TW202345861A - 經修飾之間隔體寡聚物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明包括反義寡核苷酸(ASO)，包括間隔體ASO；以及其製備及使用方法。

Description

經修飾之間隔體寡聚物及其使用方法
以下論述係為了幫助讀者理解本揭示內容而提供且不承認描述或構成其先前技術。
全世界約3億人存在HBV慢性感染。HBsAg消失，「功能性治癒」之關鍵範疇，係多種新療法之目標。已證明反義寡核苷酸在減少動物模型中之HBsAg方面為有效模式，且正使用此等分子進行臨床研究。
然而，用反義寡核苷酸治療HBV仍受擾於例如核酸酶降解及肝毒性。因此，此項技術中需要發現對核酸酶降解具有較大抗性且具有改良之肝臟安全概況的反義寡核苷酸。
本發明係關於含有寡核苷酸之化合物及組合物及其用於預防或治療疾病及病狀(例如B型肝炎(HBV))之用途。
在一範疇中，本發明提供一種反義寡核苷酸(ASO)，其包含14至22個核苷酸單元及： (a)中心區域(B')，其包含6個或更多個鄰接DNA核苷酸； (b) 5'-翼區(A')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷；以及 (c) 3'-翼區(C')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷； 其中該ASO之該中心區域與目標RNA序列至少80%互補或雜交；且其中該ASO包含至少一個經修飾之核苷酸，其選自： (N-三級丁基-胍(Gutb))，其中B為核鹼基， (N甲基-LNA (Nmln))，其中B為核鹼基， (G形夾)，及 (5(Me)-丙炔基(5prnl))。
在另一範疇中，本發明提供反義寡核苷酸(ASO)，其包含14至22個核苷酸單元以及：(a)包含6個或更多個鄰接DNA核苷酸的中心區域(B')，其中至少一個鄰接DNA核苷酸為選自Gutb、Nmln、G形夾及5prnl的經修飾之核苷酸； (b) 5'-翼區(A')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷；以及 (c) 3'-翼區(C')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷； 其中該ASO之該中心區域與目標RNA序列至少80%互補或雜交。
在另一範疇中，本發明提供反義寡核苷酸(ASO)，其包含14至22個核苷酸單元以及：(a)中心區域(B')，其包含6個或更多個鄰接DNA核苷酸；(b) 5'-翼區(A')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷；及(c) 3'-翼區(C')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷；其中該ASO之中心區域與目標RNA序列至少80%互補或雜交；且其中(i)中心區域(B')包含選自G形夾及5prnld的經修飾之核苷酸，(ii) 5'-翼區(A')包含選自Gutb及Nmln的經修飾之核苷酸，(iii) 3'-翼區(C')包含選自Gutb及Nmln的經修飾之核苷酸，或(iv)其任何組合。
在一些實施例中，中心區域(B')包含2、3、4、5或6個或更多個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'-翼區(A')、3'-翼區(C')或兩者均包含選自Gutb、Nmln、G形夾及5prnl的經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，ASO分子進一步包含1或多個硫代磷酸酯(ps)核苷間鍵聯、甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯或其組合。
在一些實施例中，ASO分子進一步包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個硫代磷酸酯(ps)核苷間鍵聯、甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯或其組合。
在另一範疇中，本發明提供包含14至22個核苷酸單元的反義寡核苷酸(ASO)，其中該ASO包含： (a)中心區域(B')，其包含6個或更多個鄰接DNA核苷酸，其中至少一個鄰接DNA核苷酸為經修飾之核苷酸， (b) 5'-翼區(A')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷，以及 (c) 3'-翼區(C')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷， 其中該ASO之該中心區域與目標RNA序列至少80%互補或雜交，且其中該ASO包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯。
在一些實施例中，ASO包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個或至少5個或更多個核苷酸，該等核苷酸選自： (N-三級丁基-胍(Gutb))，其中B為核鹼基， (N甲基-LNA (Nmln))，其中B為核鹼基， (G形夾)，及 (5(Me)-丙炔基(5prnl))。
在一些實施例中，ASO分子進一步包含1或多個硫代磷酸酯(ps)核苷間鍵聯。
在任一前述範疇之一些實施例中，(i)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於ASO分子5'端之核苷位置3與4之間；(ii)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於ASO分子5'端之核苷位置5與6之間；(iii)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於ASO分子5'端之核苷位置6與7之間；(iv)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於ASO分子5'端之核苷位置7與8之間；(v)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於ASO分子5'端之核苷位置8與9之間；(vi)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於ASO分子5'端之核苷位置9與10之間；或(vii)其組合。
在任一前述範疇之一些實施例中，5'-翼區(A')、3'-翼區(C')或兩者均包含至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯。
在任一前述範疇之一些實施例中，ASO分子進一步包含半乳胺糖。在一些實施例中，該半乳胺糖為式(VI)之N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)：
，其中 m為1、2、3、4或5； 各n獨立地為1或2； p為0或1； 各R獨立地為H； 各Y獨立地選自-O-P(=O)(SH)-、-O-P(=O)(O)-、-O-P(=O)(OH)-及-O-P(S)S-； Z為H或第二保護基； L為連接子，或L與Y之組合為連接子；且 A為H、OH、第三保護基、活化基團或寡核苷酸。
在一些實施例中，該半乳胺糖為式(VII)之N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)： ，其中R z為OH或SH；且各n獨立地為1或2。
在任一前述範疇之一些實施例中，(i)目標RNA序列為病毒基因；(ii)目標RNA序列為來自DNA病毒之基因；(iii)目標RNA序列為來自雙股DNA (dsDNA)病毒之基因；(iv)目標RNA序列為來自嗜肝DNA病毒之基因；(v)目標RNA序列為來自B型肝炎病毒(HBV)之基因；(vi)目標RNA序列為來自基因型A至J中之任一者之HBV的基因；或(vii)目標RNA序列係選自HBV之S基因或X基因。
在任一前述範疇之一些實施例中，目標RNA序列係選自編碼甲基化可控J蛋白(MCJ蛋白)之基因、編碼TAZ之基因、編碼血管生成素樣3 (ANGPTL3)之基因、編碼二醯基甘油醯基轉移酶2 (DGAT2)之基因及編碼羥基類固醇17-β去氫酶13 (HSD17B13)之基因。
在任一前述範疇之一些實施例中，(i)該ASO之5'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接的鎖定核苷；(ii)該ASO之3'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接的鎖定核苷；或(iii)其組合。在一些實施例中，鎖定核苷係選自LNA、scpBNA、AmNA、AmNA (N-Me)、GuNA、GuNA (N-R 11)，其中R 11係選自Me、Et、 i-Pr、 t-Bu及其組合。
在任一前述範疇之一些實施例中，ASO中心區域包含至少5個經硫代磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸、至少5個經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸，或至少5個經一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵聯及一個或多個甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯連接的鄰接DNA核苷酸。
在任一前述範疇之一些實施例中，ASO中心區域包含8至10個經硫代磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸、8至10個經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸，或8至10個經一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵聯及一個或多個甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯連接的DNA核苷酸。
在任一前述範疇之一些實施例中，ASO包含至少一個具有以下結構的經修飾之核苷酸 (「(2s)T」)、 (「(5OH)C」)、 (「(8nh)A」)、 (「(8nh)G」)，或 ， 其中： R為鹵素或R'-C≡C-；且 R'為C 6-12芳基、5至12員雜芳基、羥基-C 1-6烷基或C 1-7烷醯基氧基。
在任一前述範疇之一些實施例中，ASO包含至少一個具有以下結構的經修飾之核苷酸： 其中： W獨立地為O、N或S； R 1、R 2及R 5獨立地為H或D； R 3為H或F； R 4為F或OCH 3；且 鹼基為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 其中： R為鹵素或R'-C≡C-；且 R'表示C 6-12芳基、5員至12員雜芳基、羥基-C 1-6烷基，或C 1-7烷醯基氧基。
在另一範疇中，本發明提供如表1中所示的ASO分子。
在另一範疇中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含如本文所揭示(例如任一前述範疇或實施例)之ASO分子；以及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種如本文所揭示之ASO分子。
在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含另一種治療劑。在一些實施例中，另一種治療劑係選自核苷酸類似物、核苷類似物、衣殼組裝調節劑(CAM)、重組干擾素、進入抑制劑、小分子免疫調節劑及寡核苷酸療法，其中該寡核苷酸療法視情況選自另一種反義寡核苷酸(ASO)、短干擾核酸(siNA)、NAP或STOPS TM。
在另一範疇中，本發明提供治療患有B型肝炎病毒(HBV)感染之個體的方法，其包含向患有HBV之該個體投與如本文所揭示(例如任一前述範疇或實施例)的ASO或醫藥組合物。
在一些實施例中，方法可進一步包含投與另一種治療劑。在一些實施例中，另一種治療劑係選自核苷酸類似物、核苷類似物、衣殼組裝調節劑(CAM)、重組干擾素、進入抑制劑、小分子免疫調節劑及寡核苷酸療法，其中該寡核苷酸療法視情況選自另一種反義寡核苷酸(ASO)、短干擾核酸(siNA)、NAP或STOPS TM。在一些實施例中，另一種治療劑選自由以下組成之群：包括ALG-010133、ALG-000184、重組干擾素α2b、IFN-a、PEG-IFN-a-2a、拉米夫定(lamivudine)、替比夫定(telbivudine)、阿德福韋雙匹酯(adefovir dipivoxil)、克來夫定(clevudine)、因提弗(entecavir)、替諾福韋阿拉芬胺(tenofovir alafenamide)、替諾福韋雙索酯(tenofovir disoproxil)、NVR3-778、BAY41-4109、JNJ-632、JNJ-3989 (ARO-HBV)、RG6004、GSK3228836、REP-2139、REP-2165、AB-729、VIR-2218、DCR-HBVS、JNJ-6379、GLS4、ABI-HO731、JNJ-440、NZ-4、RG7907、EDP-514、AB-423、AB-506、ABI-H03733及ABI-H2158。
在一些實施例中，療法包含降低個體的HBV病毒負荷、降低個體的病毒抗原水平，或其組合。
在另一範疇中，本發明提供減少個體中之目標基因表現的方法，其包含投與如本文所揭示的ASO或醫藥組合物。在一些實施例中，目標基因為個體內源的基因或目標基因對於個體而言不為內源的。在一些實施例中，個體所患疾病選自B型肝炎病毒(HBV)、冠狀病毒感染及肝臟疾病，其中肝臟疾病視情況選自非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)及肝細胞癌(HCC)。
在所揭示之方法的一些實施例中，個體為哺乳動物，視情況為成人。
在所揭示之方法的一些實施例中，ASO係以至少1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg或15 mg/kg之劑量投與。
在所揭示之方法的一些實施例中，ASO係以0.5 mg/kg至50 mg/kg、0.5 mg/kg至40 mg/kg、0.5 mg/kg至30 mg/kg、1 mg/kg至50 mg/kg、1 mg/kg至40 mg/kg、1 mg/kg至30 mg/kg、1 mg/kg至20 mg/kg、3 mg/kg至50 mg/kg、3 mg/kg至40 mg/kg、3 mg/kg至30 mg/kg、3 mg/kg至20 mg/kg、3 mg/kg至15 mg/kg、3 mg/kg至10 mg/kg、4 mg/kg至50 mg/kg、4 mg/kg至40 mg/kg、4 mg/kg至30 mg/kg、4 mg/kg至20 mg/kg、4 mg/kg至15 mg/kg、4 mg/kg至10 mg/kg、5 mg/kg至50 mg/kg、5 mg/kg至40 mg/kg、5 mg/kg至30 mg/kg、5 mg/kg至20 mg/kg、5 mg/kg至15 mg/kg或5 mg/kg至10 mg/kg之劑量投與。
在所揭示之方法的一些實施例中，ASO係投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
在所揭示之方法的一些實施例中，ASO係一天投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，一週投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或一個月投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
在所揭示之方法的一些實施例中，ASO係每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天投與至少一次。
在所揭示之方法的一些實施例中，ASO係投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、51、52、53、54或55週的時段。
前述一般描述及以下詳細描述為例示性及解釋性的，且意欲提供如所主張之本發明之進一步解釋。根據本發明之以下圖式簡單說明及實施方式，其他目標、優勢及新穎特徵對於熟習此項技術者將顯而易見。
相關申請案之交叉參考
本申請案依據35 U.S.C. §119主張2022年3月17日所提申之臨時申請案第63/321,019號的優先權，該臨時申請案的揭示內容以引用的方式併入本文中。
本發明係關於經修飾之反義寡核苷酸及經修飾之反義寡核苷酸的醫藥組合物。本發明亦關於使用及製備反義寡核苷酸及醫藥組合物之方法。
反義寡核苷酸(ASO)
本發明化合物包括經修飾之反義寡核苷酸(ASO)。在一些實施例中，ASO包含14至22個核苷酸單元，例如14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸單元。在一些實施例中，ASO為間隔體，其包含三個區域：5'-翼區(A')，其包含經修飾之核苷酸；中心區域(B')，其包含與翼區不同類型之核苷酸，例如能夠誘導RNA酶H裂解之核苷酸；及3'-翼區(C')，其包含經修飾之核苷酸。
所揭示之ASO包含(i)經修飾之核苷酸,諸如Gutb、Nmln、5prnl、G形夾或其組合；(ii)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯(當R a為甲基時，在序列中稱為「yp」)；或(iii)其組合。Gutb、Nmln、5prnl及G形夾之結構顯示於下文，且甲磺醯基胺基磷酸酯連接子之結構為： ；其中R a為C 1-C 6烷基、C 6-12芳基或5員至12員雜芳基。
在一些實施例中，甲磺醯基胺基磷酸酯連接子之結構為： (yp)。
舉例而言，5'-翼區及3'-翼區各自可獨立地包含2至6個核苷酸，例如2、3、4、5或6個核苷酸。此等核苷酸中之一或多者可經修飾(例如，1、2、3、4、5或6個核苷酸經修飾)。至少一個經修飾之核苷酸可包含以下結構： (N-三級丁基-胍(Gutb))或 (N甲基-LNA (Nmln))， 其中B為核鹼基。另外或替代地，至少一個經修飾之核苷酸可包含以下結構： (G形夾)或 (5(Me)-丙炔基(5prnl))。因此，5'-翼區及3'-翼區各自可獨立地包含Gutb、Nmln或兩者中之一或多者。類似地，5'-翼區及3'-翼區各自可獨立地包含G形夾、5prnl或兩者中之一或多者；然而，G形夾及5prnl亦適於納入中心區域中。舉例而言，在一些實施例中，(i)中心區域(B')包含選自G形夾及5prnl的經修飾之核苷酸，(ii) 5'-翼區(A')包含選自Gutb及Nmln的經修飾之核苷酸，(iii) 3'-翼區(C')包含選自Gutb及Nmln的經修飾之核苷酸，或(iv)其任何組合。
另外或可替代地，中心區域可包含1、2、3、4、5個或更多個經磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯(「ps」)核苷間鍵聯連接的鄰接DNA核苷。在其他實施例中，中心區域包括一個或多個經修飾之核苷酸、甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯或其組合。另外，中心區域可包括一個或多個經修飾之核苷酸，其中中心區域能夠誘導RNA酶H裂解。在一些實施例中，中心區域包括一個或多個具有經修飾之核鹼基的經修飾之核苷酸。在一些實施例中，中心區域包含6、7、8、9、10或11個鄰接DNA核苷。在一些實施例中，中心區域中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個DNA核苷經修飾。至少一個經修飾之核苷酸可包含以下結構： (N-三級丁基-胍(Gutb))或 (N甲基-LNA (Nmln))， 其中B為核鹼基。另外或替代地，至少一個經修飾之核苷酸可包含以下結構： (G形夾)或 (5(Me)-丙炔基(5prnl))。
出於本發明之目的，所揭示之ASO可包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個或至少5個或更多個Gutb、Nmln、5prnl、G形夾或其組合。Gutb、Nmln、5prnl、G形夾或其組合可併入中心區域、翼區或兩者中。一般而言，經修飾之鎖定核苷酸(Gutb及Nmln)適於納入翼區中，而5prnl及G形夾適於納入整個ASO中或特定地納入中心區域中。另外或可替代地，所揭示之ASO可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯。
在一些態樣中，本發明之間隔體ASO化合物包括式(I)化合物： A'— B'— C'， 其中A'及C'各自獨立地包含2至6個核苷酸，其中一者或多者為經修飾之核苷酸，B'包含6個或更多個經磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接的鄰接DNA核苷。在一些實施例中，B'包含一或多個經修飾之DNA核苷。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係選自鎖定核苷或2'位經取代之核苷。在一些實施例中，經修飾之DNA核苷係選自鎖定核苷或2'位經取代之核苷。
