンスオリゴ核酸を静脈投与すると約１２時間で肝臓に移行することが知られているが、アンチセンスオリゴ核酸の中には重篤な肝毒性を示すものがある。その機構としては、必ずしも明らかではないが、標的外のｍＲＮＡの発現抑制、自然免疫の活性化、未知のタンパク質遺伝子の発現促進などが考えられる。アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を予測する手段として、肝毒性を示すアンチセンスオリゴ核酸に共通する塩基配列を特定する研究が為されている（非特許文献１，２）。
国際公開第２０１１／０５２４３６号パンフレット 国際公開第２０１４／０４６２１２号パンフレット 国際公開第２０１４／１１２４６３号パンフレット 国際公開第２０１５／１２５７８３号パンフレット 国際公開第２０１６／０１７４２２号パンフレット 国際公開第２０１３／１１８７７６号パンフレット
Ｐｅｔｅｒ　Ｈ．Ｈａｇｅｄｏｒｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２３（５），ｐｐ．３０２－３１０（２０１３） Ａｎｄｒｅｗ　Ｄ．Ｂｕｒｄｉｃｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，ｐｐ．１－１０
　上述したように、アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性に関与するとされている塩基配列を特定する研究は為されている。しかし、上記非特許文献１，２で肝毒性に関与するとされている塩基配列は僅かｎｔ２またはｎｔ３であり、このように短い塩基配列を含まないアンチセンスオリゴ核酸をデザインすることが難しい場合がある。例えば、ｍＲＮＡは安定化のため部分的にループ構造や二重鎖などの自己構造を有しており、アンチセンスオリゴ核酸としては標的ｍＲＮＡの一本鎖にハイブリダイズするものをデザインすべきとの制限がある。しかも、標的ｍＲＮＡの一本鎖にハイブリダイズし且つ上記塩基配列を含まない塩基配列が、優れた活性を示し且つ肝毒性を示さないとは限らない。
　そこで本発明は、肝毒性が低減されたアンチセンスオリゴ核酸を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特に、アンチセンスオリゴ核酸において特定部分における核酸残基の塩基を修飾することにより活性を維持しつつ肝毒性を低減できることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、
　両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’－架橋型核酸であり、
　上記両末端の間に非２’，４’－架橋型の核酸残基を有し、
　上記非２’，４’－架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とするアンチセンスオリゴ核酸。
　［２］　塩基が修飾されている上記非２’，４’－架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる上記［１］に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
　［３］　上記の修飾されている塩基が、５－ヒドロキシシトシン、４－アセチルシトシン、３－Ｃ1-6アルキルシトシン、５－Ｃ1-6アルキルシトシン、２－チオシトシン、２－チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン、２－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、８－アミノグアニン、８－ハロゲノグアニン、７－デアザ－７－（２－フェニルエチニル）グアニン、７－デアザ－７－（２－ピリジルエチニル）グアニン、７－デアザ－７－［２－（Ｃ1-7アルカノイルオキシ－Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、７－デアザ－７－［２－（ヒドロキシ－Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、１－Ｃ1-6アルキルグアニン、２，２－ジ（Ｃ1-6アルキル）グアニン、２－Ｃ1-6アルキルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ1-6アルキルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ2-6アルケニルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ2-6アルキニルグアニン、７－デアザ－７－ハロゲノグアニン、イノシン、１－Ｃ1-6アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ－ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ－マンノシルキュェオシン、Ｎ6－Ｃ2-6アルケニルアデニン、１－Ｃ1-6アルキルアデニン、２－Ｃ1-6アルキルアデニン、Ｎ6－Ｃ1-6アルキルアデニンまたは２－Ｃ1-6アルキルチオ－Ｎ6－Ｃ2-6アルケニルアデニンである上記［１］に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
　［４］　上記非２’，４’－架橋型の核酸残基がＤＮＡである上記［１］～［３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
　［５］　上記２’，４’－架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する上記［１］～［４］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［式中、
　Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ3）基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基または－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ4）－基を示し（Ｒ3およびＲ4は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）
　Ｘ2は、下記式（ＩＶ）～（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Ｒ5～Ｒ18は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-10シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２－シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
　Ｘ3は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ19）基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基または－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ20）－基を示し（Ｒ19およびＲ20は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）
　Ｙ1～Ｙ3は、独立してＯ-またはＳ-を示し、
　Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
　Ｒ1とＲ2は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基を示すか、または、Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ1-4アルキレン基を形成してもよく、
　ｎは０以上２以下の整数を示す］
　［６］　上記２’，４’－架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ1がＯであり且つｎが１である上記［５］に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
　［７］　核酸残基の塩基への上記修飾の導入前に比して肝毒性が低減されている上記［１］～［６］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
　本開示において「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。
　「Ｃ2-6アルケニル基」は、炭素数が２以上、６以下であり、少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する直鎖状または分枝鎖状の一価不飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、エテニル（ビニル）、１－プロペニル、２－プロペニル（アリル）、イソプロペニル、２－ブテニル、３－ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル等である。
　「Ｃ2-6アルキニル基」は、炭素数が２以上、６以下であり、少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する直鎖状または分枝鎖状の一価不飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル（プロパルギル）、２－ブチニル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等である。好ましくはＣ2-4アルキニル基であり、より好ましくはＣ2-3アルキニル基である。
　「Ｃ6-12アリール基」とは、炭素数が６以上、１２以下の一価芳香族炭化水素基をいう。例えば、フェニル、ナフチル、インデニル、ビフェニル等である。
　「ハロゲノ基」としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基およびヨード基を例示することができ、クロロ基またはブロモ基が好ましい。
　「Ｃ3-10シクロアルキル基」は、炭素数３以上、１０以下の環状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、ジメチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル等である。好ましくはＣ3-6シクロアルキル基である。
　「アミノ基の保護基」としては、例えば、ｔ－ブトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル系保護基；ベンジルオキシカルボニル基、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｏ－ニトロベンジルオキシカルボニル基などのアリールメトキシカルボニル系保護基；ベンジル基、４－メトキシベンジル基、トリフェニルメチル基などのアリールメチル系保護基；ホルミル基やアセチル基などのアルカノイル系保護基；ベンゾイル基などのアロイル系保護基；２，４－ジニトロベンゼンスルホニル基、ｏ－ニトロベンゼンスルホニル基などのアリールスルホニル系保護基などを挙げることができる。
　「Ｃ1-6アルキレン基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の二価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチレン、エチレン、メチルメチレン、ｎ－プロピレン、メチルエチレン、ｎ－ブチレン、メチルプロピレン、ジメチルエチレン、ｎ－ペンチレン、ｎ－ヘキシレン等である。好ましくはＣ1-4アルキレン基であり、より好ましくはＣ1-2アルキレン基であり、よりさらに好ましくはメチレンである。
