ES2894358T3 - Método para amplificar ADN - Google Patents

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Abstract

Un método para amplificar el ADN genómico de una célula, que comprende: (a) proporcionar una mezcla de la reacción, en donde la mezcla de la reacción comprende el ADN genómico, un primer tipo de cebador, un segundo tipo de cebador, una mezcla de monómeros de nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, y el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, en donde la secuencia común La secuencia se selecciona de tal manera que la secuencia común no se une sustancialmente al ADN genómico para provocar amplificación, en donde la secuencia variable se selecciona del grupo que consiste de (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG, en donde N se refiere a cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural, n es un número entero positivo seleccionado de 3-17, m es un número entero positivo seleccionado de 3-5; (b) colocar la mezcla de la reacción en un primer programa de ciclo térmico de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador pueda emparejarse con el ADN genómico y amplificar el ADN genómico para obtener un producto de amplificación genómica, en donde el producto de amplificación genómica comprende la secuencia común en su extremo 5' y comprende una secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3'; (c) colocar la mezcla de la reacción obtenida en el paso (b) en un segundo programa de ciclo térmico, de tal manera que la secuencia común del segundo tipo de cebador pueda emparejarse con el extremo 3' del producto de amplificación genómica y amplificar el producto de amplificación genómica para obtener un producto de amplificación genómica expandido, en donde la mezcla de la reacción se proporciona antes del paso (b) y el paso (c).

Description

DESCRIPCIÓN
Método para amplificar ADN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere a un método para amplificar ADN, en particular, un método para amplificar el genoma completo de una sola célula, como se reivindica.
ANTECEDENTES
La secuenciación del genoma completo de una sola célula es una nueva técnica para amplificar y secuenciar el genoma completo a nivel de una sola célula. Su principio es amplificar una cantidad diminuta de ADN de genoma completo aislado de una sola célula y realizar una secuenciación de alto rendimiento después de obtener una alta cobertura del genoma completo. Son necesarios dos prerrequisitos para el establecimiento de esta técnica: 1. técnica de amplificación del genoma completo de alta calidad; y 2. una técnica de secuenciación de bajo coste y alto rendimiento.
Actualmente, hay cuatro tipos principales de técnicas de amplificación de genoma completo: Preamplificación de extensión de cebador-Reacción en cadena de la polimerasa (denominada PEP-PCR; para información detallada sobre el método, ver Zhang L, Cui X, Schmitt K, Hubert R, Navidi W, Arnheim N. 1992. Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis. Proc Natl Acad Sci U S A.89 (13):5847-51), Reacción en cadena de la polimerasa cebada con oligonucleótidos degenerados (denominada DOP-PCR, para el método detallado ver Telenius H, Carter NP, Bebb CE, Nordenskjo M, Ponder BA, Tunnacliffe A. 1992. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics13:718-25), amplificación de desplazamiento múltiple (denominada MDA, para el método detallado, ver Dean FB, Nelson JR, Giesler TL, LaskenRS. 2001. Rapid amplification of plasmid and phageDNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification.Genome Res. 11:1095-99) y múltiples ciclos de amplificación basados en apareamiento y formación de giro (denominado MALBAC; para el método detallado, ver la Solicitud de patente PCT N° WO2012166425). MDA y MALBAC también se analizan en Chen M, Song P, Zou D, Hu X, Zhao S, Gao S, Ling F.
2014. Comparación de amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) y ciclos de amplificación basados en giros y apareamiento múltiple (MALBAC) en secuenciación unicelular. p LoS One.9: el 14520. La WO 2004/081225 también analiza los métodos para la amplificación del genoma completo. Sin embargo, algunos de los métodos de amplificación convencionales actualmente disponibles son fáciles de operar pero en última instancia llevan a resultados de amplificación no deseables, mientras que otros tienen un buen efecto de amplificación pero el proceso de funcionamiento es bastante complicado. Tomando MALBAC como ejemplo, tiene principalmente los siguientes defectos: 1. Generalmente, los productos de amplificación solo pueden obtenerse después de pasar por varios pasos como lisis celular, terminación de lisis (aumentando la temperatura/añadiendo un reactivo neutralizante), preamplificación, y amplificación, etc. Todo el proceso implica la preparación de múltiples reactivos y la adición de líquidos con la tapa abierta, lo que aumenta el riesgo de introducir contaminación ambiental. 2. Todo el proceso experimental dura más de 4 horas, con una baja eficiencia con respecto al personal y al instrumental, y por lo tanto no puede proporcionar resultados satisfactorios en un corto período de tiempo para muestras que tienen una necesidad clínica urgente de verificación. 3. Todo el proceso experimental requiere un alto grado de competencia por parte de los operadores, y los usuarios principiantes no pueden obtener resultados de amplificación satisfactorios en poco tiempo.
Por lo tanto, en la actualidad hay una necesidad urgente de un método de amplificación mejorado que supere uno, más o todos los defectos de los métodos de amplificación convencionales.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación proporciona un método para amplificar el ADN genómico de una célula y un kit para amplificar el ADN genómico, como se reivindica.
La invención proporciona un método para amplificar el ADN genómico de una célula, que comprende: (a) proporcionar una mezcla de la reacción, en donde la mezcla de la reacción comprende el ADN genómico, un primer tipo de cebador, un segundo tipo de cebador, una mezcla de monómeros de nucleótidos, y una polimerasa de ácido nucleico, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, y el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, en donde se selecciona la secuencia común de tal manera que la secuencia común no se una sustancialmente al ADN genómico para provocar la amplificación, en donde la secuencia variable se selecciona del grupo que consiste de (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG, donde N se refiere a cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural, n es un número entero positivo seleccionado de 3-17, m es un número entero positivo seleccionado de 3-15, x es un número entero positivo seleccionado de 3-13; (b) colocar la mezcla de la reacción en un primer programa de ciclo térmico de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador pueda emparejarse con el ADN genómico y amplificar el ADN genómico para obtener un producto de amplificación genómica, en donde el producto de amplificación genómica comprende la secuencia común en su extremo 5' y comprende una secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3'; (c) colocar la mezcla de la reacción obtenida en el paso (b) en un segundo programa de ciclo térmico, de tal manera que la secuencia común del segundo tipo de cebador pueda emparejarse con el extremo 3' del producto de amplificación genómica y amplificar el producto de amplificación genómica para obtener un producto de amplificación genómica ampliado, en donde la mezcla de la reacción se proporciona antes del paso (b) y el paso (c).
En algunas realizaciones, el método comprende además analizar el producto de amplificación para identificar características de secuencia asociadas a enfermedad o fenotipo. En algunas realizaciones, las características de secuencia asociadas con la enfermedad o el fenotipo incluyen anomalías cromosómicas, translocación cromosómica, aneuploidía, deleción o duplicación cromosómica parcial o completa, haplotipos de HLA fetal y mutaciones paternas. En algunas realizaciones, la enfermedad o fenotipo se selecciona del grupo que consiste de: beta-talasemia, síndrome de Down, fibrosis quística, enfermedad de células falciformes, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de X frágil, atrofia muscular espinal, hemoglobinopatía, alfa-talasemia, enfermedades relacionadas con X (enfermedades dominadas por genes en el cromosoma X), espina bífida, anencefalia, cardiopatías congénitas, obesidad, diabetes, cáncer, sexo fetal y RHD fetal
En algunas realizaciones, el ADN genómico está contenido dentro de una célula y la mezcla de la reacción comprende además un surfactante y/o una liasa capaz de lisar la célula.
En algunas realizaciones, el método comprende además colocar la mezcla de la reacción en un programa de ciclo térmico de lisis antes de dichos pasos (b) y (c), de tal manera que se lisa la célula y se libera el ADN genómico.
La secuencia común se selecciona de tal manera que la secuencia común no se una sustancialmente al ADN genómico para provocar la amplificación. En algunas realizaciones, la secuencia común se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones, la secuencia variable comprende una secuencia aleatoria. En algunas realizaciones, la secuencia variable tiene una longitud de 2-20 bases, 3-10 bases, 4-9 bases o 5-8 bases. En algunas realizaciones, tres o más posiciones de bases en la secuencia variable consisten de uno o más tipos de bases seleccionadas de G, A y T, o consisten de uno o más tipos de bases seleccionadas de C, A y T. En algunas realizaciones, las tres o más posiciones de bases están localizadas en el extremo 3' o en el medio de la secuencia variable. La secuencia variable se selecciona del grupo que consiste de (N)nGGG, (N)nTTT, (N mTNTNG, donde N se refiere a cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural, n es un número entero positivo seleccionado de 3-17, m es un número entero positivo seleccionado de 3-15, respectivamente. En algunas realizaciones, la secuencia variable se selecciona de tal manera que la secuencia variable se distribuya homogéneamente en el genoma y con una alta cobertura.
En algunas realizaciones, el primer tipo de cebador incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 12 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG], la SEQ ID NO: 13 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT] o la SEQ ID NO: 14 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG], y el segundo tipo de cebador en una orientación 5' a 3', tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 1 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG], en donde N es cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural.
En algunas realizaciones, la polimerasa de ácido nucleico tiene termoestabilidad y/o actividad de desplazamiento de cadena. En algunas realizaciones, la polimerasa de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de ADN polimerasa Phi29, ADN polimerasa Bst, Pirofago 3137, polimerasa Vent (por ejemplo, polimerasa Vent Thermococcus litoralis, polimerasa Deep Vent, polimerasa Vent(-exo), polimerasa Deep Vent(-exo)), ADN polimerasa TOPOTaq, polimerasa 9°Nm, ADN polimerasa I de fragmento de Klenow, transcriptasa inversa MMLV, transcriptasa inversa a Mv , transcriptasa inversa del VIH, variante de la ADN polimerasa en fase T7 (que carece de actividad exonucleasa 3'-5'), ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion®, polimerasa Taq, ADN polimerasa Bst (de longitud completa), ADN polimerasa de E. coli, ADN polimerasa LongAmp Taq, ADN polimerasa OneTaq y cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la mezcla de la reacción comprende además un regulador de pH, de tal manera que el valor de pH de la mezcla de la reacción se mantiene entre 7,0 y 9,0.
En algunas realizaciones, la mezcla de la reacción comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste de: Mg2+, dTT, albúmina de suero bovino, inhibidor de DNasa, RNasa, SO42', Cl-, K+, Ca2+, Na+ y (NH4)+.
En algunas realizaciones, el primer programa de ciclo térmico incluyó: (b1) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico capaz de abrir cadenas dobles del ADN genómico; (b2) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la unión del primer tipo de cebador a la plantilla de ADN de cadena sencilla; (b3) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la extensión de la longitud del primer tipo de cebador que se une a una plantilla de ADN de cadena sencilla bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico, para producir un producto de amplificación; (b4) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico capaz de desnaturalizar el producto de amplificación en cadenas sencillas; (b5) repetir los pasos (b2) a (b4) hasta un primer número de ciclos designado. En algunas realizaciones, el primer número de ciclos designado es de más de 2. En algunas realizaciones, después de pasar al segundo ciclo, el producto de amplificación comprende el producto de amplificación genómica que comprende la secuencia común en el extremo 5' y una secuencia complementaria de la secuencia común en el extremo 3'. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso (b4') después del paso (b4) y antes del paso (b5), en el que la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico adecuado que permite la hibridación del extremo 3' y el extremo 5' del producto de amplificación del genoma para formar una estructura de giro, o permitir la unión del extremo 3' del producto de amplificación del genoma a un cebador. En algunas realizaciones, el método pasa directamente al paso (b5) después del paso (b4). En algunas realizaciones, el primer número de ciclos del paso (b5) es de más de 3, más de 4, más de 5 o más de 6 y no más de 10.
En algunas realizaciones, el paso (c) comprende: (c1) colocar la mezcla de la reacción obtenida en el paso (b) en un programa térmico capaz de abrir cadenas dobles de ADN; (c2) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la unión del segundo tipo de cebador a cadenas sencillas del producto de amplificación genómica obtenido en el paso (b); (c3) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la extensión de la longitud del segundo tipo de cebador que se une a cadenas sencillas de los productos de amplificación, bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico; (c4) repetir los pasos (c1) a (c3) hasta un segundo número de ciclos designado. En algunas realizaciones, el segundo número de ciclos en el paso (c4) es mayor que el primer número de ciclos en el paso (b5). En algunas realizaciones, el programa térmico en el paso (b1) comprende dejar reaccionar durante 1-10 minutos a una temperatura entre 90-95° C. En algunas realizaciones, el paso (b2) comprende colocar la mezcla de la reacción en más de un programa térmico para promover la unión suficiente y eficaz del primer tipo de cebador a la plantilla de ADN; en algunas realizaciones, el más de un programa térmico comprende: una primera temperatura entre 5-10° C, una segunda temperatura entre 25-30° C y una tercera temperatura entre 45-50° C.
En algunas realizaciones, el paso (b2) comprende permitir la reacción a una primera temperatura durante 3­ 50 s, permitir la reacción a una segunda temperatura durante 3-50 s, y permitir la reacción a una tercera temperatura durante 3-50 s. En algunas realizaciones, el programa térmico en el paso (b3) comprende permitir la reacción a una temperatura de 60-90° C durante 1-15 minutos. En algunas realizaciones, el programa térmico en el paso (b4) comprende permitir la reacción a una temperatura de 90-95° C durante 10-50 s. En algunas realizaciones, el programa térmico en el paso (c1) comprende permitir la reacción a una temperatura de 90-95° C durante 10-30 s. En algunas realizaciones, el programa térmico en el paso (c2) comprende permitir la reacción a una temperatura de 45­ 65° C durante 10-30 s. En algunas realizaciones, el programa térmico en el paso (c3) comprende permitir la reacción a una temperatura de 60-80° C durante 1-15 minutos. En algunas realizaciones, el ADN genómico en el paso (a) se libera de una célula lisada, el lisado incluye lisado térmico, lisado de bases, lisado enzimático o lisado mecánico.
En algunas realizaciones, el lisado térmico comprende lisar a una temperatura entre 20-100° C durante 10­ 100 minutos. En algunas realizaciones, el lisado térmico se lleva a cabo en presencia de un reactivo de lisado. En algunas realizaciones, el reactivo de lisado incluye uno o más surfactantes seleccionados del grupo que consiste de: NP-40, Tween, SDS, Triton X-100, EDTA e isotiocianato de guanidinio y/o liasa.
También se divulga en la presente un método para amplificar el genoma de una célula, dicho método comprende: (a) proporcionar una mezcla de la reacción, en donde la mezcla de reacción comprende ADN de dicho genoma, un primer tipo de cebador, un segundo tipo de cebador, un mezcla de monómeros de nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, y en donde el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable; (b) colocar la mezcla de la reacción en un primer programa de ciclo térmico de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador pueda emparejarse con el ADN del genoma y amplificar el ADN del genoma para obtener un producto de amplificación genómica, en donde el producto de amplificación genómica comprende la secuencia común en su extremo 5' y comprende la secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3'; en donde el primer programa de ciclo térmico comprende: (b1) permitir reaccionar a una primera temperatura desnaturalizante entre 90-95° C durante 1-10 minutos; (b2) permitir reaccionar a una primera temperatura de apareamiento a entre 5-10° C durante 3-50 s, a una segunda temperatura de apareamiento entre 25­ 30° C durante 3-50 s, y a una tercera temperatura de apareamiento entre 45-50° C para 3-50 s; (b3) permitir reaccionar a una primera temperatura de alargamiento entre 60-90° C durante 1-15 minutos; (b4) permitir reaccionar a una primera temperatura de fusión entre 90-95° C durante 10-50 s; (b5) repetir los pasos (b2) a (b4) durante 6-9 ciclos; (c) colocar la mezcla de la reacción obtenida en el paso (b) en un segundo programa de ciclo térmico, de tal manera que la secuencia común del segundo tipo de cebador pueda emparejarse con el extremo 3' del producto de amplificación genómica y amplificar el producto de amplificación genómica para obtener un producto de amplificación genómica expandido; en donde el segundo programa de ciclo térmico comprende: (c1) permitir reaccionar a una segunda temperatura de desnaturalización entre 90-95° C durante 1-10 minutos; (c2) permitir reaccionar a una segunda temperatura de fusión entre 90-95° C durante 10-30 s; (c3) permitir reaccionar a una cuarta temperatura de apareamiento entre 45-65° C durante 10-30 s; (c4) permitir reaccionar a una segunda temperatura de alargamiento entre 60-80° C durante 1-15 minutos; (c5) repetir los pasos (c2) a (c4) durante 5-30 ciclos; (d) obtener el producto de amplificación del paso (c); en donde la mezcla de la reacción se proporciona antes del paso (b) y el paso (c).
En algunas realizaciones, la secuencia común comprende o consiste de la SEQ ID NO: 1; la secuencia variable comprende o consiste de NNNNNTTT o NNNNNGGG y N es cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural.
La invención también proporciona una mezcla que contiene un primer tipo de cebador y un segundo tipo de cebador, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde el extremo 3' del primer cebador es la secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, en donde la secuencia común se selecciona de tal manera que la secuencia común no se una sustancialmente al ADN genómico para provocar amplificación, y en donde el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable, y en donde el extremo 3' del segundo tipo de cebador no contiene otras secuencias adicionales, en donde la secuencia variable se selecciona del grupo que consiste de (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG, donde N se refiere a cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural, n es un número entero positivo seleccionado de 3-17, m es un número entero positivo seleccionado de 3-15, respectivamente.
En algunas realizaciones, la mezcla comprende además una mezcla de monómeros de nucleótidos y Mg2+. En algunas realizaciones, la mezcla comprende además uno o más componentes de los siguientes: dTT, albúmina de suero bovino (BSA), regulador de pH (por ejemplo, Tris HC1), inhibidor de ADNasa, RNasa, SO42', Cl-, K+, Ca2+, Na+ y/o (NH4)+.
En algunas realizaciones, la mezcla comprende además una polimerasa de ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el kit comprende además un surfactante y/o una liasa capaz de lisar una célula. En algunas realizaciones, el surfactante se selecciona de uno o más de NP-40, Tween, SDS, TritonX-100, EDTA e isotiocianato de guanidina. En algunas realizaciones, la liasa se selecciona entre una o más proteasa K, pepsina y papaína.
En algunas realizaciones, la mezcla comprende además un surfactante y/o una liasa capaz de lisar una célula.
En otro aspecto de la presente solicitud, se proporciona un kit para amplificar ADN genómico como se reivindica, dicho kit comprende un primer tipo de cebador y un segundo tipo de cebador como se reivindica, y comprende además una instrucción para los usuarios, dicha instrucción registra los siguientes pasos: mezclar el primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador en el mismo recipiente antes de dicha amplificación, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, y en donde el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las características anteriores y otras de la presente divulgación se describirán de manera más completa a través de la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, en combinación con los dibujos. Se entiende que estos dibujos solo representan varias realizaciones de la presente divulgación y, por lo tanto, no deben considerarse como limitativos del alcance de la divulgación. Aplicando los dibujos, la presente divulgación se describirá más claramente y con más detalles.
La Figura 1 muestra el principio básico del método de amplificación de la presente solicitud.
La Figura 2 muestra los resultados de la electroforesis en gel de los productos de amplificación obtenidos amplificando el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y el método de dos pasos del Ejemplo 3, respectivamente, en donde (a) muestra los resultados de amplificación del método de dos pasos del Ejemplo 3 (de izquierda a derecha, línea 1, marcador de peso molecular; líneas 2-11, muestras de amplificación de una sola célula; líneas 12-14, control positivo (40 pg ADNg); líneas 15-17, control negativo; línea 18, marcador de peso molecular); (b) muestra los resultados de amplificación del método de tres pasos del Ejemplo 2 (de izquierda a derecha, línea 1, marcador de peso molecular; líneas 2-11, muestras de amplificación de una sola célula; líneas 12-14, control positivo (40 pg ADNg); líneas 15-17, control negativo; línea 18, marcador de peso molecular).
La Figura 3 muestra los resultados de electroforesis en gel de lo siguiente: se amplificó el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y el método de dos pasos del Ejemplo 3, respectivamente, y se seleccionaron aleatoriamente 7 muestras de productos de amplificación obtenidos de los dos métodos (es decir, un total de 14 muestras) como plantilla, respectivamente, y los 20 sitios patogénicos que se muestran en la Tabla 6 se amplificaron usando los cebadores que se muestran en la Tabla 7, y los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en gel. a-g en ellos representan imágenes de electroforesis en gel de productos reamplificados de los productos de amplificación de ADN genómico de una sola célula, respectivamente, en donde las bandas de la fila superior indican los resultados de la amplificación usando el método de dos pasos y las bandas de la fila inferior indican los resultados de la amplificación usando el método de tres pasos (a: la fila superior corresponde a la muestra 2_1 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_1; b: la fila superior corresponde a la muestra 2_2 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_3; c: la fila superior corresponde a la muestra 2_3 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_4; d: la fila superior corresponde a la muestra 2_4 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_5; e: la fila superior corresponde a la muestra 2_5 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_6; f: la fila superior corresponde a la muestra 2_6 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_7; g: la fila superior corresponde a la muestra 2_7 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_8). En cada imagen de electroforesis, de izquierda a derecha, las líneas indican secuencialmente el marcador de peso molecular y los resultados de la amplificación de los sitios patogénicos 1-20 se muestran en la Tabla 6 (amplificación de los sitios patogénicos 1-16 en la Figura (a)).
La Figura 4 muestra los resultados de electroforesis en gel de lo siguiente: se amplificó el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y el método de dos pasos del Ejemplo 3, respectivamente, y se seleccionaron aleatoriamente 3 muestras de los productos de amplificación obtenidos de los dos métodos (es decir, un total de 6 muestras) como plantillas, respectivamente, y los 20 sitios patogénicos mostrados en la Tabla 10 se amplificaron usando los cebadores mostrados en la Tabla 11, y los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en gel. a-c en ellos representan imágenes de electroforesis en gel de productos reamplificados de los productos de amplificación de ADN genómico de una sola célula, respectivamente, donde las bandas de la fila superior indican los resultados de la amplificación usando el método de dos pasos y las bandas de la fila inferior indican los resultados de la amplificación usando el método de tres pasos (a: la fila superior corresponde a la muestra 2_1 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_1; b: la fila superior corresponde a la muestra 2_2 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_4; c: la fila superior corresponde a la muestra 2_7 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_8). En cada imagen de electroforesis, de izquierda a derecha, las líneas indican secuencialmente el marcador de peso molecular y los resultados de la amplificación de los sitios patogénicos 1-20 se muestran en la Tabla 6.
La Figura 5 muestra los resultados de amplificación de qPCR de lo siguiente: se amplificó el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y el método de dos pasos del Ejemplo 3, respectivamente, y se seleccionaron aleatoriamente 4 muestras de los productos de amplificación obtenidos de los dos métodos (es decir, un total de 8 muestras) como plantillas, respectivamente, y la amplificación de qPCR se realizó usando los 6 pares de cebadores de inspección de calidad que se muestran en la Tabla 14. a-f en ellos representan los datos de detección de q-PCR en el ADN de plantilla usando los cebadores de inspección de calidad para los cromosomas CH1, CH2, CH3, CH4, CH5, CH6 y CH7, respectivamente, en donde Ct representa el número de ciclo umbral y ADN1 y ADN2 representan controles positivos.
La Figura 6 muestra los resultados del número de copias de cromosomas obtenido al secuenciar la biblioteca genómica construida usando los productos de amplificación obtenidos al amplificar el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de dos pasos del Ejemplo 3. La ordenada vertical representa el número de copias de cromosomas, que es 2 en personas normales; la ordenada horizontal representa los cromosomas 1-22 y los cromosomas sexuales, en donde a-j representa los resultados del número de copias de cromosomas obtenido mediante la secuenciación de bibliotecas genómicas construidas con las muestras 2_1, 2_2, 2_3, 2_4, 2_5, 2_6, 2_7, 2_8, 2_9 y 2_10.
La Figura 7 muestra los resultados del número de copias de cromosomas obtenido al secuenciar la biblioteca genómica construida usando los productos de amplificación obtenidos al amplificar el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2. La ordenada vertical representa el número de copias de cromosomas, que es 2 en personas normales; la ordenada horizontal representa los cromosomas 1-22 y los cromosomas sexuales. a-i representan los resultados del número de copias de cromosomas obtenido secuenciando bibliotecas genómicas construidas a partir de las muestras 3_1, 3_3, 3_4, 3_5, 3_6, 3_7, 3_8, 3_9 y 3_10.
La Figura 8 muestra estadísticas de los resultados de secuenciación obtenidos mediante la secuenciación de segunda generación de bibliotecas genómicas construidas respectivamente usando los productos de amplificación obtenidos de la amplificación del ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 (es decir, muestras 3_1, 3_3, 3_4, 3_5, 3_6, 3_7, 3_8, 3_9 y 3_10) y usando el método de dos pasos del Ejemplo 3 (es decir, muestras 2_1, 2_2, 2_3, 2_4, 2_5, 2_6, 2_7, 2_8, 2_9 y 2_10), respectivamente.
La Figura 9 muestra los resultados comparativos del coeficiente de variación del número de copias después de la secuenciación de segunda generación de bibliotecas genómicas construidas respectivamente usando los productos de amplificación obtenidos amplificando el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 (es decir, muestras 3_1, 3_3, 34, 3_5, 3_6, 3_7, 3_8, 3_9 y 3_10) y usando el método de dos pasos del Ejemplo 3 (es decir, muestras 2_1, 2_2, 2_3, 2_4, 2_5, 2_6, 2_7, 2_8, 2_9 y 2_10), respectivamente.
La Figura 10 muestra los resultados obtenidos mediante la secuenciación de alto rendimiento de lo siguiente: se amplificó el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y el método de dos pasos del Ejemplo 3, respectivamente, y los productos de amplificación de los dos métodos (en donde los productos de amplificación del método de tres pasos se muestran como 3-1 y 3-2, y los del método de dos pasos se muestran como 2-1) y el ADN genómico extraído de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) (mostrados como Gdna), se sometieron a PCR multiplex respectivamente, y los productos de amplificación de PCR multiplex se sometieron a secuenciación de alto rendimiento.
La Figura 11 muestra los resultados de la electroforesis en gel de los productos de amplificación obtenidos amplificando el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y usando el método de un paso del Ejemplo 5, respectivamente, en donde a muestra el resultado de amplificación del método de un paso del Ejemplo 5 (de izquierda a derecha, línea 1, marcador de peso molecular; líneas 2-11, muestras de amplificación de una sola célula; líneas 12-14, control positivo (40 pg ADNg); líneas 15-17, control negativo; línea 18, marcador de peso molecular); b representa los resultados de amplificación del método de tres pasos del Ejemplo 2 (de izquierda a derecha, línea 1, marcador de peso molecular; líneas 2-11, muestras de amplificación de una sola célula; líneas 12-14, control positivo (40 pg ADNg); líneas 15-17, control negativo; línea 18, marcador de peso molecular).
La Figura 12 muestra los resultados de la electroforesis en gel de lo siguiente: el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales se amplificó usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y el método de un paso del Ejemplo 5, respectivamente, y se seleccionaron aleatoriamente 4 muestras de productos de amplificación obtenidos de los dos métodos (es decir, un total de 8 muestras) como plantillas, respectivamente, y la amplificación para los 20 sitios patogénicos como se muestra en la Tabla 6 se realizó usando los cebadores que se muestran en la Tabla 7, respectivamente, y los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en gel. a-d representan imágenes de electroforesis en gel de productos de amplificación repetida de ADN genómico de una sola célula, respectivamente, en donde las bandas de la fila superior indican los resultados de amplificación usando el método de dos pasos y las bandas de la fila inferior indican los resultados de amplificación usando el método de tres pasos (a: la fila superior corresponde a la muestra 1_1 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_1; b: la fila superior corresponde a la muestra 1_2 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_2; c: la fila superior corresponde a la muestra 1_3 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_3; d: la fila superior corresponde a la muestra 1_4 y la fila inferior corresponde a la muestra 3_4. En cada imagen de electroforesis, de izquierda a derecha, las líneas indican secuencialmente los resultados de amplificación para los sitios patogénicos 1-20 que se muestran en la Tabla 6.
La Figura 13 muestra los resultados del número de copias de cromosomas obtenido mediante la secuenciación de bibliotecas genómicas construidas usando productos de amplificación obtenidos amplificando el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de un solo paso del Ejemplo 5, en donde la ordenada vertical representa el número de copias de cromosomas, que es 2 en personas normales; la ordenada horizontal representa los cromosomas 1-22 y los cromosomas sexuales, en donde a-j representan los resultados del número de copias de cromosomas obtenidos mediante la secuenciación de bibliotecas genómicas construidas con las muestras 1_1, 1_2, 1_3, 1_4, 1_5, 1_6, 1_7, 1_8, 1_9 y 1_10, respectivamente.
La Figura 14 muestra los resultados del número de copias de cromosomas obtenido mediante la secuenciación de bibliotecas genómicas construidas usando productos de amplificación obtenidos amplificando el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2, en donde la ordenada vertical representa el número de copias de cromosomas, que es 2 en personas normales; la ordenada horizontal representa los cromosomas 1-22 y los cromosomas sexuales, en donde a-i representan los resultados del número de copias de cromosomas obtenidos secuenciando bibliotecas genómicas construidas con las muestras 3_1, 3_2, 3_3, 3_4, 3_5, 3_6, 3_7, 3_8 y 3-10, respectivamente.
La Figura 15 muestra estadísticas de los resultados de secuenciación obtenidos mediante la secuenciación de segunda generación de bibliotecas genómicas construidas con los productos de amplificación obtenidos mediante la amplificación del ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y usando el método de un solo paso del Ejemplo 5, respectivamente.
La Figura 16 muestra los resultados comparativos del coeficiente de variación del número de copias después de la secuenciación de segunda generación de bibliotecas genómicas construidas con los productos de amplificación obtenidos amplificando el ADN genómico de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) normales usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 y usando el método de un solo paso del Ejemplo 5, respectivamente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación proporciona un método para amplificar el ADN genómico, en particular un método para amplificar el genoma completo de una sola célula, como se reivindica.
La presente divulgación se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que antes de la reacción de amplificación del ADN genómico, todos los reactivos requeridos para la amplificación pueden añadirse a una sola mezcla de la reacción, y luego esta mezcla de la reacción se coloca en condiciones para la reacción de amplificación, hasta completar la amplificación. Este método elimina la necesidad de añadir reactivos a una mezcla de la reacción después del inicio de la reacción de amplificación y reduce de este modo en gran medida las operaciones adicionales provocadas, y la contaminación que podría resultar de la adición de reactivos, y acorta en gran medida el tiempo de reacción requerido.
Antes de la presente divulgación, cuando se usaban dos o más cebadores para ADN genómico, la reacción de amplificación debía separarse en por lo menos dos pasos, donde se usaban cebadores diferentes en cada paso y, por lo tanto, se lograban diferentes propósitos de amplificación. Anteriormente se creía que, para evitar interferencias entre cebadores que a su vez impactan sobre el efecto de amplificación, los cebadores requeridos para el segundo paso solo podían añadirse a la mezcla de la reacción después de que se hubiese completado el primer paso, o el primer paso solo podía emplear un número de ciclos muy bajo (por ejemplo, 1 ciclo). Por lo tanto, en los métodos anteriores a la presente divulgación, pueden añadirse solo los cebadores necesarios para el primer paso antes de una reacción de amplificación y después de que finaliza la reacción de amplificación del primer paso, añadir los cebadores necesarios para el segundo paso al sistema de reacción, (ver, por ejemplo, la WO2012/166425); o emplear solamente un número de ciclos muy bajo en el primer paso, por lo que difícilmente puede lograrse una eficiencia de amplificación deseable. Sorprendentemente, los inventores de la presente solicitud descubrieron que cuando se colocan todos los cebadores que originalmente se creía que interfería entre sí a la vez en una única mezcla de la reacción y se realiza la amplificación en las condiciones de reacción de la presente divulgación, puede obtenerse inesperadamente un efecto de amplificación que es comparable al de cuando los cebadores se añaden por separado. Por lo tanto, la presente divulgación mejora en gran medida la eficacia de la reacción, acorta el tiempo de reacción y reduce el riesgo de contaminación de la muestra y mejora la fiabilidad de los resultados.
En un aspecto, la presente solicitud proporciona un método para amplificar ADN genómico de una célula como se reivindica, que comprende: (a) proporciona una mezcla de reacción en donde la mezcla de la reacción comprende el ADN genómico, un primer tipo de cebador, un segundo tipo de cebador, una mezcla de monómeros de nucleótidos , y polimerasa de ácido nucleico, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, (b) colocar la mezcla de la reacción en un primer programa de ciclo térmico de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador pueda emparejarse con el ADN genómico y amplificar el a Dn genómico para obtener un producto de amplificación genómica, en donde el producto de amplificación genómica comprende la secuencia común en su extremo 5' y comprende una secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3'; (c) colocar la mezcla de la reacción obtenida en el paso (b) en un segundo programa de ciclo térmico, de tal manera que la secuencia común del segundo tipo de cebador pueda emparejarse con el extremo 3' del producto de amplificación genómica y amplificar el producto de amplificación genómica para obtener un producto de amplificación genómica expandido. Ver la Figura 1 para la ilustración de una realización del método proporcionado en la presente solicitud.
Paso (a): proporcionar una mezcla de la reacción
El método de la presente solicitud es ampliamente aplicable para la amplificación de ADN genómico, particularmente para la amplificación rápida y precisa de una cantidad diminuta de ADN genómico.
I. ADN genómico
El método de la presente solicitud es preferiblemente útil para ADN genómico. En ciertas realizaciones, la cantidad inicial de ADN genómico contenida en una mezcla de la reacción no es de más de 10 ng, no más de 5 ng, no más de 1 ng, no más de 500 pg, no más de 200 pg, no más de 100 pg, no más de 50 pg, no más de 20 pg, o no más de 10 pg.
Un ADN genómico puede ser de una muestra biológica, por ejemplo, tejido biológico o fluido corporal que contiene células o ADN libre. Las muestras que contienen ADN genómico pueden obtenerse mediante métodos conocidos, por ejemplo, a través de muestras de mucosa oral, muestras nasales, cabello, enjuague bucal, sangre del cordón umbilical, plasma, líquido amniótico, tejido embrionario, células endoteliales, muestras de uñas, muestras de pezuñas, etc. Una muestra biológica puede proporcionarse en cualquier forma adecuada, por ejemplo, en forma embebida en parafina, en forma recién aislada, etc. El ADN genómico puede ser de cualquier especie o especie biológica, incluyendo pero no limitado a, humanos, mamíferos, ganado, cerdos, ovejas, caballos, roedores, pájaros, peces, pez cebra, camarones, plantas, levaduras, virus o bacterias.
En ciertas realizaciones, el ADN genómico es el de una sola célula o el de dos o más células del mismo tipo. Las células individuales o células del mismo tipo pueden ser de, por ejemplo, embriones preimplantatorios, células embrionarias en sangre periférica de mujeres embarazadas, espermatozoides individuales, óvulos, óvulos fecundados, células cancerosas, células bacterianas, células tumorales circulantes, células de tejido tumoral., o células individuales o múltiples células del mismo tipo obtenidas de cualquier tejido. El método de la presente solicitud puede usarse para amplificar ADN en algunas muestras valiosas o muestras con una cantidad inicial baja, por ejemplo, óvulos humanos, células germinales, células tumorales circulantes, células de tejido tumoral, etc.
También se conocen en la técnica métodos para obtener células individuales, por ejemplo, mediante el método de clasificación por citometría de flujo (Herzenberg et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 1453-55, 1979; lverson et al., Prenatal Diagnosis 1:61 -73, 1981; Bianchi et al., Prenatal Diagnosis 11: 523-28, 1991), clasificación de células activadas por fluorescencia, el método de separación usando perlas magnéticas (MACS, Ganshirt-Ahlert et al., Am J Obstet Gynecol 166: 1350, 1992), usando un recolector de células semiautomático (por ejemplo, el sistema de transferencia de células Quixell™ de Stoelting Co.) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, pueden usarse técnicas de centrifugación en gradiente y citometría de flujo para aumentar la eficiencia de separación y clasificación. En algunas realizaciones, pueden seleccionarse células de tipos particulares, como células que expresan biomarcadores particulares, de acuerdo con diferentes propiedades de células individuales.
Los métodos para obtener ADN genómico también son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, el ADN genómico puede liberarse y obtenerse lisando células a partir de muestras biológicas o células individuales. La lisis puede realizarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, la lisis puede realizarse mediante lisis térmica, lisis de bases, lisis enzimática, lisis mecánica o cualquier combinación de las mismas (ver, específicamente, por ejemplo, U.S. 7.521.246, Manual técnico de Thermo Scientific Pierce Cell Lysis v2 y Current Protocols in Molecular Biology (1995). John Wiley and Sons, Inc.(suplemento 29) págs. 9.7.1-9.7.2.).
La lisis mecánica incluye métodos que rompen las células usando fuerzas mecánicas como el uso de ultrasonidos, agitación a alta velocidad, homogeneización, presurización (por ejemplo, prensa francesa), descompresión y trituración. El método de lisis mecánico más comúnmente usado es el método de homogeneización de líquidos, que obliga a la suspensión celular a pasar a través de un espacio muy estrecho y, por lo tanto, se aplica una fuerza de corte sobre la membrana celular (WO2013153176 A1).
En ciertas realizaciones, pueden usarse métodos de lisis suave. Por ejemplo, las células pueden lisarse calentándolas en una solución que contiene Tween-20 a 72° C durante 2 min, calentándolas en agua a 65° C durante 10 min (Esumi et al., Neurosci Res 60(4) 439 -51 (2008)), calentándolas en tampón de PCR II (Applied Biosystems) que contiene NP-40 al 0,5% a 70° C durante 90 s (Kurimoto et al., Nucleic Acids Res 34(5):e42 (2006)), o usando proteasa (por ejemplo, proteasa K) o una solución de sal caotrópica (por ejemplo, isotiocianato de guanidina) (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° US 20070281313).
La lisis térmica incluye calentamiento y métodos repetidos de congelación-descongelación. En algunas realizaciones, la lisis térmica comprende lisar durante 10 a 100 minutos a una temperatura entre 20 y 100 grados centígrados. En algunas realizaciones, la temperatura para la lisis térmica puede ser cualquier temperatura entre 20­ 90, 30-90, 40-90, 50-90, 60-90, 70-90, 80-90, 30-80, 40-80, 50 -80, 60-80 o 70-80° C. En algunas realizaciones, la temperatura para la lisis térmica no es menor de 20, 30, 40 o 50° C. En algunas realizaciones, la temperatura para la lisis térmica no es de más de 100, 90 u 80° C. En algunas realizaciones, el tiempo para la lisis térmica puede ser cualquier período entre 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 20-30, 30-100, 30-90, 30-80, 30-70, 30-60, 30-50 o 30-40 minutos. En algunas realizaciones, el tiempo para la lisis térmica no es de menos de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 minutos. En algunas realizaciones, el tiempo para la lisis térmica no es de más de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 o 20 minutos. En algunas realizaciones, la temperatura para la lisis térmica varía con el tiempo. En algunas realizaciones, la lisis térmica se mantiene a una temperatura de 30-60° C durante 10-30 minutos, seguido de una temperatura de 70-90° C durante 5-20 minutos.
En algunas realizaciones, la lisis térmica se lleva a cabo en presencia de un reactivo de lisis. En presencia de un reactivo de lisis, puede reducirse el tiempo o la temperatura necesarios para la lisis. Un reactivo de lisis puede romper las interacciones proteína-proteína, lípido-lípido y/o proteína-lípido, promoviendo de este modo la liberación de ADN genómico de una célula.
En algunas realizaciones, el reactivo de lisis comprende un surfactante y/o una liasa. Los surfactantes pueden clasificarse en surfactantes iónicos, anfóteros y no iónicos. Generalmente, las eficacias de lisis de los surfactantes anfóteros y no iónicos son más débiles que las de los surfactantes iónicos. Los surfactantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, uno o más de NP-40, Tween, SDS, GHAPS, TritonX-100, TritonX-114, EdTA, desoxicolato de sodio, colato de sodio e isotiocianato de guanidina. Los expertos en la técnica pueden seleccionar el tipo y la concentración de un surfactante en base a la necesidad práctica. En algunas realizaciones, la concentración de trabajo de un surfactante es del 0,01%-5%, 0,1%-3%, 0,3%-2% o 0,5-1%.
Las liasas ejemplares pueden ser proteinasa K, pepsina, papaína, etc., o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la concentración de trabajo de una liasa es del 0,01%-1%, 0,02%-0,5%, 0,03%-0,2% o 0,4-0,1%.
En el método proporcionado en la presente, puede usarse un lisado que contiene ADN genómico directamente en una mezcla de la reacción. Por ejemplo, una muestra biológica puede pretratarse mediante lisis para obtener un lisado, que luego se mezcla con otros componentes de la mezcla de la reacción. Si es necesario, el lisado puede procesarse adicionalmente para aislar el ADN genómico que contiene, y luego el ADN genómico aislado se mezcla adicionalmente con otros componentes de la mezcla de la reacción para proporcionar una mezcla de la reacción.
En algunas realizaciones, una muestra de ácido nucleico obtenida mediante lisis puede amplificarse sin purificarse.
También se divulga en la presente un método más simple, es decir, mezclar directamente una célula que contiene ADN genómico con otros componentes requeridos para la amplificación para obtener una mezcla de la reacción, en otras palabras, el ADN genómico en la mezcla de la reacción está presente dentro de una célula. En tales circunstancias, la mezcla de la reacción puede contener además surfactantes (como, pero no limitados a, uno o más de NP-40, Tween, SDS, TritonX-100, EDTA e isotiocianato de guanidina) y/o liasa (por ejemplo, una o más de proteasa K, pepsina y papaína) capaces de lisar la célula. De esta manera, la lisis celular y la amplificación del ADN genómico se producen en la misma mezcla de la reacción, lo que no solo mejora la eficiencia de la reacción, acorta el tiempo de reacción, sino que también conserva un efecto de amplificación bastante bueno.
En ciertas realizaciones, el método proporcionado en la presente puede comprender además colocar la mezcla de la reacción en un programa de ciclo térmico de lisis después de completar el paso (a) y antes del paso (b), de tal manera que se lisa la célula y se libera el ADN genómico. Los expertos en la técnica pueden seleccionar un programa de ciclo térmico de lisis adecuado de acuerdo con los componentes del lisado contenidos en la mezcla de la reacción, tipo de célula, etc. Un programa de ciclo térmico de lisis ejemplar incluye colocar la mezcla de la reacción a 50° C durante de 3 minutos a 8 horas (por ejemplo, cualquier período de tiempo entre 3 minutos a 7 horas, 3 minutos a 6 horas, 3 minutos a 5 horas, 3 minutos a 4 horas, 3 minutos a 3 horas, 3 minutos a 2 horas, 3 minutos a 1 hora, 3 minutos a 40 minutos, 3 minutos a 20 minutos; como 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, etc.), luego a 80° C durante de 2 minutos a 8 horas (por ejemplo, cualquier período de tiempo de 2 minutos a 7 horas, 2 minutos a 6 horas, 2 minutos a 5 horas, 2 minutos a 4 horas, 2 minutos a 3 horas, 2 minutos a 2 horas, 2 minutos a 1 hora, 2 minutos a 40 minutos, 2 minutos y 20 minutos; como 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, etc.). El programa térmico de lisis puede ejecutarse durante 1 ciclo, o 2 o más ciclos según sea necesario, dependiendo de las condiciones específicas de lisis.
ii. Cebadores
La mezcla de la reacción contiene además dos tipos diferentes de cebador, de los cuales el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, y el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable, como se define en las reivindicaciones. La secuencia variable en el primer tipo de cebador puede unirse a la plantilla de ADN genómico y una cierta longitud de la plantilla genómica puede replicarse bajo la acción de una polimerasa de ácido nucleico, para obtener un producto de amplificación con una secuencia común en su extremo 5' y una secuencia genómica en su extremo 3', a la que también se hace referencia en la presente como semi-amplicón. La secuencia variable en el primer tipo de cebador también puede emparejarse y unirse a un semi-amplicón y replicarse usando el semi-amplicón como plantilla, generando un producto de amplificación con una secuencia común en su extremo 5' y una secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3', a la que también se hace referencia como amplicón completo. El segundo tipo de cebador puede unirse a la secuencia complementaria de la secuencia común en el extremo 3' de un amplicón completo y de este modo replica aún más el amplicón completo y aumenta considerablemente su número.
La secuencia común en la presente solicitud se refiere a una secuencia específica localizada en el extremo 5' del primer tipo de cebador. La longitud de una secuencia común puede ser, por ejemplo, 10-30, 12-29, 15-28, 18­ 26 o 20-24 bases. En la presente solicitud, se selecciona una secuencia común adecuada, de tal manera que sustancialmente no se una al ADN genómico, lo que da como resultado una amplificación, y evita la polimerización entre el primer tipo de cebador y el primer tipo de cebador o entre el primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador.
En ciertas realizaciones, una secuencia común solo comprende tres o dos tipos de bases con escasa capacidad de emparejamiento autocomplementario, y no comprende el otro o los dos tipos de bases. En ciertas realizaciones, la secuencia común consiste de tres tipos de bases, G, A y T, es decir, la secuencia común no contiene la base C. En ciertas realizaciones, la secuencia común consiste de tres tipos de bases, C, A y T, es decir, la secuencia común no contiene la base G. En ciertas realizaciones, la secuencia común consiste de dos tipos de bases, A y T, A y C, A y G, T y C, o T y G, es decir, la secuencia común no contiene G y C al mismo tiempo. tiempo. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que si una secuencia común contiene una base C o G, puede producirse una polimerización cebador-cebador, que genera polímeros y, por lo tanto, deteriora la capacidad de amplificar el a Dn genómico. Preferiblemente, una secuencia común no tiene ninguna secuencia de autoemparejamiento, o ninguna secuencia que pueda provocar el emparejamiento cebador-cebador, o múltiples bases del mismo tipo en sucesión.
En ciertas realizaciones, puede seleccionarse una secuencia de bases adecuada de secuencia y proporción común de cada base de la misma, para asegurar que la secuencia común en sí misma no experimente emparejamiento de bases con la secuencia de plantilla de ADN genómico o dé como resultado una amplificación.
En ciertas realizaciones, la secuencia común se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1. (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), SEQ ID NO: 2 (GTGGAGTTAGTGAGTGTAATGGAT), SEQ ID NO: 3 (GGTTTGGTGTGTGTGTG), SEQ ID NO: 4 (ACAACACTATCAATCCCTATCCTAC), SEQ ID NO: 5 (ATGGTAGTGGGTAGATGATTAGGT), SEQ ID NO: 6 (CATATCCCTATACCTAATACCATTAC).
El extremo 5' del primer tipo de cebador es una secuencia común y el extremo 3' es una secuencia variable. Una secuencia común y una secuencia variable pueden ser directamente adyacentes o pueden tener una secuencia espaciadora de una o más bases. La secuencia variable en la presente solicitud se refiere a una secuencia de bases con una secuencia no fija, por ejemplo, puede comprender una secuencia aleatoria. Una secuencia aleatoria puede comprender cualquier nucleótido que pueda experimentar emparejamiento de bases con un ácido nucleico de origen natural, como cuatro tipos de bases de origen natural de A, T, G y C, así como otros análogos de nucleótidos y nucleótidos modificados conocidos por los expertos en la técnica, siempre que pueda emparejarse con el ADN genómico y lograr la amplificación. La secuencia de nucleótidos en una secuencia variable puede tener múltiples posibilidades de variación. Por lo tanto, el primer tipo de cebador puede comprender un conjunto de cebadores con diferentes secuencias, en donde cada cebador tiene una secuencia común en su extremo 5' y una secuencia variable en su extremo 3'. Las secuencias comunes en estos cebadores son idénticas, pero las secuencias variables pueden variar.
Una secuencia variable puede tener una longitud adecuada, por ejemplo, 2-20 bases, 2-19 bases, 2-18 bases, 2-17 bases, 2-16 bases, 2-15 bases 2-14 bases, 2-13 bases, 2-12 bases, 2-11 bases, 2-12 bases, 2-11 bases, 2-10 bases, 2-9 bases, 2-8 bases, 3-18 bases, 3-16 bases, 3-14 bases, 3-12 bases, 3-10 bases, 4-16 bases, 4-12 bases, 4-9 bases o 5-8 bases. En ciertas realizaciones, la secuencia variable tiene una longitud de 5 bases. En ciertas realizaciones, la secuencia variable tiene una longitud de 8 bases. Teóricamente, si la base en cada posición se selecciona al azar de los cuatro tipos de bases, A, T, G y C, una secuencia variable con una longitud de 4 bases puede generar 256 posibles secuencias aleatorias mediante combinación, y una secuencia variable con un una longitud de 5 bases puede generar 1024 posibles secuencias aleatorias mediante combinación, y así sucesivamente. Estas secuencias variables pueden emparejarse complementariamente con las secuencias correspondientes en diferentes posiciones en el ADN genómico, y de este modo se inicia la replicación en diferentes posiciones en el ADN genómico.
Las secuencias variables pueden seleccionarse mediante un enfoque aleatorio, también pueden aplicarse ciertas condiciones limitantes sobre la base del enfoque aleatorio, con el fin de eliminar algunas situaciones no deseadas o mejorar el grado de coincidencia con el ADN genómico objetivo. En ciertas realizaciones, tres o más posiciones de bases en la secuencia variable consisten de uno o más tipos de bases seleccionadas de G, A y T (es decir, que no son C), o consisten de uno o más tipos de bases de C, A, y T (es decir, que no son G), para evitar el emparejamiento complementario entre la secuencia variable y la secuencia común. En algunas realizaciones, cuando la secuencia común no contiene G pero contiene C, tres o más posiciones de bases en la secuencia variable consisten de uno o más tipos de bases de C, A y T (es decir, que no son G). En algunas realizaciones, cuando la secuencia común no contiene C pero contiene G, tres o más posiciones de bases en la secuencia variable consisten de uno o más tipos de bases de G, A y T (es decir, que no son C). En algunas realizaciones, cuando una secuencia común no contiene ni C ni G, tres o más posiciones de bases en una secuencia variable consisten de uno o más tipos de bases seleccionadas de G, A y T (es decir, que no son C) o consisten de una o más más tipos de bases de C, A y T (es decir, que no son G). Las tres o más bases pueden estar localizadas en el extremo 3' de la secuencia variable, o pueden estar localizadas en la parte media de la secuencia variable. Las tres o más bases pueden ser sucesivas o no sucesivas. Por ejemplo, ninguna de las tres bases adyacentes en el extremo 3' de la secuencia variable es C, o las tres bases en el extremo 3' de una secuencia variable que están espaciadas entre sí no son C, o ciertas dos bases sucesivas así como otra base espaciada de las mismas en el extremo 3' de una secuencia variable no son C. Cuando las tres posiciones de bases son sucesivas, pueden estar en las siguientes secuencias ejemplares: TTT, GGG, TTG, GAA o ATG.
La secuencia variable se selecciona del grupo que consiste de: (N)nGGG, (N)nTTT y (N)mTNTNG, donde N es cualquier nucleótido aleatorio que puede experimentar emparejamiento de bases con un ácido nucleico de origen natural, n es un número entero positivo seleccionado de 3-17, y m es un número entero positivo seleccionado de 3­ 15, respectivamente. En ciertas realizaciones, la secuencia variable en el primer tipo de cebador puede tener una o más secuencias de (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG. En ciertas realizaciones, se selecciona una secuencia variable del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 7 (NNNNNGGG), SEQ ID NO: 8 (NNNNNTTT), SEQ ID NO: 9 (NNNTNTNG).
En ciertas realizaciones, las secuencias variables que están distribuidas de manera más uniforme en el genoma y con una mayor cobertura también pueden seleccionarse mediante cálculos estadísticos, aumentando de este modo la oportunidad de reconocimiento entre la secuencia variable y el ADN genómico.
En ciertas realizaciones, el primer tipo de cebador puede comprender la SEQ ID NO: 12 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG], la SEQ ID NO: 13 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNTTTT] o la SEQ ID NO: 14 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG], en donde N es cualquier nucleótido (por ejemplo, A, T, G, C) que puede experimentar emparejamiento de bases con un ácido nucleico de origen natural.
El segundo tipo de cebador en la mezcla de la reacción comprende la secuencia común pero no la secuencia variable. Los extremos 5' y 3' del segundo tipo de cebador pueden contener o no otras secuencias adicionales. En ciertas realizaciones, la secuencia del segundo tipo de cebador consiste de la secuencia común del primer tipo de cebador. En ciertas realizaciones, el segundo tipo de cebador, en una orientación 5' a 3', comprende o consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG].
En algunas realizaciones, la concentración del cebador en la mezcla de la reacción es de 300 ng-1500 ng/pl. En algunas realizaciones, la concentración del cebador en la mezcla de la reacción es de 300 ng-1400 ng/pl, 300 ng-1200 ng/pl, 300 ng-1000 ng/pl, 300 ng-800 ng/pl, 300 ng-600 ng/pl o 300 ng-400 ng/pl. En algunas realizaciones, la concentración del cebador en la mezcla de la reacción es de 500 ng-1400 ng/pl, 600 ng-1400 ng/pl, 800 ng-1400 ng/pl, 900 ng-1400 ng/pl, 1000 ng-1400 ng/pl o 1200 ng-1400 ng/pl. En algunas realizaciones, la concentración del cebador en la mezcla de la reacción es de 400 ng-1400 ng/pl, 500 ng-1200 ng/pl, 600 ng-1000 ng/pl o 700 ng-800 ng/pl.
Mi. Otros componentes
La mezcla de la reacción comprende además otros componentes necesarios para la amplificación del ADN, como polimerasa de ácido nucleico, una mezcla de monómeros de nucleótidos, e iones metálicos adecuados y componentes tampón requeridos para la actividad enzimática, y similares. Para por lo menos uno o más tipos de estos componentes, pueden usarse reactivos conocidos en la técnica.
La polimerasa de ácido nucleico en la presente solicitud se refiere a una enzima capaz de sintetizar una nueva cadena de ácido nucleico. Puede usarse cualquier polimerasa de ácido nucleico adecuada para el método de la presente solicitud. Preferiblemente, se usa ADN polimerasa. En ciertas realizaciones, el método de la presente solicitud utiliza una polimerasa de ácido nucleico termoestable, como aquellas cuya actividad polimerasa no disminuye o disminuye en menos del 1%, 3%, 5%, 7%, 10%, 20%, 30 %, 40% o 50% a una temperatura para la amplificación por PCR (por ejemplo, 95° C). En ciertas realizaciones, la polimerasa de ácido nucleico usada en el método de la presente solicitud tiene actividad de desplazamiento de cadena. La "actividad de desplazamiento de cadenas" de la presente solicitud se refiere a una actividad de la polimerasa de ácido nucleico que permite la separación de una plantilla de ácido nucleico de la cadena complementaria con la que se empareja y se une, y donde dicha separación se realiza en una dirección 5' a 3', y va acompañada de generación de una nueva cadena de ácido nucleico que es complementaria a la plantilla. Las polimerasas de ácido nucleico con capacidad de desplazamiento de cadena y sus aplicaciones son conocidas en la técnica, ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5824517. Las polimerasas de ácido nucleico adecuadas incluyen, pero no se limitan a: una o más ADN polimerasa Phi29, ADN polimerasa Bst, ADN polimerasa Bst 2.0, Pirofago 3137, polimerasa Vent (por ejemplo, polimerasa Thermococcus litoralis Vent, polimerasa Deep Vent, polimerasa Vent(-exo), polimerasa Deep Vent(-exo)), ADN polimerasa TOPOTaq, polimerasa 9°Nm, ADN polimerasa I del fragmento Klenow, transcriptasa inversa MMLV, transcriptasa inversa AMV, transcriptasa inversa del VIH, variante de la ADN polimerasa en fase T7 (que carece de actividad de exonucleasa 3'-5'), ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® , Taq polimerasa, ADN polimerasa Psp GBD(exo-), ADN polimerasa Bst (de longitud completa), ADN polimerasa de E. coli, ADN polimerasa LongAmp Taq, ADN polimerasa OneTaq.
En ciertas realizaciones, la mezcla de la reacción contiene una o más de Vent polimerasa de Thermococcus litoralis, Deep Vent polimerasa, Vent(-exo) polimerasa o Deep Vent(-exo) polimerasa. En ciertas realizaciones, la mezcla de la reacción contiene Vent polimerasa de Thermococcus litoralis. La Vent polimerasa de Thermococcus litoralis se refiere a una polimerasa natural aislada de Thermococcus litoralis. En ciertas realizaciones, la mezcla de la reacción contiene Deep Vent polimerasa. La Deep Vent polimerasa se refiere a una polimerasa natural aislada de la especie Pyrococcus GB-D. En ciertas realizaciones, la mezcla de la reacción contiene Vent(-exo) polimerasa. La Vent(-exo) polimerasa se refiere a una enzima resultante de la ingeniería genética D141A/E143A de la Deep Vent polimerasa. Las varias Vent polimerasas de la presente solicitud están disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England Biolabs Company.
Una mezcla de la reacción también puede comprender iones metálicos adecuados necesarios para ejercer la actividad enzimática de la polimerasa de ácido nucleico (por ejemplo, iones Mg2+ en una concentración adecuada (por ejemplo, a una concentración final de aproximadamente 1,5 mM a aproximadamente 8 mM), una mezcla de monómeros de nucleótidos (por ejemplo, dATP, dGTP, dTTP y dCTP), albúmina de suero bovino (BSA), dTT (por ejemplo, a una concentración final de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 7 mM), agua purificada y similares.
En ciertas realizaciones, la mezcla de la reacción también puede comprender además un regulador de pH, de tal manera que el valor de pH de la mezcla de la reacción se mantenga entre 7,0 y 9,0. Los reguladores de pH adecuados pueden incluir, por ejemplo, Tris HCl y Tris SO4. En ciertas realizaciones, una mezcla de la reacción también puede comprender uno o más tipos de otros componentes, por ejemplo, inhibidor de DNasa, RNasa, SO42", Cl-, K+, Ca2+, Na y/o (NH4)+ y similares.
Una de las características del método proporcionado en la presente es que la mezcla de la reacción se proporciona antes del paso (b) y el paso (c). Como la preparación de la mezcla de la reacción se completa por completo antes de que se realice el programa del ciclo térmico, la mezcla de la reacción puede reaccionar de acuerdo con los ajustes predeterminados tras entrar en el programa del ciclo térmico, sin necesidad de abrir más la tapa o añadir ningún componente, y de este modo se evita la contaminación y se mejora la eficacia de la reacción. En algunas realizaciones, una vez completado el paso (a), no hay necesidad de añadir más reactivos como enzimas, cebadores y dNTP a la mezcla de la reacción. En algunas realizaciones, el suministro de la mezcla de la reacción se completa antes del paso (b). En algunas realizaciones, no se añaden adicionalmente reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores, y dNTP) a la mezcla de la reacción después del inicio del paso (b). En algunas realizaciones, el paso (a) precede al paso (b) y al paso (c).
Paso (b): colocación en el primer programa de ciclo térmico
El método proporcionado en la presente comprende el paso (b): colocar la mezcla de la reacción en el primer programa de ciclo térmico, de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador pueda emparejarse con el ADN genómico y amplificar el ADN genómico para obtener un producto de amplificación genómica, en donde el producto de amplificación genómica comprende la secuencia común en su extremo 5' y comprende la secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3'.
"Amplificación" en la presente solicitud significa la adición de nucleótidos complementarios a una plantilla de ácido nucleico en el extremo 3' de un cebador bajo la acción de una polimerasa de ácido nucleico, mediante lo cual se sintetiza una nueva cadena de ácido nucleico que es complementaria en bases a la plantilla de ácidos nucleicos. Pueden usarse métodos adecuados para amplificar ácidos nucleicos, como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de ligasa (LCR) u otros métodos de amplificación adecuados. Todos estos métodos son conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° U.S. 4.683.195 y US 4.683.202, así como Innis et al., “PCR protocols: a guide to method and applications" Academic Press, Incorporated (1990) y Wu et al. (1989) Genomics 4:560-569.
Durante el proceso de amplificación, la mezcla de la reacción se coloca en un programa de ciclo térmico adecuado, de tal manera que las cadenas dobles de la plantilla de ADN se desenrollan en cadenas sencillas, los cebadores hibridan con las cadenas sencillas de la plantilla y los cebadores se alargan. Por tanto, un programa de ciclo térmico comprende típicamente: una temperatura de desnaturalización o fusión a la que las cadenas dobles de la plantilla de ADN se desenrollan en cadenas sencillas; una temperatura de apareamiento a la que un cebador hibrida específicamente con un plantilla de ADN de cadena sencilla; y una temperatura de alargamiento a la que la ADN polimerasa añade nucleótidos complementarios a las bases de la plantilla de ADN en el extremo 3' de un cebador, de modo que el cebador se alarga y se obtiene una nueva cadena de ADN que es complementaria a la plantilla de ADN. La cadena de ADN recién sintetizada puede servir como una nueva plantilla de ADN en el siguiente ciclo de reacción, para un nuevo ciclo de síntesis de ADN.
En el paso (b) del método de la presente solicitud, la mezcla de la reacción se coloca en un primer programa de ciclo térmico de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador en la mezcla de la reacción pueda unirse al ADN genómico a través del emparejamiento de bases, y ese ADN genómico se replica bajo la acción de una polimerasa de ácido nucleico.
En el primer programa de ciclo térmico, primero se coloca la mezcla de la reacción en un programa térmico capaz de abrir las cadenas dobles del ADN genómico (paso (b1)). Para asegurar que las cadenas dobles de ADN genómico se desenrollen completamente en cadenas sencillas (es decir, desnaturalización/fusión), pueden usarse temperaturas de reacción altas como 90° C-95° C y puede mantenerse un tiempo de reacción prolongado. En ciertas realizaciones, el programa térmico en el paso (b1) comprende hacer reaccionar a una temperatura entre 90° C-95° C durante 1-10 minutos.
Luego, la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico que permite la unión del primer tipo de cebador a la plantilla de ADN de cadena sencilla (paso (b2)). En este programa térmico, la secuencia variable en el primer tipo de cebador se une a secuencias complementarias en diferentes posiciones en el ADN genómico a través de la complementariedad de bases (es decir, apareamiento) y de este modo se inician las replicaciones en diferentes posiciones en el ADN genómico. Debido a la diversidad de secuencias variables en el primer tipo de cebador, en donde hay diferencias con respecto tanto a la proporción de bases como a la secuencia, la temperatura de unión óptima para cada secuencia variable al ADN genómico también varía en gran medida. Por tanto, a una temperatura de apareamiento dada, es posible que sólo algunos de los cebadores puedan unirse bien al ADN genómico, mientras que la unión de los otros al ADN genómico puede no ser ideal. En ciertas realizaciones, el paso (b2) comprende un programa de colocar la mezcla de la reacción en más de una temperatura, para facilitar la unión suficiente del primer tipo de cebador al plantilla de ADN. Por ejemplo, la mezcla de la reacción desnaturalizada de ADN puede enfriarse rápidamente a una temperatura baja, como aproximadamente 5° C-10° C, seguido de dejar que la mezcla de la reacción reaccione durante un período adecuado a diferentes temperaturas de apareamiento respectivamente, mediante calentamiento en gradiente, por lo que se asegura que la mayor cantidad posible de cebadores se emparejen con el ADN genómico. En ciertas realizaciones, el paso (b2) comprende dejar reaccionar durante un período adecuado (por ejemplo, 3-50 s) a una primera temperatura de apareamiento entre 5-10° C (por ejemplo, 10° C), dejar reaccionar durante un período adecuado (por ejemplo, 3-50 s) a una segunda temperatura de apareamiento entre 25-30° C (por ejemplo, 30° C), y dejar reaccionar durante un período adecuado (por ejemplo, 3­ 50 s) a una tercera temperatura de apareamiento entre 45-50° C (por ejemplo, 50° C).
Es bien conocido en la técnica que la temperatura de apareamiento de un cebador generalmente no es más de 5° C menor que el valor de Tm de un cebador, y una temperatura de apareamiento excesivamente baja llevará a una unión no específica cebador-cebador, lo que da como resultado una agregación de cebadores y productos de amplificación inespecíficos. Por lo tanto, no se usarán habitualmente bajas temperaturas, como 5° C-10° C, como temperatura de apareamiento del cebador. Sin embargo, los inventores han descubierto inesperadamente que incluso si el calentamiento por gradiente comienza desde una temperatura baja (por ejemplo, 5° C-10° C), el emparejamiento entre los cebadores y el ADN genómico puede mantener una buena especificidad y los resultados de la amplificación todavía mantienen una variabilidad muy baja, lo que indica resultados de amplificación precisos y fiables. Por otra parte, como las temperaturas de apareamiento para los cebadores cubren circunstancias de baja temperatura, se asegura la unión de un intervalo más amplio de secuencias de cebadores al ADN genómico, por lo que se proporcionan mejores cobertura genómica y profundidad de amplificación.
Después del programa térmico de apareamiento del cebador, la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico que permite el alargamiento del primer tipo de cebador que se une a una plantilla de ADN de cadena sencilla bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico, para producir un producto de amplificación (paso (b3)). La temperatura de alargamiento está habitualmente relacionada con la temperatura óptima para la ADN polimerasa, para lo cual los expertos en la técnica pueden realizar una selección específica de acuerdo con la mezcla de la reacción específica. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa en la mezcla de la reacción puede tener actividad de desplazamiento de cadena, de tal manera que si durante el alargamiento, el cebador encuentra un cebador o amplicón que se une a la plantilla en sentido descendente, la actividad de desplazamiento de cadena de la ADN polimerasa puede permitir la separación del cebador en sentido descendente de la cadena de la plantilla, asegurando de este modo que el cebador de alargamiento continúe alargándose, de modo que se obtengan secuencias de amplificación más largas. Las ADN polimerasas con actividad de desplazamiento de cadena incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ADN polimerasa phi29, ADN polimerasa T5, s Eq UENASE 1.0 y SEQUEnAs E 2.0. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa en la mezcla de la reacción es una ADN polimerasa termoestable. Las ADN polimerasas termoestables incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ADN polimerasa Taq, enzima de secuencia OmniBase™, ADN polimerasa Pfu, polimerasa TaqBead ™ Hot Start, ADN polimerasa Vent (por ejemplo, Vent polimerasa de Thermococcus litoralis, Deep Vent polimerasa, Vent(-exo) polimerasa y Deep Vent(-exo) polimerasa), ADN polimerasa Tub, ADN polimerasa TaqPlus, ADN polimerasa Tfl, ADN polimerasa Tli y ADN polimerasa Tth. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa en la mezcla de la reacción puede ser una ADN polimerasa que es termoestable y tiene actividad de desplazamiento de cadena. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa en la mezcla de la reacción se selecciona del grupo que consiste de: una o más de ADN polimerasa Phi29, ADN polimerasa Bst, Pirofago 3137, polimerasa Vent (por ejemplo, Therm polimerasa de Thermococcus litoralis, polimerasa Deep Vent, polimerasa Vent(-exo), polimerasa Deep Vent(-exo)), ADN polimerasa TOPOTaq, polimerasa 9°Nm, ADN polimerasa I del fragmento Klenow, transcriptasa inversa MMLV, transcriptasa inversa AMV, transcriptasa inversa del VIH, variante de ADN polimerasa de fase T7 (que carece de actividad de exonucleasa 3'-5'), ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion®, polimerasa Taq, ADN polimerasa Bst (longitud completa), ADN polimerasa de E. coli, ADN polimerasa LongAmp Taq, ADN polimerasa OneTaq. En ciertas realizaciones, el paso (b3) comprende permitir reaccionar a una temperatura de alargamiento entre 60-90° C (por ejemplo, 65-90° C, 70­ 90° C, 75-90° C, 80-90° C, 60-90° C, 60° C). 85° C, 60-80° C, 60-75° C o 60-70° C) durante 1-15 minutos (por ejemplo, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-14, 3-14, 5-14, 6-14, 7 -14, 8-14, 9-14, 10-14, 11-14, 12-14 o 13-14 minutos). En ciertas realizaciones, el paso (b3) comprende permitir reaccionar a 70° C durante 2 minutos.
Después del programa de extensión del cebador, la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico capaz de desnaturalizar el producto de amplificación en cadenas sencillas (paso (b4)). La temperatura en este paso puede ser similar a la del paso (b1), pero el tiempo de reacción es más corto. En ciertas realizaciones, el paso (b4) comprende dejar reaccionar a una temperatura de 90-95° C durante 10-50 s. En este punto, las cadenas sencillas de ADN en la mezcla de la reacción contienen no solo las cadenas sencillas de ADN genómico originales, sino también las cadenas sencillas de ADN recién sintetizadas resultantes de la amplificación, ambas de las cuales pueden servir como plantillas de ADN en el siguiente ciclo, unirse a los cebadores e iniciar el próximo ciclo de replicación.
Luego, se repiten los pasos (b2) a (b4) hasta un primer número de ciclos designado para obtener el producto de amplificación genómica. El primer número de ciclos debe ser por lo menos 2. En el primer ciclo, la secuencia en el extremo 3' de la secuencia variable del primer tipo de cebador se alarga, y el producto de amplificación obtenido tiene una secuencia común en su extremo 5' y un secuencia complementaria de la secuencia de cadena sencilla de la plantilla genómico en su extremo 3'; tales productos de amplificación también se conocen como semi-amplicón. En el segundo ciclo, los propios productos de amplificación anteriores también pueden servir ellos mismos como plantillas de ADN para unirse a las secuencias variables en el primer tipo de cebadores. El cebador se extiende hacia el extremo 5' del producto de amplificación bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico hasta que se completa la replicación de la secuencia común en el extremo 5' del producto de amplificación, obteniendo de este modo un producto de amplificación genómica que tiene una secuencia común en su extremo 5' y una secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3'; a dicho producto de amplificación también se hace referencia como amplicón completo.
En ciertas realizaciones, el primer número de ciclos se controla dentro de un intervalo adecuado para asegurar suficientes productos de amplificación para su uso en reacciones posteriores sin comprometer la precisión de los productos de amplificación debido a un número excesivo de ciclos. Por ejemplo, el primer número de ciclos es por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5 o por lo menos 6, y preferiblemente no más de 8, no más de 9, no más de 10, no más de 11 o no más que 12. Si el número de ciclos es demasiado bajo, se obtienen pocos productos de amplificación y, por lo tanto, para obtener suficientes productos de amplificación, es necesario aumentar el número de ciclos en el siguiente paso de amplificación (es decir, el paso (c)), lo que reducirá la precisión de los resultados de la amplificación. Aunque si el número de ciclos es demasiado alto, puede producirse una variación de secuencia durante la amplificación del ADN genómico, lo que da como resultado un sesgo de plantillas en el siguiente paso de amplificación (es decir, el paso (c)), lo que lleva un resultado de amplificación final impreciso.
En ciertas realizaciones, en el paso (b), se incluye además un paso (b4') después del paso (b4), en el que la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico adecuado que permite la hibridación del extremo 3' y el extremo 5' del producto de amplificación genómica para formar una estructura de giro, o permitir la unión del extremo 3' del producto de amplificación genómica a un cebador. Anteriormente se consideró que el paso (b4') era capaz de proteger el extremo 3' de un amplicón completo y, por lo tanto, se evitaba la polimerización de la cabeza a la cola entre amplicones completos y, en consecuencia, se evitaba la conjunción de dos secuencias que originalmente no son adyacentes en un genoma. Esto ayudará a mejorar la precisión del resultado de la amplificación.
En ciertas realizaciones, el método pasa directamente al paso (b5) después del paso (b4), sin pasar por otros pasos (por ejemplo, el paso (b4')). De esta manera, los amplicones completos no se han sometido a pasos particulares para evitar la polimerización de la cabeza a la cola y, por tanto, teóricamente, tal resultado de amplificación debería ser algo defectuoso con respecto a la precisión. Sin embargo, inesperadamente, en el método de la presente solicitud, incluso sin un paso particular después del paso (b4), que permite que los amplicones completos formen un giro o permite la unión del extremo 3' a un cebador, el resultado final de la amplificación todavía tiene una precisión considerablemente alta. que es comparable al efecto del método que emplea el paso (b4'). Esto simplifica los pasos de reacción a la vez que conserva la especificidad de las reacciones.
En el paso (b), no solo hay el primer tipo de cebador sino también el segundo tipo de cebador en el sistema de reacción. El segundo tipo de cebador contiene la secuencia común en el primer tipo de cebador. Como la secuencia común no es sustancialmente complementaria a las secuencias genómicas, si la especificidad de la reacción de amplificación es lo suficientemente alta, el segundo tipo de cebador no se emparejará directamente con el ADN genómico e iniciará la replicación del ADN genómico en el paso (b). Sin embargo, cuando el paso (b) ha pasado por dos ciclos, los amplicones completos con una secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3' comienzan a emerger en la mezcla de la reacción, y el extremo 3' de tales amplicones completos puede emparejarse con el segundo tipo de cebador a través del emparejamiento de bases y, por tanto, podría provocar la replicación de los amplicones completos por el segundo tipo de cebador comenzando en el paso (b) (por ejemplo, a partir del tercer ciclo). Esto podría interferir en la replicación del ADN genómico por el primer tipo de cebador, provocando una amplificación insuficiente del ADN genómico por el primer tipo de cebador, por lo que no se alcanza la cobertura deseada de ADN genómico. Además, cuando el primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador existen en el sistema de reacción al mismo tiempo, el primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador podrían experimentar una reacción de amplificación cebador-cebador independiente de la plantilla, lo que da como resultado generación de polímero de cebador. Sin embargo, sorprendentemente, a pesar de la presencia de estas incertidumbres descritas anteriormente, los inventores de la presente divulgación descubrieron inesperadamente que cuando tanto el primer tipo de cebador como el segundo tipo de cebador están en la mezcla de la reacción al mismo tiempo y ambos son capaces de la reacción de amplificación, el primer tipo de cebador parece no ser interferido por el segundo tipo de cebador, y todavía mantiene alta especificidad y cobertura amplia para la amplificación del ADN genómico, y cuando se compara con el método en el que se usa solo el primer tipo de cebador en el paso (b) y luego se añade adicionalmente el segundo tipo de cebador en el paso (c), los resultados obtenidos son en general comparables.
Paso (c): colocación en un segundo programa de ciclo térmico
El método proporcionado en la presente comprende además el paso (c): colocar la mezcla de la reacción obtenida del paso (b) en un segundo programa de ciclo térmico de tal manera que la secuencia común del segundo tipo de cebador pueda emparejarse con el extremo 3' del producto de amplificación genómica y amplificar el producto de amplificación genómica para obtener un producto de amplificación genómica expandido.
Como el producto de amplificación genómica obtenido en el paso (b), es decir, el amplicón completo, tiene una secuencia complementaria a la secuencia común en el extremo 3', puede ser complementario a la secuencia común del segundo tipo de cebador; bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico, el segundo tipo de cebador se extiende y se replica la longitud completa del amplicón completo.
En el segundo programa de ciclo térmico, la mezcla de la reacción se coloca primero en un programa térmico capaz de abrir cadenas dobles de ADN (paso (cl)). Las cadenas dobles de ADN en la presente se refieren principalmente a las cadenas dobles del producto de amplificación genómica (es decir, amplicón completo) obtenido en el paso (b). Aunque el ADN genómico original todavía existe en la mezcla de la reacción en este punto, el ADN genómico original no es la plantilla de ADN que se va a amplificar en el paso (c), ya que el segundo tipo de cebador no se une sustancialmente al ADN genómico. Puede usarse una temperatura de reacción más alta, como 90° C-95° C, para la reacción durante un período adecuado, siempre que las cadenas dobles del amplicón completo que se amplifiquen puedan desnaturalizarse en cadenas sencillas. En ciertas realizaciones, el programa térmico en el paso (c1) comprende permitir la reacción durante 10-30 s (por ejemplo, 20 s) a una temperatura de fusión entre 90-95° C (por ejemplo, 94° C). En ciertas realizaciones, se comprende además un paso para colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico capaz de abrir cadenas dobles de ADN y permitir que reaccione durante un tiempo suficiente, después de que finaliza el primer programa de ciclo térmico pero antes de que comience el segundo programa de ciclo térmico. Esto ayudará a asegurar la desnaturalización completa de las cadenas dobles de ADN de la plantilla en cadenas sencillas.
Después del paso (cl), la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico que permite la unión del segundo tipo de cebador a cadenas sencillas del producto de amplificación genómica obtenido en el paso (b). Sobre la base de la composición de base en el segundo tipo de cebador, puede calcularse el valor de Tm del segundo tipo de cebador y puede determinarse una temperatura de apareamiento adecuada para el segundo tipo de cebador en base a este valor de Tm. En ciertas realizaciones, el programa térmico en el paso (c2) comprende permitir la reacción durante 10-30 s (por ejemplo, 15 s) a una temperatura de apareamiento entre 45-65° C (por ejemplo, 58° C). En ciertas realizaciones, el segundo tipo de cebador es la SEQ ID NO: 1 y el programa térmico en el paso (c2) comprende permitir la reacción durante 10-30 s a 58°C. En ciertas realizaciones, la temperatura de apareamiento en el paso (c2) es más alta que en el paso (b2). En el paso (c2), la mezcla de la reacción todavía puede contener el primer tipo de cebador que no experimentó la reacción en el paso (b), y las secuencias variables de este primer tipo de cebadores pueden emparejarse con las plantillas de ADN de cadena sencilla obtenidas en el paso (cl), lo que da como resultado secuencias de amplificación incompletas. Cuando la temperatura de apareamiento en el paso (c2) es más alta que la adecuada para el primer tipo de cebador, puede reducirse o evitarse la unión del primer tipo de cebador con la plantilla de ADN de cadena sencilla, permitiendo selectivamente de este modo la amplificación del segundo tipo de cebador.
Una vez completado el apareamiento del cebador, la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico que permite el alargamiento del segundo tipo de cebador que se une a cadenas sencillas del producto de amplificación, bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el programa térmico en el paso (c3) comprende permitir la reacción durante 1-15 minutos (por ejemplo, 2 minutos) a una temperatura de alargamiento entre 60-80° C (por ejemplo, 72° C).
Los pasos (c1) a (c3) pueden repetirse hasta un segundo número de ciclos para obtener el producto de amplificación genómica expandido deseado. Durante este proceso, el producto de amplificación genómica obtenido en el paso (b) se replica y amplifica adicionalmente, cuyo número se aumenta considerablemente, para proporcionar suficientes secuencias de a Dn genómico para estudios u operaciones posteriores. En ciertas realizaciones, el segundo número de ciclos en el paso (c4) es mayor que el primer número de ciclos en el paso (b5). En ciertas realizaciones, el segundo número de ciclos se controla dentro de un intervalo adecuado de tal manera que pueda proporcionar una cantidad suficiente de ADN sin comprometer la precisión de la amplificación debido a un número excesivo de ciclos. En ciertas realizaciones, el segundo número de ciclos es de 15-30 ciclos (por ejemplo, 15-30, 15­ 28, 15-26, 15-24, 15-22, 15-20, 15-18, 15-17, 16- 30, 17-30, 18-30, 20-30, 22-30, 24-30, 26-30, 28-30 ciclos).
En ciertas realizaciones, el paso (c) comprende además colocar la mezcla de la reacción en el mismo programa térmico que en el paso (c3) (por ejemplo, 72° C) y permitir la reacción durante un período adecuado (por ejemplo, 5 minutos) después del segundo programa de ciclos térmicos. Luego, la mezcla de la reacción se coloca a una temperatura de 4° C para terminar la reacción. En ciertas realizaciones, la mezcla de la reacción se coloca a una temperatura de 4° C para terminar la reacción directamente después de completar la reacción del paso (c).
También se divulga en la presente un método para amplificar el genoma de una célula que comprende: (a) proporcionar una mezcla de la reacción, en donde la mezcla de la reacción comprende ADN de dicho ADN genómico, un primer tipo de cebador, un segundo tipo de cebador, una mezcla de monómeros de nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, y en donde el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable;
(b) colocar la mezcla de la reacción en un primer programa de ciclos térmicos de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador pueda emparejarse con el ADN del genoma y amplificar el ADN del genoma para obtener un producto de amplificación genómica, en donde el producto de amplificación genómica comprende la secuencia común en su extremo 5' y comprende la secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3'; en donde el primer programa de ciclos térmicos comprende:
(b1) dejar reaccionar a una primera temperatura de desnaturalización entre 90-95° C durante 1-10 minutos; (b2) dejar reaccionar a una primera temperatura de apareamiento entre 5-10° C durante 3-50 s, a una segunda temperatura de apareamiento entre 25-30° C durante 3-50 s y a una tercera temperatura de apareamiento entre 45-50° C durante 3-50 s;
(b3) dejar reaccionar a una primera temperatura de alargamiento entre 60-90° C durante 1-15 minutos;
(b4) dejar reaccionar a una primera temperatura de fusión entre 90-95° C durante 10-50 s;
(b5) repetir los pasos (b2) a (b4) hasta 6-9 ciclos;
(c) colocar la mezcla de la reacción obtenida en el paso (b) en un segundo programa de ciclos térmicos, de tal manera que la secuencia común del segundo tipo de cebador pueda emparejarse con el extremo 3' del producto de amplificación genómica y amplificar el producto de amplificación genómica para obtener un producto de amplificación genómica expandido, en donde el segundo programa de ciclo térmico comprende:
(c1) dejar reaccionar a una segunda temperatura de desnaturalización entre 90-95° C durante 1-10 minutos; (c2) dejar reaccionar a una segunda temperatura de fusión entre 90-95° C durante 10-30 s;
(c3) dejar reaccionar a una cuarta temperatura de apareamiento entre 45-65° C durante 10-30 s;
(c4) dejar reaccionar a una segunda temperatura de alargamiento entre 60-80° C durante 1-15 minutos; (c5) repetir los pasos (c2) a (c4) durante 5-30 ciclos;
(d) obtener el producto de amplificación del paso (c);
en donde la mezcla de la reacción se proporciona antes del paso (b) y el paso (c).
El ADN genómico en la mezcla de la reacción en el paso (a) puede estar presente dentro de una célula, es decir, la mezcla de la reacción contiene células en las que está contenido el ADN genómico a amplificar. En ciertas realizaciones, la mezcla de la reacción en el paso (a) contiene células y comprende además componentes capaces de lisar células, como surfactante y/o liasa, etc. Pueden usarse surfactantes adecuados, como uno o más de NP-40, Tween, SDS, TritonX-100, EDTA e isotiocianato de guanidina. También pueden seleccionarse liasas adecuadas, como una o más de proteasa K, pepsina y papaína. En tales realizaciones, el método de amplificación del genoma celular como se ha descrito anteriormente comprende además colocar una mezcla de la reacción en un programa de ciclo térmico de lisis después del paso (a) y antes del paso (b) (por ejemplo, colocar una mezcla de la reacción a 50° C durante 20 minutos, luego a 80° C durante 10 minutos), para permitir la lisis de la célula y la liberación del ADN genómico. De esta manera, toda la reacción de amplificación en realidad implica permitir que la lisis celular y la amplificación del genoma se produzcan en la misma mezcla de la reacción, y se logra colocando una mezcla de la reacción en diferentes programas de ciclos térmicos. Esto simplifica enormemente el procedimiento, evita el riesgo de contaminación provocado por múltiples manipulaciones de muestras y también logra una buena especificidad de amplificación y una baja variabilidad con respecto al resultado de amplificación.
El primer tipo de cebador puede comprender o consistir de la SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14 y/o 15, en donde la secuencia común comprende o consiste de la SEQ ID NO: 1.
Ventajas
El método proporcionado por la presente solicitud tiene varias ventajas sobre los métodos del estado de la técnica.
En un aspecto, la presente divulgación combina los pasos de preamplificación, amplificación, etc. de ácido nucleico en una reacción, en condiciones de ciclo térmico. Esta reacción reduce la operación manual y la amplificación del genoma completo del ácido nucleico puede lograrse simplemente colocando el ácido nucleico en un tubo de PCR y realizando un programa específico, cuyos productos de amplificación tienen un alto grado de cobertura del genoma y un bajo sesgo de amplificación. Se eliminan las operaciones de preparación de reactivos y la adición de líquidos con la tapa abierta, y se reducen los riesgos de contaminación resultantes del entorno experimental y los operadores, y a la vez, el período de tiempo experimental general se acorta, siendo el tiempo total de amplificación de solo 2,5 horas.
En otro aspecto, la presente divulgación también puede combinar pasos de lisis celular, preamplificación y amplificación de ácidos nucleicos, etc. en una reacción, en condiciones de ciclo térmico, lo que reduce aún más las operaciones manuales y elimina el paso en el que las células se lisan por separado, y acorta aún más el tiempo experimental y reduce los riesgos de contaminación.
El método de la presente solicitud también conserva una alta precisión y una amplia cobertura de amplificación, además de operaciones simplificadas. El método de la presente solicitud usa una técnica de amplificación cuasi-lineal para reducir el sesgo de amplificación dependiente de la secuencia. En la preamplificación, la atención se centra en la amplificación a partir de la plantilla de ADN de la muestra original, y con una alta cobertura del genoma y un pequeño sesgo de amplificación. Los amplicones completos generados durante la fase de preamplificación se amplifican en gran número durante la fase de amplificación. El proceso de amplificación mediante dicha técnica tiene un alto rendimiento, con una plantilla inicial mínima de unos pocos picogramos, y los resultados son fiables y reproducibles.
Solicitud
En ciertas realizaciones, el producto obtenido por amplificación usando el método de la presente solicitud puede usarse adicionalmente para secuenciación, como para secuenciación del genoma completo. Debido al alto requisito de la cantidad inicial de muestras que se analizarán (más de 100 ng) mediante varias plataformas de análisis de secuenciación, como Next Generation Sequencing (NGS), micromatriz y PCR cuantitativa fluorescente, etc., se necesita la amplificación del genoma completo si se necesita obtener suficiente material de ácido nucleico para el análisis de una sola célula humana (aproximadamente 6 pg) o de una muestra en una pequeña cantidad inicial. El ADN genómico en una muestra biológica (por ejemplo, una sola célula) puede amplificarse mediante el método de la presente solicitud, y el producto obtenido de la amplificación puede secuenciarse mediante un método de secuenciación adecuado en la técnica. Los métodos de secuenciación ejemplares incluyen, secuenciación por hibridación (SBH), secuenciación por ligasa (SBL), secuenciación por adición de nucleótidos fluorescentes incremental cuantitativa (QIFNAS), ligación y escisión por pasos, sondas moleculares, pirosecuenciación, secuenciación fluorescente in situ (FISSEQ), transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), secuenciación multiplex (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 12/027039; porreca et al. (2007) NAT. Methods 4:931), secuenciación de colonias polimerizadas (POLONY) (US 6.432.360, US 6.485.944 y PCT/US05/06425); secuenciación swing PCT US05/27695), digestión con sonda informadora TaqMan, secuenciación de círculo rodante de nanorred (ROLONY) (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 12/120541), perlas FISSEQ (US 7.425.431) y ensayo de ligación de oligonucleótidos específicos de alelos, etc.
En ciertas realizaciones, la secuenciación de los productos de amplificación del método de la presente puede lograrse mediante un método de alto rendimiento. Los métodos de alto rendimiento típicamente fragmentan las moléculas de ácido nucleico que se van a secuenciar (por ejemplo, mediante escisión enzimática o cizallamiento mecánico, etc.), para formar una gran cantidad de fragmentos cortos que varían de decenas a cientos de pb de longitud. Al secuenciar decenas de miles, cientos de miles, millones, decenas de millones o incluso cientos de millones de fragmentos tan cortos en paralelo en una reacción de secuenciación, el rendimiento de la secuenciación puede aumentarse en gran medida y puede acortarse el tiempo necesario para la secuenciación. Las secuencias medidas de fragmentos cortos pueden unirse en una secuencia completa después del procesamiento de datos mediante software. En la técnica se conocen una variedad de plataformas de secuenciación de alto rendimiento, como Roche 454, Illumina Solexa, AB-SOLiD, Helicos y tecnología de plataforma Polonator, y similares. También se conocen en la técnica una variedad de técnicas de secuenciación basadas en luz, ver, por ejemplo, las descritas en Landegren et al. (1998) Genome Res. 8: 769-76, Kwok (2000) Pharmacogenomics 1: 95-100 y Shi (2001) Clin. Chem. 47: 164-172.
En ciertas realizaciones, los productos obtenidos de la amplificación usando el método de la presente solicitud también pueden usarse para analizar genotipos o polimorfismos genéticos en el ADN genómico, como el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), el análisis de repetición en tándem corto (STR), análisis de polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP), análisis de número variable de repeticiones en tándem (VNTR), análisis de repetición en tándem complejo (CTR) o análisis de microsatélites y similares, ver, por ejemplo, Krebs, J.E., Goldstein, E.S. y Kilpatrick, S.T. (2009). Lewin's Genes X (Jones & Bartlett Publishers) como referencia.
En ciertas realizaciones, los productos de amplificación obtenidos mediante el método de la presente solicitud también pueden usarse para análisis médicos y/o de diagnóstico. Por ejemplo, puede amplificarse una muestra biológica de un individuo usando el método de la presente solicitud, y puede analizarse si hay anomalías tales como mutaciones, deleciones, inserciones o fusión entre cromosomas en el gen o secuencia de ADN de interés en el producto de amplificación., mediante lo cual evaluar el riesgo de desarrollar cierta enfermedad para el individuo, la etapa de progresión, el genotipado y la gravedad de la enfermedad, o la probabilidad de que el individuo responda a cierta terapia. El gen o secuencia de ADN de interés puede analizarse usando métodos adecuados conocidos en la técnica como, pero no limitados a, hibridación de sonda de ácido nucleico, amplificación específica de cebador, secuenciación de una secuenciad e interés, polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP), etc.
En ciertas realizaciones, los métodos de la presente solicitud pueden usarse para comparar genomas derivados de diferentes células individuales, en particular diferentes células individuales del mismo individuo. Por ejemplo, cuando hay diferencias entre genomas de diferentes células individuales del mismo individuo, como entre células tumorales y células normales, el ADN genómico de diferentes células individuales puede amplificarse por separado usando el método de la presente, y el producto de amplificación puede ser analizado adicionalmente, por ejemplo, analizado y comparado mediante secuenciación, o someterse a análisis de hibridación genómica comparativa (CGH). Ver, Fan, H.C., Wang, J., Potanina, A., y Quake, S.R. (2011). Whole-genome molecular haplotyping of single cells. Nature Biotechnology 29, 51-57., y Navin, N., Kendall, J., Troge, J., Andrews, P., Rodgers, L., McIndoo, J., Cook, K., Stepansky, A., Levy, D., Esposito, D., et al. (2011). Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature 472, 90-94, como referencia.
En ciertas realizaciones, los métodos de la presente solicitud pueden usarse para identificar estructuras haploides o genotipos haploides en cromosomas homólogos. El genotipo haploide se refiere a la combinación de alelos en múltiples loci que se co-heredan en el cromosoma del mismo haplotipo. Una muestra biológica (por ejemplo, una célula individual del diploide de un individuo) puede dividirse en suficientes porciones para que las secuencias de ADN de dos haplotipos homólogos se separen estadísticamente en diferentes porciones. Cada sección se asigna como una mezcla de la reacción, y cada mezcla de la reacción se somete a amplificación de ADN mediante el método de la presente solicitud, y luego el producto de amplificación se somete a análisis de secuencia y se alinea con una secuencia genómica de referencia (por ejemplo, secuencia genómica estándar de humanos disponible públicamente, ver International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 431, 931-945 (2004)), para identificar mutaciones de un solo nucleótido en el mismo. Si no se dispone fácilmente de una secuencia del genoma de referencia, también puede usarse una región de longitud adecuada ensamblada a partir de múltiples secuencias de fragmentos del genoma por medio de ensamblaje genómico de novo para comparación.
En ciertas realizaciones, los productos obtenidos a partir de la amplificación usando el método de la presente solicitud pueden usarse adicionalmente para análisis como clonación de genes, PCR cuantitativa de fluorescencia y similares.
En ciertas realizaciones, el método de la presente solicitud también puede comprender además analizar el producto de amplificación para identificar características de secuencia asociadas a enfermedad o fenotipo. En algunas realizaciones, analizar el producto de amplificación comprende la genotipificación del amplicón de a Dn . En algunas otras realizaciones, analizar el producto de amplificación incluye identificar el polimorfismo de amplicones de ADN, como el análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). El SNP puede detectarse mediante algunos métodos bien conocidos, como ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA), extensión de una sola base, extensión del cebador específico de alelo, hibridación de malapareamientos y similares. Una enfermedad puede diagnosticarse mediante la comparación de SNP con los de fenotipos de enfermedad conocidos.
En algunas realizaciones, las características de secuencia asociadas a la enfermedad o al fenotipo incluyen anomalías cromosómicas, translocación cromosómica, aneuploidía, deleción o duplicación de una parte o de todos los cromosomas, haplotipos HLA fetales y mutaciones paternas.
En algunas realizaciones, la enfermedad o el fenotipo puede ser beta-talasemia, síndrome de Down, fibrosis quística, enfermedad de células falciformes, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de X frágil, atrofia muscular espinal, hemoglobinopatía, alfa-talasemia, enfermedades ligadas al cromosoma X (enfermedades dominadas por genes en el cromosoma X), espina bífida, anencefalia, enfermedad cardiaca congénita, obesidad, diabetes, cáncer, sexo fetal y RHD fetal.
Kit
Otro aspecto de la solicitud también proporciona un kit para la amplificación de ADN genómico como se reivindica, en donde el kit comprende una mezcla que contiene un primer tipo de cebador y un segundo tipo de cebador, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, y el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable.
En ciertas realizaciones, en las que la mezcla comprende además una mezcla de monómeros de nucleótidos (por ejemplo, dATP, dGTP, dTTP y dCTP), dTT y Mg2+. En ciertas realizaciones, la concentración de Mg2+ en la mezcla está entre 2 mmol-8 mmol/pl, la concentración de dNTP está entre 1 mmol-8 mmol/pl y la concentración de dTT está entre 2 mmol-7 mmol/pl. En ciertas realizaciones, la mezcla comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste de: albúmina de suero bovino (BSA), un regulador de pH (por ejemplo, Tris HCl), inhibidor de DNasa, RNasa, SO42", Cl-K+, Ca2+, Na+ y/o (NH4)+ y similares. En ciertas realizaciones, el intervalo de valores de pH de la mezcla está entre 7,0 y 9,0.
En ciertas realizaciones, el kit comprende además una polimerasa de ácido nucleico y la polimerasa de ácido nucleico no está contenida en la mezcla del primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador. En tales realizaciones, la polimerasa de ácido nucleico puede almacenarse en un recipiente separado, formando opcionalmente una mezcla con otros componentes, o estando presente en una forma sustancialmente pura.
En ciertas realizaciones, la mezcla del primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador comprende además una polimerasa de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la mezcla comprende: un primer tipo de cebador, un segundo tipo de cebador, una mezcla de monómeros de nucleótidos, Mg2+, dTT, Tris HCl y una polimerasa de ácido nucleico, y uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste de: BSA, inhibidor de DNasa, RNasa, SO42", Cl-, K+, Ca2+, Na+ y (NH4)+, etc. En tal realización, la mezcla puede contener todos los reactivos requeridos para la reacción de amplificación excepto el ADN genómico. Cuando se usa dicha mezcla en la reacción de amplificación de la presente solicitud, los reactivos que contienen ADN genómico pueden mezclarse directamente con la mezcla en el kit y, opcionalmente, puede añadirse una cantidad adecuada de agua pura para obtener el volumen de reacción requerido, luego puede obtenerse la mezcla de la reacción en el paso (a) del método de la presente solicitud.
En ciertas realizaciones, un kit comprende además un componente capaz de lisar una célula, como uno o más surfactantes y/o una o más liasas. Los surfactantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, uno o más de NP-40, Tween, SDS, TritonX-100, EDTA e isotiocianato de guanidinio. Las liasas ejemplares pueden ser una o más de proteasa K, pepsina y papaína. El componente que lisa una célula puede almacenarse por separado en un recipiente separado o mezclarse con otros componentes. En ciertas realizaciones, un kit comprende un surfactante y una liasa, colocados por separado en diferentes recipientes o colocados en el mismo recipiente.
En ciertas realizaciones, la mezcla de primer tipo de cebador, segundo tipo de cebador y polimerasa de ácido nucleico comprende además un surfactante y/o una liasa.
En ciertas realizaciones, el kit comprende un recipiente, en el que están contenidos todos los reactivos. En ciertas realizaciones, el kit comprende dos recipientes, en donde un recipiente almacena los componentes necesarios en la reacción de amplificación, incluyendo la polimerasa de ácido nucleico, y el otro recipiente almacena los componentes necesarios en la lisis celular, incluyendo la liasa. En ciertas realizaciones, el kit comprende cuatro recipientes, en donde un primer recipiente almacena polimerasa de ácido nucleico, un segundo recipiente almacena componentes necesarios en la reacción de amplificación distintos de la polimerasa de ácido nucleico, un tercer recipiente almacena liasa y un cuarto recipiente almacena componentes necesarios en la lisis celular distintos de la liasa.
Otro aspecto de la solicitud también proporciona un kit para la amplificación de ADN genómico como se reivindica, que comprende un primer tipo de cebador y un segundo tipo de cebador como se define en las reivindicaciones, y además comprende una instrucción para los usuarios, dicha instrucción registra los siguientes pasos: mezclar el primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador en el mismo recipiente antes de dicha amplificación, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, y en donde el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable. El primer tipo de cebador y el segundo tipo de cebador en el kit pueden colocarse por separado en diferentes recipientes, pero la instrucción puede incluir el paso de mezclar los dos en el mismo recipiente antes de la amplificación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Obtención de genoma de una sola célula, control positivo y control negativo
ADN genómico de una sola célula: se digirieron con tripsina fibroblastos epidérmicos (AFP) humanos cultivados en buen estado y se recogieron las células digeridas en un tubo EP de 1,5 ml. Las células recogidas se centrifugaron y se enjuagaron con una solución de PBS 1x. Después de enjuagar, se añadió 1 x PBS para suspender las células. Se aspiró una parte de la suspensión que contenía células usando una pipeta y se recogieron células individuales usando una pipeta bucal bajo un microscopio de 10 aumentos, el volumen de la solución de PBS aspirada no excedió 1 microlitro y las células individuales recogidas se transfirieron a un tubo de PCR que contenía 4 microlitros de tampón de lisis (que contenía Tris-Cl, KCl, EDTA, Triton X-100 y Qiagen Protease). Después de una breve centrifugación, el tubo de PCR se colocó en un instrumento de PCR donde se realizó un programa de lisis, y el programa específico se muestra en la Tabla 1.
T l 1: Pr r m li i
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Control positivo: se diluyó ADN genómico estándar a 30 pg/pl de solución de ADN con agua libre de nucleasas y se añadió 1 pl de la solución anterior a un tubo de PCR que contenía 4 pl de tampón de lisis celular. El ADN genómico estándar fue ADN genómico de células humanas extraídas previamente.
Control negativo: se añadieron 5 pl de tampón de lisis celular a un tubo de PCR.
Ejemplo 2: Amplificación del genoma usando ciclos de amplificación basados en giro y apareamiento múltiples (MALBAC) (referido como método de tres pasos)
Al método del presente ejemplo también se hace referencia en la presente como método de tres pasos, ya que básicamente comprende tres pasos, concretamente, lisar células, preamplificación y amplificación exponencial.
Se aislaron y lisaron fibroblastos epidérmicos humanos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, para obtener ADN genómico de una sola célula. Se usó el kit de amplificación del genoma completo de una sola célula de Jiangsu Yikon Genomics Co., Ltd. (N° de cat. YK001A/B), y la amplificación se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Específicamente, se mezclaron un tampón de preamplificación y una mezcla de enzimas de preamplificación en una proporción de 30:1 para generar una mezcla de preamplificación. Se añadieron 30 pl de mezcla de preamplificación respectivamente a tubos de PCR que contenían cada uno muestras a amplificar (ADN genómico, control positivo y control negativo obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 1). Los tubos de PCR se colocaron en un instrumento de PCR para la preamplificación y el programa de preamplificación se muestra en la Tabla 2.
Tabl BAC
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Se mezclaron una mezcla de tampón de amplificación y de enzimas de amplificación en una proporción de 30:0,8 para generar una mezcla de amplificación. Se añadieron 30 j l de la mezcla de amplificación a un tubo de PCR donde se completó la preamplificación, seguido de la amplificación exponencial, cuyo programa se muestra en la Tabla 3.
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Ejemplo 3: amplificación genómica usando cebadores mixtos (referido como método de dos pasos)
Al método del presente ejemplo también se hace referencia en la presente como método de dos pasos, que comprende básicamente dos pasos, concretamente, lisar células y reacción de amplificación.
Se aislaron y lisaron fibroblastos epidérmicos humanos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, para obtener ADN genómico de una sola célula.
Se preparó una mezcla de amplificación que contenía Na+, Mg2+, Cl-, Tris-Cl, TritonX-100, dNTP, polimerasa Vent, cebador de la SEQ ID NO: 1, cebador de la SEQ ID NO: 12 y cebador de la SEQ ID NO: 13.
Los cebadores usados en este ejemplo se diseñaron de acuerdo con los siguientes principios:
1. La secuencia común de un cebador solo contiene tres tipos de bases con una débil capacidad de emparejamiento autocomplementario, como G, A y T.
2. Uno o más de los tres tipos de bases mencionados en 1 se usan en el extremo 3' de la secuencia de bases variable del cebador (tres o más bases que son sucesivas o no sucesivas), para asegurar que no se producirá ese fenómeno de emparejamiento autocomplementario o emparejamiento complementario con el extremo 5' de un cebador diferente en el extremo 3' del cebador.
3. Mediante el cálculo estadístico de los sitios de reconocimiento de las secuencias de bases variables del cebador en el genoma, se seleccionan las secuencias que cumplen las condiciones anteriores, se distribuyen de manera más uniforme en el genoma y tienen una mayor cobertura, para aumentar la oportunidad de reconocimiento entre la secuencia de bases variable y el ADN genómico.
4. La proporción de uso y la composición de los tres tipos de bases en la secuencia común del cebador están especialmente diseñadas para garantizar que la secuencia común no se una al ADN genómico y genere amplificación. Se añaden 60 j l de mezcla de amplificación a los tubos de PCR de cada muestra a amplificar (a Dn genómico, control positivo y control negativo obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 1), respectivamente. Los tubos de PCR se colocaron en un instrumento de PCR para su amplificación, y el programa de amplificación se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4: progr ente solicitud
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Ejemplo 4: Comparación del producto de amplificación del método de dos pasos y el producto de amplificación del método de tres pasos MALBAC de la presente solicitud
Electroforesis en ael
Se tomaron 5 microlitros de producto de amplificación sin purificar del método de tres pasos del Ejemplo 2 y producto de amplificación sin purificar del método de dos pasos del Ejemplo 3, respectivamente, y se añadieron respectivamente con 1 microlitro de tampón de carga de 6xADN (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de Cat. CW0610A) para la carga de muestras. Se usó gel de agarosa al 1% como gel, y se usó DM2000 (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de Cat. CW0632C) como marcador.
Ver la Figura 2 para los resultados de la electroforesis, donde (a) son los resultados de amplificación del método de dos pasos del Ejemplo 3 (de izquierda a derecha, línea 1, marcador de peso molecular; líneas 2-11, muestras de amplificación de una sola célula; líneas 12-14, control positivo (40 pg ADNg); líneas 15-17, control negativo (libre de ADN genómico); línea 18, marcador de peso molecular); (b) son los resultados de amplificación del método de tres pasos del Ejemplo 2 (de izquierda a derecha, línea 1, marcador de peso molecular; líneas 2-11, muestras de amplificación de una sola célula; líneas 12-14, control positivo (40pg ADNg); líneas 15-17, control negativo (libre de ADN genómico); línea 18, marcador de peso molecular). La electroforesis muestra que: la posición de la banda y el brillo del producto de amplificación de dos pasos del Ejemplo 3 eran comparables a los del producto de amplificación de tres pasos del Ejemplo 2, sin diferencias significativas, lo que indica que la precisión y el rendimiento del producto de la amplificación de dos pasos son comparables a los resultados del método de tres pasos.
Producto de purificación
Se tomaron 50 microlitros de productos de amplificación no purificados del método de tres pasos del Ejemplo 2 y del método de dos pasos del Ejemplo 3, y los productos de amplificación se purificaron con un kit de purificación en columna universal (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de Cat. CW2301), cuyos pasos de purificación se realizaron de acuerdo con las instrucciones del kit. Se usron 50 microlitros de EB para la elución. Una vez que se hubo completado la purificación, se sometieron 2 pl del producto purificado a medición de concentración usando Nanodrop (AOSHENG, NANO-100). Los resultados de la medición de la concentración se muestran en la Tabla 5.
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continuación
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Los resultados de la medición de la concentración muestran que: la concentración posterior a la purificación de los productos de amplificación obtenidos mediante los dos métodos de amplificación eran comparables, sin diferencias significativas.
Detección de sitios causantes de enfermedades.
Se seleccionaron aleatoriamente 20 sitios patogénicos (ver la tabla a continuación para los sitios seleccionados) y se diseñaron cebadores. Los sitios patogénicos seleccionados y sus cebadores correspondientes se muestran en la Tabla 6 y la Tabla 7, respectivamente.
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continuación
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Se seleccionaron aleatoriamente 7 productos de amplificación amplificados de acuerdo con el Ejemplo 2 y 7 productos de amplificación amplificados de acuerdo con el Ejemplo 3 como ADN plantilla, respectivamente. Los 20 sitios patogénicos anteriores se amplificaron respectivamente mediante PCR usando 2xTaq MasterMix que contenía colorante (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de cat. CW0682). La composición del sistema de amplificación se muestra en la Tabla 8 y el programa de amplificación se muestra en la Tabla 9.
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Los resultados de la amplificación se muestran en la Fig. 3. Los resultados de la amplificación muestran que: no hubo una diferencia significativa en la precisión de la amplificación y la cantidad de productos de amplificación entre los dos métodos.
Se seleccionaron aleatoriamente otros 20 sitios patogénicos (ver la tabla a continuación para los sitios seleccionados) y se diseñaron cebadores. Los sitios patogénicos seleccionados y sus cebadores correspondientes se muestran en la Tabla 10 y la Tabla 11, respectivamente.
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continuación
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Se seleccionaron aleatoriamente 3 muestras amplificadas de acuerdo con el Ejemplo 2 (mostradas como 2_1, 2_3 y 2 _ 7 en la Figura 4) y tres muestras amplificadas de acuerdo con el Ejemplo 3 (mostradas como 3_1, 3_4 y 3_8 en la Figura 4) como a Dn plantilla, respectivamente, y los 20 sitios patogénicos anteriores se amplificaron respectivamente mediante PCR usando mezcla maestra 2xTaq que contiene colorante (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de Cat. CW0682). El sistema de amplificación y el programa de amplificación se muestran en la Tabla 8 y la Tabla 9, respectivamente, excepto que como la temperatura de apareamiento se seleccionó 55° C.
Los resultados de la amplificación se muestran en la Fig. 4. Los resultados de la amplificación muestran que: los 20 sitios que provocan enfermedades pueden amplificarse bien en los productos de amplificación de los dos métodos de amplificación anteriores, y no hubo una diferencia significativa en la precisión de la amplificación y la cantidad de productos de amplificación entre los dos métodos.
Detección por q-PCR usando cebadores de detección de calidad
Se seleccionaron aleatoriamente 4 muestras amplificadas de acuerdo con el método de tres pasos del Ejemplo 2 (mostradas como 3-5, 3-6, 3-9, 3-10 en la Figura 5) y 4 muestras amplificadas de acuerdo con el método de dos pasos del Ejemplo 3 (mostradas como 2-1, 2-3, 2-7, 2-10 en la Figura 5) como plantilla de ADN, respectivamente. El ADN plantilla se sometió a detección por q-PCR usando 6 pares de cebadores de inspección de calidad como se muestra en la Tabla 14, que se dirigen a secuencias de ADN en diferentes cromosomas, respectivamente. Se usó mezcla 2xFastSYBR (adquirida de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de Cat. CW0955) en la PCR cuantitativa fluorescente. La composición del sistema de amplificación se muestra en la Tabla 12 y el programa de amplificación se muestra en la Tabla 13.
Tabla 12: sistema de am lificación -PCR
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-
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Tabla 14: Pares de cebadores de ins ección de calidad
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Los resultados de la amplificación se muestran en la Figura 5, en donde a-f se refieren a datos de detección por q-PCR para ADN plantilla, dirigido a secuencias de ADN en los cromosomas CH1, CH2, CH3, CH4, CH5, CH6 y CH7, respectivamente. Los resultados de la amplificación muestran que: los valores de Cr obtenidos de q-PCR usando productos de amplificación del método de dos pasos y los del método de tres pasos como plantillas de q-PCR, fueron comparables, sin diferencias significativas, lo que indica que no hubo diferencias significativas en el número inicial de plantillas para q-PCR, es decir, no hubo diferencia significativa entre la cantidad de productos de amplificación del método de dos pasos y el método de tres pasos. Además, los 6 pares de cebadores de inspección de calidad verificaron diferentes secuencias en los cromosomas 1, 2, 4, 5, 6 y 7, respectivamente, y los resultados no mostraron consistentemente diferencias significativas entre las cantidades iniciales de plantilla de los dos métodos.
Secuenciación de genes
Se seleccionaron aleatoriamente 10 productos purificados amplificados por el método de dos pasos del Ejemplo 3 (mostrados como 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10 en la Figura 6, Figura 8 y Figura 9) y 10 muestras purificadas amplificadas por el método de tres pasos del Ejemplo 2 (mostradas como 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3­ 5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10 en la Figura 7, Figura 8 y Figura 9), se construyeron en una biblioteca genómica mediante fragmentación y se secuenciaron con el secuenciador hiseq2500 mediante secuenciación superficial. Para cada muestra, se midió un volumen de datos de 1,5 Mb y la secuencia obtenida por secuenciación se mapeó en el genoma de referencia humano (hg19).
Los resultados del método de dos pasos en el Ejemplo 3 se muestran en la Figura 6, y los resultados del método de tres pasos en el Ejemplo 2 se muestran en la Figura 7, donde la ordenada vertical representa el número de copias del cromosoma, que es 2 en personas normales; la ordenada horizontal representa los cromosomas 1-22 y los cromosomas sexuales. Los resultados anteriores muestran que: la detección cromosómica de células por el método de tres pasos del Ejemplo 2 y por el método de dos pasos del Ejemplo 3 tiene resultados consistentes.
En los resultados de secuenciación, también se proporcionan varios parámetros indicadores de resultados de secuenciación de alto rendimiento, como se muestra en la Figura 8, en donde la "proporción de lecturas únicas mapeadas al genoma humano" en los datos brutos (es decir, únicas_mapeadas_de_bruto) es el indicador de medición más importante. La media de únicas_mapeadas_de_bruto de todas las muestras del método de dos pasos en el Ejemplo 3 fue del 74,15%, mientras que el de todas las muestras del método de tres pasos en el Ejemplo 2 fue del 68,5%, lo que indica que la proporción de únicas_mapeadas_de_bruto para la muestra de amplificación del método de dos pasos del Ejemplo 3 fue significativamente mayor que la de la muestra de amplificación del método de tres pasos MALBAC.
El coeficiente de variación del número de copias puede usarse para comparar el grado de dispersión del número de copias de la muestra después de que la muestra se amplifica mediante los dos tipos de métodos de amplificación. El coeficiente de variación del número de copias medio de todas las muestras amplificadas usando el método de dos pasos del Ejemplo 3 fue 0,1200, mientras que el de todas las muestras amplificadas usando el método de tres pasos del Ejemplo 2 fue 0,1205. No hubo diferencias significativas entre los coeficientes de variación del número de copias de los dos tipos de métodos de amplificación. Ver la Figura 9 para los datos detallados.
Evaluación ADO
Se seleccionaron aleatoriamente 150 sitios SNP y se diseñaron los cebadores correspondientes. Ver la Tabla 15 para conocer los sitios seleccionados y los cebadores correspondientes.
Tabla 15: 150 sitios SNP cebadores corres ondientes de los mismos
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continuación
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Para medir la eficiencia de amplificar un sitio dado y el abandono alélico (ADO) para determinar la eficiencia de amplificación y si la amplificación tuvo éxito, se seleccionaron aleatoriamente dos productos de amplificación (3-1 y 3-2) del método de tres pasos del Ejemplo 2, un producto de amplificación (2-1) del método de dos pasos del Ejemplo 3, y 120 ng de ADN extraído de células de fibroblastos epidérmicos humanos (AFP) y se sometieron a PCR multiplex, respectivamente (ver la Tabla 15 para los cebadores). La composición del sistema de amplificación se muestra en la Tabla 16 y el programa de amplificación se muestra en la Tabla 17.
T l 1 : M z l m lifi i n r P R m l i l x
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Los productos de amplificación se construyeron en una biblioteca genómica mediante fragmentación y se secuenciaron con el secuenciador hiseq2500, con una profundidad de secuenciación media de 5 Mb (ver la figura 10 para los resultados estadísticos). Los datos de PCR multiplex muestran que: no hubo una diferencia significativa entre los parámetros de índice como el contenido de g C, los datos de alta calidad (alta_calidad_de_bruto), la proporción mapeada única de datos brutos (únicas_mapeadas_de_bruto) y la cobertura media (profundidad media) de los productos de amplificación de los tres tipos de muestras descritos anteriormente.
Además, los resultados del análisis de secuenciación de segunda generación muestran que se detectaron un total de 23 loci homocigotos en productos de PCR multiplex usando ADNg como material de partida. De estos 23 loci homocigotos, 23 y 22 se detectaron respectivamente en los dos productos de amplificación del método de tres pasos del Ejemplo 2; 21 se detectaron en el producto de amplificación del método de dos pasos del Ejemplo 3. No hubo diferencia significativa entre la proporción ADO de loci homocigotos del producto de amplificación del Ejemplo 2 y la del Ejemplo 3. Ver la Tabla 18 para los datos detallados.
Tabla 18: Comparación de ADO del producto de amplificación del Ejemplo 3 y del producto de m lifi i n l E m l 2 n l i h m i ADN
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Los resultados del análisis de secuenciación de segunda generación mostraron que se detectaron un total de 62 loci heterocigotos en productos de PCR multiplex usando ADNg como material de partida. De estos 62 loci heterocigotos, se detectaron 59 y 56 respectivamente en las dos muestras del Ejemplo 2; 51 se detectaron en una muestra del Ejemplo 3. No hubo diferencia significativa entre la proporción de ADO de loci heterocigotos del producto de amplificación del Ejemplo 2 y la del Ejemplo 3. Ver la Tabla 19 para los datos detallados.
Tabla 19: Comparación de ADO del producto de amplificación del Ejemplo 3 y del producto de m lifi i n l E m l 2 n l i h m i ADN
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Ejemplo 5: amplificación genómica usando un método en el que la lisis y la amplificación se completan en un solo paso (referido como método de un solo paso)
Al método del presente ejemplo también se hace referencia como método de un paso en la presente, porque la lisis de la célula, la preamplificación y la amplificación exponencial se combinaron y completaron en un solo paso.
Se aislaron y lisaron fibroblastos epidérmicos humanos de acuerdo con el método del Ejemplo 1 para obtener ADN genómico de una sola célula.
Se preparó la mezcla de amplificación, que contenía Na+, Mg2+, Cl-, Tris-Cl, dNTP, TritonX-100, polimerasa Vent, cebador de la SEQ ID NO: 1, cebador de la SEQ ID NO: 12 y cebador de la SEQ ID NO: 13.
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Ejemplo 6: Comparación del producto de amplificación del método de un paso del Ejemplo 5 y el del método de tres pasos del Ejemplo 2
Electroforesis en ael
Se tomaron 5 microlitros de producto de amplificación sin purificar del método de tres pasos del Ejemplo 2 y producto de amplificación sin purificar del método de un paso del Ejemplo 5, respectivamente, y se añadieron respectivamente 1 microlitro de tampón de carga de ADN 6x (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de Cat. CW0610A) para la carga de muestras. Se usó gel de agarosa al 1% como gel, y se usó DM2000 (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de cat. CW0632C) como marcador.
Ver la Figura 11 para electroforesis, en donde la primera fila muestra el resultado de amplificación de un paso del Ejemplo 5 (de izquierda a derecha, línea 1, marcador de peso molecular; líneas 2-11, muestras de amplificación de una sola célula; líneas 12-14, control positivo (40pg ADNg); líneas 15-17, control negativo (libre de ADN genómico); línea 18, marcador de peso molecular). La electroforesis muestra que: la posición de la banda y el brillo del producto de amplificación de un paso del Ejemplo 5 eran comparables a los del producto de amplificación de tres pasos del Ejemplo 2, sin diferencias significativas.
Producto de purificación
Se tomaron 50 microlitros de productos de amplificación no purificados del método de tres pasos del Ejemplo 2 y del método de un paso del Ejemplo 5, y los productos de amplificación se purificaron con un kit de purificación de columna universal (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N° de Cat. CW2301), cuyos pasos de purificación se realizaron de acuerdo con las instrucciones del kit. Se usaron 50 microlitros de EB para la elución. Una vez completada la purificación, se sometieron 2 pl del producto purificado a medición de concentración usando Nanodrop (AOSHENG, NANO-100). Los resultados de la medición de la concentración se muestran en la Tabla 21.
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continuación
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Los resultados de la medición de la concentración muestran que: la concentración posterior a la purificación de los productos de amplificación obtenidos mediante los dos métodos de amplificación después de la purificación fueron comparables, sin diferencias significativas.
Detección de sitios patogénicos
Se seleccionaron aleatoriamente veinte sitios patogénicos y se diseñaron cebadores. Los sitios patogénicos seleccionados y sus cebadores correspondientes se muestran en la Tabla 6 y la Tabla 7 en el Ejemplo 4, respectivamente.
Se seleccionaron aleatoriamente cuatro muestras amplificadas de acuerdo con el Ejemplo 2 y cuatro muestras amplificadas de acuerdo con el Ejemplo 5 como ADN plantilla, respectivamente. La composición del sistema de amplificación y el programa de amplificación es como se muestra en las Tablas 8 y 9 en el Ejemplo 4, respectivamente, excepto que los números de ciclo en las figuras 12(a) y 12(b) fueron 30 ciclos. Los 20 sitios patogénicos anteriores se amplificaron respectivamente mediante PCR usando mezcla maestra 2xTaq que contenía colorante (adquirido de Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., N°de cat. CW0682).
Los resultados de la amplificación se muestran en la Figura 12. Los resultados de la amplificación muestran que: no hubo una diferencia significativa en la precisión de la amplificación y la cantidad de productos de amplificación entre los dos métodos.
Secuenciación de genes
Se seleccionaron aleatoriamente 10 productos purificados amplificados por el método de tres pasos del Ejemplo 2 (mostrados como 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2- 9, 2-10 en la Figura 14) y 10 productos purificados amplificados por el método de un paso del Ejemplo 5 (mostrados como 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1­ 8, 1-9, 1-10 en la Figura 13), se construyeron en una biblioteca genómica mediante fragmentación y se secuenciaron con el secuenciador hiseq2500 mediante secuenciación superficial. Para cada muestra, se midió un volumen de datos de 1,5 Mb y la secuencia obtenida por secuenciación se mapeó en el genoma de referencia humano (hg19).
Los resultados del método de un paso en el Ejemplo 5 se muestran en la Figura 13, y los resultados del método de tres pasos en el Ejemplo 2 se muestran en la Figura 14, en donde la ordenada vertical representa el número de copias de cromosomas, que es 2 en personas normales; la ordenada horizontal representa los cromosomas 1-22 y los cromosomas sexuales. Los resultados anteriores muestran que: la detección cromosómica de células mediante el método de tres pasos del Ejemplo 2 y mediante el método de dos pasos del Ejemplo 3 tiene resultados consistentes.
En los resultados de la secuenciación, también se proporcionan varios parámetros de índice de resultados de secuenciación de alto rendimiento, como se muestra en la Figura 15, en donde la "proporción de lecturas únicas mapeadas al genoma humano" en los datos brutos (es decir, únicas_mapeadas_de_bruto) es el índice de medición más importante. La media de únicas_mapeadas_de_bruto de todas las muestras del método de un paso en el Ejemplo 5 fue del 79,13%, mientras que el de todas las muestras del método de tres pasos en el Ejemplo 2 fue del 74,25%, lo que indica que la proporción de únicas_mapeadas_de_bruto ntre las muestras de amplificación del método de un paso del Ejemplo 5 fue significativamente mayor que el de las muestras de amplificación del método de tres pasos del Ejemplo 2.
El coeficiente de variación del número de copias puede usarse para comparar el grado de dispersión del número de copias de la muestra, después de que la muestra se amplifica mediante los dos tipos de métodos de amplificación. El coeficiente de variación medio del número de copias de todas las muestras amplificadas usando el método de un paso del Ejemplo 5 fue cercano al de todas las muestras amplificadas usando el método de tres pasos del Ejemplo 2. Ver la Figura 16 para los datos detallados.
Aunque se han divulgado varios aspectos y realizaciones mediante la presente divulgación, otros aspectos y realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los varios aspectos y realizaciones divulgados en la presente tienen únicamente el propósito de ilustrar y no se pretende que limiten el alcance de la presente

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para amplificar el ADN genómico de una célula, que comprende:
(a) proporcionar una mezcla de la reacción, en donde la mezcla de la reacción comprende el ADN genómico, un primer tipo de cebador, un segundo tipo de cebador, una mezcla de monómeros de nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico,
en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, y el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable,
en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, en donde la secuencia común La secuencia se selecciona de tal manera que la secuencia común no se une sustancialmente al ADN genómico para provocar amplificación,
en donde la secuencia variable se selecciona del grupo que consiste de (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG, en donde N se refiere a cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural, n es un número entero positivo seleccionado de 3-17, m es un número entero positivo seleccionado de 3-5; (b) colocar la mezcla de la reacción en un primer programa de ciclo térmico de tal manera que la secuencia variable del primer tipo de cebador pueda emparejarse con el ADN genómico y amplificar el ADN genómico para obtener un producto de amplificación genómica, en donde el producto de amplificación genómica comprende la secuencia común en su extremo 5' y comprende una secuencia complementaria de la secuencia común en su extremo 3';
(c) colocar la mezcla de la reacción obtenida en el paso (b) en un segundo programa de ciclo térmico, de tal manera que la secuencia común del segundo tipo de cebador pueda emparejarse con el extremo 3' del producto de amplificación genómica y amplificar el producto de amplificación genómica para obtener un producto de amplificación genómica expandido, en donde la mezcla de la reacción se proporciona antes del paso (b) y el paso (c).
2. El método de la reivindicación 1,
(a) que comprende además analizar el producto de amplificación para identificar características de secuencia asociadas a enfermedad o a fenotipo; y/o
(b) en donde el ADN genómico está contenido dentro de una célula y la mezcla de la reacción comprende además un surfactante y/o una liasa capaz de lisar la célula; y/o
(c) que comprende además colocar la mezcla de la reacción en un programa de ciclo térmico de lisis antes de dichos pasos (b) y (c), de tal manera que la célula se lisa y se libera el ADN genómico; y/o
(d) en donde la secuencia común se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6; y/o
(e) en donde la secuencia variable se selecciona de tal manera que la secuencia variable se distribuya homogéneamente en el genoma y con una alta cobertura; y/o
(f) en donde el primer tipo de cebador incluye una secuencia de la SEQ ID NO: 12 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG], SEQ ID NO: 13 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT], o SEQ ID NO: 14 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG], y el segundo tipo de cebador, en una orientación 5' a 3', tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 1 [GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG], en donde N es cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural; y/o
(g) en donde la mezcla de la reacción comprende además un agente de ajuste del pH, de tal manera que el pH de la mezcla de la reacción se mantiene entre 7,0 y 9,0.
3. El método de la reivindicación 2(a), en donde las características de la secuencia asociadas con la enfermedad o el fenotipo incluyen anomalías cromosómicas, translocación cromosómica, aneuploidía, deleción o duplicación cromosómica parcial o completa, haplotipos de HLA fetal y mutaciones paternas, o la enfermedad o el fenotipo se seleccionan del grupo que consiste de: beta-talasemia, síndrome de Down, fibrosis quística, enfermedad de células falciformes, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de X frágil, atrofia muscular espinal, hemoglobinopatía, alfatalasemia, enfermedades ligadas a X (enfermedades dominadas por genes en el X cromosoma), espina bífida, anencefalia, enfermedad cardiaca congénita, obesidad, diabetes, cáncer, sexo fetal y RHD fetal.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el primer programa de ciclo térmico incluye:
(b1) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico capaz de abrir cadenas dobles del ADN genómico; (b2) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la unión del primer tipo de cebador a la plantilla de ADN de cadena sencilla;
(b3) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la extensión de la longitud del primer tipo de cebador que se une a una plantilla de ADN de cadena sencilla bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico, para producir un producto de amplificación;
(b4) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico capaz de desnaturalizar el producto de amplificación en cadenas sencillas;
(b5) repetir los pasos (b2) a (b4) hasta un primer número de ciclos designados;
y:
(a) en donde el primer número de ciclos designados es de más de 2; y/o
(b) que comprende además un paso (b4') después del paso (b4) y antes del paso (b5), en donde la mezcla de la reacción se coloca en un programa térmico adecuado que permite la hibridación del extremo 3' y el extremo 5' del producto de amplificación genómica para formar una estructura de giro, o permitir la unión del extremo 3' del producto de amplificación genómica a un cebador; y/o
(c) en donde el método pasa directamente al paso (b5) después del paso (b4); y/o
(d) en donde el primer número de ciclos del paso (b5) es más de 3, más de 4, más de 5 o más de 6; y no más de 10; y/o
(e) en donde el programa térmico en el paso (b1) comprende dejar reaccionar durante 1-10 minutos a una temperatura entre 90-95° C; y/o
(f) en donde el paso (b2) comprende colocar la mezcla de la reacción en más de un programa térmico para promover la unión suficiente y eficiente del primer tipo de cebador a la plantilla de ADN; y/o
(g) en donde el paso (b2) comprende dejar reaccionar a una primera temperatura durante 3-50 s, dejar reaccionar a una segunda temperatura durante 3-50 s, y dejar reaccionar a una tercera temperatura durante 3-50 s; y/o
(h) en donde el programa térmico en el paso (b3) comprende dejar reaccionar a una temperatura de 60-90° C durante 1-15 minutos; y/o
(i) em donde el programa térmico en el paso (b4) comprende dejar reaccionar a una temperatura de 90-95° C durante 10-50 s.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el paso (c) comprende:
(c1) colocar la mezcla de la reacción del paso (b) en un programa térmico capaz de abrir cadenas dobles de ADN;
(c2) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la unión del segundo tipo de cebador a cadenas sencillas del producto de amplificación genómica del paso (b);
(c3) colocar la mezcla de la reacción en un programa térmico que permite la extensión de la longitud del segundo tipo de cebador que se une a cadenas sencillas de los productos de amplificación, bajo la acción de la polimerasa de ácido nucleico;
(c4) repetir los pasos (c1) a (c3) hasta un segundo número de ciclos designado; y
en donde
(a) el segundo número de ciclos en el paso (c4) es mayor que el primer número de ciclos en el paso (b5); y/o (b) el programa térmico en el paso (c1) comprende dejar reaccionar a una temperatura de 90-95° C durante 10­ 30 s; y/o
(c) el programa térmico en el paso (c2) comprende dejar reaccionar a una temperatura de 45-65° C durante 10­ 30 s; y/o
(d) el programa térmico en el paso (c3) comprende dejar reaccionar a una temperatura de 60-80° C durante 1-15 minutos.
6. El método de la reivindicación 4(f), en donde más de un programa térmico comprende: una primera temperatura entre 5-10° C, una segunda temperatura entre 25-30° C y una tercera temperatura entre 45-50° C.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el ADN genómico en el paso (a) se libera de una célula lisada, la lisis incluye lisis térmica, lisis de bases, lisis enzimática o lisis mecánica.
8. El método de la reivindicación 7, en donde
(a) la lisis térmica comprende lisar a una temperatura entre 20-100° C durante 10-100 minutos; o
(b) la lisis térmica se lleva a cabo en presencia de un reactivo de lisis.
9. El método de la reivindicación 8(b), en donde el reactivo de lisis incluye uno o más surfactantes seleccionados del grupo que consiste de: NP-40, Tween, SDS, Triton X-100, EDTA e isotiocianato de guanidinio y/o liasa.
10. Un kit para amplificar ADN genómico, que comprende una mezcla que contiene un primer tipo de cebador y un segundo tipo de cebador, en donde el primer tipo de cebador comprende, en una orientación 5' a 3', una secuencia común y una secuencia variable, en donde el extremo 3' del primer cebador es la secuencia variable, en donde la secuencia común consiste de tres o dos tipos de bases seleccionadas del grupo que consiste de cuatro tipos de bases: G, A, C y T, siempre que la secuencia común no comprenda G y C al mismo tiempo, en donde la secuencia común se selecciona de tal manera que la secuencia común no se una sustancialmente al ADN genómico para provocar amplificación, y donde el segundo tipo de cebador comprende la secuencia común pero no la secuencia variable, y en donde el extremo 3' del segundo tipo de cebador no contiene otras secuencias adicionales, en donde la secuencia variable se selecciona del grupo que consiste de (N)nGGG, (N)nTTT, (N)mTNTNG, donde N se refiere a cualquier nucleótido que pueda emparejarse con un ácido nucleico de origen natural, n es un número entero positivo seleccionado de 3-17, m es un número entero positivo seleccionado de 3-15, respectivamente.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105602939A (zh) * 2015-09-02 2016-05-25 序康医疗科技（苏州）有限公司 扩增dna的方法
CN107254541B (zh) * 2017-08-03 2020-05-08 广州万德基因医学科技有限公司 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用
TWI706041B (zh) * 2018-12-10 2020-10-01 洪敏勝 以雷射誘發加熱於微流道中的原位ｄｎａ複製及檢測方法
CN111549110B (zh) * 2019-03-22 2022-04-01 健生生物技术有限公司 一种检测qPCR过程中的非特异性扩增的引物组、试剂盒以及检测方法
GB2597433B (en) * 2019-05-10 2024-05-08 Univ Hong Kong Chinese Primers and assays for linking regions using polymerases
JP2023545218A (ja) * 2020-10-06 2023-10-26 マテリアルズ アンド マシーンズ コーポレーション オブ アメリカ 生物学的試料からのｒｎａ又はｄｎａの検出のための方法
CN112309500A (zh) * 2020-10-30 2021-02-02 广州序科码生物技术有限责任公司 一种基于单细胞测序数据唯一片段序列捕获方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1604040B1 (en) * 2003-03-07 2010-10-13 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
WO2012166425A2 (en) 2011-05-27 2012-12-06 President And Fellows Of Harvard College Methods of amplifying whole genome of a single cell
CN104114703A (zh) * 2012-03-30 2014-10-22 深圳华大基因科技服务有限公司 全基因组扩增方法及其应用
EP3140425B1 (en) * 2014-05-06 2020-02-12 Baylor College of Medicine Methods of linearly amplifying whole genome of a single cell
US10208339B2 (en) * 2015-02-19 2019-02-19 Takara Bio Usa, Inc. Systems and methods for whole genome amplification
CN105602939A (zh) 2015-09-02 2016-05-25 序康医疗科技（苏州）有限公司 扩增dna的方法

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