A'、B'及C'中之核苷酸及/或核苷數目可選自以下群組(A':B':C')：(2:10:2)、(2:10:3)、(2:10:4)、(2:10:5)、(3:10:2)、(3:10:3)、(3:10:4)、(3:10:5)、(4:10:2)、(4:10:3)、(4:10:4)、(4:10:5)、(5:10:2)、(5:10:3)、(5:10:4)、(5:10:5)、(2:9:2)、(2:9:3)、(2:9:4)、(2:9:5)、(3:9:2)、(3:9:3)、(3:9:4)、(3:9:5)、(4:9:2)、(4:9:3)、(4:9:4)、(4:9:5)、(5:9:2)、(5:9:3)、(5:9:4)、(5:9:5)、(2:8:2)、(2:8:3)、(2:8:4)、(2:8:5)、(3:8:2)、(3:8:3)、(3:8:4)、(3:8:5)、(4:8:2)、(4:8:3)、(4:8:4)、(4:8:5)、(5:8:2)、(5:8:3)、(5:8:4)、(5:8:5)、(2:7:2)、(2:7:3)、(2:7:4)、(2:7:5)、(3:7:2)、(3:7:3)、(3:7:4)、(3:7:5)、(4:7:2)、(4:7:3)、(4:7:4)、(4:7:5)、(5:7:2)、(5:7:3)、(5:7:4)、(5:7:5)、(2:6:2)、(2:6:3)、(2:6:4)、(2:6:5)、(3:6:2)、(3:6:3)、(3:6:4)、(3:6:5)、(4:6:2)、(4:6:3)、(4:6:4)、(4:6:5)、(5:6:2)、(5:6:3)、(5:6:4)及(5:6:5)。
在一些實施例中，5'-翼區包含一個或多個鎖定核苷或2'位經取代之核苷。在一些實施例中，3'-翼區包含一個或多個鎖定核苷或2'位經取代之核苷。在一些實施例中，中心區域包含一個或多個鎖定核苷或2'位經取代之核苷。在一些實施例中，5'-翼區、3'-翼區、中心區域或其組合包含一個或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個)鎖定核苷或2'位經取代之核苷。鎖定核苷可在糖之4'與2'位之間含有橋，其中該橋包含2至4個視情況經取代之原子。舉例而言，LNA核苷為： 。其他例示性鎖定核苷包括以下： (ScpBNA或「cp」)； (AmNA，當R 10為H時；AmNA(N-Me)，當R 10為CH 3時；AmNA(N-烷基)，當R 10為C 1-C 6烷基時)； (GuNA)；或 (GuNA (N-R 11)；其中B為核鹼基；R 10為H或C 1-C 6烷基；且R 11為C 1-C 6烷基。在某些實施例中，5'-翼區中之所有核苷皆為鎖定核苷。在一些實施例中，3'-翼區中之所有核苷皆為鎖定核苷。在一些實施例中，3'-翼區包含LNA及選自ScpBNA、AmNA及GuNA之一個或兩個核苷。在一些實施例中，5'-翼區皆均為LNA，且3'-翼區含有LNA及選自ScpBNA、AmNA及GuNA之一個或兩個核苷。PCT/JP2010/068409、PCT/JP2013/075370、PCT/JP2015/054308、PCT/JP2018/006061及/或PCT/JP2018/006062中包括其他核苷酸，該等文獻以全文引用之方式併入。Gutb及Nmln為鎖定核苷酸之其他實例，其可納入5'-翼區或3'-翼區或兩者中。
在一些實施例中，ASO之5'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接之鎖定核苷、經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鎖定核苷或其組合。在一些實施例中，5'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接之2'位取代核苷、經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之2'位取代核苷或其組合。在一些實施例中，5'-翼區包含至少一個鎖定核苷及至少一個2'位取代核苷，其中該鎖定核苷與該2'位取代核苷藉由硫代磷酸酯連接子或甲磺醯基胺基磷酸酯連接子連接。在一些實施例中，5'-翼區進一步包含RNA核苷或DNA核苷，其中RNA核苷及DNA核苷不為鎖定核苷或2'位取代核苷。在一些實施例中，5'-翼區中的至少兩個核苷藉由硫代磷酸酯連接子或甲磺醯基胺基磷酸酯連接子連接。在一些實施例中，5'-翼區中的至少2、3、4、5或6個核苷藉由硫代磷酸酯連接子、甲磺醯基胺基磷酸酯連接子或其組合連接。
在一些實施例中，ASO之3'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接之鎖定核苷、經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鎖定核苷或其組合。在一些實施例中，3'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接之經取代核苷、經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之經取代核苷或其組合。在一些實施例中，3'-翼區包含至少一個鎖定核苷及至少一個2'位取代核苷，其中該鎖定核苷及該2'位取代核苷藉由硫代磷酸酯連接子或甲磺醯基胺基磷酸酯連接子連接。在一些實施例中，3'-翼區進一步包含RNA核苷或DNA核苷，其中RNA核苷及DNA核苷不為鎖定核苷或2'位取代核苷。在一些實施例中，3'-翼區中的至少兩個核苷藉由硫代磷酸酯連接子或甲磺醯基胺基磷酸酯連接子連接。在一些實施例中，3'-翼區中的至少2、3、4、5或6個核苷藉由硫代磷酸酯連接子、甲磺醯基胺基磷酸酯連接子或其組合連接。
在一些實施例中，5'-翼區及/或3'-翼區中的一或多個核苷酸包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯或甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，5'-翼區中之所有核苷酸均包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，3'-翼區中之所有核苷酸均包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，5'-翼區中的所有核苷酸包含甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，3'-翼區中的所有核苷酸包含甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯。
在一些實施例中，中心區域包括一個或多個具有經修飾之核鹼基的經修飾之核苷酸。舉例而言，中心區域可包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個或至少5個或更多個Gutb、Nmln、5prnl、G形夾或其組合。在一些實施例中，中心區域包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個或至少5個或更多個5prnl、G形夾或其組合。另外或可替代地，中心區域可包括一個或多個具有以下結構的經修飾之核苷酸： (「(2s)T」)、 (「(5OH)C」)、 (「(8nh)A」)、 (「(8nh)G」)及/或 ，其中R為鹵素或R'-C≡C-；且R'為C 6-12芳基、5員至12員雜芳基、羥基-C 1-6烷基或C 1-7烷醯基氧基。在一些實施例中，中心區域在第1、第2、第3或第4個空隙核苷位置(自5'端)包括一個經修飾之核苷酸(例如(2s)T或(5OH)C)。在一些實施例中，經修飾之核苷酸處於第3個空隙核苷位置(自5'端)。在一些實施例中，經修飾之核苷酸為具有以下結構之核苷酸： 其中： W獨立地為O、N或S； R 1、R 2及R 5獨立地為H或D； R 3為H或F； R 4為F或OCH 3；且 鹼基為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 其中： R為鹵素或R'-C≡C-；且 R'表示C 6-12芳基、5員至12員雜芳基、羥基-C 1-6烷基，或C 1-7烷醯基氧基。在一些實施例中，C 1-7烷醯基包括(但不限於)甲醯基、乙醯基、乙基羰基、正丙基羰基、異丙基羰基、正丁基羰基、異丁基羰基、三級丁基羰基、正戊基羰基及正己基羰基。其他經修飾之核苷酸包括PCT/JP2018/006061中之經修飾之核苷酸，其以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，除非另外指示，否則「芳基」係指具有完全非定域π電子系統之碳環狀(全碳)環。「芳基」可由兩個或更多個稠環(共享兩個相鄰碳原子之環)構成。當芳基為稠環系統時，則連接至分子之其餘部分之環具有完全非定域π電子系統。稠環系統中之其他環可具有或可不具有完全非定域π電子系統。芳基之實例包括不限於苯、萘及薁之基團。
如本文所用，除非另外指示，否則「雜芳基」係指具有完全非定域π電子系統且在環中含有獨立地選自由氮、氧及硫組成之群的一個或多個雜原子(例如一至三個雜原子、或一至四個雜原子或一至五個雜原子)的環。「雜芳基」可由兩個或更多個稠合環(共享兩個相鄰碳原子之環)構成。當雜芳基為稠環系統時，連接至分子之其餘部分之環具有完全非定域π電子系統。稠環系統中之其他環可具有或可不具有完全非定域π電子系統。雜芳基環之實例包括不限於呋喃、噻吩、吡咯、 唑、噻唑、咪唑、吡唑、異 唑、異噻唑、三唑、噻二唑、吡啶、嗒 、嘧啶、吡 及三 。
在一些實施例中，ASO中心區域包含至少5個經硫代磷酸酯連接之鄰接DNA核苷、至少5個經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鄰接DNA核苷或其組合。在一些實施例中，中心區域中的至少2、3、4、5或6個核苷藉由硫代磷酸酯連接子、甲磺醯基胺基磷酸酯連接子或其組合連接。在一些實施例中，中心區域的DNA核苷藉由硫代磷酸酯連接子或甲磺醯基胺基磷酸酯連接子連接至5'-翼區的核苷。在一些實施例中，中心區域的DNA核苷藉由硫代磷酸酯連接子或甲磺醯基胺基磷酸酯連接子連接至3'-翼區的核苷。在一些實施例中，中心區域包含8至10個經硫代磷酸酯連接之鄰接DNA核苷、8至10個經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鄰接DNA核苷或其組合。
在一些實施例中，ASO與始於HBV之X區或HBV之S區的病毒目標RNA序列互補或雜交。病毒目標可例如始於acc.KC315400.1 (基因型B，「gt B」)中或基因型A、C或D中之任一者中之靶點的5'端。熟習此項技術者應瞭解HBV位置，例如如Wing-Kin Sung等人, Nature Genetics44:765 (2012)中所述。在一些實施例中，S區定義為小S蛋白之起點(在基因型B KC315400.1分離株中，位置#155))直至X蛋白之起點前(在基因型B KC315400.1分離株中，位置#1373)。在一些實施例中，X區定義為自X蛋白(在基因型B KC315400.1分離株中，位置#1374)之起點直至DR2位點之終點(在基因型B KC315400.1分離株中，位置#1603)。
在一些實施例中，ASO與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個位於SEQ ID NO: 89之位置100-800或1050-1700內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，ASO與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至15、7至14、7至13、7至12或7至11個位於SEQ ID NO: 89之位置100-800或1050-1700內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，ASO與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個位於SEQ ID NO: 89之位置180至280、300至450、650至775、1125至1300或1400至1650內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，ASO與病毒目標RNA序列互補或雜交，該等病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個位於SEQ ID NO: 89之位置180至215、230至270、350至420、675至730、1165至1210、1245至1290、1400至1480或1500至1630內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，ASO與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個始於以下位置的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成：SEQ ID NO: 89之位置191、245、246、276、376、377、381、383、694、700、1182、1261、1262、1408、1410、1426、1431、1432、1433、1435、1438、1441、1443、1513、1516、1517、1518、1519、1520、1521、1522、1527、1559、1575、1576、1577、1580、1581、1582或1589。在一些實施例中，ASO與病毒目標RNA序列完全互補。在一些實施例中，在ASO與病毒目標序列之間存在小於或等於5、4、3、2或1個錯配。在一些實施例中，在ASO與病毒目標序列之間存在小於或等於2個錯配。在一些實施例中，在ASO與病毒目標序列之間存在小於或等於1個錯配。在一些實施例中，錯配存在於ASO之翼區中。在一些實施例中，錯配存在於ASO之5'翼區中。在一些實施例中，錯配存在於ASO之3'翼區中。在一些實施例中，錯配存在於ASO之中心區域中。
在一些實施例中，中心區域與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個位於SEQ ID NO: 89之位置100-800或1050-1700內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，中心區域與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至15、7至14、7至13、7至12或7至11個位於SEQ ID NO: 89之位置100-800或1050-1700內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，中心區域與病毒目標RNA序列互補或雜交，該等病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個位於SEQ ID NO: 89之位置180至280、300至450、650至775、1125至1300或1400至1650內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，中心區域與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個位於SEQ ID NO: 89之位置180至215、230至270、350至420、675至730、1165至1210、1245至1290、1400至1480或1500至1630內的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成。在一些實施例中，中心區域與病毒目標RNA序列互補或雜交，該病毒目標RNA序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個始於以下位置的鄰接核苷酸、由該等鄰接核苷酸組成或主要由該等鄰接核苷酸組成：SEQ ID NO: 89之位置191、245、246、276、376、377、381、383、694、700、1182、1261、1262、1408、1410、1426、1431、1432、1433、1435、1438、1441、1443、1513、1516、1517、1518、1519、1520、1521、1522、1527、1559、1575、1576、1577、1580、1581、1582或1589。在一些實施例中，中心區域與病毒目標RNA序列完全互補。在一些實施例中，中心區域與病毒目標序列之間存在小於或等於5、4、3、2或1個錯配。在一些實施例中，中心區域與病毒目標序列之間存在小於或等於2個錯配。在一些實施例中，中心區域與病毒目標序列之間存在小於或等於1個錯配。
在一些實施例中，ASO包含與選自表1中所列之序列的核苷酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或100%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明之ASO可具有與表1之ASO相差一個核苷的序列。在一些實施例中，本發明之ASO可具有與表1之ASO相差兩個核苷的序列。在一些實施例中，本發明之ASO可具有與表1之ASO相差三個核苷的序列。在一些實施例中，本發明之ASO可具有與表1之ASO相差四個核苷的序列。
在一些實施例中，本發明之ASO可具有表1之序列，但中心區域中的一個T被(2s)T置換，中心區域中的一個C 被(5OH)C置換，且/或中心區域中的一個A被(8nh)A置換。在一些實施例中，本發明之ASO具有表1之序列，但在5'翼部分中具有一個或兩個ScpBNA、AmNA或GuNA。在一些實施例中，本發明之ASO可具有表1之序列，但在3'翼部分中具有一個或兩個ScpBNA、AmNA或GuNA。在一些實施例中，本發明之ASO可具有表1之序列，但該序列之5'端附接有mA或mU。在一些實施例中，本發明之ASO可具有表1之序列，但該序列之5'端、該序列之3'端或該兩端均附接有mA或mU，該序列連接至GalNAc衍生物(例如GalNAc4，諸如GalNAc4-(PS)2-p-，或GalNAc6，諸如GalNAc6-(PS)2-p-)，如本文中所詳述。
在一些實施例中，ASO包含與SEQ ID NO: 1至88中之任一者之核苷酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或100%一致的核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明之ASO具有與SEQ ID NO: 1-88之任一核苷酸相差一個核苷的序列。在其他實施例中，ASO具有與SEQ ID NO: 1-88之任一核苷酸相差1、2、3或4個核苷的序列。在一些實施例中，本發明之ASO具有SEQ ID NO: 1-88中之任一者的序列，但中心區域中之一個T被(2s)T置換，中心區域中之一個C 被(5OH)C置換，且/或中心區域中之一個A被(8nh)A置換。在一些實施例中，本發明之ASO具有SEQ ID NO: 1-88中之任一者的序列，但在5'翼部分中具有一個或兩個ScpBNA、AmNA或GuNA。在一些實施例中，本發明之ASO具有SEQ ID NO: 1-88中之任一者的序列，但在3'翼部分中具有一個或兩個ScpBNA、AmNA或GuNA。在一些實施例中，本發明之ASO具有SEQ ID NO: 1-88中之任一者的序列，但該序列之5'端附接有mA或mU。在一些實施例中，本發明之ASO具有SEQ ID NO: 1-88中之任一者的序列，但該序列之5'端附接有mA或mU，該序列連接至GalNAc衍生物(例如GalNAc4，諸如GalNAc4-(PS)2-p-，或GalNAc6，諸如GalNAc6-(PS)2-p-)，如本文中所詳述。
目標RNA序列
所揭示之ASO可如下減少目標RNA序列(例如目標基因)的表現：募集RNA酶H以使目標RNA序列的RNA轉錄本裂解及降解，降低RNA含量且從而降低由目標RNA序列編碼之蛋白質的含量。
出於本發明之目的，目標RNA序列可為細胞中的任何基因。在一些實施例中，目標基因為病毒基因。在一些實施例中，病毒基因來自DNA病毒。在一些實施例中，DNA病毒為雙股DNA (dsDNA)病毒。在一些實施例中，dsDNA病毒為嗜肝DNA病毒。在一些實施例中，嗜肝DNA病毒為B型肝炎病毒(HBV)。在一些實施例中，HBV係選自HBV基因型A-J。在一些實施例中，病毒疾病係由RNA病毒引起。在一些實施例中，RNA病毒為單股RNA病毒(ssRNA病毒)。在一些實施例中，ssRNA病毒為正義單股RNA病毒((+)ssRNA病毒)。在一些實施例中，(+)ssRNA病毒為冠狀病毒。在一些實施例中，冠狀病毒為β-冠狀病毒。在一些實施例中，β-冠狀病毒係選自由以下組成之群：嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2) (亦臨時稱為2019新型冠狀病毒，或2019-nCOV))、人類冠狀病毒OC43 (hCoV-OC43)、中東呼吸道症候群相關冠狀病毒(MERS-CoV，亦臨時稱為2012新型冠狀病毒或2012-nCoV)及嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒(SARS-CoV，亦稱為SARS-CoV-1)。在一些實施例中，β-冠狀病毒為SARS-CoV-2，為COVID-19之病原體。一些例示性目標基因展示於本說明書結尾的表6中。
在一些實施例中，目標RNA序列係選自HBV之S基因或X基因。在一些實施例中，HBV具有SEQ ID NO: 90之核苷酸序列中所示的基因體序列，其對應於以全文引用之方式併入的GenBank登錄號U95551.1之核苷酸序列。