　「Ｃ1-7アルカノイル基」とは、炭素数１～７の脂肪族カルボン酸からＯＨを除いた残りの原子団をいう。例えば、ホルミル、アセチル、エチルカルボニル、ｎ－プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｔ－ブチルカルボニル、ｎ－ペンチルカルボニル、ｎ－ヘキシルカルボニル等であり、好ましくはＣ1-4アルカノイル基であり、より好ましくはアセチルである。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性は、顕著に低減されている。さらに、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性が高く、且つ、生体内においてヌクレアーゼによる攻撃を受け難く安定であるといえる。よって本発明のアンチセンスオリゴ核酸は、実用性の高い核酸医薬になり得るものとして産業上極めて利用価値が高い。
図１は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図２は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図３は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図４は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図５は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図６は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図７は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図８は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図９は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図１０は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図１１は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図１２は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図１３は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図１４は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図１５は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図１６は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図１７は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図１８は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図１９は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２０は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２１は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２２は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２３は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２４は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２５は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２６は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図２７は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２８は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。 図２９は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。 図３０は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり；両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’－架橋型核酸であり；上記両末端の間に非２’，４’－架橋型の核酸残基を有し；上記非２’，４’－架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とする。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の塩基配列は、標的ｍＲＮＡに高い結合親和性をもってハイブリダイズでき且つ特定部分における１以上の核酸残基の塩基が修飾されていれば特に制限されない。塩基を修飾する前の元の塩基配列は、標的ｍＲＮＡに従って常法により決定すればよい。
　例えば、標的ｍＲＮＡの翻訳開始部位を結合標的部位として選択すると、翻訳阻害活性の高いアンチセンスオリゴ核酸をデザインできることがある。また、ｍＲＮＡは分子内でヘアピンループ構造や二重鎖構造を形成していることがあり、結合標的部位としては、速度論的および熱力学的に一本鎖構造部位が好ましい。そこで、ｍＲＮＡの二次構造を計算で予測し、一本鎖構造であると予測される部位を結合標的部位として選択することができる。その他、二重鎖が形成されている箇所を選択的に切断するＲＮａｓｅＨを用いるランダムスクリーニングにより、標的ｍＲＮＡと二重鎖を最も形成し易い配列を特定することも可能である。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸における核酸塩基は、修飾塩基以外、一般的なアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンであればよい。但し、メチルシトシンはチミンから容易に合成可能であるため、シトシンの代わりにメチルシトシンを用いてもよい。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、Ｓ化オリゴ核酸であってもよい。通常のオリゴ核酸ではリボース間がホスホジエステル結合で結合されているが、ホスホロチオエート結合でリボース間を結合することにより、エキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼに対するオリゴ核酸の耐性が向上する。また、全てのリン酸基がＳ化されている完全型Ｓ化オリゴ核酸であってもよいし、一部のリン酸基がＳ化されているキメラ型Ｓ化オリゴ核酸であってもよい。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の塩基長としては、７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下が好ましい。塩基長が７ｎｔ以上であれば、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性や特異性を十分に確保することができる。一方、塩基長が３０ｎｔ以下であれば抗原性が十分に抑制され、また、合成もし易い。当該塩基長としては、１０ｎｔ以上が好ましく、１２ｎｔ以上がより好ましく、また、２５ｎｔ以下が好ましく、２０ｎｔ以下が好ましい。なお、塩基長が１７ｎｔのオリゴ核酸は４17＝１．７×１０10種あり、ヒトゲノムの全塩基数である２×３×１０9を超えるため、特異性の向上のため当該塩基長を１７ｎｔ以上にすることも可能である。
　本発明のアンチセンスオリゴ核酸では、両末端からそれぞれ独立して１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’－架橋型核酸である。少なくとも両末端部位における核酸が２’，４’－架橋されていることにより、生体内において各種ヌクレアーゼによる攻撃を受け難くなっており、生体への投与後、生体内に長時間存在することができる。また、２’，４’－架橋により構造が安定化されていることから、標的ｍＲＮＡと二重鎖を形成し易い。
　２以上の２’，４’－架橋型核酸残基における２’，４’－架橋構造は、互いに同一であってもよいし異なっていてもよい。２’，４’－架橋構造は、リボース部分の構造を安定化するものであれば特に制限されないが、例えば、上記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の構造を挙げることができる。
　２’，４’－架橋型核酸残基における核酸塩基は、一般的なアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンであってもよいし、修飾されていてもよい。但し、メチルシトシンはチミンから容易に合成可能であるため、特に両末端部分においては、シトシンの代わりにメチルシトシンを用いてもよい。両末端部分における修飾塩基の数としては、両末端部分における２’，４’－架橋型核酸残基にもよるが、５以下または４以下が好ましく、３以下がより好ましく、１または２がよりさらに好ましい。両末端部分における修飾塩基は、非２’，４’－架橋型核酸残基における修飾塩基と同様のものを挙げることができる。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、２’，４’－架橋型核酸残基で構成される両末端の間に、１以上の非２’，４’－架橋型の核酸残基を有する。即ち、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の両末端部分以外は、非２’，４’－架橋型核酸残基で構成されている。以下、本開示においては、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の上記両末端部分以外の部分を「中間部分」ということがある。中間部分の非２’，４’－架橋型核酸残基は、２’位－４’位間が架橋されていなければＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸誘導体、およびこれら２以上の組合わせであってもよい。核酸誘導体としては、例えば、２’－ハロゲノ核酸、２’－アセトキシ核酸などの２’－Ｃ1-6アルキルカルボニルオキシ核酸、２’－メトキシ核酸などの２’－Ｃ1-6アルキルオキシ核酸、２’－トリメチルシリルオキシ核酸などの２’－トリＣ1-6アルキルシリルオキシ核酸などを挙げることができる。しかし、上記中間部分の核酸がすべてＤＮＡであることが好ましい。中間部分の核酸がすべてＤＮＡである場合、標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡ－ＤＮＡ二本鎖が形成され、当該二本鎖がＲＮＡｓｅＨの基質となり、標的ｍＲＮＡが切断される。ＲＮＡｓｅＨの基質の観点から、上記中間部分の長さとしては４ｎｔ以上が好ましく、５ｎｔ以上がより好ましく、６ｎｔ以上がよりさらに好ましい。一方、上記中間部分の長さとしては、抗原性の観点から、１０ｎｔ以下が好ましい。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸においては、上記中間部分中の１以上の核酸残基の塩基が修飾されている。本発明のアンチセンスオリゴ核酸の元の塩基配列は、標的ｍＲＮＡの結合標的部位の塩基配列に相補的であり、当該結合標的部位に対して強い結合親和性を有するため、標的ｍＲＮＡと二本鎖を形成すべき中間部分の塩基を修飾しても、結合親和性は維持されると考えられる。一方、アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性は、標的ｍＲＮＡ以外の化合物との相互作用が原因であり、そのような化合物との結合親和性は標的ｍＲＮＡに比べて低い可能性が高いため、本発明において上記中間部分中の１以上の核酸残基の塩基を修飾することにより、肝毒性が低減される程度にそのような化合物との相互作用が低減されると考えられる。
