CN115651974B - 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用 - Google Patents
人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115651974B CN115651974B CN202211411050.XA CN202211411050A CN115651974B CN 115651974 B CN115651974 B CN 115651974B CN 202211411050 A CN202211411050 A CN 202211411050A CN 115651974 B CN115651974 B CN 115651974B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr tube
- gdna
- cell line
- pcr
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 18
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 claims description 10
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 9
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 101710147059 Nicking endonuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 18
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 abstract description 9
- 238000004088 simulation Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 33
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000012854 evaluation process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用。该制备方法包括以下步骤：将背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA混合，制得混合gDNA；采用缺刻酶切的方式将混合gDNA打断，制得cfDNA标准品；其中，背景细胞系为未发生突变的细胞系，突变细胞系为在预设位点发生突变的细胞系。通过采用缺刻酶切的方式对混合gDNA进行打断，能有效避免文库转化效率低和双链占比低的问题，同时还能避免纯合突变的引入造成最低检测线难以确定的情况。该制备方法简单，能工业化大量生产，能很好地模拟真实的cfDNA样品，作为阳性参考品高效地应用于高通量测序等项目，提供高精度的检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用。
背景技术
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术 ("Next-generation"sequencing technology,NGS)，是一种能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，已成为当前医学诊断中获取及时准确的诊断信息的重要来源。在建立检测方法时，需要对检测方法的科学性和准确性进行评估，以提升诊断信息的精准度，对检测方法的评估过程以及检测过程本身都需要采用标准样品作为对照进行参考。
尽管组织样本仍是进行高通量测序技术等基因检测的第一选择，但有时候由于条件所限，例如取样量偏少，或病人体质不宜活检等情况下，只能采用血液作为备选进行基因检测。cfDNA(cell-free DNA)是指细胞凋亡后进入血液中裂解释放出来的DNA，是一种未被包裹的、游离的DNA，对cfDNA的检测可以提供有效的医疗诊断信息。例如，ctDNA(circluting-tumor DNA)，即由肿瘤细胞释放到血液中的DNA，属于cfDNA中的一种，血浆中ctDNA的浓度和可检测到的ctDNA水平已被证明与肿瘤分期有关。然而，传统技术制得的人工模拟cfDNA标准品往往难以模拟真实样品，存在建库效率低、双链形成率低、难以确定最低检测下限等问题，难以适应当前市场对于高效率、高精度的检测需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用，该制备方法操作简单，制得的标准品能真实模拟人体样品，与真实的cfDNA具有相近的建库效率、双链形成率和突变水平，从而有效提升了将其应用于高通量测序技术等重要检测项目的效率和精度。
本发明的第一方面，提供了一种人工模拟cfDNA标准品的制备方法，其包括以下步骤：
将背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA混合，制得混合gDNA；
采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断，制得所述cfDNA标准品；
其中，所述背景细胞系为未发生突变的细胞系，所述突变细胞系为在预设位点发生突变的细胞系。