例示性HBV基因體序列展示於與以全文引用之方式併入的Genbank登錄號KC315400.1對應的SEQ ID NO: 89中。SEQ ID NO: 89之核苷酸2307..3215,1..1623對應於編碼聚合酶蛋白的聚合酶/RT基因序列。SEQ ID NO: 89之核苷酸2848..3215,1..835對應於編碼大S蛋白的PreS1/S2/S基因序列。SEQ ID NO: 89之核苷酸3205..3215,1..835對應於編碼中等S蛋白之PreS2/S基因序列。SEQ ID NO: 89之核苷酸155..835對應於編碼小S蛋白的S基因序列。SEQ ID NO: 89之核苷酸1374..1838對應於編碼X蛋白的X基因序列。SEQ ID NO: 89之核苷酸1814..2452對應於編碼前核心/核心蛋白的PreC/C基因序列。SEQ ID NO: 89之核苷酸1901..2452對應於編碼核心蛋白的C基因序列。HBV基因體進一步包含病毒調控元件，諸如病毒啟動子(preS2、preS1、核心及X)及增強子元件(ENH1及ENH2)。SEQ ID NO: 89之核苷酸1624..1771對應於ENH2。SEQ ID NO: 60之核苷酸1742..1849對應於核心啟動子。SEQ ID NO: 89之核苷酸1818...3215,1..1930對應於編碼核心蛋白及聚合酶蛋白的前基因體RNA (pgRNA)。
在一些實施例中，目標RNA序列係選自SARS-CoV之基因體。在一些實施例中，SARS-CoV具有對應於以全文引用之方式併入的Genbank登錄號NC_004718.3之核苷酸序列的基因體。
在一些實施例中，目標RNA序列係選自MERS-CoV之基因體。在一些實施例中，MERS-CoV具有對應於以全文引用之方式併入的Genbank登錄號NC_019843.3之核苷酸序列的基因體。
在一些實施例中，目標RNA序列係選自hCoV-OC43之基因體。在一些實施例中，hCoV-OC43具有對應於以全文引用之方式併入的Genbank登錄號NC_006213.1之核苷酸序列的基因體。
在一些實施例中，目標RNA序列係選自SARS-CoV-2之基因體。在一些實施例中，SARS-CoV-2具有對應於以全文引用之方式併入的Genbank登錄號NC_045512.2之核苷酸序列的基因體序列。
在一些實施例中，目標RNA序列可為任何羥基類固醇去氫酶基因。在任何實施例中，基因為羥基類固醇17-β去氫酶13 (HSD17B13)。HSD17B13具有SEQ ID NO: 91之核苷酸序列中所示的序列，該序列對應於Genbank登錄號NM_178135.5之編碼序列的核苷酸序列(核苷酸42至944)，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，目標RNA序列與SEQ ID NO: 91內的核苷酸區域至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致，但SEQ ID NO: 91中的胸腺嘧啶(Ts)被尿嘧啶(U)置換。在一些實施例中，第一核苷酸序列與SEQ ID NO: 91內之15至30、15至25、15至23、15至22、15至21、17至25、17至23、17至22、17至21或19至21個核苷酸至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。
在一些實施例中，目標RNA序列參與肝臟代謝。在一些實施例中，目標RNA序列為電子傳輸鏈之抑制劑。在一些實施例中，目標基因編碼MCJ蛋白(MCJ/DnaJC15或甲基化可控J蛋白)。在一些實施例中，MCJ蛋白由SEQ ID NO: 92之mRNA序列編碼，其對應於以全文引用之方式併入的GenBank登錄號NM_013238.3之核苷酸序列。
在一些實施例中，目標RNA序列為TAZ。在一些實施例中，TAZ包含SEQ ID NO: 93之核苷酸序列，其對應於以全文引用之方式併入的GenBank登錄號NM_000116.5之核苷酸序列。
在一些實施例中，目標RNA序列為血管生成素樣3 (ANGPTL3)。在一些實施例中，ANGPTL3包含SEQ ID NO: 94之核苷酸序列，其對應於以全文引用之方式併入的GenBank登錄號NM_014495.4之核苷酸序列。
在一些實施例中，目標RNA序列為二醯基甘油醯基轉移酶2 (DGAT2)。在一些實施例中，DGAT2包含SEQ ID NO: 95之核苷酸序列，其對應於以全文引用之方式併入的GenBank登錄號NM_001253891.1之核苷酸序列。
結合部分
本發明亦關於與ASO結合的其他組分，諸如靶向部分及在一端或多端經修飾之寡核苷酸。在一些實施例中，結合部分係選自半乳胺糖、肽、蛋白質、固醇、脂質、磷脂、生物素、啡 、活性藥物物質、膽固醇、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明(rhodamines)、香豆素、葉酸及染料。
在一些實施例中，靶向部分可包含碳水化合物，諸如單醣，例如 N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、雙醣、三醣、四醣、寡醣及多醣。在一些實施例中，靶向部分為一種或多種GalNAc衍生物，諸如經由一個或多個連接子與ASO連接之兩種或三種GalNAc衍生物，視情況呈連續結構。在某些實施例中，靶向部分包含經由連接子連接之三個連續GalNAc部分，諸如： 。
在一些實施例中，結合部分為半乳胺糖。在一些實施例中，本文所揭示之任一種ASO連接至結合部分，亦即半乳胺糖。在一些實施例中，半乳胺糖為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。在一些實施例中，本文所揭示之任一種ASO包含GalNAc。在一些實施例中，GalNAc具有式(VI)： ，其中m為1、2、3、4、或5；各n獨立地為1或2；p為0或1；各R獨立地為H或第一保護基；各Y獨立地選自-O-P(=O)(SH)-、-O-P(=O)(O)-、-O-P(=O)(OH)-、-O-P(S)S-及-O-；Z為H或第二保護基；L為連接子或L與Y的組合為連接子；且A為H、OH、第三保護基、活化基團或寡核苷酸。在一些實施例中，第一保護基為乙醯基。在一些實施例中，第二保護基為三甲氧基三苯甲基(TMT)。在一些實施例中，活化基團為胺基亞磷酸酯基團。在一些實施例中，胺基亞磷酸酯基團為氰基乙氧基 N,N-二異丙基胺基亞磷酸酯基團。在一些實施例中，連接子為C6-NH 2基團。在一些實施例中，A為ASO。在一些實施例中，R為H，Z為H，且n為1。在一些實施例中，R為H，Z為H，且n為2。
在一些實施例中，GalNAc為式(VII)： ， 其中R z為OH或SH；且各n獨立地為1或2。在一些實施例中，靶向配位體可為GalNAc靶向配位體，可包含1、2、3、4、5或6個GalNAc單元。在一些實施例中，靶向配位體可為選自GalNAc2、GalNAc3、GalNAc4、GalNAc5及GalNAc6之GalNAc。
在一些實施例中，GalNAc可為GalNAc亞醯胺酯、GalNAc 4 CPG、GalNAc胺基磷酸酯，或GalNAc4-ps-GalNAc4-ps-GalNAc4。下文展示此等GalNAc部分：
GalNAc 4 部分
GalNAc4胺基亞磷酸酯
GalNAc4 CPG
GalNAc3、GalNAc4、GalNAc5及GalNAc6可在與1、2或3個部分之合成期間與本文所揭示之ASO結合。諸如GalNAc1及GalNAc2之其他GalNAc部分可用以使用合成後結合來形成5'及3'-GalNAc。 GalNAc 胺基亞磷酸酯
GalNAc構築嵌段 在與寡核苷酸連接之後(命名法)
GalNAc-3胺基亞磷酸酯 (GalNAc3-(PS)2-p)
GalNAc-4胺基亞磷酸酯    (GalNAc4-(PS)2-p)
GalNAc-5胺基亞磷酸酯    (GalNAc5-(PS)2-p)
GalNAc-6胺基亞磷酸酯 (GalNAc6-(PS)2-p)
在一些實施例中，ASO在ASO之5'端、3'端或兩端含有靶向部分。結合部分可經由1、2、3、4或5個或更多個連接子連接至ASO。在一些實施例中，一個或多個連接子獨立地選自由以下組成之群：磷酸二酯(p或po)連接子、硫代磷酸酯(ps)連接子、甲磺醯基胺基磷酸酯連接子(yp)、胺基亞磷酸酯(HEG)連接子、三乙二醇(TEG)連接子及/或二硫代磷酸酯連接子。在一些實施例中，一個或多個連接子獨立地選自由以下組成之群：p-(PS)2、(PS)2-p-TEG-p、(PS)2-p-HEG-p及(PS)2-p-(HEG-p)2。
在一些實施例中，結合部分為脂質部分。在一些實施例中，本文所揭示之任一種ASO連接至結合部分，亦即脂質部分。脂質部分之實例包括但不限於膽固醇部分、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-丙三醇或1-二-O-十六烷基-外消旋-丙三醇-S-H-膦酸三乙銨)、多元胺或聚乙二醇鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分或十八烷基胺或己胺基-羰基-氧基膽固醇部分。
在一些實施例中，結合部分為活性藥物物質。在一些實施例中，本文所揭示之任一種ASO連接至結合部分，亦即活性藥物物質。活性藥物物質之實例包括但不限於阿司匹林(aspirin)、華法林(warfarin)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(5)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺醯基肌胺酸(dansylsarcosine)、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸(flufenamic acid)、醛葉酸(folinic acid)、苯并噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、二氮呯(diazepine)、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽(barbiturate)、頭孢菌素(cephalosporin)、磺胺藥物、抗糖尿病劑、抗細菌劑或抗生素。
例示性ASO
如上文所述，本文所揭示之ASO可包含經修飾之核苷酸，諸如Gutb、Nmln、5prnl、G形夾或其組合。另外或可替代地，本文所揭示之ASO可包含至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯。表1提供一些例示性ASO，其包含經修飾之核苷酸，諸如Gutb、Nmln、5prnl、G形夾或其組合；至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯(在序列中稱為「yp」)；或其組合。 表 1 - 例示性 ASO 序列
SEQ ID NO. ASO # 序列 (5' 至 3')
1 1 lnGpslnApslnTpslnApslnAypApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
2 2 lnGpslnApslnTpslnApslnAypAypAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
3 3 lnGpslnApslnTpslnApslnAypAypAyp(5oh)CypGyp(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
4 4 lnGpslnApslnTpslnApslnAypApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
5 5 lnGpslnApslnTpslnApslnAypAypAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
6 6 lnGpslnApslnTpslnApslnAypAypAyp(5oh)CypGyp(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
7 7 lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnAypApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
8 8 lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnAypAypAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
9 9 lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnAypAypAyp(5m)CypGyp(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
10 10 lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnAypAypAyp(5m)CypGyp(5m)Cyp(5m)CypGyp(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
11 11 lnGpslnApslnTpslnApslnAypAypAyp(5oh)CypGyp(5m)Cyp(5m)CypGyp(5m)CyplnApslnGpslnApscp(5m)C
12 12 lnGpslnApslnTpslnApslnAypApsAyp(5oh)CpsGyp(5m)Cps(5m)CypGps(5m)CyplnApslnGpslnApscp(5m)C
13 13 lnGyplnAyplnTyplnAyplnAypApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnAyplnGyplnAypcp(5m)C
14 14 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAyp(5oh)CypGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
15 15 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cyp(5m)CypGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
16 16 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CypGyp(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
17 17 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGyp(5m)CyplnApslnGpslnApscp(5m)C
18 18 lnGpslnApsScTypdTps(5m)Cps(8Am)ApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
19 19 lnGpslnApsScTypdTyp(5m)Cps(8Am)ApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
20 20 lnGpslnApsScTypdTyp(5m)Cyp(8Am)AypGyp(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
21 21 lnGpslnApsScTypdTyp(5m)Cyp(8Am)AypGyp(5m)CypGyp(5m)Cyp(5m)CypGypApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
22 22 lnGpslnApsScTypdTps(5m)Cyp(8Am)ApsGyp(5m)CpsGyp(5m)Cps(5m)CypGpsAypln(5m)CpslnGpslnGpslnG
23 23 GalNac4-ps2-p-mA-lnGpslnApslnTpslnApslnAypAypAyp(5oh)CypGyp(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
24 24 GalNac4-ps2-p-mA-lnGpslnApslnTpslnApslnAypAypAyp(5oh)CypGyp(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
25 25 lnGpslnApslnTpsTps (gcl)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
26 26 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps (gcl)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
27 27 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps (gcl)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
28 28 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps (gcl)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
29 29 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsAps (gcl)CpslnGpslnGpslnG
30 30 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps (gcl)CpsGpsAps (gcl)CpslnGpslnGpslnG
31 31 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps (gcl)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
32 32 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps (gcl)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
33 33 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps (gcl)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
34 34 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps (gcl)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
35 35 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnAps(gcl)C
36 36 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps (gcl)CpslnApslnGpslnAps (gcl)C
37 37 lnGpslnApslnTpsTps (5prnl)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
38 38 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps (5prnl)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
39 39 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps (5prnl)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
40 40 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps (5prnl)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
41 41 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps (5prnl)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
42 42 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps (5prnl)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
43 43 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps (5prnl)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
44 44 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps (5prnl)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
45 45 lnGps (gutb)ApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
46 46 lnGpslnAps (gutb)TpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
47 47 lnGpslnApslnTps (gutb)ApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