　中間部分において塩基が修飾されている核酸残基の数としては、中間部分を構成する核酸残基の数にもよるが、５以下が好ましい。当該数が少ない程、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性はより確実に維持されると考えられる。当該数としては４以下または３以下がより好ましく、２または１がよりさらに好ましく、１が特に好ましい。
　塩基の修飾としては、例えば、基の置換、官能基の付加、官能基の除去が考えられる。塩基の修飾については、１つの塩基内であれば、２以上の修飾を組み合わせてもよい。また、基の置換には、塩基の複素環に結合している置換基の置換のみでなく、塩基の複素環を形成する基の置換であってもよい。例えば、塩基の複素環を形成する＝Ｎ－を＝Ｃ＜に置換することも可能である。例えば、アデニンおよびグアニンの７位における＝Ｎ－は、官能基の付加により＝Ｎ+＜になってもよいし＝Ｃ＜になってもよい。
　シトシンを修飾する場合、好ましい置換基導入位置としては５位を挙げることができる。５位の置換基としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ6-12アリール基、水酸基、アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、カルボキシ基、スルホン酸基などを挙げることができる。また、４位アミノ基に１個または２個のＣ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基またはＣ2-6アルキニル基を導入してもよい。
　また、シトシン、チミン、ウラシルの好適な修飾としては、２位カルボニル基のチオカルボニル基への置換を挙げることができる。また、チミンやウラシルの３位アミノ基にＣ1-6アルキル基を導入してもよい。
　グアニンまたはアデニンを修飾する場合、好ましい置換基導入位置としては８位を挙げることができる。８位の置換基としては、アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基などの親水性置換基の他、ハロゲノ基を挙げることができる。また、７位の＝Ｎ－を＝Ｃ＜に変換し、フェニルエチニル基を導入してもよい。
　さらに具体的な修飾塩基としては、例えば、５－ヒドロキシシトシン、４－アセチルシトシン、３－Ｃ1-6アルキルシトシン、５－Ｃ1-6アルキルシトシン、２－チオシトシン等のシトシン誘導体；２－チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン等のチミン誘導体；２－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン等のウリジン誘導体；８－アミノグアニン、８－ハロゲノグアニン、７－デアザ－７－（２－フェニルエチニル）グアニン、７－デアザ－７－［２－（４－ピリジル）エチニル］グアニン、７－デアザ－７－［２－（２－ピリジル）エチニル］グアニン、７－デアザ－７－［２－（３－ピリジル）エチニル］グアニン、７－デアザ－７－［２－（Ｃ1-7アルカノイルオキシ－Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、７－デアザ－７－［２－（ヒドロキシ－Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、１－Ｃ1-6アルキルグアニン、２，２－ジ（Ｃ1-6アルキル）グアニン、２－Ｃ1-6アルキルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ1-6アルキルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ2-6アルケニルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ2-6アルキニルグアニン、７－デアザ－７－ハロゲノグアニン、イノシン、１－Ｃ1-6アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ－ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ－マンノシルキュェオシン等のグアニン誘導体；Ｎ6－Ｃ2-6アルケニルアデニン、１－Ｃ1-6アルキルアデニン、２－Ｃ1-6アルキルアデニン、Ｎ6－Ｃ1-6アルキルアデニンまたは２－Ｃ1-6アルキルチオ－Ｎ6－Ｃ2-6アルケニルアデニン等のアデニン誘導体を挙げることができる。
　本発明者らは、修飾塩基を有する化合物として、以下の新規７－置換グアノシン誘導体（ＶＩＩＩ）を開発した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［式中、
　Ｒ31は、Ｈ、または、シリル系保護基、トリチル系保護基、カーバメート系保護基およびベンジルエーテル系保護基から選択される水酸基の保護基を示し；
　Ｒ32およびＲ33は、独立して、ハロゲノ基、ニトロ基またはＣ1-6アルキル基に置換されていてもよいフェニル基、または、シアノ基で置換されていてもよいＣ1-6アルキル基を示し；
　Ｒ34は、アミノ基の保護基を示し；
　Ｒ35は、ハロゲノ基またはＲ36－Ｃ≡Ｃ－（Ｒ36は、Ｃ6-12アリール基、複素芳香環基、ヒドロキシ－Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-7アルカノイルオキシ－Ｃ1-6アルキル基を示す。］
　「シリル系保護基」としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルテキシルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリ－ｐ－キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル、ｔ－ブチルメトキシフェニルシリルなどを挙げることができ、「トリチル系保護基」としては、トリフェニルメチル、α－ナフチルジフェニルメチル、ｐ－メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ－メトキシフェニル）メチル、４－（４’－ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル、４，４’，４”－トリス（４，５－ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”－トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”－トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３－（イミダゾイル－１－イルメチル）ビス（４’，４”－ジメトキシフェニル）メチル、１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－１’－ピレニルメチルなどを挙げることができ、「カーバメート系保護基」としては、ｔ－ブトキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどを挙げることができ、「ベンジルエーテル系保護基」としては、ベンジル、メトキシベンジル、ニトロベンジル、ハロベンジル、フェニルベンジルなどを挙げることができ、「アルカノイル系保護基」としては、ホルミル、アセチル、ハロゲノ化アセチル、ピバロイル、ベンゾイルなどを挙げることができる。また、「アミノ基の保護基」としては、前述したものを挙げることができる。
　「複素芳香環基」とは、窒素原子、酸素原子または硫黄原子等のヘテロ原子を少なくとも１個有する５員環芳香族ヘテロシクリル基、６員環芳香族ヘテロシクリル基または縮合環芳香族ヘテロシクリル基をいう。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チエニル、フリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾール等の５員複素芳香環基；ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル等の６員複素芳香環基；インドリル、イソインドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル等の縮合環複素芳香環基を挙げることができる。好ましくは窒素原子を含む複素芳香環基であり、より好ましくはピリジルである。
　修飾すべき塩基は特に制限されない。例えば、本発明のアンチセンスオリゴ核酸の塩基長は７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であるので、元となるアンチセンスオリゴ核酸の塩基配列を決定した後、１つずつ塩基を修飾していき、肝毒性低減効果が優れる修飾塩基を決定してもよい。しかし、後記の実施例の通り、ＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれるチミン、グアニンまたはシトシンを修飾する場合に良好な肝毒性低減効果が見られる傾向があるので、これら配列に含まれる核酸残基の塩基を修飾することを一つの目安とすることができる。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、特に１つの核酸残基の塩基が修飾されていることにより、かかる修飾前のアンチセンスオリゴ核酸に比べて肝毒性が低減されている。例えば、肝毒性の指標となるＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）とＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）のアンチセンスオリゴ核酸投与後における血清濃度が、上記修飾前のアンチセンスオリゴ核酸を用いる以外は同様の条件で測定された血清濃度に対して、６０％以下または５０％以下であることが好ましく、４０％以下または２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがよりさらに好ましく、５％以下であることが特に好ましい。また、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の投与後のＡＳＴの血清濃度としては、１００ＩＵ／Ｌ以下が好ましく、４０ＩＵ／Ｌ以下がより好ましく、また、ＡＬＴの血清濃度としては１００ＩＵ／Ｌ以下が好ましく、４０ＩＵ／Ｌ以下がより好ましく、２０ＩＵ／Ｌ以下がよりさらに好ましい。
　本開示において、ＡＳＴおよびＡＬＴの血清濃度は、例えば、マウスまたはラットに１０ｍｇ／ｋｇ体重以上、３０ｍｇ／ｋｇ体重以下程度の所定投与量で、アンチセンスオリゴ核酸を静脈注射してから７０時間以上、１２０時間以下程度の所定時間経過後に採血し、遠心分離して得られた血清から測定すればよい。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、常法により製造することができる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴ核酸の塩基長は７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であることから、核酸の自動合成機を使って容易に製造することができる。