在一些实施方式中，所述缺刻酶切的方式是指：采用核酶使所述混合gDNA 随机产生缺口，然后采用缺刻切割酶把所述缺口切断。
在一些实施方式中，
所述制备方法满足以下(1)～(2)中的一个或多个条件：
(1)所述核酶包括创伤弧菌核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、Nt.CviPII切刻内切酶以及Nb.Bsm I切刻内切酶中的一种或多种；
(2)所述缺刻切割酶包括T7核酸内切酶。
在一些实施方式中，所述背景细胞系的gDNA与突变细胞系的gDNA混合的摩尔比为(90～99.99)：(0.01～10)。
在一些实施方式中，采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断后，所得片段的主峰大小为150bp～500bp。
在一些实施方式中，采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断后，还包括对所述片段进行筛选的步骤，筛选后所得的目标片段的主峰大小为200bp～400bp。
在一些实施方式中，所述突变细胞系的gDNA的突变频率为 0.01％％～10％％。
本发明的第二方面，提供了一种人工模拟cfDNA标准品，其由前述一种或多种实施方式所述的制备方法制得。
本发明的第三方面，提供了前述的人工模拟cfDNA标准品在血液cfDNA检测中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种cfDNA文库的构建方法，其包括以下步骤：
将前述的人工模拟cfDNA标准品按照以下操作进行处理：末端修复、加多聚腺嘌呤尾、接头连接、PCR扩增以及文库纯化。
本发明的第五方面，提供了一种cfDNA文库，其通过前述的构建方法获得。
本发明的第六方面，提供了一种高通量测序方法，其包括以下步骤：
对前述的cfDNA文库进行靶向捕获，然后进行数据分析。
本发明通过采用缺刻酶切的方式对混合gDNA进行打断，能有效避免文库转化效率低和双链占比低的问题，同时还能避免纯合突变的引入造成最低检测线难以确定的情况。该制备方法简单，能工业化大量生产，且制得的cfDNA标准品与真实的cfDNA样品在文库转化效率、双链占比以及突变引入方面均具有相近的表现，能很好地模拟真实的cfDNA样品，作为阳性参考品高效地应用于高通量测序等cfDNA检测项目，提供高精度的检测结果。
附图说明
图1为超声打断建库方式易导致单链和突变的示意图；
图2为采用链置换酶的方式产生纯合突变的示意图；
图3为本申请一实施方式采用缺刻酶切的方式进行建库的示意图；
图4是实施例1、对比例1、3、4的DNA文库产出量比较；
图5是实施例1、对比例1、3、4的DNA文库双链占比比较；
图6是实施例1、对比例1、3、4的DNA文库突变背景引入水平比较；
图7为实施例1～2与对比例1～2的突变检测比较。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
目前，市面上用于cfDNA检测，特别是用于低频突变检测的商品化标准品大多是通过采用超声对混合细胞系的DNA进行打断的方式获得的。采用超声打断的方式存在以下问题：1.易导致5’端受损，从而导致5’端磷酸化受影响，建库时只能产生单链文库，造成双链占比过低；2.易导致3’端受损，从而导致与建库接头的连接受到影响，造成建库成功率低、产量偏低。双链占比过低、建库成功率低会导致制得的产品与真实的cfDNA样品相差较大，不能很好地模拟实际情况，升高最低检测下限，不利于检测的精确度。
基于上述背景，本发明的第一方面，提供了一种人工模拟cfDNA标准品的制备方法，其包括以下步骤：
将背景细胞系的gDNA(genomic DNA，基因组DNA)和突变细胞系的gDNA 混合，制得混合gDNA；
采用缺刻酶切的方式将混合gDNA打断，制得cfDNA标准品；
其中，背景细胞系为未发生突变的细胞系，突变细胞系为在预设位点发生突变的细胞系。
为了解决传统技术中存在的建库成功率低、双链占比低的问题，本发明的发明人也曾尝试采用其他类型的酶来进行cfDNA标准品的制备，例如，采用链置换酶进行酶切，这一方案虽然能有效改善建库效率，但是存在反复的链置换方式，从而导致一些突变的引入，特别是纯合突变的引入，会对分析造成巨大的干扰，无法判别样品中存在的突变来源于本身的突变还是处理过程中引入的突变，因此，将难以确定最低检测线，导致检测方法精度大大降低。而后，通过大量研究，发明人提出了缺刻酶切的方案用于进行人工模拟cfDNA标准品的制备，与其他方案相比，本发明的技术方案能有效避免文库转化效率低和双链占比低的问题，同时还能避免纯合突变的引入造成最低检测线难以确定的情况。该制备方法简单，能工业化大量生产，且制得的cfDNA标准品与真实的cfDNA 样品在文库转化效率、双链占比以及突变引入方面均具有相近的表现，能很好地模拟真实的cfDNA样品，作为阳性参考品高效地应用于高通量测序等cfDNA 检测项目，提供高精度的检测结果。
在一些实施方式中，缺刻酶切的方式是指：采用核酶使混合gDNA随机产生缺口，然后采用缺刻切割酶把缺口切断。
在一些实施方式中，制备方法满足以下(1)～(2)中的一个或多个条件：
(1)所述核酶包括创伤弧菌核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、Nt.CviPII切刻内切酶以及Nb.Bsm I切刻内切酶中的一种或多种；
(2)所述缺刻切割酶包括T7核酸内切酶。