48 48 lnGpslnApslnTpslnAps (gutb)ApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
49 49 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)Cps (gutb)ApslnGpslnApsln(5m)C
50 50 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGps (gutb)Apsln(5m)C
51 51 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnAps (gutb)(5m)C
52 52 lnGps (gutb)ApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
53 53 lnGpslnAps (gutb)TpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
54 54 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsAps (gutb) (5m)CpslnGpslnGpslnG
55 55 GalNac4-ps2-p-mA-lnGps (gutb)ApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
56 56 GalNac4-ps2-p-mA-lnGps (gutb)ApslnTpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
57 57 GalNac4-ps2-p-mA-lnGps (gutb)ApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
58 58 GalNac4-ps2-p-mA-lnGps (gutb)ApslnTpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
59 59 GalNac4-ps2-p-mA-lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
60 60 GalNac4-ps2-p-mA-lnGpslnAps (gutb)TpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
61 61 GalNac4-ps2-p-mA-lnGpslnAps (gutb)TpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
62 62 GalNac4-ps2-p-mA-lnGpslnAps (gutb)TpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
63 63 GalNac4-ps2-p-mA-lnGpslnAps (gutb)TpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
64 64 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C
65 65 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
66 66 (Nmln)AGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
67 67 lnGps (Nmln)ApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
68 68 lnGpslnAps (Nmln)TpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
69 69 lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
70 70 lnGpslnApslnTpslnAps (Nmln)ApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
71 71 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)Cps (Nmln)ApslnGpslnApsln(5m)C
72 72 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnAps (Nmln)GpslnApsln(5m)C
73 73 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGps (Nmln)Apsln(5m)C
74 74 lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnAps (Nmln) (5m)C
75 75 lnGpslnApscpTpsTps(5m)Cps(8nh)ApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
76 76 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
77 77 (Nmln)GpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
78 78 lnGps (Nmln)ApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
79 79 lnGpslnAps (Nmln)TpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGpslnG
80 80 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGpslnGps (Nmln)G
81 81 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)CpslnGps (Nmln)GpslnG
82 82 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsApsln(5m)Cps (Nmln)GpslnGpslnG
83 83 lnGpslnApslnTpsTps(5m)CpsApsGps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGpsAps (Nmln)(5m)CpslnGpslnGpslnG
84 84 GalNAc4-ps2-p-mA-lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
85 85 GalNAc4-ps2-p-mA-lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnApsApsAps(5OH)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
86 86 GalNAc4-ps2-p-mA-lnGpslnApslnTpslnApslnApsApsAps(5m)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApsln(5m)C
87 87 GalNAc4-ps2-p-mA-lnGpslnApslnTps (Nmln)ApslnApsApsAps(5OH)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CpslnApslnGpslnApscp(5m)C-3'
88 88 lnGyplnAyplnTyplnAyplnAypApsAps(5oh)CpsGps(5m)Cps(5m)CpsGps(5m)CyplnAyplnGyplnAypcp(5m)C
在表1中，粗體核苷含有以下修飾之一：
  
N- 三級丁基- 胍(Gutb) N 甲基-LNA (Nmln) G 形夾(gcl)
 
5(Me)- 丙炔基(5prnl)  
醫藥組合物
本發明亦涵蓋包含本發明之ASO的醫藥組合物。一個實施例為醫藥組合物，其包含本發明之一種或多種ASO及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
在一些實施例中，含有本發明之ASO的醫藥組合物經調配以便經由非經腸遞送來全身性投與。非經腸投與包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；以及真皮下投與，例如經由植入裝置。在一較佳實施例中，含有本發明之ASO的醫藥組合物經調配以便皮下(SC)或靜脈內(IV)遞送。非經腸投與之調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及如熟習此項技術者所瞭解之其他醫藥學上可接受之添加劑。對於靜脈內使用而言，可控制溶質之總濃度以使得製劑具等張性。
含有本發明之ASO的醫藥組合物適用於治療例如與HBV基因之表現或活性相關的疾病或病症。
在一些實施例中，醫藥組合物包含：本發明之第一ASO，其與HBV之第一X區中的病毒目標RNA序列互補或雜交；及本發明之第二ASO，其與HBV之第二X區或S區中的病毒目標RNA序列互補或雜交；及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。當醫藥組合物包含兩種或更多種ASO時，ASO可以不同量存在。舉例而言，在一些實施例中，第一ASO與第二ASO之重量比為1:4至4:1，例如1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1或4:1。在一些實施例中，第一ASO與第二ASO之莫耳比為1:4至4:1，例如1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1或4:1。
療法
可向個體投與本文所述之siNA分子及組合物以治療疾病。本文進一步揭示本文所揭示之任一種siRNA分子或組合物用於製造供治療疾病用之藥劑的用途。特定而言，本發明提供用於治療不同疾病(諸如感染性疾病，包括但不限於病毒性疾病及肝病)的ASO。
本發明之一個範疇包括治療經診斷患有、懷疑患有HBV感染及/或HBV相關病症或處於HBV感染及/或HBV相關病症風險中之個體的方法。在治療應用中，包含至少一種所揭示之ASO的組合物以足以治癒或至少部分地阻滯此類疾病(包括其併發症及疾病發展中的中間病理學表型)的量投與懷疑或已經罹患該疾病的個體(諸如個體之血清及/或肝臟中持久存在HBV cccDNA、存在HBV抗原(例如HBsAg及/或HBeAg)，或HBV病毒載量升高)。
可藉由此項技術中已知之任何診斷或預後分析或其組合來鑑別罹患HBV感染及/或HBV相關病症之個體。舉例而言，HBV感染及/或HBV相關病症的典型症狀包括但不限於存在肝臟HBV cccDNA、存在血清及/或肝臟HBV抗原(例如HBsAg及/或HBeAg)、ALT升高、AST升高、抗HBV抗體不存在或含量低、肝臟損傷、肝硬化、δ肝炎、急性B型肝炎、急性爆發性B型肝炎、慢性B型肝炎、肝纖維化、末期肝臟疾病、肝細胞癌、血清疾病樣症候群、厭食症、噁心、嘔吐、低度發熱、肌痛、疲勞、味覺敏銳度及嗅覺障礙(厭食及厭惡香菸)、右上象限及上腹疼痛(間歇性、輕度至中度)、肝性腦病變、嗜睡、睡眠模式紊亂、心智混亂、昏迷、腹水、胃腸出血、凝血病、黃疸、肝腫大(輕度腫大、軟肝)、脾腫大、掌紅斑、蜘蛛痣、肌肉萎縮、蛛狀血管瘤、血管炎、靜脈曲張出血、周邊水腫、男子女乳症、睪丸萎縮、腹部側支靜脈(臍周靜脈曲張(caput medusa))、丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)含量高(在1000至2000 IU/mL範圍內)、ALT含量高於AST含量、γ-麩胺醯基轉肽酶(GGT)及/或鹼性磷酸酶(ALP)含量升高、白蛋白含量降低血清鐵含量升高、白血球減少症(亦即，顆粒球減少症)、淋巴球增多症、紅血球澱積速率(ESR)增加、紅血細胞存活期縮短、溶血、血小板減少症、國際標準化比值(INR)延長、存在血清HBV DNA、胺基轉移酶升高(＜5倍的ULN)、膽紅素含量增加、凝血酶原時間(PT)延長、高球蛋白血症、存在組織非特異性抗體(諸如抗平滑肌抗體(ASMA)或抗核抗體(ANA))、存在組織特異性抗體(諸如針對甲狀腺的抗體)、類風濕性因子(RF)含量升高、高膽紅素血症、低血小板及白血細胞計數、AST含量高於ALT含量、小葉發炎伴變性及再生肝細胞變化，以及以小葉中心為主的壞死。
在一些實施例中，經所揭示之ASO治療的個體將顯示以下病狀或症狀中之一者或多者的改善或消除：存在肝臟HBV cccDNA、存在血清及/或肝臟HBV抗原(例如HBsAg及/或HBeAg)、抗HBV抗體不存在或含量低、肝臟損傷、肝硬化、δ肝炎、急性B型肝炎、急性爆發性B型肝炎、慢性B型肝炎、肝纖維化、末期肝臟疾病、肝細胞癌、血清疾病樣症候群、厭食症、噁心、嘔吐、低度發熱、肌痛、疲勞、味覺敏銳度及嗅覺障礙(厭食及厭惡香菸)、右上象限及上腹疼痛(間歇性、輕度至中度)、肝性腦病變、嗜睡、睡眠模式紊亂、心智混亂、昏迷、腹水、胃腸出血、凝血病、黃疸、肝腫大(輕度腫大、軟肝)、脾腫大、掌紅斑、蜘蛛痣、肌肉萎縮、蛛狀血管瘤、血管炎、靜脈曲張出血、周邊水腫、男子女乳症、睪丸萎縮、腹部側支靜脈(臍周靜脈曲張)、ALT含量高於AST含量、白血球減少症(亦即，顆粒球減少症)、白蛋白含量降低、血清鐵含量升高、淋巴球增多症、紅血球澱積速率(ESR)增加、紅血細胞存活期縮短、溶血、血小板減少症、國際標準化比值(INR)延長、存在血清HBV DNA、凝血酶原時間(PT)延長、高球蛋白血症、存在組織非特異性抗體(諸如抗平滑肌抗體(ASMA)或抗核抗體(ANA))、存在組織特異性抗體(諸如針對甲狀腺的抗體)、高膽紅素血症、低血小板及白血細胞計數、AST含量高於ALT含量、小葉發炎伴變性及再生肝細胞變化，以及以小葉中心為主的壞死。
本發明提供一種用於治療經診斷患有或懷疑患有HBV感染及/或HBV相關病症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之本發明的ASO組合物。在一些實施例中，方法包含向該個體投與本發明之第一ASO及本發明之第二ASO，其中該第一ASO與HBV之第一X區中的病毒目標RNA序列互補或雜交，且該第二ASO與HBV之第二X區或S區中的病毒目標RNA序列互補或雜交。在一些實施例中，第二ASO與HBV之第二X區中的病毒目標RNA序列互補或雜交。在其他實施例中，第二ASO與HBV之S區中的病毒目標RNA序列互補或雜交。
在所揭示之方法及用途的一些實施例中，疾病為呼吸道疾病。在一些實施例中，呼吸道疾病為病毒感染。在一些實施例中，呼吸道疾病為病毒性肺炎。在一些實施例中，呼吸道疾病為急性呼吸道感染。在一些實施例中，呼吸道疾病為感冒。在一些實施例中，呼吸道疾病為嚴重急性呼吸道症候群(SARS)。在一些實施例中，呼吸道疾病為中東呼吸道症候群(MERS)。在一些實施例中，疾病為冠狀病毒疾病2019 (例如COVID-19)。在一些實施例中，呼吸道疾病可包括一個或多個選自以下之症狀：咳嗽、喉嚨痛、流鼻涕、打噴嚏、頭痛、發熱、呼吸短促、肌痛、腹痛、疲勞、呼吸困難、持續性胸部疼痛或壓力、喚醒困難、嗅覺及味覺喪失、肌肉或關節疼痛、發冷、噁心或嘔吐、鼻塞、腹瀉、咯血、結膜充血、產痰、胸悶及心悸。在一些實施例中，呼吸道疾病可包括選自以下之併發症：鼻竇炎、中耳炎、肺炎、急性呼吸窘迫症候群、彌散性血管內凝血、心包炎及腎衰竭。在一些實施例中，呼吸道疾病為特發性的。
在一些實施例中，本發明提供治療或預防冠狀病毒感染之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之一種或多種ASO或如本文所揭示的醫藥組合物。在一些實施例中，冠狀病毒感染係選自由以下組成之群：中東呼吸道症候群(MERS)、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)及COVID-19。在一些實施例中，個體已用一種或多種另外的冠狀病毒治療劑治療。在一些實施例中，個體同時用一種或多種另外的冠狀病毒治療劑治療。
在一些實施例中，疾病為肝病。在一些實施例中，肝病為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。在一些實施例中，NAFLD為非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。在一些實施例中，肝病為肝細胞癌(HCC)。
本發明之ASO可用於治療有需要之個體的疾病。在一些實施例中，治療有需要之個體之疾病的方法包含向該個體投與本文所揭示之任一種ASO。在一些實施例中，治療有需要之個體之疾病的方法包含向個體投與本文所揭示之任一種組合物。
可藉由此項技術中已知之方法來投與ASO。在一些實施例中，藉由皮下(SC)或靜脈內(IV)遞送來投與ASO。本發明之之製劑(例如ASO或組合物)可經口、非經腸、外用或直腸給予。其當然以適合於各種投與途徑之形式給與。舉例而言，其如下投與：以錠劑或膠囊形式，藉由注射、輸注或吸入投與；以洗劑或軟膏形式外用投與；及以栓劑形式直腸投與。在一些實施例中，皮下投與較佳。
如本文所用，片語「非經腸投藥(parenteral administration)」及「非經腸投與(administered parenterally)」意謂除經腸及外用投藥之外的投藥模式，通常為注射，且包括不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內及胸骨內注射及輸注。
如本文所用，片語「全身性投與」及「周邊投與」意謂除直接投與中樞神經系統中以外，投與化合物、藥物或其他材料，使得其進入患者之系統且因此經受代謝及其他類似過程，例如皮下投與。
此等化合物可藉由任何適合投藥途徑投與人類及其他動物以供治療，包括經口、鼻(如藉由例如噴霧劑)、直腸、陰道內、非經腸、腦池內及外用，如藉由散劑、軟膏或滴劑，包括頰內及舌下。
不論所選投與途徑，本發明之化合物(例如ASO) (其可以適合的水合形式及/或本發明之醫藥組合物使用)均藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受的劑型。
可改變本發明之醫藥組合物中活性成分的實際劑量水準，以使得活性成分的量針對特定患者、組合物及投與模式有效地達成所需治療反應而對患者無毒性。
所選劑量水準將視多種因素而定，包括所用的本發明特定化合物(例如ASO)或其酯、鹽或醯胺的活性、投藥途徑，投藥時間、所用特定化合物之排泄或代謝速率、吸收速率及程度、治療持續時間、與所用特定化合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史，以及醫學技術中熟知之類似因素。
一般熟習此項技術之醫師或獸醫可容易判定及開具所需醫藥組合物之有效量。舉例而言，醫師或獸醫可使醫藥組合物中所用之本發明化合物(例如ASO)的起始劑量水平低於為了達成所需治療作用而必需的水平，且逐漸增加劑量直至達成所需作用。
一般而言，本發明化合物(例如ASO)之適合日劑量為有效產生治療作用之最低劑量的化合物量。此有效劑量一般視上文所述之因素而定。較佳地，化合物係以約0.01 mg/kg至約200 mg/kg、更佳約0.1 mg/kg至約100 mg/kg、甚至更佳約0.5 mg/kg至約50 mg/kg投與。在一些實施例中，化合物係以約1 mg/kg至約40 mg/kg、約1 mg/kg至約30 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約15 mg/kg或1 mg/kg至約10 mg/kg投與。在一些實施例中，化合物係以等於或大於以下之劑量投與：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1 mg/kg。在一些實施例中，化合物係以等於或大於以下之劑量投與：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30 mg/kg。在一些實施例中，化合物係以等於或小於以下之劑量投與：200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20或15 mg/kg。在一些實施例中，化合物之總日劑量等於或大於10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或100 mg。
必要時，活性化合物(例如ASO)之有效日劑量可以兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次劑量或子劑量投與，該等劑量或子劑量分別在全天的適當間隔時間投與，視情況以單位劑型投與。在一些實施例中，化合物係投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次。較佳給藥為每天投與一次。在一些實施例中，化合物係一週投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次。在一些實施例中，化合物係一個月投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次。在一些實施例中，化合物係每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天投與一次。在一些實施例中，化合物係每3天投與。在一些實施例中，化合物係每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週投與一次。在一些實施例中，化合物係每月投與。在一些實施例中，化合物係每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個月投與一次。在一些實施例中，化合物係在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70天之時段內投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53次。在一些實施例中，化合物係在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53週之時段內投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53次。在一些實施例中，化合物係在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53個月之時段內投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53次。在一些實施例中，化合物係一週投與至少一次，歷時至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70週之時段。在一些實施例中，化合物係一週投與至少一次，歷時至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個月之時段。在一些實施例中，化合物係一週投與至少兩次，歷時至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70週之時段。在一些實施例中，化合物係一週投與至少兩次，歷時至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個月之時段。在一些實施例中，化合物係每兩週投與至少一次，歷時至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70週之時段。在一些實施例中，化合物係每兩週投與至少一次，歷時至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個月之時段。在一些實施例中，化合物係每四週投與至少一次，歷時至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70週之時段。在一些實施例中，化合物係每四週投與至少一次，歷時至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個月之時段。
所述方法中之個體可為哺乳動物，且其包括人類及非人類哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類，諸如成人。
一些實施例包括用於治療感染病毒之個體中之HBV病毒的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明的一種或多種ASO或本發明組合物，藉此降低個體中之病毒的病毒載量及/或降低個體中的病毒抗原含量。ASO可與病毒中之目標RNA的一部分(例如HBV之第二X區域及/或S區域)互補或雜交。
在一些實施例中，如本文所述之經修飾之寡核苷酸可與一種或多種其他藥劑組合使用以治療及/或抑制複製性HBV及/或HDV。當本文所述之化合物(例如ASO)與另一種藥劑共投與時，有效量可小於當化合物單獨使用時。其他藥劑包括但不限於干擾素、核苷/核苷酸類似物、衣殼組裝調節劑(CAM)、siRNA、其他ASO、核酸聚合物或S-抗原轉運抑制寡核苷酸聚合物(NAP或STOPS)、進入抑制劑及/或小分子免疫調節劑。其他藥劑之實例包括ALG-010133、ALG-000184、重組干擾素α2b、IFN-a、PEG-IFN-a-2a、拉米夫定、替比夫定、阿德福韋雙匹酯、克來夫定、因提弗、替諾福韋阿拉芬胺、替諾福韋雙索酯、NVR3-778、BAY41-4109、JNJ-632、JNJ-3989 (ARO-HBV)、RG6004、GSK3228836、REP-2139、REP-2165、AB-729、VIR-2218、DCR-HBVS、JNJ-6379、GLS4、ABI-HO731、JNJ-440、NZ-4、RG7907、EDP-514、AB-423、AB-506、ABI-H03733及ABI-H2158。在一些實施例中，本文所揭示之任一種ASO與STOPS之一共投與。例示性STOPS描述於國際公開案第WO2020/097342號及美國公開案第2020/0147124號中，兩者均以全文引用之方式併入。在一些實施例中，STOP為ALG-010133。在一些實施例中，本文所揭示之任一種ASO與替諾福韋共投與。在一些實施例中，本文所揭示之任一種ASO與CAM共投與。例示性CAM描述於Berke等人, Antimicrob Agents Chemother, 2017, 61(8):e00560-17；Klumpp等人, Gastroenterology, 2018, 154(3):652-662.e8；國際申請案第PCT/US2020/017974號、第PCT/US2020/026116號及第PCT/US2020/028349號以及美國申請案第16/789,298號、第16/837,515號及第16/849,851號，其中之每一者以全文引用之方式併入。在一些實施例中，CAM為ALG-000184、ALG-001075、ALG-001024、JNJ-632、BAY41-4109或NVR3-778。在一些實施例中，ASO與另一種藥劑同時投與。在一些實施例中，ASO與另一種藥劑依序投與。在一些實施例中，ASO在另一種藥劑投與之前投與。在一些實施例中，ASO在另一種藥劑投與之後投與。
定義
如本文所用，術語「患者」與「個體」係指待藉由本發明之方法治療的生物體。此類生物體較佳為哺乳動物(例如海洋動物、猿猴、馬科動物、牛科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物及其類似物)且更佳為人類。
如本文所用，術語「有效量」係指足以達成有益或所需結果之化合物(例如本發明之ASO)的量。有效量可在一次或多次投與、施用或給藥中投與且並不意欲限於特定調配或投與途徑。
如本文所用，術語「治療」包括引起病狀、疾病、病症及其類似者改善或其症狀減緩的任何效果，例如減輕、減少、調節、減緩或消除。
如本文所用，術語「緩解(alleviate/alleviating)」係指病狀的嚴重程度降低，諸如嚴重程度降低例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指活性劑與惰性或活性載劑之組合，此組合使得該組合物尤其適合於活體內或離體診斷或治療用途。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指任一種標準醫藥學載劑，諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液、水、乳液(例如諸如油/水或水/油乳液)，及各種類型的潤濕劑。組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見例如Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, Mack Publ.Co., Easton, PA [1975]。
如本文所用，術語「約」當提及可量測的值(例如體重、時間及劑量)時，意欲涵蓋所述值及+/-10%的範圍。舉例而言，「約10」應理解為「10」與「9至11」。
如本文所用，術語「核鹼基」或「鹼基」係指形成核苷的生物學含氮化合物。核鹼基之實例包括但不限於胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、及其類似物或衍生物。
在通篇說明書中，在將組合物描述為具有、包括或包含特定組分的情況下，或在將製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，另外考慮存在基本上由所例舉組分組成或由所例舉組分組成的本發明之組合物，且存在基本上由所例舉處理步驟組成或由所例舉處理步驟組成的根據本發明之製程及方法。
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之普通技術人員通常所理解相同的含義。儘管可使用與本文所述類似或等效的任何方法及材料來實施或測試本發明，但現描述代表性說明性方法及材料。
在提供值範圍的情況下，應瞭解，彼範圍之上限與下限之間的各中間值(除非上下文另外明確規定，否則至下限單位之十分之一)，及彼所述範圍內之任何其他所述或中間值，均涵蓋於本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內且亦涵蓋於本發明內，受所述範圍內之任何具體排除的限制。當所述範圍包含一個或兩個限值時，本發明亦包括排除彼等所含限值中之一者或兩者的範圍。
本發明不限於所述特定實施例，因此可變化。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不希望具有限制性，因為本發明之範圍將僅由隨附申請專利範圍限定。
如熟習此項技術者在閱讀本發明後將顯而易見，本文中所述及說明之個別實施例中的每一者具有離散組分及特徵，其可容易與其他若干實施例中之任一者的特徵分離或組合而不背離本發明之範圍或精神。任何所述方法均可以所述事件之次序或以邏輯上可能之任何其他次序來進行。
本說明書中所引用之所有公開案及專利係以引用之方式併入本文中，就如同特定地且單獨地指示各個別公開案或專利以引用之方式併入一般，且以引用之方式併入本文中以結合所引用之公開案揭示及描述方法及/或材料。對任何公開案之引用係關於其在申請日之前的揭示內容，且不應解釋為承認本發明無權先於依賴於先前發明之此類公開案。此外，所提供之公開案的日期可能與可能需要單獨確認之實際公開案日期不同。 實例
以下實例說明本發明之某些實施例以幫助熟習此項技術者實施本發明。因此，決不認為實例限制本發明之範圍。
實例1：ASO合成
間隔體ASO序列：DNA、2'-O-Me及LNA胺基亞磷酸酯單體購自市售來源(Hongene Biotech USA Inc.)。所有單體在真空乾燥器中用除濕劑(P 2O 5，RT 24h)乾燥。所附著的通用固體載體(CPG)獲自ChemGenes公司。合成工作流程用的化學物質及溶劑購自VWR/Sigma市售來源，且在不進行任何純化或處理之情況下使用。溶劑(乙腈)及溶液(亞醯胺酯及活化劑)在合成期間儲存在分子篩上。
在Expedite 8909合成儀上使用製造商書寫的標準循環(其中幾個等待步驟有修改且偶合步驟有修改)來合成對照及目標寡核苷酸序列。固體載體為可控孔徑玻璃且單體含有標準保護基團。根據標準固相胺基亞磷酸酯合成方案，使用市售5'- O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'- O-(2-氰基乙基- N,N-二異丙基) DNA、2'-OMe及/或6- N-苯甲醯基腺苷(A Bz)、5甲基4- N-苯甲醯基胞苷(C Bz)、2- N-異丁醯基鳥苷(G iBu)及尿苷(U)或胸苷(T)之LNA胺基亞磷酸酯單體個別地合成各種嵌合寡核苷酸。2'- O-Me-2,6-二胺基嘌呤胺基亞磷酸酯係購自Glen Research。製備胺基亞磷酸酯於無水乙腈中之0.1 M溶液。合成寡核糖核苷酸硫代磷酸酯時，5-乙硫基四唑用作活化劑，含3%二氯乙酸之二氯甲烷用於脫除三苯甲基，含乙酸酐之THF及含16% N-甲基咪唑之THF用於封端，且DDTT ((二甲胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮用作硫轉移劑。在5-(乙硫基)-1H-四唑活化劑存在下，使胺基亞磷酸酯於CH 3CN中之0.1 M溶液與固體結合之寡核苷酸發生延長的偶合，隨後進行延長的封端、氧化及脫除保護基，得到經修飾之寡核苷酸。所有經修飾之胺基亞磷酸酯的逐步偶合效率大於98.5%。
脫除保護基及自固體載體裂解係利用氨/甲胺(1:1，AMA)之混合物在65℃下維持15分鐘達成，當使用通用連接子時，在65℃下進行脫除保護基90分鐘，或將固體載體與氨水(28%)溶液一起在55℃下加熱8小時以將鹼不穩定型保護基團脫除。
在過濾移除固體載體之後，在GeneVac離心式蒸發器中真空移除脫除保護基溶液。
dA胺基亞磷酸酯
(5-Me)-dC胺基亞磷酸酯
dG胺基亞磷酸酯
dT胺基亞磷酸酯
2'-OMe-A胺基亞磷酸酯
2'-OMe-(5m)C胺基亞磷酸酯
2'-OMe-G胺基亞磷酸酯
2'-OMe-U胺基亞磷酸酯
鎖定核酸 (LNA) 胺基亞磷酸酯
LNA-A胺基亞磷酸酯
LNA(5m)C胺基亞磷酸酯
LNA-G胺基亞磷酸酯
LNA-T胺基亞磷酸酯
實例2：經修飾之間隔體序列
AmNA (N-Me)-T、AmNA (N-Me)-4- N-苯甲醯基(5m)胞苷((5m) C Bz)、AmNA (N-Me)-4- N-苯甲醯基胞苷(A Bz)及AmNA (N-Me)-2- N-pac (G pac)係購自Luxna Biotech，而scp-BNA-T、scp-BNA-6- N-苯甲醯基腺苷(A Bz)、scp-BNA-4- N-苯甲醯基-5甲基胞苷((5m) C Bz)、scp-BNA-2- N-異丁醯基鳥苷(G iBu)胺基亞磷酸酯單體係根據參考文獻中所述的程序合成(Takao Yamaguchi, Masahiko Horiba及Satoshi Obika; Chem.Commun.,2015, 51, 9737-9740；Masahiko Horiba, Takao Yamaguchi，及Satoshi Obika; Journal of Organic Chemistry,2016, 81, 11000-11008)。所有單體均在真空乾燥器中用除濕劑乾燥(KOH及P 2O 5，在室溫下持續24小時)。在AmNA(N-Me)-PS-DNA-PS及scp-BNA-PS-DNA-PS修飾之情況下，使用在無水CH 3CN中稀釋至0.12 M濃度之胺基亞磷酸酯單體，在針對固體結合之寡核苷酸的0.3 M 5-(苯甲硫基)-1H-四唑活化劑(偶合時間16分鐘)存在下，在1 μM規模下，在3'至5'方向上執行合成，隨後執行經修改之封端、氧化及脫除保護基，得到經修飾之寡核苷酸。所有經修飾之胺基亞磷酸酯的逐步偶合效率大於97%。DDTT (二甲胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮用作合成寡核糖核苷酸硫代磷酸酯之硫轉移劑。攜帶寡核苷酸之固體載體用含有20% DEA的乙腈溶液洗滌15分鐘，接著用MeCN充分洗滌管柱。載體與二異丙胺:水:甲醇(1:1:2)一起在加熱塊中於65℃下加熱8小時，以自載體裂解且脫除鹼不穩定保護基團。 AmNA (N-Me) 單體
AmNA-NCH 3-A胺基亞磷酸酯
AmNA-NCH 3-(5m)C胺基亞磷酸酯
AmNA-NCH 3-G胺基亞磷酸酯
AmNA-NCH 3-T胺基亞磷酸酯
scp-BNA 單體
scp-BNA-A胺基亞磷酸酯
scp-BNA-(5m)C胺基亞磷酸酯
scp-BNA-G胺基亞磷酸酯
scp-BNA-T胺基亞磷酸酯
使用不同長度的GalNAc部分合成5'及3'-GalNAc結合的寡核苷酸，例如如下文所述。在用1、2或3個部分合成期間，以與下文所述相同之方式使GalNAc3、GalNAc4、GalNAc5及GalNAc6與寡核苷酸結合。其他GalNAc部分，諸如本文中先前所述之GalNAc-1及GalNAc-2，亦用於形成5'及3'-GalNAc (利用合成後的結合)。 GalNAc 胺基亞磷酸酯
GalNAc構築嵌段 在與寡核苷酸連接之後(命名法)
GalNAc-3胺基亞磷酸酯 (GalNAc3-(PS)2-p)
GalNAc-4胺基亞磷酸酯 (GalNAc4-(PS)2-p)
GalNAc-5胺基亞磷酸酯    (GalNAc5-(PS)2-p)
GalNAc-6胺基亞磷酸酯 (GalNAc6-(PS)2-p)
粗寡聚物定量或原始分析
將樣品溶解於去離子水(1.0 mL)中且如下定量：首先在Nanodrop UV分光光度計上僅用水執行空白試驗。Nano Drop儀器可經由使用多種路徑長度量測寬濃度範圍之核酸。最準確的定量結果可藉由在260 nm吸光度下量測經稀釋之寡核苷酸來達成。粗物質在-20℃儲存。
粗HPLC/LC-MS分析
使用0.1 OD粗樣品進行粗物質MS分析。證實粗物質LC-MS資料之後，接著執行純化步驟。
HPLC純化
藉由陰離子交換HPLC純化磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)及經修飾之嵌合寡核苷酸。緩衝液為含20 mM磷酸鈉之10% CH 3CN，pH 8.5 (緩衝液A)；及含20 mM磷酸鈉之10% CH 3CN、1.8 M NaBr，pH 8.5 (緩衝液B)。彙集含有全長寡核苷酸之溶離份，去鹽且凍乾。
脂質結合的寡核苷酸藉由內部裝填的RPC-Source15逆相管柱來純化。緩衝液為含20 mM乙酸鈉之10% CH 3CN (緩衝液A)及CH 3CN (緩衝液B)。彙集含有全長寡核苷酸之溶離份，去鹽且凍乾。
經純化之寡聚物的去鹽
接著使用Sephadex G-25 M (Amersham Biosciences)將經純化之乾燥寡聚物去鹽。用10 mL去離子水將濾筒調節三次。在極緩慢逐滴溶離之情況下，將充分溶解於2.5 mL去離子水中之經純化之寡核苷酸施加至濾筒中。無鹽的寡聚物用3.5 ml去離子水直接溶離至螺旋蓋小瓶中。
最終HPLC及電噴霧LC/MS分析
將約0.10 OD的寡聚物溶解於水中且接著吸移至特殊小瓶中用於IEX-HPLC及LC/MS分析。分析型HPLC及ES LC-MS確定嵌合寡核苷酸之完整性。
GalNAc酯與寡核苷酸之合成後結合
5'-C6- 胺基前驅體合成
使用通用載體(負載量65 µmol/g)，以10 µmol規模合成序列。使用0.1 M乙腈中的6-(4-單甲氧基三苯甲基胺基)己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)-胺基亞磷酸酯在5'端引入C6-NH 2連接子，偶合時間為10分鐘。承載寡核苷酸的固體載體與氨水/甲胺(1:1)溶液一起在搖動器中、在室溫下加熱3小時，以便自載體裂解及脫除鹼不穩定性保護基團。在IEX純化及去鹽之後，使用C6-NH 2修飾之ASO執行合成後結合。 用於結合之GalNAc酯
GalNAc-1部分
GalNAc-2部分
5'-GalNAc合成之合成後結合 將5'-C6-NH 2修飾之序列溶解於0.2 M碳酸氫鈉緩衝液pH 8.5 (0.015 mM)中，且添加溶解於DMSO中之5至7 mol當量的GalNAc酯。在室溫下攪拌反應混合物4小時。分析樣本以證實是否存在任何未反應之經胺基修飾的ASO。向其中添加氨水(28 wt.%)(5倍反應體積)，且在室溫下攪拌2至3小時。在減壓下濃縮反應混合物，且將殘餘物溶解於水中且在強陰離子交換管柱上藉由HPLC純化。
實例3：HBsAg釋放分析活體外分析
將HepG2.2.15細胞(整合有四個HBV基因體之穩定細胞株)在具有10%胎牛血清(FBS)及1%青黴素/鏈黴素、1%麩醯胺酸、1%非必需胺基酸、1%丙酮酸鈉及250 μg/ml G418之DMEM培養基中維持。使細胞在37℃下、在5% CO 2氛圍中維持。對於HBsAg釋放分析而言，製備分析培養基：具有5% FBS、1%青黴素/鏈黴素、1%麩醯胺酸及1% DMSO的DMEM。在分析前一天，胰蛋白酶化HepG2.2.15細胞用分析培養基洗滌一次，以250 g旋轉5分鐘，再懸浮於分析培養基中，且將細胞於分析培養基中以每孔50,000個接種於經膠原蛋白塗覆之96孔盤中。次日，ASO用Opti-MEM、9-pt稀釋(3倍稀釋)且根據製造商手冊稀釋脂染胺RNAiMAX (Invitrogen)。將ASO稀釋液與RNAiMAX稀釋液混合，在室溫下置放5分鐘，且向96孔盤之各孔中添加15 µl。培養盤在培育箱中、在37℃、5% CO 2下擱置5天。培育之後，收集上清液且用ELISA套組(Diasino)量測HBsAg。用CellTiter-Glo (Promega)量測細胞存活率。使用Prism Graphpad計算相對於未處理細胞對照使HBsAg分泌減少50%所需之藥物濃度EC 50。使用相同軟體計算相對於未處理細胞對照使細胞存活率降低50%所需之藥物濃度CC 50。
表1中之化合物的所得EC 50及CC 50展示於下表2中。EC 50及CC 50值如下：A：＜1 nM，B：1-10 nM，C：10-100 nM，D：＞100 nM。
表2.HBsAg 釋放分析
ASO # HepG2.2.15 HBsAg 釋放分析EC 50(nM) HepG2.2.15 細胞存活率分析CC 50(nM)
1 B D
2 C D
3 B D
4 C D
5 B D
6 B D
7 B D
8 B D
9 B D
10 B D
11 D D
12 D D
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25 B C
26 A C
27 A D
28 B C
29 A C
30 A C
31 A C
32 B C
33 A D
34 A C
35 B D
36 B D
37 A C
38 A C
39 A C
40 A C
41 B D
42 B D
43 B D
44 B D
45 B D
46 B D
47 B D
48 C D
49 B D
50 B D
51 B D
52 A D
53 A D
54 A D
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64 B D
65 B D
66 B D
67 B D
68 B D
69 A D
70 B D
71 B D
72 B D
73 B D
74 C D
75 A D
76 A D
77 A D
78 B D
79 B D
80 A D
81 A D
82 A D
83 A D
84
85
86      
87      
另外，評估一些ASO對經HBV感染之人類初代肝細胞(PHH)的活體外力價。下表3提供來自此等實驗之例示性EC 50及CC 50資料。
表3. 經HBV 感染之PHH 的EC 50 及CC 50
ASO# EC 50(nM) CC 50(nM)
64 C D
65 C D
69 C D
實例4：解鏈溫度(T m)
評估本文所揭示之若干種例示性ASO的解鏈溫度，且代表性結果提供於下表4中。
表4. 解鏈溫度
ASO# T m( ℃)
64 74.3 (± 0.3)
65 77.9 (± 0.3)
69 79.4 (± 0.1)
實例5：活體內力價的改良
使用標準胺基亞磷酸酯化學方法，在ABI 394及Expedite 8909合成器上合成具有所揭示之化學物質的ASO。使用如上文所論述的HBsAg釋放分析，針對HepG2.2.15細胞執行ASO之活體外篩選。選擇某些ASO進行N-乙醯基半乳胺糖(GalNac)結合且在腺相關病毒(AAV)-HBV小鼠模型中以1 x 5 mg/kg進行單次劑量的測試。
表5顯示使用1x5mg/kg QW的例示性HBsAg最低點(相較於ASO 59)。在此等ASO的HBx區中，靶向包括HBx在內的所有HBV轉錄本(nmlnA對lnA的單一置換)改良HBsAg的最低點。
表5.HBsAg 最低點
ASO # 1x5 mg/kg 下的HBsAg 最低點
84  -0.63 log10 IU/ML
85  -0.66 log10 IU/ML
86  -0.48 log10 IU/ML
87  -0.44 log10 IU/ML
圖顯示ASO 59與ASO 87的例示性並列比較，後者含有nmlnA且前者含有lnA。如圖中可見，添加lnmnA使得力價改良。 ***** 表6 - 目標基因序列
SEQ ID NO: 描述 序列
89 B型肝炎病毒(Genbank登錄號KC315400.1) ctccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctcaagttccggaacagtaaaccctgctccgactactgcctctcccatatcgtcaatcttctcgaggactggggaccctgtaccgaatatggagagcaccacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagcacccacgtgtcctggccaaaatttgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggaacatcaactaccagcaccggaccatgcaaaacctgcacaactactgctcaagggacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggttttgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttatctttgggtatacatttaaaccctcacaaaacaaaaagatggggatattcccttaacttcatgggatatgtaattgggagttggggcactttgcctcaggaacatattgtacaaaaaatcaagcaatgttttaggaaacttcctgtaaacaggcctattgattggaaagtatgtcaacraattgtgggtcttttggggtttgccgcccctttcacgcaatgtggatatcctgctttaatgcctttatatgcatgtatacaagctaagcaggcttttactttctcgccaacttacaaggcctttctgtgtaaacaatatctgaacctttaccccgttgctcggcaacggtcaggtctttgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcttggccataggccatcagcgcatgcgtggaacctttgtggctcctctgccgatccatactgcggaactcctagcagcttgttttgctcgcagccggtctggagcaaaacttatcggcaccgacaactctgttgtcctctctcggaaatacacctcctttccatggctgctaggatgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtctacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccatctcggggccgtttgggactctaccgtccccttctgcgtctgccgttccgcccgaccacggggcgcacctctctttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttactgagtgggaggagttgggggaggaggttaggttaaaggtctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtgtgttcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacggcactcaggcaagcaattctgtgttggggtgagttaatgaatctagccacctgggtgggaagtaatttggaagatccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaacgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattgtggtttcacatttcctgtcttacttttgggagagaaactgttcttgaatatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcatatagaccacaaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgaagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggacacataaggtgggaaactttacggggctttattcttctacggtaccttgctttaatcctaaatggcaaactccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagacttaaattaattatgcctgctaggttttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccgtattatccagagtatgtagttaatcattacttccagacgcgacattatttacacactctttggaaggcggggatcttatataaaagagagtccacacgtagcgcctcattttgcgggtcaccatattcttgggaacaagatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgaaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccacacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcacccctcctcatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcatattcacaacagtgccagcagctcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttctctccacctctaagagacactcatcctcaggccatgcagtggaa
90 B型肝炎病毒(Genbank登錄號U95551.1) aattccacaacctttcaccaaactctgcaagatcccagagtgagaggcctgtatttccctgctggtggctccagttcaggagcagtaaaccctgttccgactactgcctctcccttatcgtcaatcttctcgaggattggggaccctgcgctgaacatggagaacatcacatcaggattcctaggaccccttctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggaactaccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcctgtcctccaacttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcctcaaccaccagcacgggaccatgccgaacctgcatgactactgctcaaggaacctctatgtatccctcctgttgctgtaccaaaccttcggacggaaattgcacctgtattcccatcccatcatcctgggctttcggaaaattcctatgggagtgggcctcagcccgtttctcctggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacagcatcttgagtccctttttaccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaaccctaacaaaacaaagagatggggttactctctgaattttatgggttatgtcattggaagttatgggtccttgccacaagaacacatcatacaaaaaatcaaagaatgttttagaaaacttcctattaacaggcctattgattggaaagtatgtcaacgaattgtgggtcttttgggttttgctgccccatttacacaatgtggttatcctgcgttaatgcccttgtatgcatgtattcaatctaagcaggctttcactttctcgccaacttacaaggcctttctgtgtaaacaatacctgaacctttaccccgttgcccggcaacggccaggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcttggtcatgggccatcagcgcgtgcgtggaaccttttcggctcctctgccgatccatactgcggaactcctagccgcttgttttgctcgcagcaggtctggagcaaacattatcgggactgataactctgttgtcctctcccgcaaatatacatcgtatccatggctgctaggctgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttacgtcccgtcggcgctgaatcctgcggacgacccttctcggggtcgcttgggactctctcgtccccttctccgtctgccgttccgaccgaccacggggcgcacctctctttacgcggactccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccaccgaatgttgcccaaggtcttacataagaggactcttggactctctgcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtttgtttaaagactgggaggagttgggggaggagattagattaaaggtctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacatcgacccttataaagaatttggagctactgtggagttactctcgtttttgccttctgacttctttccttcagtacgagatcttctagataccgcctcagctctgtatcgggaagccttagagtctcctgagcattgttcacctcaccatactgcactcaggcaagcaattctttgctggggggaactaatgactctagctacctgggtgggtgttaatttggaagatccagcatctagagacctagtagtcagttatgtcaacactaatatgggcctaaagttcaggcaactcttgtggtttcacatttcttgtctcacttttggaagagaaaccgttatagagtatttggtgtctttcggagtgtggattcgcactcctccagcttatagaccaccaaatgcccctatcctatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaacctcaatgttagtattccttggactcataaggtggggaactttactggtctttattcttctactgtacctgtctttaatcctcattggaaaacaccatcttttcctaatatacatttacaccaagacattatcaaaaaatgtgaacagtttgtaggcccacttacagttaatgagaaaagaagattgcaattgattatgcctgctaggttttatccaaaggttaccaaatatttaccattggataagggtattaaaccttattatccagaacatctagttaatcattacttccaaactagacactatttacacactctatggaaggcgggtatattatataagagagaaacaacacatagcgcctcattttgtgggtcaccatattcttgggaacaagatctacagcatggggcagaatctttccaccagcaatcctctgggattctttcccgaccaccagttggatccagccttcagagcaaacacagcaaatccagattgggacttcaatcccaacaaggacacctggccagacgccaacaaggtaggagctggagcattcgggctgggtttcaccccaccgcacggaggccttttggggtggagccctcaggctcagggcatactacaaactttgccagcaaatccgcctcctgcctccaccaatcgccagacaggaaggcagcctaccccgctgtctccacctttgagaaacactcatcctcaggccatgcagtgg
91 17β-HSD 13型編碼序列(Genbank登錄號NM 178135.5)(核苷酸42至944) ATGAACATCATCCTAGAAATCCTTCTGCTTCTGATCACCATCATCTACTCCTACTTGGAGTCGTTGGTGAAGTTTTTCATTCCTCAGAGGAGAAAATCTGTGGCTGGGGAGATTGTTCTCATTACTGGAGCTGGGCATGGAATAGGCAGGCAGACTACTTATGAATTTGCAAAACGACAGAGCATATTGGTTCTGTGGGATATTAATAAGCGCGGTGTGGAGGAAACTGCAGCTGAGTGCCGAAAACTAGGCGTCACTGCGCATGCGTATGTGGTAGACTGCAGCAACAGAGAAGAGATCTATCGCTCTCTAAATCAGGTGAAGAAAGAAGTGGGTGATGTAACAATCGTGGTGAATAATGCTGGGACAGTATATCCAGCCGATCTTCTCAGCACCAAGGATGAAGAGATTACCAAGACATTTGAGGTCAACATCCTAGGACATTTTTGGATCACAAAAGCACTTCTTCCATCGATGATGGAGAGAAATCATGGCCACATCGTCACAGTGGCTTCAGTGTGCGGCCACGAAGGGATTCCTTACCTCATCCCATATTGTTCCAGCAAATTTGCCGCTGTTGGCTTTCACAGAGGTCTGACATCAGAACTTCAGGCCTTGGGAAAAACTGGTATCAAAACCTCATGTCTCTGCCCAGTTTTTGTGAATACTGGGTTCACCAAAAATCCAAGCACAAGATTATGGCCTGTATTGGAGACAGATGAAGTCGTAAGAAGTCTGATAGATGGAATACTTACCAATAAGAAAATGATTTTTGTTCCATCGTATATCAATATCTTTCTGAGACTACAGAAGTTTCTTCCTGAACGCGCCTCAGCGATTTTAAATCGTATGCAGAATATTCAATTTGAAGCAGTGGTTGGCCACAAAATCAAAATGAAATGA
92 MCJ mRNA (Genbank登錄號NM_013238.3) agtcactgccgcggcgccttgagtctccgggccgccttgccatggctgcccgtggtgtcatcgctccagttggcgagagtttgcgctacgctgagtacttgcagccctcggccaaacggccagacgccgacgtcgaccagcagagactggtaagaagtttgatagctgtaggactgggtgttgcagctcttgcatttgcaggtcgctacgcatttcggatctggaaacctctagaacaagttatcacagaaactgcaaagaagatttcaactcctagcttttcatcctactataaaggaggatttgaacagaaaatgagtaggcgagaagctggtcttattttaggtgtaagcccatctgctggcaaggctaagattagaacagctcataggagagtcatgattttgaatcacccagataaaggtggatctccttacgtagcagccaaaataaatgaagcaaaagacttgctagaaacaaccaccaaacattgatgcttaaggaccacactgaaggaaaaaaaaagaggggacttcgaaaaaaaaaaaagccctgcaaaatattctaaaacatggtcttcttaattttctatatggattgaccacagtcttatcttccaccattaagctgtataacaataaaatgttaatagtcttgctttttattatcttttaaagatctccttaaattctataactgatcttttttcttattttgtttgtgacattcatacatttttaagatttttgttatgttctgaattcccccctacacacacacacacacacacacacacacacacgtgcaaaaaatatgatcaagaatgcaattgggatttgtgagcaatgagtagacctcttattgtttatatttgtaccctcattgtcaatttttttttagggaatttgggactctgcctatataaggtgttttaaatgtcttgagaacaagcactggctgatacctcttggagatatgatctgaaatgtaatggaatttattaaatggtgtttagtaaagtaggggttaaggacttgttaaagaaccccactatctctgagaccctatagccaaagcatgaggacttggagagctactaaaatgattcaggtttacaaaatgagccctgtgaggaaaggttgagagaagtctgaggagtttgtatttaattatagtcttccagtactgtatattcattcattactcattctacaaatatttattgaccccttttgatgtgcaaggcactatcgtgcgtcccctgagagttgcaagtatgaagcagtcatggatcatgaaccaaaggaacttatatgtagaggaaggataaatcacaaatagtgaatactgttagatacagatgatatattttaaaagttcaaaggaagaaaagaatgtgttaaacactgcatgagaggaggaataagtggcatagagctaggctttagaaaagaaaaatattccgataccatatgattggtgaggtaagtgttattctgagatgagaattagcagaaatagatatatcaatcggagtgattagagtgcagggtttctggaaagcaaggtttggacagagtggtcatcaaaggccagccctgtgacttacactgcattaaattaatttcttagaacatagtccctgatcattatcactttactattccaaaggtgagagaacagattcagatagagtgccagcattgtttcccagtattcctttacaaatcttgggttcattccaggtaaactgaactactgcattgtttctatcttaaaatactttttagatatcctagatgcatctttcaacttctaacattctgtagtttaggagttctcaaccttggcattattgacatgttaggccaaataattttttttgtgggaggtctcttgtgcgttttagatgattagcaataatccctgacctgttatctactaaagactagtcgtttctcatcagttgtgacaacaaaaatggttccagatattgccaaatgccctttagaggacagtaatcgcccccagttgagaaccatttcagtaaaactttaattactattttttcttttggtttataaaataatgatcctgaattaaattgatggaaccttgaagtcgataaaatatatttcttgctttaaagtccccatacgtgtcctactaattttctcatgctttagtgttttcacttttctcctgttatccttgtacctaagaatgccatcccaatccccagatgtccacctgcccaaagtctaggcatagctgaaggccaagctaaaatgtatccctctttttctggtacatgcagcaaaagtaatatgaattatcagctttctgagagcaggcattgtatctgtcttgtttggtgttacattggcacccaataaatatttgttgagtgaatgaataaattcccatagcactttattcttcacatggtacataactataggggctatagcttggtaccttgtgaagcaactcttggtgtaacataccttatttctcatactaaaatgcaagaacctttagagcaaggatcttgccattcatctttgtaacctctttactctggagcacttgcatttagcaggcatcataaagttttacgtaccaagaaaatgttgctgttttctgaatactatgcatcaaaaaatgttaccactaatttttaaagctctgctaaggaatattggggcaccctcagatgcaccttttaattgatgtcatattttcctaatccatactttattcatgagaatttgagtcaccccagcattagcttggaatttccttatttcccatttgctttgcaggtgccttggagtcagatctggttttgaatactatcttcctgttatgtgatcttgggcagttacttaattttctagtcaataacccgtatctataaaatagagaaaataatcctacacaccggggcctgttgtggggcggggagaggggggagggatcgcatttggagatatactaatgtaaatgacaagttaattggtgcagcacaccaacatggctcatgtctacatatgtaacaaacctgcacgttgtgcacatgtgccctagaacttaaagtataataaaaagaaattttaaaaaatcctgtcaaataaggttatagtagagaataaggatgtgtaaagcatttagtcacgtaaatgcttaaaaaaatgtaatttttacttctttcactgcctcatttaattagttttatctttaataataccttggattcagggtaaagtttcagttatgtcccagtaatcatttattttaccctcgaatctgcaatttggatagaacatggtggggacagctcgtctctattccttgcagcattaacaggctggaggcaccacttctctggccagcaagttgggcctggttgttggctgagagcctcagttcctttctgcacaggttcctctttacataggcttctcaacagggctactagagcatcgtcaccatagcagctgtcttataacagagagtggtcggtctgagagacaaaaaatggaagctgccaaattgttctgggtctggaaactgtcagggcatcacttgtgccatattcagttggcctaagaattacagagcctgcctcgattcaaagggagaggatagagaggactgaaggaatcagtgctcatctttaatatgcagcaggacaggtttgggattttttttcccccttgagtctgtgaaggcattacttaagaacaaagtcaggcatgtataattgaactacagttacttgaaatataagcccagaaagtttcagataataaatacaactatttttctgctgttacccttgtacctaaagatgccatcctaatccccagatctccacaactatacctacatagtagaaggttaaaatgtatccctctttttctggtgcatccagcaaaagtaatatcatgaattatgagctctctgagagcaaggatcatatcagtcttgtttattgttgcagtgaacaagtacagttgcagatattcaggagtaattatctaaatggcagtaggcttataaaactgaattttcaccagccacaccctccccccaactccttatctgtaaaaagcttatttgagtggttacctgtcttcagtaaagattgcgcttgcatatttgctgtcattgcatattctgcttaattaagctctgttgatattgcagtttctgtgcatacttacatcttagatgcaatctgagggcctaggaaggccttttaaaaataaaacaattccgattgcagagaaagtgtaagtcaaggacagttaattcaaggggaacatagaaagctatttagattttagttgatggtgccagtcttcagcgtaaagtcaaaagtggagggaagtttagtaaggaaaaaatgttgggcttggaatacattgtttagtcttcaaagcactttactttttatgaaatatattttagacattcagcaaatattgaatacttactatatcaggcagtaaagatataaattcattcttaaaatgtgcaacatgttcaaactgaaaaaaatacattcttaaacaggaaactttttccttcatactttttaattaacaagacatataagagttgcattaatgggcgtgcttatgattgatcacccagcagcatcattagaaataatatattttattcatgtgcagaaatcttttggttgtcctggggaaccttgaacacagaaaagagcttttattgataaggtaattgaacacacttgacaattagcttaatatggtttaataccatttgtgggagaagatgaatcagccaggctctttacgtcaagaatatgaagtttctcttgagtcaaccaacttaagatgagctacggagactgcagtgaaaagttaaatatccaagtacaccagccaatttcacacagtggaaccatgctgtcctcgggcaccctgcacctcgcccaacagtcatcaactagatggaggctcctggctgcaaggaggatttgatgggaatgagtaaatgtgtcagcatagtccgtcccttctaatggaaaagcaacccaaagagcaaatcctattaatggctggatcagtatcatctacttgtcaaaaacattccatgaattatgagtcaaaattttatttatggtggcattacacacattaagagatgaggacttctgttagcataatttattagctggaaaagttgagaaggttctctggactcatttttataggtggaacctaagtgatctggataattgcccaccagcaaaattgctgggcatggtggacaaagaaaatgttccttctaatgattttttatgagctgagtagctattgttcccagctgagtgctcttttcctctttttattgttgctgagcaaaagaatttataaaaagctctttcttttgtattaaaaaccctgctcaattgaaatgcaagttcattaagtaatcttcatttctcttcctgccataataaccctttccctctctgttcgattcaacagtatctagcagcactgctccaaattttaagtctgaacagactatattacatagatgtagagaaatactcaatcttcagcattaagagggagcttaatttcacacgggtggaatatgatcactcaggctagatgttggccataaatttcaaattagtatctcaacttagcaggggggatcaacagtggcaaacttcaattatgacaggataaaaatcacatagagatattggttcaatatggacatctaaactataatgctaaaagccaataattagaataagttcattttaagaaaagcattaataatattagctaacgtttagtacctgtgccaaacattctacctatgttaccttgattttcatagccagcctaagaggtactattatgtatccccattttacaggttaagaaacaggctcagaggagtttaggatcttttccaagattacatagccagtaagtggtggcactaggaaccaaattcagactctgaatcgcatgctgtttatattatattgcactcattctaaatatgtgggaatcagaatgaaggggcttgtatgacttttggctcattttttgatgcatgtgacctgggattataaatgtgaaattaggtttacgaaaggatccagtgtcattgtgcatcatgggcaaggagtacctaatctctttaattcttccctggaagcttacgatgtccatccaagtgcacatagcaaaagttctgttgtaaagtttagcagagtgactttctttgactcagagtgatgacggaggaagctttgataagattttatctgaaatgttcatggacaagagctttcaaggagaacatccagagcaaggttctgaagacagctcatgaaggtgaagcagcagacctggcacaagaaatgaagagagagctcagtgtattaaagatgaaaacaagaaaaccgaatatattgaaaggagcagagaggcaatgaaaacaagacaactgaaatgaggtaacttgcagcaattgaaagggaatttcagtacttttatagaattcttaaaaattgtttcctgctgtttattttcaattttgaacagggttatttgtccatgccatactttttttgccaaattccaaaattgtgtatagttctatagttgtctggtggagtcaatggaactttagttaccagtctaagaatgtgtctttgagattgtccagttaattctctatttccagtagctgtaataaatggtgaaaaggtttctgactcctggagaaagtttctaactccttatgactaatattcataacagacttgtgagttccttgaacatggatacacctatatgcaagagtgtattccaaagctaactcagtgatctttccatttatctattcttggattagtggtgcctttgctctttccttctgtaaatgtgaatagttaagagttgactgcagaagtgtttacactttggcttccatgcctctggaatgtttgtgctttggtggtgagatgtgagactatatttgtatagtctgcatctctcaggctgccccagaatgttgtacagtgcagtgctgaagaaagcagcaggtacacacagaaatgcagcctttcctggttaaccctgcttggatctgagttacactttgtttcctgacttcttgggacttaggtaatcagtttgccttctactctatctcattttgtactcgcttacatactacattcttgtttgggctttcgtttcttcttgtaagcagagattttttaaaatccaatatgtgaaaatacggatgcactacaattaaataaataaaatgctgttgtgtttgttttgctttaaaattgtaaaggataaacaataagatagttttatctatgtggttttcccgatgcagttaaaataaaacctaatctgctaaaattgaa
93 TAZ (GenBank登錄號NM_000116.5) gctttccggcggttgcaccgggccggggtgccagcgcccgccttcccgtttcctcccgttccgcagcgcgcccacggcctgtgaccccggcgaccgctccccagtgacgagagagcggggccgggcgctgctccggcctgacctgcgaagggacctcggtccagtcccctgttgcgccgcgcccccgtccgtccgtgcgcgggccagtcaggggccagtgtctcgagcggtcgaggtcgcagacctagaggcgccccacaggccggcccggggcgctgggagcgccggccgcgggccgggtggggatgcctctgcacgtgaagtggccgttccccgcggtgccgccgctcacctggaccctggccagcagcgtcgtcatgggcttggtgggcacctacagctgcttctggaccaagtacatgaaccacctgaccgtgcacaacagggaggtgctgtacgagctcatcgagaagcgaggcccggccacgcccctcatcaccgtgtccaatcaccagtcctgcatggacgaccctcatctctgggggatcctgaaactccgccacatctggaacctgaagttgatgcgttggacccctgcagctgcagacatctgcttcaccaaggagctacactcccacttcttcagcttgggcaagtgtgtgcctgtgtgccgaggagcagaatttttccaagcagagaatgaggggaaaggtgttctagacacaggcaggcacatgccaggtgctggaaaaagaagagagaaaggagatggcgtctaccagaaggggatggacttcattttggagaagctcaaccatggggactgggtgcatatcttcccagaagggaaagtgaacatgagttccgaattcctgcgtttcaagtggggaatcgggcgcctgattgctgagtgtcatctcaaccccatcatcctgcccctgtggcatgtcggaatgaatgacgtccttcctaacagtccgccctacttcccccgctttggacagaaaatcactgtgctgatcgggaagcccttcagtgccctgcctgtactcgagcggctccgggcggagaacaagtcggctgtggagatgcggaaagccctgacggacttcattcaagaggaattccagcatctgaagactcaggcagagcagctccacaaccacctccagcctgggagataggccttgcttgctgccttctggattcttggcccgcacagagctggggctgagggatggactgatgcttttagctcaaacgtggcttttagacagatttgttcatagaccctctcaagtgccctctccgagctggtaggcattccagctcctccgtgcttcctcagttacacaaaggacctcagctgcttctcccacttggccaagcagggaggaagaagcttaggcagggctctctttccttcttgccttcagatgttctctcccaggggctggcttcaggagggagcatagaaggcaggtgagcaaccagttggctaggggagcagggggcccaccagagctgtggagaggggaccctaagactcctcggcctggctcctacccaccgcccttgccgaaccaggagctgctcactacctcctcagggatggccgttggccacgtcttccttctgcctgagcttcccccccaccacaggccctttcctcaggcaaggtctggcctcaggtgggccgcaggcgggaaaagcagcccttggccagaagtcaagcccagccacgtggagcctagagtgagggcctgaggtctggctgcttgcccccatgctggcgccaacaacttctccatcctttctgcctctcaacatcacttgaatcctagggcctgggttttcatgtttttgaaacagaaccataaagcatatgtgttggcttgttgtaaaa
94 ANGPTL3 (GenBank登錄號NM_014495.4) agaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaaaatcaagataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgatcaagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagacgaagggccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaaccagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaacctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaacttttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagaccgtggaagaccaatataaacaattaaaccaacagcatagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctcagaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaacatgatggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggcatgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttatatcaggtagtccatggacattaattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggttttgggaggcttgatggagaattttggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattatgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgggaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaatgtccccaatgcaatcccggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcaactgtccagagggttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatataacaaaccaagagcaaaatctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaatggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaatgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagttaatgtggtctaataatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaatagattttttttatcttaaagtcactgtctatttaagattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataatactatttgttttaaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatcaataggtgaacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattttaaaaggcatcatatgagctaatatcacaactttcccagtttaaaaaactagtactcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagaggactggtaattgtacagttcttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagtatgtgtaaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatttggagtaaatgtttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaatactgtattaaaataagttcgctgtctttaaacaaatggagatgactactaagtcacattgactttaacatgaggtatcactataccttatttgttaaaatatatactgtatacattttatatattttaacacttaatactatgaaaacaaataattgtaaaggaatcttgtcagattacagtaagaatgaacatatttgtggcatcgagttaaagtttatatttcccctaaatatgctgtgattctaatacattcgtgtaggttttcaagtagaaataaacctcgtaacaagttactgaacgtttaaacagcctgacaagcatgtatatatgtttaaaattcaataaacaaagacccagtccctaaattatagaaatttaaattattcttgcatgtttatcgacatcacaacagatccctaaatccctaaatccctaaagattagatacaaattttttaccacagtatcacttgtcagaatttatttttaaatatgattttttaaaactgccagtaagaaattttaaattaaacccatttgttaaaggatatagtgcccaagttatatggtgacctacctttgtcaatacttagcattatgtatttcaaattatccaatatacatgtcatatatatttttatatgtcacatatataaaagatatgtatgatctatgtgaatcctaagtaaatattttgttccagaaaagtacaaaataataaaggtaaaaataatctataattttcaggaccacagactaagctgtcgaaattaacgctgatttttttagggccagaataccaaaatggctcctctcttcccccaaaattggacaatttcaaatgcaaaataattcattatttaatatatgagttgcttcctctatttggtttcc