　本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、標的ｍＲＮＡに対する相補塩基配列を有することから、標的ｍＲＮＡの翻訳を強く阻害できることができる上に、上記の通り肝毒性が低減されている。よって、標的ｍＲＮＡが関与する疾患を予防または治療するための医薬として有用である。
　本発明のアンチセンスオリゴ核酸は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製できる。
　本発明のアンチセンスオリゴ核酸は、ヒト以外の動物およびヒトに投与することができる。その投与量は、患者の年齢、性別、体重、状態、疾患の種類、重篤度、予防的な使用であるか或いは治療的な使用であるかなどに応じて適宜調整すればよいが、例えば、成人のヒトに対する１回当たり及び体重１ｋｇ当たりの投与量として、０．０１μｇ以上、１００ｇ以下とすることができる。当該量としては、０．１μｇ以上または１．０μｇ以上が好ましく、１０μｇ以上または１００μｇ以上がより好ましく、１ｍｇ以上がよりさらに好ましく、また、１０ｇ以下または１．０ｇ以下が好ましく、１００ｍｇ以下または１０ｍｇ以下がより好ましく、５ｍｇ以下がよりさらに好ましい。また、投与回数としては、１ヶ月に１回から１日当たり３回以下程度の間で適宜調整すればよい。
　本願は、２０１７年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１７－３０４８９号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１７－３０４８９号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　実施例１：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　（１）　アンチセンスオリゴ核酸の選別と合成
　核酸医薬で問題となっている肝毒性の誘発機構としては、（ｉ）標的外遺伝子の発現抑制、（ｉｉ）自然免疫の活性化の他、（ｉｉｉ）核酸医薬に関係するタンパク質などの生体分子を介したシグナル経路が考えられる。上記機構（ｉ）および（ｉｉ）を回避し、上記機構（ｉｉｉ）の寄与により特に強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１０１を選択した。株式会社ジーンデザインに、表１に示す配列を有する＃１０１およびその誘導体である＃１０１－Ｃ２－７の合成を外注した。得られたアンチセンスオリゴ核酸の分子量をマススペクトルにより測定した。＃１０１の分子量の理論値は４５８９．７２、実測値は４６００．６１であり、＃１０１－Ｃ２－７の分子量の理論値は４６０５．７２、実測値は４６０２．２２であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記配列中、大文字は下記構造を有する２’，４’－架橋型核酸（ＬＮＡ）を示し、小文字はＤＮＡを示し、mＣ中の塩基は５－メチルシトシンであり、ζ中の塩基は５－ヒドロキシシトシンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　各アンチセンスオリゴ核酸を生理食塩水（大塚製薬社製）に溶解して２ｍｇ／ｍＬ溶液とし、実験に用いるまで－３０℃で凍結保存した。
　（２）　肝毒性試験
　５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌマウス（日本チャールス・リバー株式会社）を１週間検疫馴化した後、実験に用いた。当該マウスを任意に４匹ずつ３群に分け、生理食塩水（大塚製薬社製）または各アンチセンスオリゴ核酸溶液を１０ｍＬ／ｋｇ体重（アンチセンスオリゴ核酸の投与量として２０ｍｇ／ｋｇ体重）の投与量で尾静脈内に単回投与した。投与から４日目（９６時間後）に、マウスを２．０～４．０％のイソフルラン（ＤＳファーマアニマルヘルス社製）で吸入麻酔し、後大静脈腹部から可能な限り採血した。得られた血液を室温で２０～６０分静置後、１７００×ｇで５分間遠心分離して血清を得た。血液採取の際、血液量が分析に必要な量に達しない場合は注射用水を用いて希釈した後、分析に用いた。生化学自動分析装置（「ＪＣＡ－ＢＭ６０７０」日本電子社製）を用いて、得られた血清中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）とアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の濃度を測定した。なお、上記の動物実験の飼育と実験は、株式会社新日本科学の動物実験規定に準じ、株式会社新日本科学安全性研究所の動物実験施設内で行った。結果を図１に示す。図１中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図１に示す結果の通り、ＡＳＴとＡＬＴは肝機能障害の指標となる酵素であり、肝毒性が特に高い＃１０１によるこれら酵素の血清中濃度を、その中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで有意に低減することができた。
　実施例２：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに、上記肝毒性誘発機構（ｉｉｉ）の寄与により強い肝毒性を誘発する＃１２、＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１２の分子量の理論値は４６１４．７３、実測値は４６１４．２７であり、＃１２－Ｃ２－１０の分子量の理論値は４６３０．７３、実測値は４６２７．８６であり、＃９８の分子量の理論値は４６１３．７５、実測値は４６１２．７９であり、＃９８－Ｃ２－７の分子量の理論値は４６２９．７５、実測値は４６３１．１０であり、＃１４の分子量の理論値は４６０６．７１、実測値は４６０５．６６であり、＃１４－Ｃ２－６の分子量の理論値は４６２２．７１、実測値は４６１９．７２であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表２に、肝毒性の測定結果を図２に示す。図２中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　図２に示す結果の通り、肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃１２、＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。また、ＡＳＴとＡＬＴの血清中濃度は、肝毒性が特に高い＃１０１程ではないが、上記変異により数％まで低減された。
　実施例３：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　ＧＲ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｏｃｏｉｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）はステロイド受容体の一種であり、ステロイドホルモンであるヒドロコルチゾンに対する受容体として働く一方で、リガンド依存的に核内移行して転写因子としても働く。そこで、これを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１２（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表３に示す配列を有するＰｏｓｉ１２およびその誘導体であるＰｏｓｉ１２－Ｃ２－１１の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１２の分子量の理論値は４６１１．７１、実測値は４６１０．８１であり、Ｐｏｓｉ１２－Ｃ２－１１の分子量の理論値は４６２７．７１、実測値は４６２５．６５であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例１（２）と同様に、マウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図３（１）に示す。
　また、各アンチセンスオリゴ核酸によるＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。具体的には、上記肝毒性試験において採血した後、マウスを凍結安楽死させ、肝臓を摘出して重量を測定した。摘出した肝臓において肉眼的に異常のみられない部位から約１００ｍｇを試料として採取した。採取した試料の重量を測定後、液体窒素にて凍結させ、超低温フリーザーで保存した。凍結保存した肝臓試料を、氷冷下でホモジネーター（Ｓｈａｋｅ　Ｍａｓｔｅｒ　ａｕｔｏ，　Ｂｉｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）とＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて可能な限りホモジナイズし、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡのＵＶ吸収スペクトルを、Ｎａｎｏ　ＶｕｅあるいはＮａｎｏ　Ｖｕｅ　Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いて測定し，ＲＮＡ濃度とＯ．Ｄ．２６０／Ｏ．Ｄ．２８０比から純度を算出した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡについてＯｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＳＹＢＲ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７５００（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｊａｐａｎ　Ｌｔｄ）を用いて定量ＰＣＲを行い、生理食塩水投与群に対してアンチセンスオリゴ核酸投与群の標的遺伝子の発現比率を算出し、活性を評価した。結果を図３（２）に示す。
　図３（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで４０％に低減された。その一方で、図３（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例４：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表４に示す配列を有するＰｏｓｉ１４およびその誘導体であるＰｏｓｉ１４－Ｃ２－６の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１４の分子量の理論値は４６９１．７８、実測値は４６９１．１０であり、Ｐｏｓｉ１４－Ｃ２－６の分子量の理論値は４７０７．７８、実測値は４７０５．２４であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図４に示す。
　図４（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで７０％に低減され、その低減度は、異常測定値を除外すると１３％となった。その一方で、図４（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例５：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　ＰＣＳＫ９（Ｐｒｏ－ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ　Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｋｅｘｉｎ　９）はエンドプロテアーゼの一種であり、ＬＤＬのレセプターに結合して分解することによりＬＤＬの取り込み量を減らし、結果的に血中ＬＤＬ濃度を上昇させる。そこでマウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１５を選択し、株式会社ジーンデザインに、表５に示す配列を有するＰｏｓｉ１５およびその誘導体であるＰｏｓｉ１５－Ｃ２－４およびＰｏｓｉ１５－Ｃ２－１１の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１５の分子量の理論値は４５８６．７７、実測値は４５８６．７３であり、Ｐｏｓｉ１５－Ｃ２－４の分子量の理論値は４６０２．７７、実測値は４６００．６１であり、Ｐｏｓｉ１５－Ｃ２－１１の分子量の理論値は４６０２．７７、実測値は４６０２．０９であった。