合适的缺刻切割酶种类能更适用于本发明的方案，能有效控制缺刻酶切的过程，有助于将打断后DNA目标片段的主峰等参数控制在合理范围，从而使得人工模拟标准品与真实的样品在建库成功率、双链占比以及突变引入等各项指标上更接近，进一步提升标准品用于检测时的精度。
可以理解，核酶和缺刻切割酶可以通过市售可得的酶组合物同时提供，例如
在一些实施方式中，背景细胞系的gDNA与突变细胞系的gDNA混合的摩尔比为(90～99.99)：(0.01～10)。可选地，背景细胞系的gDNA与突变细胞系的gDNA混合的摩尔比例如还可以是90.5：9.5、91：9、91.5：8.5、92：8、92.5： 7.5、93：7、93.5：6.5、94：6、94.5：5.5、95：5、95.5：4.5、96：4、96.5： 3.5、97：3、97.5：2.5、98：2、98.5：1.5、99：1、99.5：0.5、99.9：0.1或99.95:0.05。采用本发明的cfDNA标准品进行检测时，仅需少量的突变细胞系即可进行高精度的检测，能适应多种应用场景。在一些实施方式中，采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断后，所得片段的主峰大小为150bp～500bp。所得片段的主峰大小例如还可以是175bp、200bp、225bp、250bp、275bp、300bp、325bp、 350bp、375bp、400bp、425bp、450bp或475bp。控制片段的主峰大小在合适范围内，能够避免过大的损失的同时，提升检测的准确度。
在一些实施方式中，采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断后，还包括对所述片段进行筛选的步骤，筛选后所得的目标片段的主峰大小为200bp～ 400bp。目标片段的主峰大小例如还可以是225bp、250bp、275bp、300bp、 325bp、350bp或375bp。对打断后的片段进行筛选，可以控制片段主峰的大小在更合适的范围内，获得主峰范围分布更窄的目标片段，检测精度更高。
在一些实施方式中，突变细胞系的gDNA的突变频率为0.01％～10％。突变细胞系的gDNA的突变频率例如还可以是0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、 2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、 9％或9.5％。本发明的cfDNA标准品可以用于低突变频率的细胞系的检测，在很低的突变频率下依然具有高的检测精度。
本发明的第二方面，提供了一种人工模拟cfDNA标准品，其由前述一种或多种实施方式的制备方法制得。
本发明的第三方面，提供了前述的人工模拟cfDNA标准品在血液cfDNA检测中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种cfDNA文库的构建方法，其包括以下步骤：
将前述的人工模拟cfDNA标准品按照以下操作进行处理：末端修复、加多聚腺嘌呤尾、接头连接、PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应) 扩增以及文库纯化。优选地，在接头连接之后、PCR扩增之前，还包括磁珠纯化的步骤。
本发明的第五方面，提供了一种cfDNA文库，其通过前述的构建方法获得。
本发明的第六方面，提供了一种高通量测序方法，其包括以下步骤：
对前述的cfDNA文库进行靶向捕获，然后进行数据分析。
以下结合具体实施例和对比例对本发明做进一步详细的说明。以下具体实施例中未写明的实验参数，优先参考本申请文件中给出的指引，还可以参考本领域的实验手册或本领域已知的其它实验方法，或者参考厂商推荐的实验条件。可理解，以下实施例所用的仪器和原料较为具体，在其他具体实施例中，可不限于此；本发明说明书实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明说明书实施例公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、 kg等化学化工领域公知的质量单位。
仪器及试剂来源：
缺刻酶切试剂：dsDNA/>
链置换酶：DNA聚合酶I
分子标签文库构建试剂盒：DNA Library Preparation Kit(for)E96，货号1002103；
分子标签建库接头：UMI Adapter Kit Set B1(for/>),96rxn, 24rxn，货号1003431；
靶向捕获试剂：Hybrid Capture Reagents,96rxn，货号1005101；
磁珠：NanoPrepTM SP Beads(纳昂达)；
超声仪：CovarisTM M220 Focused-ultrasonicator；
PCR仪：Hema9600基因扩增仪。
标准操作步骤：
1.模拟cfDNA样品制备：
1.1：将背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA按比例混合，制得混合 gDNA；
1.2：采用核酶使1.1中获得的混合gDNA随机产生缺口，加入缺刻切割酶dsDNA/>切断切口，获得主峰大小为150bp～500bp的片段DNA，经筛选，获得主峰大小为200bp～400bp的目标片段DNA样品；
2.末端修复、加多聚腺嘌呤尾：
2.1取出核酸补平加A缓冲液和核酸补平加A酶置于冰上自然融解，混合均匀，瞬时离心备用。
