CN115873951A

CN115873951A - 一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2及检测引物和应用

Info

Publication number: CN115873951A
Application number: CN202211473183.XA
Authority: CN
Inventors: 王磊; 孙雷
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，本发明提供了一种前列腺癌增殖标志物tRF‑Gly‑TCC‑2及检测引物和应用，所述标志物tRF‑Gly‑TCC‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过检测前列腺组织中tRF‑Gly‑TCC‑2相对表达量，可以评判前列腺癌细胞的增殖水平。若检测样本中tRF‑Gly‑TCC‑2相对含量明显高于对照样本中tRF‑Gly‑TCC‑2相对含量，提示前列腺癌细胞处于增殖状态。本发明的标志物敏感性高、特异性强，弥补了血清PSA检测、超声、核磁共振等检测方法的不足之处。

Description

一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2及检测引物和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2及检测引物和应用。

背景技术

2016年Nature Genetics杂志报道了tRNA是一种高丰度的、广泛存在的、被动参与的mRNA解码器及蛋白翻译元件。tRNA通过其反密码子与mRNA的密码子结合而显著影响生物学过程和疾病进展。同时，tRNA在体液中高丰度存在的特点使其成为临床应用的生物标志物，可被运用到肿瘤增殖、转移的检测中。

2019年Pan Jiang等在Current Medicinal Chemistry杂志上综述报道了tRF和tiRNA是在特定的细胞/组织中或者在细胞受到胁迫等特定条件下，由特定的核酸酶[如Dicer、血管生成素(ANG)]在tRNA的环上剪切，产生的特定大小的小片段RNA。tRF和tiRNA属于一类小的非编码RNA，被统称为tsRNA。tRF分为tRF-1,tRF-2,tRF-3,tRF-5和i-tRF；tiRNA分为5′tiRNA和3′tiRNA。

成熟的tRNA经剪切后转变为tRF和tiRNA，tRF和tiRNA在抑制蛋白质合成、调节基因表达、启动病毒逆转录酶和调节DNA损伤反应中发挥重要作用，可视为tRNA的功能单位。

目前，对于前列腺癌细胞增殖检测的方法通常采取血清PSA检测来评判。但在广泛应用的过程中发现此检测方法特异性差与敏感性不足，不能区分前列腺重度炎症及提示早期前列腺癌细胞增殖。虽然还有超声、核磁共振等检测方法作为补充，但这些方法仍具有上述不足之处。因此，寻找敏感性高、特异性强的标志物检测前列腺癌细胞增殖，已成为医学研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2及检测引物和应用，弥补了血清PSA检测、超声、核磁共振等检测方法的不足之处。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2，所述标志物tRF-Gly-TCC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种检测前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明还提供了一种检测前列腺癌增殖的试剂盒，所述试剂盒中包含序列为SEQID NO.2～3的引物。

本发明提供了一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2及检测引物和应用，所述标志物tRF-Gly-TCC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过检测前列腺组织中tRF-Gly-TCC-2相对表达量，可以评判前列腺癌细胞的增殖水平。若检测样本中tRF-Gly-TCC-2相对含量明显高于对照样本中tRF-Gly-TCC-2相对含量，提示前列腺癌细胞处于增殖状态。本发明的标志物敏感性高、特异性强，弥补了血清PSA检测、超声、核磁共振等检测方法的不足之处。

附图说明

图1为tRF-Gly-TCC-2在前列腺癌组织和前列腺正常组织中的表达。

具体实施方式

本发明提供了一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2，所述标志物tRF-Gly-TCC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1：GCGTTGGTGGTATAGTGGTGAGCATAGCTGCC。

在本发明中，所述tRF-Gly-TCC-2全称是tRF-1:32-Gly-TCC-2，该tsRNA片段来源于tRNA-Gly-TCC-2，由该tRNA 5’端第1位至第32位核苷酸组成，属于tRF-5c类型。

本发明还提供了一种检测前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示；

SEQ ID NO.2：ACGATCTCCCACATGGTCTAGC；

SEQ ID NO.3：TCCGATCTCCAGGAATCCTAAC。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1样本选择

试验组样本：新鲜前列腺组织(也可以使用前列腺细胞株、穿刺前列腺组织、新鲜尿液、新鲜前列腺按摩液、血液)；

对照组样品：人前列腺增生细胞系(BPH-1细胞系，购自上海宾穗生物科技有限公司)。

实施例2RNA抽提及质量检测

①匀浆：

将检测的新鲜前列腺组织研磨后，用蒸馏水溶解，振荡后，4℃7500转/分钟离心5分钟，得到沉淀细胞。加入TRI REAGENT试剂反复吹打使细胞裂解，每克沉淀细胞使用1mlTRI REAGENT试剂(避免在加入TRI REAGENT试剂进行裂解前清洗细胞，因为清洗会很可能导致mRNA的降解)。