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図５に示す。
　図５（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで４０％または６０％に低減され、その低減度は、異常測定値を除外すると３０％または４０％となった。その一方で、図５（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例６：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表６に示す配列を有するＰｏｓｉ１７およびその誘導体であるＰｏｓｉ１７－Ｃ２－１０の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１７の分子量の理論値は４３００．５４、実測値は４３００．９２であり、Ｐｏｓｉ１７－Ｃ２－１０の分子量の理論値は４３１６．５４、実測値は４３１４．４６であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図６に示す。図６中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図６（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで５０％に有意に低減された。その一方で、図６（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例７：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　Ｒｐｓ６ｋｂ２（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ６　ｋｉｎａｓｅ　ｂｅｔａ－２）は、リボソームタンパク質Ｓ６をリン酸化する酵素として同定されたセリン－スレオニンキナーゼであり、増殖因子やストレスなどの刺激により活性化され、細胞周期やタンパク質合成の調節をしている。これを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＮｏ．９７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表７に示す配列を有するＮｏ．９７およびその誘導体であるＮｏ．９７－Ｃ２－７、Ｎｏ．９７－Ｃ２－９およびＮｏ．９７－Ｃ２－１０の合成を外注した。Ｎｏ．９７の分子量の理論値は４１８２．４０、実測値は４１８３．０６であり、Ｎｏ．９７－Ｃ２－７の分子量の理論値は４１９８．４０、実測値は４１９７．５４であり、Ｎｏ．９７－Ｃ２－９の分子量の理論値は４１９８．４０、実測値は４１９６．６０であり、Ｎｏ．９７－Ｃ２－１０の分子量の理論値は４１９８．４０、実測値は４１９９．４０であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＲｐｓ６ｋｂ２の発現抑制活性を測定した。結果を図７に示す。図７中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図７（１）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで３３％、２０％または３５％に低減された。その一方で、図７（２）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更しても、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例８：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の誘導体として＃１０１－Ｔ６－５を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１０１－Ｔ６－５の分子量の理論値は４６０５．７８、実測値は４６０５．１０であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表８に、肝毒性の測定結果を図８に示す。図８中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　上記配列中、κ中の塩基は２－チオカルボニルチミンであり、κは以下の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　図８に示す結果の通り、肝毒性が非常に高いアンチセンスオリゴ核酸＃１０１の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２－チオカルボニルチミンに変換することにより、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を低減することができた。
　実施例９：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃９８－Ｔ６－５の分子量の理論値は４６２９．８１、実測値は４６３１．０５であり、＃１４－Ｔ６－４の分子量の理論値は４６２２．７７、実測値は４６２３．１１であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表９に、肝毒性の測定結果を図９に示す。図９中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちのチミンを２－チオカルボニルチミンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。
　実施例１０：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１２（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１０に示す配列を有するＰｏｓｉ１２およびその誘導体であるＰｏｓｉ１２－Ｔ６－４の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１２－Ｔ６－４の分子量の理論値は４６２７．７７、実測値は４６２９．０３であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１０に示す。図１０中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図１０（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２－チオカルボニルチミンに変更するのみで４０％に低減された。その一方で、図１０（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２－チオカルボニルチミンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例１１：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１１に示す配列を有するＰｏｓｉ１４およびその誘導体であるＰｏｓｉ１４－Ｔ６－４の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１４－Ｔ６－４の分子量の理論値は４７０７．８４、実測値は４７０８．３８であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１１に示す。図１１中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図１１（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２－チオカルボニルチミンに変更するのみで３％に低減された。その一方で、図１１（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２－チオカルボニルチミンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例１２：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１７（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１２に示す配列を有するＰｏｓｉ１７およびその誘導体であるＰｏｓｉ１７－Ｔ６－４の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１７－Ｔ６－４の分子量の理論値は４３１６．６０、実測値は４３１６．０８であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１２に示す。図１２中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図１２（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２－チオカルボニルチミンに変更するのみで６０％に低減された。その一方で、図１２（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２－チオカルボニルチミンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例１３：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の誘導体として＃１０１－Ｇ３－６を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１０１－Ｇ３－６の分子量の理論値は４６０４．７３、実測値は４６０５．４５であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１３に、肝毒性の測定結果を図１３に示す。図１３中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　上記配列中、λ中の塩基は８－アミノグアニンであり、λは以下の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　図１３に示す結果の通り、肝毒性が非常に高いアンチセンスオリゴ核酸＃１０１の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－アミノグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を低減することができた。
　実施例１４：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに＃１２、＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１２－Ｇ３－９の分子量の理論値は４６２９．７４、実測値は４６２８．１９であり、＃９８－Ｇ３－６の分子量の理論値は４６２８．７６、実測値は４６２８．９３であり、＃１４－Ｇ３－５の分子量の理論値は４６２１．７２、実測値は４６２１．３９であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１４に、肝毒性の測定結果を図１４に示す。図１４中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　図１４に示す結果の通り、肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃１２、＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－アミノグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。