2.2按照下表，在置于冰上的0.2ml PCR管中进行反应体系配制：
2.3混合均匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部。
2.4在PCR仪上启动如下反应程序，等温度稳定至20℃时将反应管放进 PCR仪：
3.接头连接
3.1取出连接缓冲液和DNA连接酶置于冰上自然融解，混合均匀，瞬时离心备用。
3.2从PCR仪上取出步骤2的PCR反应管，置于冰上，按照以下体系进行接头连接反应体系配制：
3.3混合均匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部。
3.4在PCR仪上启动如下反应程序，等温度稳定至20℃时将反应管放进 PCR仪：
4.磁珠纯化
4.1提前将NanoPrepTM SP Beads(纳昂达)取出涡旋混匀，室温平衡30min 后使用。
4.2向步骤三连接体系PCR管加入40μL NanoPrepTM SP Beads，混合均匀， 25℃孵育5～10min。
4.3将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min至液体完全澄清，使用移液器吸取移弃上清。
4.4沿PCR管侧壁缓慢加入150μL 80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30 s，使用移液器吸取移弃上清。
4.5重复步骤4.4一次。
4.6将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上，使用10μL吸头移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠。
4.7打开PCR管管盖，并于室温静置约5min，至乙醇挥发完全。注意：切勿过分干燥，否则会降低得率。
4.8移出PCR管，向PCR管中加入21μL无酶水，将磁珠悬浮均匀，25℃孵育2min。
4.9将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上2min至液体完全澄清，使用移液器吸取20μL上清，并转移至1个新的0.2ml PCR管中，置于冰上备用。
5.PCR扩增
5.1、取出2X高保真扩增酶混合物和标签扩增引物置于冰上自然解冻，混合均匀，瞬时离心备用。
5.2、按照以下体系在置于冰上的PCR管中进行反应体系配制：
将PCR管放入PCR仪中启动以下程序：
6.文库纯化、定量和质检
6.1、向PCR管加入60μL的NanoPrepTM SP Beads混合均匀，25℃孵育5 ～10min。
6.2、将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min，至液体完全澄清，使用移液器吸取移弃上清。
6.3、沿PCR管侧壁缓慢加入150μL 80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置 30s，使用移液器吸取移弃上清。
6.4、重复步骤6.3一次。
6.5、PCR管瞬时离心，放置于磁力架上，使用10μL吸头移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠。
6.6、打开PCR管管盖，并于室温静置约5min，至乙醇挥发完全。
注意：切勿过分干燥，否则会降低得率。
6.7、向PCR管加入20μL TE缓冲液，使用移液器将磁珠悬浮均匀， 25℃孵育2min。
6.8、将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上2min，至液体完全澄清，使用移液器小心将上清移取至一个新的0.2ml PCR管中进行保存，注意勿吸到磁珠。
6.9、使用Qubit对文库进行定量。
6.10、使用Bioanalyzer(Agilent)、Qsep100(Bioptic)等相关片段分析仪器进行文库片段分布检测。
7.靶向捕获和数据分析
靶向捕获按照Hybrid Capture Reagents,96rxn，货号：1005101说明书进行，杂交捕获文库500ng投入量，杂交后PCR扩增16个循环，测序数据每个文库测5g数据，经过数据分析可以得到缺刻打断的模拟和真实cfDNA 模拟是比较接近的结果，如图7所示。
实施例1
按照标准操作步骤进行，其中：背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA 的混合比例为99:1，突变细胞系的突变频率为1％(背景AA，突变aa)，SNP 数目N＝57。
实施例2
按照标准操作步骤进行，其中：背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA 的混合比例为99:1，突变细胞系的突变频率为0.5％(背景AA，突变Aa)，SNP 数目N＝70。
对比例1与标准操作步骤基本相同，区别在于：采用混比1％的真实cfDNA 样品替代步骤1中制得的模拟cfDNA样品。其中：背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA的混合比例为99:1，突变细胞系的突变频率为1％(背景AA，突变aa)，SNP数目N＝57。
真实cfDNA样品是由两个健康人的血浆通过《血清/血浆游离DNA提取试剂盒》(天根生化，DP339)提取2mL血浆的cfDNA，提取的cfDNA按照99：1 的质量进行混比，99份模拟背景基因型，1份的模拟突变基因型。