②两相分离：

匀浆后样本于25℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIREAGENT试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿(上海化学试剂有限公司)，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，25℃孵育3分钟。4℃下12000转/分钟离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积为匀浆时加入的TRI REAGENT试剂的60％。

③RNA沉淀：

将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇(上海化学试剂有限公司)混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样本匀浆时加入1ml TRI REAGENT试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后25℃孵育10分钟后，于4℃12000转/分钟离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗：

移去上清液，每1ml TRI REAGENT试剂匀浆的样本中加入至少1ml的75％乙醇(以DEPC水配制，DEPC水购自上海浦予工业科技有限公司)，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7500转/分钟，离心5分钟。

⑤重新溶解RNA沉淀：

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。

⑥对照样本RNA的抽提：

从对照样本人前列腺增生细胞系(BPH-1细胞系，购自上海宾穗生物科技有限公司)细胞中抽提RNA：加入800μl的TRI REAGENT试剂至样本中，样本裂解后，重复步骤②至步骤⑤操作。在加异丙醇沉淀RNA前，加10μg的无RNA酶的糖原作为水相载体。为降低溶液粘度，在加氯仿前先将样本两次过26号针头以剪切基因组DNA。两相分离后糖原留在水相中并和RNA共沉淀。只要糖原浓度不高于4mg/ml，不会影响cDNA的合成，同样也不会对PCR过程产生影响。

⑦RNA质量检测：

采用紫外吸收测定法，使用

ND-1000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水1μl凋零处理测量基座表面，然后RNA检测操作方法如下：

a.滴加1μl RNA样本至测量基座的表面。

b.液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件。

c.一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样本的测量。

d.测定结果(电脑自动生成的EXCEL和JPEG文件附于实验报告文件夹中)。

结果：

浓度测定

260nm处读值为1表示40ng RNA/μl。样品RNA浓度计算公式为：A260(读数)×40ng/μl。具体计算示例如下：

RNA溶于20μl DEPC水中，取1μl用于测定，测得A260＝65.003

RNA浓度＝65.003×40ng/μl＝2600.12ng/μl

取1μl用来测量以后，剩余样品RNA为19μl，剩余RNA总量为：19μl×2600.12ng/μl＝49.4μg。

纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中如Northern杂交，RT-PCR和RNA酶保护实。

实施例3RNA前处理与cDNA合成

本实施例中的试剂除rtStar^TMtRF&tiRNA Pretreatment Kit(Cat#AS-FS-005)、rtStar^TMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003)均购自美国Arraystar生物公司，其他相关试剂均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

①3’末端去乙酰化处理

a.按照表1配置去乙酰化反应液：

表1

样本RNA	5μg
		Deacylation Reaction缓冲液(5×)	3uL
SUPERase·In<sup>TM</sup>RNase抑制剂	1μL
		无核酸酶水	变量
总体积/样本	加至15μL

b.涡旋混合，37℃孵育40分钟；

c.依次加入19μL Deacylation Stop缓冲液，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应。

②去除3’-cP与添加5’-P

a.将步骤①的反应液置于冰上，依次加入表2中的试剂：

表2

b.涡旋混合，37℃孵育40分钟；

c.70℃孵育5分钟以终止反应；

d.重新抽提RNA。

③去甲基化处理

a.融解除Demethylase和Reverse Transcriptase两种酶外的所有试剂，涡旋混合，置于冰上备用。在使用前从冰箱将两种酶取出，简单离心，备用；

b.按照表3配制去甲基化反应液：

表3

无核酸酶水	变量
		Demethylation Reaction缓冲液(5×)	10μL
Demethylase	5μL
		SUPERase·In<sup>TM</sup>RNase抑制剂	1μL
Input RNA	5μg
		总体积/样本	加至50μL

c.进行去甲基化反应；

d.在37℃水浴锅中孵育2小时，然后加入40μl无核酸酶水与10μlDemethylationStop缓冲液(5×)，终止去甲基化反应；

e.重新抽提RNA。

④连接3′接头

a.在200μL无RNA酶的PCR管中依次加入表4的试剂：

表4

b.在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上；

c.添加表5的反应试剂；

表5

3’Ligation Reaction缓冲液(2X)	5μL
		3’Ligation Enzyme Mix	1.5μL
总体积	加后变为10μL

d.在热循环仪中25℃孵育1小时。

⑤反转录引物(Reverse Transcription Primer)杂交

此步反应对抑制接头二聚体的形成十分关键。反转录引物可与多余的3’接头杂交，从而将单链DNA接头转化为双链DNA分子。如果总RNA起始量为100ng，将反转录引物用无酶水1:2稀释。