　実施例１５：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１またはその誘導体である＃１０１－Ｇ４－６を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１０１－Ｇ４－６の分子量の理論値は４６６８．６１、実測値は４６７０．３１であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１５に、肝毒性の測定結果を図１５に示す。図１５中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　上記配列中、μ中の塩基は８－ブロモグアニンであり、μは以下の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　図１５に示す結果の通り、肝毒性が非常に高いアンチセンスオリゴ核酸＃１０１の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を低減することができた。
　実施例１６：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに＃１２、＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１２－Ｇ４－９の分子量の理論値は４６９３．６２、実測値は４６９２．５０であり、＃９８－Ｇ４－６の分子量の理論値は４６９２．６４、実測値は４６９３．４５であり、＃１４－Ｇ４－５の分子量の理論値は４６８５．６０、実測値は４６８３．８６であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１６に、肝毒性の測定結果を図１６に示す。図１６中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　図１６に示す結果の通り、肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃１２、＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。
　実施例１７：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４－３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１７に示す配列を有するＰｏｓｉ１４およびその誘導体であるＰｏｓｉ１４－Ｇ４－１０の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１４－Ｇ４－１０の分子量の理論値は４７７０．６７、実測値は４７７１．４６であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１７に示す。図１７中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図１７（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更するのみで３０％に低減された。その一方で、図１７（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例１８：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１５を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１８に示す配列を有するＰｏｓｉ１５およびその誘導体であるＰｏｓｉ１５－Ｇ４－８の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１５－Ｇ４－８の分子量の理論値は４６６５．６６、実測値は４６６６．０１であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１８に示す。図１８中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図１８（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更した場合にはＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はやや低下したが、図１８（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５による肝毒性は１％まで有意に低減された。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性をそれほど低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例１９：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１９に示す配列を有するＰｏｓｉ１７およびその誘導体であるＰｏｓｉ１７－Ｇ４－３、Ｐｏｓｉ１７－Ｇ４－５およびＰｏｓｉ１７－Ｇ４－８の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１７－Ｇ４－３の分子量の理論値は４３７９．４３、実測値は４３７８．５４であり、Ｐｏｓｉ１７－Ｇ４－５の分子量の理論値は４３７９．４３、実測値は４３７７．２５であり、Ｐｏｓｉ１７－Ｇ４－８の分子量の理論値は４３７９．４３、実測値は４３７８．３４であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１９に示す。図１９中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図１９（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更するのみで、３％、９％または２０％まで有意に低減された。Ｐｏｓｉ１７－Ｇ４－８による肝毒性低減効果は、異常測定値を除外すると３％にまで低下した。その一方で、図１９（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例２０：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＲｐｓ６ｋｂ２を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＮｏ．９７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２０に示す配列を有するＮｏ．９７およびその誘導体であるＮｏ．９７－Ｇ４－８の合成を外注した。Ｎｏ．９７－Ｇ４－８の分子量の理論値は４２６１．２９、実測値は４２６１．１１であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＲｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図２０に示す。図２０中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
　図２０（１）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更するのみで９％まで有意に低減された。その一方で、図２０（２）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－ブロモグアニンに変更しても、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例２１：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　上記実施例５において、Ｐｏｓｉ１５の誘導体であるＰｏｓｉ１５－Ｇ６－８を用いた以外は同様にして肝毒性と活性を評価した。Ｐｏｓｉ１５－Ｇ６－８の分子量の理論値は４６８５．９０、実測値は４６８３．０３であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表２１に、肝毒性の測定結果を図２１に示す。図２１中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　上記配列中、α中の塩基は７－フェニルエチニルグアニンであり、αは以下の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　図２１（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７－フェニルエチニルグアニンに変更するのみで、異常測定値を除いて５％まで有意に低減された。その一方で、図２１（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７－フェニルエチニルグアニンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例２２：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＲｐｓ６ｋｂ２およびマウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＮｏ．９７とＰｏｓｉ１４をそれぞれ選択し、株式会社ジーンデザインに、表２２に示す配列を有するＮｏ．９７、Ｐｏｓｉ１４、および中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－アミノグアニンに変更した誘導体の合成を外注した。また、マウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１５とＰｏｓｉ１７をそれぞれ選択し、株式会社ジーンデザインに、表２２に示す配列を有するＰｏｓｉ１５、Ｐｏｓｉ１７、および中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－アミノグアニンに変更した誘導体の合成を外注した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度と、マウスＲｐｓ６ｋｂ２遺伝子、マウスＧＲ遺伝子またはマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図２２～２５に示す。
　図２２～２５の（１）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７、Ｐｏｓｉ１４、Ｐｏｓｉ１５およびＰｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－アミノグアニンに変更するのみで明らかに低減された。その一方で、図２２～２５の（２）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７、Ｐｏｓｉ１４、Ｐｏｓｉ１５およびＰｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８－アミノグアニンに変更しても、マウスＲｐｓ６ｋｂ２遺伝子、マウスＧＲ遺伝子およびマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性は一部を除いてほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例２３：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１２を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２３に示す配列を有する＃１２と、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを以下に構造を示す７－置換グアニンに変更した誘導体の合成を外注した。なお、７－置換グアノシン誘導体の導入に用いた化合物は新規であるので、その合成方法は後記する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図２６に示す。図２６に示す結果の通り、＃１２による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンの第７位に置換基を導入するのみで、有効に低減された。