对比例2
与对比例1基本相同，区别在于：背景细胞系的gDNA和突变细胞系的 gDNA的混合比例为99:1，突变细胞系的突变频率为0.5％(背景AA，突变Aa)， SNP数目N＝70。
对比例3
与标准操作步骤基本相同，区别在于：1.2中采用超声打断的方式处理1.1 中获得的混合gDNA。使用CovarisTM系列DNA超声打断仪进行样本片段化， DNA片段打断到主峰至200-400bp停止。
对比例4与标准操作步骤基本相同，区别在于：1.2中采用等量的链置换酶替代缺刻切割酶。具体流程参考快速DNA酶切文库构建试剂盒v2 (纳昂达，#1002601)说明书片段化、末端修复&加A部分。
从图4可知，本发明的缺刻酶切方式进行建库时具有与真实cfDNA相近的文库产出水平，超声打断和链置换酶切方式则有较大的损失；从图5可知，本发明的缺刻酶切方式进行建库时具有与真实cfDNA相近的双链占比，另外两种方式则具有较多的单链；从图6可知，本发明的缺刻酶切方式具有与真实cfDNA 相近的背景突变引入水平，仅千分之一，而超声打断方式则有千分之三，链置换酶切方式则高达1％，会严重干扰检测下限；从图7可知，本发明的缺刻酶切方式进行建库时，无论是0.5％或是1％的突变都具有与真实cfDNA相近的水平。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (2)
1.一种cfDNA标准文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将背景细胞系的gDNA和突变细胞系的gDNA混合，制得混合gDNA；所述背景细胞系为未发生突变的细胞系，所述突变细胞系为在预设位点发生突变的细胞系；所述突变细胞系的gDNA的突变频率为0.01%~10%；所述背景细胞系的gDNA与突变细胞系的gDNA混合的摩尔比为99：1；
（2）采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断，制得cfDNA标准品；所述缺刻酶切的方式是指：采用核酶使所述混合gDNA随机产生缺口，然后采用缺刻切割酶把所述缺口切断；采用缺刻酶切的方式将所述混合gDNA打断后，还包括对片段进行筛选的步骤，筛选后所得的目标片段的主峰大小为200 bp ~ 400 bp；所述核酶包括创伤弧菌核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、Nt.CviPII切刻内切酶以及Nb.Bsm I切刻内切酶中的一种或多种，所述缺刻切割酶包括T7核酸内切酶；
（3）将所述cfDNA标准品按照以下操作进行处理：末端修复、加多聚腺嘌呤尾，步骤如下：取出核酸补平加A缓冲液和核酸补平加A酶置于冰上自然融解，将所述cfDNA、核酸补平加A缓冲液和核酸补平加A酶置于冰上的0.2ml PCR管中进行反应体系配制；混合均匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部；在PCR仪上启动反应程序，等温度稳定至20℃时将反应管放进PCR仪；
（4）接头连接：取出连接缓冲液和DNA连接酶置于冰上自然融解，混合均匀，瞬时离心备用；混合均匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部；在PCR仪上启动反应程序，等温度稳定至20℃时将反应管放进PCR仪；
（5）磁珠纯化，包括如下步骤：将NanoPrepTM SP Beads取出涡旋混匀，室温平衡30min后使用；向步骤（4）连接体系PCR管加入40μL NanoPrepTM SP Beads，混合均匀，25℃孵育5～10min；将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min至液体完全澄清，使用移液器吸取移弃上清；沿PCR管侧壁缓慢加入150μL 80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s，使用移液器吸取移弃上清，再重复沿PCR管侧壁缓慢加入150μL 80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s，使用移液器吸取移弃上清；将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上，使用10μL吸头移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠；打开PCR管管盖，并于室温静置5min，至乙醇挥发完全；移出PCR管，向PCR管中加入21μL无酶水，将磁珠悬浮均匀，25℃孵育2min；将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上2min至液体完全澄清，使用移液器吸取20μL上清，并转移至1个新的0.2ml PCR管中，置于冰上备用；