95 DGAT2 (GenBank登錄號NM_001253891.1) tgccccgttgtgaggtgataaagtgttgcgctccgggacgccagcgccgcggctgccgcctctgctggggtctaggctgtttctctcgcgccaccactggccgccggccgcagctccaggtgtcctagccgcccagcctcgacgccgtcccgggacccctgtgctctgcgcgaagccctggccccgggggccggggcatgggccaggggcgcggggtgaagcggcttcccgcggggccgtgactgggcgggcttcagccatgaagaccctcatagccgcctactccggggtcctgcgcggcgagcgtcaggccgaggctgaccggagccagcgctctcacggaggacctgcgctgtcgcgcgaggggtctgggagatggggagtggcctgcagtgccatcctcatgtacatattctgcactgattgctggctcatcgctgtgctctacttcacttggctggtgtttgactggaacacacccaagaaaggtggcaggaggtcacagtgggtccgaaactgggctgtgtggcgctactttcgagactactttcccatccagctggtgaagacacacaacctgctgaccaccaggaactatatctttggataccacccccatggtatcatgggcctgggtgccttctgcaacttcagcacagaggccacagaagtgagcaagaagttcccaggcatacggccttacctggctacactggcaggcaacttccgaatgcctgtgttgagggagtacctgatgtctggaggtatctgccctgtcagccgggacaccatagactatttgctttcaaagaatgggagtggcaatgctatcatcatcgtggtcgggggtgcggctgagtctctgagctccatgcctggcaagaatgcagtcaccctgcggaaccgcaagggctttgtgaaactggccctgcgtcatggagctgacctggttcccatctactcctttggagagaatgaagtgtacaagcaggtgatcttcgaggagggctcctggggccgatgggtccagaagaagttccagaaatacattggtttcgccccatgcatcttccatggtcgaggcctcttctcctccgacacctgggggctggtgccctactccaagcccatcaccactgttgtgggagagcccatcaccatccccaagctggagcacccaacccagcaagacatcgacctgtaccacaccatgtacatggaggccctggtgaagctcttcgacaagcacaagaccaagttcggcctcccggagactgaggtcctggaggtgaactgagccagccttcggggccaattccctggaggaaccagctgcaaatcacttttttgctctgtaaatttggaagtgtcatgggtgtctgtgggttatttaaaagaaattataacaattttgctaaaccattacaatgttaggtcttttttaagaaggaaaaagtcagtatttcaagttctttcacttccagcttgccctgttctaggtggtggctaaatctgggcctaatctgggtggctcagctaacctctcttcttcccttcctgaagtgacaaaggaaactcagtcttcttggggaagaaggattgccattagtgacttggaccagttagatgattcactttttgcccctagggatgagaggcgaaagccacttctcatacaagcccctttattgccactaccccacgctcgtctagtcctgaaactgcaggaccagtttctctgccaaggggaggagttggagagcacagttgccccgttgtgtgagggcagtagtaggcatctggaatgctccagtttgatctcccttctgccacccctacctcacccctagtcactcatatcggagcctggactggcctccaggatgaggatgggggtggcaatgacaccctgcaggggaaaggactgccccccatgcaccattgcagggaggatgccgccaccatgagctaggtggagtaactggtttttcttgggtggctgatgacatggatgcagcacagactcagccttggcctggagcacatgcttactggtggcctcagtttaccttccccagatcctagattctggatgtgaggaagagatccctcttcagaaggggcctggccttctgagcagcagattagttccaaagcaggtggcccccgaacccaagcctcacttttctgtgccttcctgagggggttgggccggggaggaaacccaaccctctcctgtgtgttctgttatctcttgatgagatcattgcaccatgtcagacttttgtatatgccttgaaaataaatgaaagtgagaatcctctaaaaaaaaaaaa
無
圖(Fig.)顯示所選ASO對LNA-DNA-LNA親體的活體內力價改良。G01為媒劑，其以5 mL/kg SC給予；G02為ASO 59，其在第0天以5 mg/kg SC給予一次；G-04為ASO 84，其在第0天以5 mg/kg SC給予一次。

Claims (43)

  1. 一種反義寡核苷酸(ASO)，其包含14至22個核苷酸單元及： (a)中心區域(B')，其包含6個或更多個鄰接DNA核苷酸； (b) 5'-翼區(A')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷；以及 (c) 3'-翼區(C')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷； 其中該ASO之該中心區域與目標RNA序列至少80%互補或雜交；且其中該ASO包含至少一個經修飾之核苷酸，其選自： (N-三級丁基-胍(Gutb))，其中B為核鹼基， (N甲基-LNA (Nmln))，其中B為核鹼基， (G形夾)，及 (5(Me)-丙炔基(5prnl))。
  2. 如請求項1之ASO，其中(i)該中心區域(B')包含選自G形夾及5prnl的經修飾之核苷酸，(ii)該5'-翼區(A')包含選自Gutb及Nmln的經修飾之核苷酸，(iii)該3'-翼區(C')包含選自Gutb及Nmln的經修飾之核苷酸，或(iv)其任何組合。
  3. 如請求項1或2之ASO，其中該中心區域(B')包含2、3、4、5或6個或更多個經修飾之核苷酸。
  4. 如請求項1至3中任一項之ASO，其中該5'-翼區(A')、該3'-翼區(C')或兩者均包含選自Gutb、Nmln、G形夾及5prnl的經修飾之核苷酸。
  5. 如請求項1至4中任一項之ASO分子，其中該ASO分子進一步包含1個或多個硫代磷酸酯(ps)核苷間鍵聯、甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯或其組合。
  6. 如請求項1至5中任一項之ASO分子，其中該ASO分子進一步包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個硫代磷酸酯(ps)核苷間鍵聯、甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯或其組合。
  7. 一種反義寡核苷酸(ASO)，其包含14至22個核苷酸單元，其中該ASO包含： (a)中心區域(B')，其包含6個或更多個鄰接DNA核苷酸，其中至少一個鄰接DNA核苷酸為經修飾之核苷酸， (b) 5'-翼區(A')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷，以及 (c) 3'-翼區(C')，其包含2至6個鎖定核苷酸或2'位經取代之核苷， 其中該ASO之該中心區域與目標RNA序列至少80%互補或雜交，且其中該ASO包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷間鍵聯。
  8. 如請求項7之ASO，其中該ASO包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個或至少5個或更多個選自以下的核苷酸： (N-三級丁基-胍(Gutb))，其中B為核鹼基， (N甲基-LNA (Nmln))，其中B為核鹼基， (G形夾)，及 (5(Me)-丙炔基(5prnl))。
  9. 如請求項7或8之ASO分子，其中該ASO分子進一步包含1個或多個硫代磷酸酯(ps)核苷間鍵聯。
  10. 如請求項1至9中任一項之ASO分子，其中： (i)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於該ASO分子之5'端的核苷位置3與4之間； (ii)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於該ASO分子之5'端的核苷位置5與6之間； (iii)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於該ASO分子之5'端的核苷位置6與7之間； (iv)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於該ASO分子之5'端的核苷位置7與8之間； (v)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於該ASO分子之5'端的核苷位置8與9之間； (vi)至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯介於該ASO分子之5'端的核苷位置9與10之間；或 (vii)其組合。
  11. 如請求項1至10中任一項之ASRO，其中該5'-翼區(A')、該3'-翼區(C')或兩者均包含至少一個甲磺醯基胺基磷酸酯(yp)核苷酸間鍵聯。
  12. 如請求項1至11中任一項之ASO分子，其中該ASO分子進一步包含半乳胺糖。
  13. 如請求項12之ASO分子，其中該半乳胺糖為式(VI)之N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)： ，其中 m為1、2、3、4或5； 各n獨立地為1或2； p為0或1； 各R獨立地為H； 各Y獨立地選自-O-P(=O)(SH)-、-O-P(=O)(O)-、-O-P(=O)(OH)-及-O-P(S)S-； Z為H或第二保護基； L為連接子，或L與Y之組合為連接子；且 A為H、OH、第三保護基、活化基團或寡核苷酸。
  14. 如請求項12之ASO分子，其中該半乳胺糖為式(VII)之N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)： ，其中R z為OH或SH；且各n獨立地為1或2。
  15. 如請求項1至14中任一項之ASO分子，其中： (i)該目標RNA序列為病毒基因； (ii)該目標RNA序列為來自DNA病毒的基因； (iii)該目標RNA序列為來自雙股DNA (dsDNA)病毒的基因； (iv)該目標RNA序列為來自嗜肝DNA病毒的基因； (v)該目標RNA序列為來自B型肝炎病毒(HBV)的基因； (vi)該目標RNA序列為來自基因型A至J中任一者之HBV的基因；或 (vii)該目標RNA序列係選自HBV之S基因或X基因。
  16. 如請求項1至14中任一項之ASO分子，其中該目標RNA序列係選自編碼甲基化可控J蛋白(MCJ蛋白)之基因、編碼TAZ之基因、編碼血管生成素樣3 (ANGPTL3)之基因、編碼二醯基甘油醯基轉移酶2 (DGAT2)之基因及編碼羥基類固醇17-β去氫酶13 (HSD17B13)之基因。
  17. 如請求項1至16中任一項之ASO分子，其中(i)該ASO之該5'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接的鎖定核苷；(ii)該ASO之該3'-翼區包含2至6個經硫代磷酸酯連接的鎖定核苷；或(iii)其組合。
  18. 如請求項17之ASO，其中該等鎖定核苷係選自LNA、ScpBNA、AmNA、AmNA (N-Me)、GuNA、GuNA (N-R 11)，其中R 11係選自Me、Et、 i-Pr、 t-Bu及其組合。
  19. 如請求項1至18中任一項之ASO分子，其中該ASO之該中心區域包含至少5個經硫代磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸、至少5個經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸，或至少5個經一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵聯及一個或多個甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯連接的鄰接DNA核苷酸。
  20. 如請求項5至19中任一項之ASO分子，其中該ASO之該中心區域包含8至10個經硫代磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸、8至10個經甲磺醯基胺基磷酸酯連接之鄰接DNA核苷酸，或8至10個經一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵聯及一個或多個甲磺醯基胺基磷酸酯核苷間鍵聯連接的DNA核苷酸。
  21. 如請求項1至20中任一項之ASO，其中該ASO包含至少一個具有以下結構的經修飾之核苷酸： (「(2s)T」)、 (「(5OH)C」)、 (「(8nh)A」)、 (「(8nh)G」)，或 ， 其中： R為鹵素或R'-C≡C-；且 R'為C 6-12芳基、5員至12員雜芳基、羥基-C 1-6烷基或C 1-7烷醯基氧基。
  22. 如請求項1至21中任一項之ASO，其中該ASO包含至少一個具有以下結構的經修飾之核苷酸： 其中： W獨立地為O、N或S； R 1、R 2及R 5獨立地為H或D； R 3為H或F； R 4為F或OCH 3；且 鹼基為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 或 其中： R為鹵素或R'-C≡C-；且 R'表示C 6-12芳基、5員至12員雜芳基、羥基-C 1-6烷基，或C 1-7烷醯基氧基。
  23. 一種如表1中所示的ASO分子。
  24. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之ASO分子；及醫藥學上可接受之賦形劑。
  25. 如請求項24之醫藥組合物，其進一步包含2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個如請求項3至22中任一項之ASO分子。
  26. 如請求項24或25之醫藥組合物，其進一步包含另一種治療劑。
  27. 如請求項26之醫藥組合物，其中該另一種治療劑係選自核苷酸類似物、核苷類似物、衣殼組裝調節劑(CAM)、重組干擾素、進入抑制劑、小分子免疫調節劑及寡核苷酸療法，其中該寡核苷酸療法視情況選自另一種反義寡核苷酸(ASO)、短干擾核酸(siNA)、NAP或STOPS TM。
  28. 一種治療患有B型肝炎病毒(HBV)感染之個體的方法，其包含向存在HBV之該個體投與如請求項1至23中任一項之ASO或如請求項24至27中任一項之醫藥組合物。
  29. 如請求項28之方法，其進一步包含投與另一種治療劑。
  30. 如請求項29之方法，其中該另一種治療劑係選自核苷酸類似物、核苷類似物、衣殼組裝調節劑(CAM)、重組干擾素、進入抑制劑、小分子免疫調節劑及寡核苷酸療法，其中該寡核苷酸療法視情況選自另一種反義寡核苷酸(ASO)、短干擾核酸(siNA)、NAP或STOPS TM。
  31. 如請求項28之方法，其中該另一種治療劑係選自由以下組成之群：包括ALG-010133、ALG-000184、重組干擾素α2b、IFN-a、PEG-IFN-a-2a、拉米夫定(lamivudine)、替比夫定(telbivudine)、阿德福韋雙匹酯(adefovir dipivoxil)、克來夫定(clevudine)、因提弗(entecavir)、替諾福韋阿拉芬胺(tenofovir alafenamide)、替諾福韋雙索酯(tenofovir disoproxil)、NVR3-778、BAY41-4109、JNJ-632、JNJ-3989 (ARO-HBV)、RG6004、GSK3228836、REP-2139、REP-2165、AB-729、VIR-2218、DCR-HBVS、JNJ-6379、GLS4、ABI-HO731、JNJ-440、NZ-4、RG7907、EDP-514、AB-423、AB-506、ABI-H03733及ABI-H2158。
  32. 如請求項28至31中任一項之方法，其中該ASO與該另一種治療劑同時或連續投與。
  33. 如請求項28至32中任一項之方法，其中該治療包含降低該個體的HBV病毒載量、降低該個體的病毒抗原水平，或其組合。
  34. 一種減少個體中之目標基因表現的方法，其包含向該個體投與如請求項1至23中任一項之ASO或如請求項24至27中任一項之醫藥組合物。
  35. 如請求項34之方法，其中該目標基因為該個體內源的基因或該目標基因對於該個體而言不為內源的。
  36. 如請求項34或35之方法，其中該個體患有選自以下之疾病：B型肝炎病毒(HBV)、冠狀病毒感染及肝臟疾病，其中該肝臟疾病視情況選自非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)及肝細胞癌(HCC)。
  37. 如請求項28至36中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物，視情況為成人。
  38. 如請求項28至37中任一項之方法，其中該ASO係以至少1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg或15 mg/kg的劑量投與。
  39. 如請求項28至38中任一項之方法，其中該ASO係以0.5 mg/kg至50 mg/kg、0.5 mg/kg至40 mg/kg、0.5 mg/kg至30 mg/kg、1 mg/kg至50 mg/kg、1 mg/kg至40 mg/kg、1 mg/kg至30 mg/kg、1 mg/kg至20 mg/kg、3 mg/kg至50 mg/kg、3 mg/kg至40 mg/kg、3 mg/kg至30 mg/kg、3 mg/kg至20 mg/kg、3 mg/kg至15 mg/kg、3 mg/kg至10 mg/kg、4 mg/kg至50 mg/kg、4 mg/kg至40 mg/kg、4 mg/kg至30 mg/kg、4 mg/kg至20 mg/kg、4 mg/kg至15 mg/kg、4 mg/kg至10 mg/kg、5 mg/kg至50 mg/kg、5 mg/kg至40 mg/kg、5 mg/kg至30 mg/kg、5 mg/kg至20 mg/kg、5 mg/kg至15 mg/kg，或5 mg/kg至10 mg/kg之間的劑量投與。
  40. 如請求項28至39中任一項之方法，其中該ASO投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
  41. 如請求項28至40中任一項之方法，其中該ASO一天投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次、一週投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或一個月投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
  42. 如請求項28至41中任一項之方法，其中該ASO每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天投與至少一次。
  43. 如請求項28至42中任一項之方法，其中該ASO投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、51、52、53、54或55週之時段。
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