　実施例２４：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
　マウスＧＲおよびマウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４とＰｏｓｉ１５をそれぞれ選択し、株式会社ジーンデザインに、表２４に示す配列を有するＰｏｓｉ１４、Ｐｏｓｉ１５、および中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７－置換グアニンに変更した誘導体の合成を外注した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度と、マウスＧＲ遺伝子またはマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図２７，２８に示す。
　図２７，２８の（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４およびＰｏｓｉ１５による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７－置換グアニンに変更するのみで明らかに低減された。その一方で、図２７，２８の（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４およびＰｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７－置換グアニンに変更しても、マウスＧＲ遺伝子およびマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。
　実施例２５：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１０１を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２５に示す配列を有する＃１０１と、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５－ヒドロキシシトシンに変更した誘導体の合成を外注した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図２９に示す。図２９に示す結果の通り、＃１０１による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンの５－ヒドロキシシトシンに変更するのみで、有効に低減された。
　実施例２６：　アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
　強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１０１を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２６に示す配列を有する＃１０１と、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１～３つの塩基を５－ヒドロキシシトシン（ζ）、２－チオカルボニルチミン（κ）または８－ブロモグアニン（μ）に変更した誘導体の合成を外注した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図３０に示す。図３０に示す結果の通り、＃１０１による肝毒性は、中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの１つの塩基を誘導体に変更するのみで有効に低減され、同中間部分における非２’，４’－架橋型核酸残基のうちの２以上の塩基を誘導体に変更すると、肝毒性の減弱効果はより一層高まることが実証された。
　実施例２７：　７－デアザ－７－ヨードグアノシン誘導体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　（１）　化合物２の合成
　化合物１は、Ｆ．Ｓｅｅｌａら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００４，８，１２０３－１２１０およびＭ．Ｍａｃｋｏｖａら，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１５，１６，２２２５－２２３６に従って合成した。
　テトラメチルグアニジン（４．３ｍＬ，３５ｍｍｏｌ）およびピリジン－２－アルドキシム（４．３ｇ，３５ｍｍｏｌ）を化合物１（５．１ｇ，７．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／１，４－ｄｉｏｘａｎｅ混合溶液（１７０ｍＬ，ＤＭＦ：１，４－ｄｉｏｘａｎｅ＝１：１）に加え、窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。酢酸エチルで希釈し、１規定塩酸水溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をメタノールで洗浄し、白色固体である化合物２（４．９ｇ）を得た。
1Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δＨ：１．２２（９Ｈ，ｓ），２．３８（３Ｈ，ｓ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．６４（１Ｈ，ｍ），２．９１（１Ｈ，ｍ），４．４５－４．６２（３Ｈ，ｍ），５．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１，５．５Ｈｚ），７．３４－７．４１（５Ｈ，ｍ），７．８８－７．９４（４Ｈ，ｍ），１０．９６（１Ｈ，ｓ），１１．９５（１Ｈ，ｓ）
　（２）　化合物３の合成
　氷冷下において１規定ナトリウムメトキシド（１２．４ｍＬ，１２．４ｍｍｏｌ）を化合物２（４．５ｇ，６．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／メタノール混合溶液（１５１．５ｍＬ，ＴＨＦ：メタノール＝１５０：１．５）に加え、窒素雰囲気下、氷冷下１５分攪拌した。氷冷下において酢酸（０．８ｍＬ）を加え濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製し、白色固体である化合物３（３．０ｇ）を得た。
1Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δＨ：１．２３（９Ｈ，ｓ），２．０９（１Ｈ，ｍ），２．３６（１Ｈ，ｍ），３．５０（２Ｈ，ｍ），３．７６（１Ｈ，ｓ），４．２９（１Ｈ，ｓ），４．９３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），６．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．１，５．５Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｓ），１０．９７（１Ｈ，ｓ），１１．９０（１Ｈ，ｓ）
　（３）　化合物４の合成
　ジメトキシトリチルクロリド（０．８ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を化合物３（１．０ｇ，２．２ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１５ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、一晩攪拌した。メタノールを加え１時間攪拌した後、クロロホルムで希釈し、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝９４／５／１）で精製し、白色固体である化合物４（１．３ｇ）を得た。
1Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δＨ：１．２０（９Ｈ，ｓ），２．１５（１Ｈ，ｍ），２．４０（１Ｈ，ｍ），３．０４（１Ｈ，ｍ），３．１３（１Ｈ，ｍ），３．７０（６Ｈ，ｓ），３．８６（１Ｈ，ｍ），４．２７（１Ｈ，ｍ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．４３（１Ｈ，ｍ），６．８１－６．８４（４Ｈ，ｍ），７．１５－７．３５（１０Ｈ，ｍ），１０．９４（１Ｈ，ｓ），１１．９０（１Ｈ，ｓ）
　（４）　化合物５の合成
　２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．２７ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）をジイソプロピルエチルアミン（０．２８ｍＬ，１．７ｍｍｏｌ）と化合物４（０．５ｇ，０．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．４ｇ）を得た。
31Ｐ　ＮＭＲ（１２２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．５３，１４８．９１
　実施例２８：　７－デアザ－７－（２－フェニルエチニル）グアノシン誘導体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　（１）　化合物６の合成
　ヨウ化銅（６ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０９ｍＬ，０．６ｍｍｏｌ）、エチニルベンゼン（０．０４ｍＬ，０．４ｍｍｏｌ）および化合物４（０．２ｇ，０．３ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液（５ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３５ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で２時間攪拌した。反応液をセライト濾過した後、濃縮し残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トリエチルアミン＝９８：２）で精製し、標題化合物（０．１５ｇ）を得た。
1Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＨ：１．３０（９Ｈ，ｓ），１．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），２．４２（２Ｈ，ｍ），３．２８（１Ｈ，ｍ），３．４０（１Ｈ，ｍ），３．７３（６Ｈ，ｓ），４．０３（１Ｈ，ｍ），４．５５（１Ｈ，ｍ），６．４４（１Ｈ，ｍ），６．８１－６．８４（４Ｈ，ｍ），７．１３（１Ｈ，ｓ），７．１７－７．３３（１０Ｈ，ｍ），７．４１－７．４３（２Ｈ，ｍ），７．５０－７．５４（２Ｈ，ｍ），７．９１（１Ｈ，ｓ），１１．６９（１Ｈ，ｓ）
　（２）　化合物７の合成
　２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１６ｍＬ，０．７ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミン（０．１５ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）および化合物６（０．４ｇ，０．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．４ｇ）を得た。