（6）PCR扩增以及文库纯化，步骤如下：取出2X高保真扩增酶混合物和标签扩增引物置于冰上自然解冻，混合均匀，瞬时离心备用；在置于冰上的PCR管中进行反应体系配制，2X高保真扩增酶混合物25ul、标签扩增引物5ul、步骤（4）连接产物；将PCR管放入PCR仪中启动程序；向PCR管加入60μL的NanoPrepTM SP Beads混合均匀，25℃孵育5～10min；将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min，至液体完全澄清，使用移液器吸取移弃上清；沿PCR管侧壁缓慢加入150μL 80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s，使用移液器吸取移弃上清；重复沿PCR管侧壁缓慢加入150μL 80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s，使用移液器吸取移弃上清；PCR管瞬时离心，放置于磁力架上，使用10μL吸头移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠；打开PCR管管盖，并于室温静置5min，至乙醇挥发完全；向PCR管加入20μL TE缓冲液，使用移液器将磁珠悬浮均匀，25℃孵育2min；将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上2min，至液体完全澄清，使用移液器小心将上清移取至一个新的0.2ml PCR管中进行保存，注意勿吸到磁珠；使用Qubit对文库进行定量；使用Bioanalyzer或Qsep100片段分析仪器进行文库片段分布检测。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述核酶和所述缺刻切割酶由NEBNext® dsDNA Fragmentase®提供。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211411050.XA CN115651974B (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211411050.XA CN115651974B (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115651974A CN115651974A (zh) | 2023-01-31 |
| CN115651974B true CN115651974B (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=85020427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211411050.XA Active CN115651974B (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115651974B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055487A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-12-21 | 苏州安可济生物科技有限公司 | 模拟血浆基质的循环肿瘤游离dna标准品的制备 |
| CN111172263A (zh) * | 2018-11-12 | 2020-05-19 | 北京医院 | 一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法 |
| CN111321136A (zh) * | 2018-12-13 | 2020-06-23 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种cfDNA野生型标准品及其制备方法 |
| WO2021253372A1 (zh) * | 2020-06-19 | 2021-12-23 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种高兼容性的PCR-free建库和测序方法 |
| CN113832549A (zh) * | 2021-11-03 | 2021-12-24 | 纳昂达(南京)生物科技有限公司 | 低频引入突变的酶切打断建库方法和试剂盒 |
| CN113930512A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-01-14 | 苏州水木济衡生物技术有限公司 | 一种模拟血浆循环肿瘤游离dna标准品及其制备方法与应用 |
-
2022
- 2022-11-11 CN CN202211411050.XA patent/CN115651974B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055487A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-12-21 | 苏州安可济生物科技有限公司 | 模拟血浆基质的循环肿瘤游离dna标准品的制备 |
| CN111172263A (zh) * | 2018-11-12 | 2020-05-19 | 北京医院 | 一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法 |
| CN111321136A (zh) * | 2018-12-13 | 2020-06-23 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种cfDNA野生型标准品及其制备方法 |