a.向步骤④-d的PCR管里加入表6的试剂；

表6

无核酸酶水	2.3μL
		Reverse Transcription Primer	0.5μL
总体积	加后变为12.8μL

b.在热循环仪中依次75℃孵育5min，37℃孵育15min，25℃孵育15min。

⑥连接5′接头

a.在20μL无核酸酶水中重悬5’接头；

注意：如果总RNA起始量为100ng，将5′接头用无核酸酶水1:2稀释。

b.在单独的无核酸酶的200μL PCR管中加入0.6μL的5’接头。(N为实验所处理的样本数目)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后立即在冰上冷却。

注意：将剩余的5’重悬接头储存在-80℃冰箱。为了避免RNA降解，请在接头变性后30分钟内使用接头。

c.向步骤⑤-b中的PCR管中依次加入表7的反应物，充分混合。

表7

5′Adaptor(denatured)	0.5μL
		5′Ligation Reaction缓冲液	0.5μL
5′Ligation Enzyme Mix	1.2μL
		总体积	加后变为15μL

d.热循环仪25℃孵育1小时。

⑦反转录反应

a.在无核酸酶的200μL PCR管加入表8的反应物：

表8

Adaptor Ligated RNA	15μL
		First-Strand Synthesis Reaction缓冲液	4μL
SUPERase·In<sup>TM</sup>RNase抑制剂	0.5μL
		Reverse Transcriptase	0.5μL
总体积	加后变为20μL

b.热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于PCR扩增反应。

注意：如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止RT反应。然后将样本置于-20℃冰箱保存。

实施例4合成的cDNA用于实时定量PCR检测

本实施例中的试剂2X PCR master mix(AS-MR-006-5)购自美国Arraystar生物公司；引物设计软件是Primer 5.0；QuantStudio^TM5Real-time PCR System(AppliedBiosystems)购自美国应用生物系统公司。

①制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板

1.针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应：

PCR反应的体系如表9所示：

表9

轻弹管底将溶液混合，5000转/分钟短暂离心，设置PCR反应：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。

2.PCR产物与100bp DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

3.将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8，1×10^-9，这几个梯度浓度的DNA。

②进行Realtime PCR反应

1.将所有cDNA样本分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如表10所示：

表10

2×Master Mix	5μl
		10uM的PCR特异引物F	0.5μl
10uM的PCR特异引物R	0.5μl
		加无核酸酶水至总体积为	8μl

轻弹管底将溶液混合，5000转/分钟，离心5分钟。

2.加样

a.将8μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中；

b.再加入对应的2μl cDNA；

c.粘上Sealing Film封口膜，并离心5分钟后混合；

c.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。

3.将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。

所有的指标均按以下程序进行：

95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。

为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃加热到95℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/秒)。

③结果与计算

各样本的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样本目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样本的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样本此基因的校正后的相对含量。

④待测基因以内参校正

实时定量PCR时各样本加样量均为2μl，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因U6(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样本内参的值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。

本实施例中所使用的基因和引物如表11所示。

表11

结果：检测样本与对照样本经上述操作步骤处理后，均可得到组织中tRF-Gly-TCC-2的相对含量，若检测样本中tRF-Gly-TCC-2相对含量明显高于对照样本中tRF-Gly-TCC-2相对含量，提示前列腺癌细胞处于增殖状态。

由以上实施例可知，本发明提供了一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2及检测引物和应用，所述标志物tRF-Gly-TCC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过检测前列腺组织中tRF-Gly-TCC-2相对表达量，可以评判前列腺癌细胞的增殖水平。若检测样本中tRF-Gly-TCC-2相对含量明显高于对照样本中tRF-Gly-TCC-2相对含量，提示前列腺癌细胞处于增殖状态。本发明的标志物敏感性高、特异性强，弥补了血清PSA检测、超声、核磁共振等检测方法的不足之处。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2，其特征在于，所述标志物tRF-Gly-TCC-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种检测前列腺癌增殖标志物tRF-Gly-TCC-2的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。

3.一种检测前列腺癌增殖的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含序列为SEQ IDNO.2～3的引物。