31Ｐ　ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．７０，１４８．９７
　実施例２９：　７－デアザ－７－［２－（４－ピリジル）エチニル］グアノシン誘導体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
  
　（１）　化合物８の合成
　ヨウ化銅（２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０４ｍＬ，０．３ｍｍｏｌ）、ｐ－エチニルピリジン（２０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）および化合物４（０．１ｇ，０．１ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液（２．５ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で１時間攪拌した。反応液をセライト濾過した後、濃縮し残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／トリエチルアミン＝９８／２）で精製し、淡黄色固体である標題化合物（０．０８ｇ）を得た。
1Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＨ：１．３１（９Ｈ，ｓ），２．２１（１Ｈ，ｍ），２．４３（２Ｈ，ｍ），３．３０（１Ｈ，ｍ），３．４０（１Ｈ，ｍ），３．７３（６Ｈ，ｓ），４．０６（１Ｈ，ｍ），４．５７（１Ｈ，ｂｒｓ），６．４１（１Ｈ，ｔｒ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），６．８０－６．８３（４Ｈ，ｍ），７．２８－７．４３（１０Ｈ，ｍ），７．１７－７．２２（２Ｈ，ｍ），８．１４（１Ｈ，ｓ），８．５３－８．５５（２Ｈ，ｍ），１１．７８（１Ｈ，ｓ）
　（２）　化合物９の合成
　２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１５ｍＬ，０．７ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍＬ，１．７ｍｍｏｌ）および化合物８（０．５ｇ，０．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．５ｇ）を得た。
31Ｐ　ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．６４，１４９．０７
　実施例３０：　７－デアザ－７－［２－（アセトキシメチル）エチニル］グアノシン誘導体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　（１）　化合物１０の合成
　ヨウ化銅（４ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０９ｍＬ，０．７ｍｍｏｌ）、１－アセトキシ－２－プロピン（２０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）および化合物４（０．１ｇ，０．１ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液（２．５ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で１時間攪拌した。反応液をセライト濾過した後、濃縮し残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝９８／１／１）にて精製後、アミノシリカゲルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝９８／１／１）にて再精製し、淡黄色固体である標題化合物（０．０８ｇ）を得た。
1Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＨ：１．２８（９Ｈ，ｓ），２．０８（３Ｈ，ｓ），２．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），２．３７（２Ｈ，ｍ），３．２４（１Ｈ，ｍ），３．３７（１Ｈ，ｍ），３．７７（６Ｈ，ｓ），４．０１（１Ｈ，ｍ），４．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．９１（２Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｍ），６．８０－６．８３（４Ｈ，ｍ），７．０７（１Ｈ，ｓ），７．８１－７．４１（９Ｈ，ｍ），８．０３（１Ｈ，ｓ），１１．７３（１Ｈ，ｓ）
　（２）　化合物１１の合成
　２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１ｍＬ，０．４ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ，１．０ｍｍｏｌ）および化合物１０（０．３ｇ，０．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．３ｇ）を得た。
31Ｐ　ＮＭＲ（１２２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．７２，１４９．０４

Claims (7)

  1. 　塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、
    　両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’－架橋型核酸であり、
    　上記両末端の間に非２’，４’－架橋型の核酸残基を有し、
    　上記非２’，４’－架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とするアンチセンスオリゴ核酸。
  2. 　塩基が修飾されている上記非２’，４’－架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる請求項１に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
  3. 　上記の修飾されている塩基が、５－ヒドロキシシトシン、４－アセチルシトシン、３－Ｃ1-6アルキルシトシン、５－Ｃ1-6アルキルシトシン、２－チオシトシン、２－チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン、２－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、８－アミノグアニン、８－ハロゲノグアニン、７－デアザ－７－（２－フェニルエチニル）グアニン、７－デアザ－７－（２－ピリジルエチニル）グアニン、７－デアザ－７－［２－（Ｃ1-7アルカノイルオキシ－Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、７－デアザ－７－［２－（ヒドロキシ－Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、１－Ｃ1-6アルキルグアニン、２，２－ジ（Ｃ1-6アルキル）グアニン、２－Ｃ1-6アルキルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ1-6アルキルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ2-6アルケニルグアニン、７－デアザ－７－Ｃ2-6アルキニルグアニン、７－デアザ－７－ハロゲノグアニン、イノシン、１－Ｃ1-6アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ－ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ－マンノシルキュェオシン、Ｎ6－Ｃ2-6アルケニルアデニン、１－Ｃ1-6アルキルアデニン、２－Ｃ1-6アルキルアデニン、Ｎ6－Ｃ1-6アルキルアデニンまたは２－Ｃ1-6アルキルチオ－Ｎ6－Ｃ2-6アルケニルアデニンである請求項１に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
  4. 　上記非２’，４’－架橋型の核酸残基がＤＮＡである請求項１～３のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
  5. 　上記２’，４’－架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する請求項１～４のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ［式中、
    　Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ3）基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基または－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ4）－基を示し（Ｒ3およびＲ4は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）、
    　Ｘ2は、下記式（ＩＶ）～（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、Ｒ5～Ｒ18は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-10シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２－シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
    　Ｘ3は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ19）基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基または－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ20）－基を示し（Ｒ19およびＲ20は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）
    　Ｙ1～Ｙ3は、独立してＯ-またはＳ-を示し、
    　Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
    　Ｒ1とＲ2は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基を示すか、または、Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ1-4アルキレン基を形成してもよく、
    　ｎは０以上２以下の整数を示す］
  6. 　上記２’，４’－架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ1がＯであり且つｎが１である請求項５に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
  7. 　核酸残基の塩基への上記修飾の導入前に比して肝毒性が低減されている請求項１～６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
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