| WO2021253372A1 (zh) * | 2020-06-19 | 2021-12-23 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种高兼容性的PCR-free建库和测序方法 |
| CN113930512A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-01-14 | 苏州水木济衡生物技术有限公司 | 一种模拟血浆循环肿瘤游离dna标准品及其制备方法与应用 |
| CN113832549A (zh) * | 2021-11-03 | 2021-12-24 | 纳昂达(南京)生物科技有限公司 | 低频引入突变的酶切打断建库方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Development of Reference Materials for Noninvasive Prenatal Aneuploidy Testing by Massively Parallel Sequencing: A Proof-of-Concept Study;Jonatan Blais等;JALM;第50-60页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115651974A (zh) | 2023-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11326202B2 (en) | Methods of enriching and determining target nucleotide sequences | |
| US20220002783A1 (en) | Methods for preparing a sample for nucleic acid amplification | |
| DK2725125T3 (en) | HIGH-THROUGHPUT METHYLING DETECTION PROCEDURE | |
| EP4239067A2 (en) | Transposase compositions for reduction of insertion bias | |
| JP7426370B2 (ja) | ゲノムｄｎａ断片の標的化された精製のための調製用電気泳動方法 | |
| US20230056763A1 (en) | Methods of targeted sequencing | |
| CN112195521A (zh) | 一种基于转座酶的dna/rna共建库方法、试剂盒及应用 | |
| WO2012166425A2 (en) | Methods of amplifying whole genome of a single cell | |
| CN103298955A (zh) | 用于构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒 | |
| CN107488725A (zh) | 适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法及其应用 | |
| ES2894358T3 (es) | Método para amplificar ADN | |
| CN111321208A (zh) | 一种基于高通量测序的建库方法 | |
| CN107338284B (zh) | 人和小鼠pdx模型有关交叉污染检测试剂盒及检测方法 | |
| CN115651974B (zh) | 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用 | |
| CN109234388B (zh) | 用于dna高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用 | |
| CN113005525A (zh) | Ffpe样本建库的方法及其应用 | |
| CN110452958B (zh) | 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用 | |
| CN117051079A (zh) | Ngs单链文库、其构建方法及构建试剂盒 | |
| CN108130314B (zh) | 一种单克隆细胞培养方法 | |
| CN115386622A (zh) | 一种转录组文库的建库方法及其应用 | |
| CN114085917B (zh) | 基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒 | |
| WO2022036138A1 (en) | Methods and compositions for single cell analysis | |
| EP4240840A1 (en) | Precise genome deletion and replacement method based on prime editing | |
| CN113930512A (zh) | 一种模拟血浆循环肿瘤游离dna标准品及其制备方法与应用 | |
| CN111088303A (zh) | 模拟血浆cfDNA及制备方法和测序文库的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |