TW201804156A - 新穎組合測試 - Google Patents

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Abstract

本發明系關於一種偵測和/或篩檢患者之結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之方法，包括辨認糞便潛血陽性之患者，以及進一步測試一或多額外的因子。該方法可用於評估患者結腸鏡檢查之適當性。

Description

新穎組合測試
本發明係關於偵測和篩檢之方法，特定而言，篩檢患者之結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之方法。
結腸直腸癌(colorectal cancer，CRC)為致死率極高的常見疾病，其病勢發展包括自癌前腫瘤(息肉)之增生異常、導至第一、二、三期以及最終第四期之CRC。死亡率有很大的變化，取決於疾病是否於早期局部生長階段即被偵測，此時仍可進行有效治療；或，末期時疾病已擴散至結腸、直腸、或其他器官，此時治療更加困難。於第一期檢測出該疾病之患者，超過90%具有5年之存活期，但於第四期之轉移性疾病之患者僅有10%。因此，許多國家有CRC篩檢計畫，以診斷CRC、癌前腫瘤或息肉之患者。CRC之罹患率係取決於年齡及性別；男性較女性常見，並且年長者較易罹病。CRC較不常見於小於50歲的人，因此針對年長者檢測較為有效。實際篩檢年齡範圍依據篩檢計畫、國家而不同，但較常針對年齡為50-74者。篩檢年齡之範圍將來可擴展至年輕或年長者，因為50歲以下患者逐漸增加，年長者預期壽命增加。
CRC篩檢計劃能及早偵測CRC，從而盡早治療，使存活期增加。早期偵測CRC亦可節省醫療支出以及資源，減少昂貴的晚期癌症藥物治療及照護之需求。理想上，CRC篩檢計畫可偵測癌前結腸直腸息肉或腺瘤，若無進行治療可能發展為CRC，但若已被偵測則可於腫瘤發展前清除。此種患者預後良好。
通常用於偵測和/或篩檢CRC之方法均有重要缺陷。在美國，篩檢CRC之主要方法為結腸鏡檢查(colonoscopy)。結腸鏡基本上涉及以肉眼檢查結腸，並使用穿過降、橫、升結腸之鏡檢判斷癌化或可能之癌前病變。結腸鏡的主要優點為偵測準確性，具有95%之CRC臨床特異性、以及偵測癌前腫瘤之高臨床敏感性(高於95%)。結腸鏡檢查之高準確性使其成為CRC標準偵測方法，尤其是檢測時可以移除低級病變。但，作為第一線診斷或篩檢，結腸鏡檢查仍有許多限制。結腸鏡檢查為高侵入性且須住院的，通常在麻醉下進行，並且患者診前須空腹，在一些案例中造成對患者的傷害(例如腸道撕裂)，而且價格昂貴(超過1000美元)。僅有0.5%之結腸鏡篩檢診斷測出罹患CRC，所以大多數檢測均無實質效益。由於以上缺點，結腸鏡檢查之患者順從性較低，並且已達篩選年紀的人並不採納。因此，結腸鏡檢查並非多數國家作為第一線之CRC檢測或篩檢。
一些健保機關採用相似之方法：乙狀結腸鏡檢查(sigmoidoscopy)，其中僅使用較短的範圍檢查降結腸(descending colon)。雖然此技術省略三分之二的結腸，但可檢查癌症最常發生之區域。乙狀結腸鏡檢查之缺點與結腸鏡檢查相似，因此亦非用於第一線檢測。其他如使用虛擬結腸鏡檢查或電腦斷層掃描(computerized tomography，CT)結腸圖(colonography)等。前述技術使用X射線和電腦技術之結合，形成結腸和直腸之影像以偵測結腸直腸腫瘤或息肉。
傳統上使用的生物標記包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)已被開發用於CRC血液檢測之生物標記，但其臨床準確性於經常使用之標記而言過低，而且較佳應用於患者的病勢監測。特定基因序列之高度甲基化近年被開發用於癌症血檢之診斷標記。例如，使用PCR擴增血漿萃取之DNA而偵測Septin9基因之高度甲基化的方法已被發表可偵測到72%之結腸癌，其偽陽性機率為10%(Grutzmann等人, 2008)。特定基因或基因座之DNA甲基化之狀態通常可使用亞硫酸氫(bisulphite)選擇性地將胞嘧啶(cytosine)而非5-甲基胞嘧啶去胺，導致可以用定序或其他方法偵測初級DNA序列之改變(Allen et al, 2004)。
最常用於CRC偵測及篩檢之方法包括二步驟，其中，首先篩選年齡族群使用第一線之非侵入性糞便檢測篩選，篩檢出具有CRC高風險之次群。於糞便測試中陽性反應者進一步採用結腸鏡檢查。由於糞便檢測多數為陰性者，因此二步驟方法避免無病變之受檢者進行非必要的結腸鏡檢測。約有5%受檢者糞便檢測結果為陽性，並且具有CRC較高風險。較高風險群體中，約有5%可被發現罹患CRC。因此，考量糞便檢測低臨床準確性，有必要開發價格低、準確性高之糞便CRC檢測試驗。
目前使用糞便檢測CRC之原理係偵測結腸或直腸中的出血。簡而言之，結腸或直腸部分地因突出之癌變或癌前病變之生長而阻塞，糞便移動至該阻塞處可能造成外傷或出血，通過測試糞便中是否存在紅血球蛋白(haemoglobin)來檢測出血。不同日的出血量可能大幅地改變，因此需要多次且不同日檢測。
目前CRC之糞便檢測係設計為偵測糞便中之紅血球蛋白。癒創木脂糞便潛血試驗(guaiac fecal occult blood test，FOBT或gFOBT)係用於偵測紅血球蛋白之化學方法，其中患者或操作者可塗抹少量糞便至塗佈有α癒創木酸之試紙或其他材料。若糞便中含有血液，則其中的過氧化氫與試紙接觸，藉由血紅素(紅血球蛋白之成分)之催化反應，使α癒創木酚酸(alpha-guaiaconic acid)氧化為藍色之醌化合物，產生快速的顏色改變。在測試中，攝取肉類(含有血紅素)以及某些蔬菜，包含其他類似血紅素功能之催化劑，可造成偽陽性結果。相似地，某些物質例如維他命C，可造成偽陰性結果，因此檢測前通常建議限制飲食。癒創木脂FOBT具有高臨床特異性，係依賴於所採用之檢測標準以及60-70%之CRC偵測敏感性。但，較不易偵測癌前息肉或腺瘤。化學FOBT方法過去是一種選擇，雖然目前仍廣泛使用，但已為糞便免疫化學方法取代。
糞便免疫化學試驗(FIT)方法(或稱iFOBT或FOBTi)，為偵測糞便樣本中的紅血球蛋白之主要免疫試驗。FIT由於不受飲食影響以及可偵測糞便中較少量的血液，FIT可得到較低偽陽性和偽陰性結果。該項檢測與gFOBT相似，但可偵測更多相關臨床病變。但，較不易偵測息肉或腺瘤。
總體上已達篩檢年齡者之CRC篩檢計畫在多個國家均使用FIT紅血球蛋白試驗，並可提高CRC之存活率。但僅有5%受試者於糞便血紅血球蛋白檢測呈現陽性，但可用結腸鏡檢測發現CRC，多數結腸鏡檢測係非必要。進行非必要之結腸鏡檢查對於患者及健保機關有許多缺點，包括(1)對於健康者大量非必要之侵入性結腸鏡檢查；(2)大量醫療支出耗費於昂貴且非必要之結腸鏡檢查；(3)由於結腸鏡檢查之公共投資不足，健保機關(特別是歐洲CRC篩檢計畫)對於結腸鏡檢查之提供無法滿足醫療需求，造成大量結腸鏡檢查積壓用，以及造成FIT陽性者等待結腸鏡檢查時間過長；以及(4)增加等待時間可能造成真正罹患CRC之患者嚴重延誤治療。
CRC篩檢計畫受限於上述問題。通常解決方法為提高FIT檢測之陰性/陽性臨界值，例如，每克糞便20微克(μg)紅血球蛋白(20µg Hb/g feces)增加至40µg/g(或等同液體濃度，若糞便稀釋於緩衝液中收集)，或Eiken OC-感測器FIT試驗由100奈克(ng)/毫升(ml)的糞便紅血球蛋白增加至200ng/ml。如此可減少受檢者送往結腸鏡檢查之數量，但也降低檢測出罹患CRC之患者數量因此提高CRC死亡率。以目前臨界值(20 µg/克糞便)而言，FIT試驗針對70%CRC患者可獲得陽性反應，提高臨界值將降低該數值(例如60或65%CRC患者)，即是說，將近三分之一CRC患者無法檢測出。
因此，有必要降低進行非必要結腸鏡檢查人數的新方法，同時保持檢測具有CRC之患者。改善CRC之偵測應非可行方法，但可設計檢測系統以辨認雖於糞便紅血球蛋白有陽性反應但無CRC，因此無需使用結腸鏡檢查。進一步地，辨認無罹患疾病者的方法亦可增加FIT敏感性已偵測到更多CRC患者，包括：(1)增加後續結腸鏡檢查的偵測率，以及(2)允許使用更佳以及動態的FIT臨界值，以提高高罹病率患者之檢出。本發明提供一種CRC之高陰性預測值之方法，該方法可用於區別糞便紅血球蛋白陽性者但為低CRC風險之族群，因此無須使用結腸鏡檢查；以及高CRC風險之族群，需進行結腸鏡和進一步檢查。故，可減少受檢者轉診至結腸鏡檢查，同時繼續檢測確實罹患CRC之受檢者。
本發明第一實施態樣係提供一種偵測和/或篩檢患者之結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括： (a) 辨認糞便潛血陽性之患者；以及 (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中一或多部分；其中，該部分樣本係選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、以及缺氧誘發因子所構成之群組； 其中，步驟(b)所得之結果係用於判斷患者罹患結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之可能性。
本發明進一步實施態樣係提供一種評估患者結腸鏡檢查之適當性之方法，包括： (a) 測試患者糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中一或多部分；其中，該部分樣本係選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、以及缺氧誘發因子所構成之群組；以及 (c) 使用步驟(b)所得之結果判斷患者結腸鏡檢查之適當性。
本發明係一FIT組合測試，用於糞便血紅素陽性之受試者，可改善CRC篩檢之敏感性和特異性，例如糞便試驗，並且更有效率地使用結腸鏡檢查，改善篩檢計畫之保健支出以及降低非必要之結腸鏡檢查。前述方法可包括任意二或多之參數組合如下： i. 測量糞便血紅素之量化值(FIT結果)：高FIT表示較高可能性罹患CRC； ii. 循環核小體之表觀遺傳特徵：癌症係遺傳及表觀遺傳失調之疾病，以及該失調於循環血漿或血清核小體和/或其相關DNA之偵測用於癌症偵測。本發明揭示建立健康循環血漿/血清之表觀核小體之數據可與其他因子結合，以排除罹患癌症之可能。 iii. 循環鐵代謝生物標記：FIT試驗中，無論其他因子，高於特定臨界值之血紅素量視為陽性反應。但，血紅素於糞便中存在可能為偽陽性。癌症一般可能與貧血相關，此外，糞便血紅素真陽性反應可能與長時間之腸胃道出血(gastrointestinal bleeding，GI bleeding)相關，以及與患者鐵代謝失調相關。前述失調可以藉由偵測血液/血清/血漿中多種鐵代謝生物標記，包括患者的血球比容(haematocrit)、紅血球容積(packed cell volume)、血紅素量、鐵蛋白量、運鐵蛋白量、可溶運鐵蛋白受體(sTfR)量、鐵調素(hepcidin)量、血幼素(HJV)量、和/或骨成形性蛋白質6(bone morphogenetic protein 6，BMP6)量。鐵代謝生物標記於男性和女性具有不同正常值，因此患者性別可用於解釋結果。本發明揭示鐵蛋白可用於血清生物標記，單獨或組合均可。亦可採用其他鐵代謝生物標記之阻斷，因為鐵蛋白是由於發炎而提高之急性期蛋白。該些標記另包括與發炎無關之血球比容和血紅素量。運鐵蛋白亦不與發炎相關，相較於血球比容和血紅素量對於較小的鐵代謝阻斷更具有敏感性。STfR亦可準確地代表少量鐵平衡失調，因此可作為鐵平衡健康/狀態的預測因子。慢性鐵代謝之阻斷導致可溶性HJV增加，並可被偵測。鐵調素係調節系統性鐵恆定，直接反應鐵濃度之波動，可用於生物標記。若鐵濃度下降，肝細胞停止生產鐵調素，引發膳食鐵吸收的上調(upregulation)以及系統性移動/回收/保存鐵。在慢性低量腸胃道出血時，鐵調素依賴上調依然可保持長期鐵濃度平衡。BMP6亦可直接關聯於鐵濃度之波動，其可被鐵調素主要活化路徑中細胞激素(cytokine)活化。 iv. 缺氧誘發因子(HIF)：HIF包括HIF-1及其次單元HIF-1a和HIF-1b、HIF-2及其次單元HIF-2a和HIF-1b，以及HIF-3，係於缺氧環境下誘發之轉錄因子，他們通過改變基因表現引發多種細胞間和細胞內反應，使細胞適應及生存於缺氧環境，這是由於一或二種的全身性貧血，其中貧血可造成全身細胞缺氧並且提高HIF，或是腫瘤微環境所造成之局部HIF升高。 v. 循環癌胚抗原(CEA)或其他已知CRC標記：CEA量提高與罹患CRC之高可能性及其他晚期疾病相關。 vi. 其他患者參數，特別是性別和年齡或出生日：患者參數例如年齡、性別、抽菸習慣、體重、或身體質量指數(BMI)也與罹患CRC疾病之可能性相關。本發明揭示組合年齡和FIT量化結果可增加組合測試之準確性，優於僅使用FIT。
因此，本發明之第一態樣係提供一種偵測和/或篩檢患者之結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括 (a) 辨認糞便潛血陽性之患者；以及 (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中一或多部分；其中，該部分樣本係選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、以及缺氧誘發因子所構成之群組； 其中，步驟(b)所得之結果係用於判斷患者罹患結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之可能性。
於一實施例，若其於步驟(b)之結果為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陽性反應，鑑定患者為具有高CRC、結腸直腸腺瘤或息肉風險之患者。於一替代實施例，若其於步驟(b)之結果為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陰性反應，鑑定患者為具有低CRC、結腸直腸腺瘤或息肉風險之患者。
習知技術者可知患者之糞便樣本中存在糞便潛血則視為陽性反應，其中糞便潛血存在量高於試驗所用之(單一)臨界值。
步驟(b)所得之結果可用於與糞便潛血量化結果和/或其他因子組合。於一較佳實施例，該因子係選自前述6類因子其中之一。於一更佳實施例，其他因子係患者之年齡和/或性別和/或鐵代謝生物標記。
本發明進一步實施態樣係提供一種偵測和/或篩檢患者結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括： (a) 辨認糞便潛血陽性之患者；以及 (b) 偵測或測量核小體之數量和/或患者之血液、血清、或血漿中無細胞核小體之表觀遺傳特徵。 其中，步驟(b)之結果係用於判斷患者罹患結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之可能性。
習知技術者可知本說明書用語「無細胞核小體」可包括任何具有一或多核小體之無細胞染色質片段。步驟(b)中無細胞核小體之表觀遺傳特徵可包括但不限於，一或多組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白同功異構體、修飾核苷酸、和/或核小體-蛋白質加合物中結合至核小體之蛋白質。
目前之糞便潛血試驗，例如FIT，單一而言並不足夠準確地診斷患者之結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉。因此診斷必須以侵入性之結腸鏡檢查確認。但，本發明揭示將糞便潛血試驗之量化結果與其他參數和/或鐵蛋白試驗和/或無細胞核小體試驗結合，可提供辨認無罹患結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之患者次群。
由於糞便潛血試驗陽性而接受結腸鏡檢查者，僅有約5%發現罹患CRC。本發明揭示將糞便潛血試驗結果以及血液/血清/血漿試驗和/或患者臨床數據結合，在組合中具有高陰性預測值，提供一種可降低疑似罹患CRC之患者總數約25-50%或以上之試驗。前述試驗可降低健康受試者進行結腸鏡檢查之數量(例如，約50%)，除了避免患者進行非必要侵入性試驗，亦可降低保健支出。
糞便潛血陽性之受試者中，本發明之方法理想上可辨認無罹患CRC之次群。本發明揭示圖1之接收者操作曲線，係來自1907名糞便潛血陽性之受試者，其中使用本發明之方法。接收者操作曲線揭示當特異性為25%時，試驗之敏感性為100%。即，該25%受試者無須結腸鏡檢查，並且若無進一步篩檢並不會造成錯失任何CRC患者。因此，該25%受試者代表1907名FIT陽性之群體中極低CRC風險者。進一步地，若維持97.4%敏感性，特異性可增加至33%。因此使用本發明之實施方式，組合包括FIT結果、年齡、以及5種循環血清核小體包括5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3、和核小體-HMGB1加合物，轉診至結腸鏡檢查者可降低四分之一且不會錯失任何CRC患者，或降低三分之一同時錯失2.6%之CRC患者。前述結果係相較於增加FIT/FOBT試驗之臨界值但將錯失高達10%之CRC患者。
進一步地，目前結腸鏡檢查之功能不足以支持篩檢計畫中糞便潛血陽性反應受試者之需求量。因此，降低轉診數將有助於健保機關，同時確保具有高CRC可能性者可接受結腸鏡檢查以及減少等待時間。
因此，本發明進一步實施態樣提供一種評估患者結腸鏡檢查之適當性之方法，包括： (a) 測試患者糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中一或多部分；其中，該部分樣本係選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、以及缺氧誘發因子所構成之群組；以及 (c) 使用步驟(b)所得之結果判斷患者結腸鏡檢查之適當性。
本發明進一步實施態樣係提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性，因此用於評估患者結腸鏡檢查之適當性之方法，包括： (a) 試驗患者糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者之血液、血清、或血漿中核小體量和/或無細胞核小體之表觀遺傳特徵；以及 (c) 使用步驟(b)之無細胞核小體之結果判斷患者結腸鏡檢查之適當性。
習知技術者可知，受試者被辨認糞便潛血陽性反應後可進行步驟(b)。進一步地，在步驟(c)中建立患者結腸鏡檢查之適當性時，步驟(b)之結果可與FIT量化結果或其他因子組合。
於一實施例，步驟(b)之結果可與糞便潛血之量化結果結合，例如步驟(a)之糞便潛血量化結果。於進一步實施例，糞便潛血之量化結果之臨界值係至少10 µg Hb/g，例如至少20、30、40、50 µg Hb/g；特定而言，至少約20µg Hb/g。
本實施態樣中，例如，若步驟(b)之結果為陽性，該患者應進一步進行結腸鏡檢查，由於糞便潛血試驗結果以及高陰性預測值試驗(例如，無細胞核小體試驗)均為陽性。但若步驟(b)之結果為陰性，該患者則不適合進行結腸鏡檢查，因為高陰性預測值試驗(例如，無細胞核小體試驗)與糞便潛血試驗結果不符。
因此，本發明進一步實施態樣係提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性，包括： (a) 試驗患者糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者之血液、血清、或血漿中核小體量和/或無細胞核小體之表觀遺傳特徵；以及 (c) 使用步驟(b)之無細胞核小體之結果，選擇性地結合FIT結果和其他因子，判斷患者罹患CRC和/或息肉之風險。
習知技術者可知上述分法之目的係辨認需要或不需要進一步篩檢(例如使用結腸鏡檢查或乙狀結腸鏡檢查)CRC和/或結腸直腸息肉之次群：(i)藉由辨認罹患CRC和/或結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸息肉之低風險者，且其不需進一步篩檢；和/或(ii)藉由辨認罹患CRC和/或結腸直腸息肉之高風險者，且其需進一步篩檢。
習知技術者可知，若糞便樣本中存在有糞便潛血，患者篩檢則為糞便潛血「陽性」反應。
本說明書所述核小體試驗，係使用核小體之存在或數量和/或包含特定表觀遺傳結構之核小體作為罹患癌症之可能性之標記。因此，若核小體數量和/或無細胞核小體之表觀遺傳特徵之存在或數量相異於一或多癌症控制組(確診罹患CRC)，患者可於步驟(c)被檢測為無需進行結腸鏡檢查之「陰性」，即患者為糞便血紅素陽性但結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉陰性，並且不適合進行結腸鏡檢查。
本發明進一步實施態樣係提供一種偵測和/或篩檢患者結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括： (a) 辨認糞便潛血陽性之患者； (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中鐵代謝生物標記之數量；以及 (c) 藉由步驟(b)中鐵代謝生物標記之結果，並選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，判斷患者罹患結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之可能性。
於一實施例，該鐵代謝生物標記係選自鐵蛋白、血球比容、血紅素、運鐵蛋白、可溶運鐵蛋白受體(sTfR)、鐵調素、血幼素(HJV)、和/或骨成形性蛋白質6(bone morphogenetic protein 6，BMP6)。於一實施例，該鐵代謝生物標記係選自鐵蛋白。於一實施例，紅血球容積(packed cell volume)亦可用於鐵代謝生物標記。
於一實施例，若步驟(c)之結果為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陽性，可辨認患者具有罹患CRC、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性。於一替代實施例，若步驟(c)之結果為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陰性，可辨認患者具有罹患CRC、結腸直腸腺瘤或息肉之低可能性。
習知技術者可知，若受試者之糞便樣本中糞便潛血存在量高於試驗所採用之一臨界值，患者則於步驟(a)中視為陽性。
糞便潛血陽性之受檢者群體中，本發明可提供辨認低CRC風險之受檢者次群之試驗。該試驗可與其他因子組合將有助於本發明之一組合試驗。本發明揭示篩選年齡且為FIT陽性(臨界值20µg Hb/g)之599名受試者之鐵代謝標記-鐵蛋白。若男性和女性均使用鐵蛋白數量臨界值：192 ng/ml，可辨認出25%之低風險次群，其中僅包括10%之CRC病例(118受試者中12名)。若使用不同鐵蛋白數量臨界值：男性為208 ng/ml以及女性為164 ng/ml，可減少誤診無CRC者至1名(118受試者中1%)，但增加可能之癌前腺瘤患者7名(178受試者中4%)。
於一實施例，鐵代謝生物標記為鐵蛋白，其臨界值至少為150 ng/ml，例如至少160、170、180、190、200、210、220、230、240、或250 ng/ml；特定而言，為190 ng/ml。臨界值可進一步以性別區分，故於進一步實施例中，針對男性之臨界值為至少190、195、200、205、或210ng/ml；針對女性之臨界值為至少150、155、160、165、170、175、180、185、或190 ng/ml。但於進一步實施例，男性之鐵蛋白臨界值為至少200ng/ml；女性之鐵蛋白臨界值為至少160ng/ml。
於一實施例，由步驟(b)所得之鐵代謝生物標記係用於組合糞便潛血量化結果，例如由步驟(a)所得之糞便潛血量化結果。於進一步實施例，糞便潛血量化之臨界值至少為10 µg Hb/g，例如至少20、30、40、或50 µg Hb/g，特定而言，至少約20µg Hb/g。
本發明進一步實施態樣係提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性，因此用於評估患者結腸鏡檢查之適當性之方法，包括： (a) 檢測自患者取得之糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、血漿樣本中鐵代謝生物標記之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之鐵代謝生物標記結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於評估患者結腸鏡檢查之適當性。
本發明進一步實施態樣係提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性，包括： (a) 檢測自患者取得之糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、血漿樣本中鐵代謝生物標記之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之鐵代謝生物標記結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於判斷患者具有CRC和/或息肉之相對風險。
本發明進一步實施態樣系提供一種偵測和/或篩檢患者結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括： (a) 辨認糞便潛血陽性之患者； (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中已知之CRC生物標記之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之CRC生物標記結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於判斷患者具有CRC、結腸直腸腺瘤或息肉之可能性。
於一實施例，若步驟(c)之結果為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陽性，則可辨認患者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性。於一替代實施例，若步驟(c)之結果為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陰性，則可辨認患者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之低可能性。
習知技術者可知，若糞便樣本中存在有高於試驗所使用之(單一)臨界值之糞便潛血，則步驟(a)中患者可視為「陽性」。
已知有數種CRC血液生物標記，包括但不限於癌胚抗原(CEA)、骨橋蛋白(osteopontin)、CYFRA-21-1、成纖維細胞活化蛋白質(seprase)、Timp-1、p53抗體和AFP抗體。因此，於一實施例，該CRC生物標記係選自CEA、骨橋蛋白、CYFRA-21-1、成纖維細胞活化蛋白質、Timp-1、p53抗體和AFP抗體。於進一步實施例，該CRC生物標記係CEA。
於糞便潛血試驗陽性之群體中，本發明提供之試驗可用於辨認具有低CRC風險之次群。該試驗可組合其他因子將有助於本發明之組合測試。本發明中揭示599名篩選年紀之FIT陽性受試者，其糞便中CRC生物標記：CEA之臨界值為20µg Hb/g。使用臨界值為1.3 ng/ml之單一CEA數量可辨認25%之低風險次群，其中僅包括15%CRC患者(118名受試者中18名)。
於一實施例，CRC生物標記係CEA，其臨界值至少為0.5 ng/ml，例如至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、或1.5 ng/ml，特定而言，臨界值為1.3 ng/ml。
於一實施例，步驟(b)所得之CRC生物標記結果係用於組合糞便潛血量化結果，例如自步驟(a)所得之糞便潛血量化結果。於進一步實施例，糞便潛血量化結果之臨界值至少為10 µg Hb/g，例如至少20、30、40、或50 µg Hb/g，特定而言，至少約20µg Hb/g。
本發明進一步實施態樣係提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性，因此用於評估患者結腸鏡檢查之適當性之方法，包括： (a) 檢測自患者取得之糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、血漿樣本中已知的CRC生物標記之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之CRC生物標記結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於評估患者結腸鏡檢查之適當性。
本發明進一步實施態樣係提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性之方法，包括： (a) 檢測自患者取得之糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、血漿樣本中已知的CRC生物標記之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之CRC生物標記結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於判斷患者具有結腸直腸癌(CRC)和/或息肉之相對風險。
本發明進一步實施態樣係提供一種偵測和/或篩檢患者之結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括： (a) 辨認糞便潛血陽性反應之患者； (b) 偵測或測量患者血液、血清、血漿樣本中缺氧誘發因子之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之缺氧誘發因子結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於判斷患者具有結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之可能性。
於一實施例，若步驟(c)之結果係該患者為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陽性，該患者可視為具有結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性。於一替代實施例，若步驟(c)之結果係該患者為CRC、結腸直腸腺瘤或息肉陰性，該患者可視為具有結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之低可能性。
於一實施例，缺氧誘發因子係選自HIF-1、HIF-2、和HIF-3。
於一實施例，自步驟(b)所得之缺氧誘發因子之結果，用於組合糞便潛血試驗之量化結果，例如步驟(a)所得之糞便潛血量化結果。於進一步實施例，糞便潛血量化結果之臨界值至少為10 µg Hb/g，例如至少20、30、40、或50 µg Hb/g，特定而言，至少約20µg Hb/g。
本發明進一步實施態樣提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性，因此用於評估患者結腸鏡檢查之適當性之方法，包括： (a) 檢測自患者取得之糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中缺氧誘發因子之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之缺氧誘發因子結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於判斷患者結腸鏡檢查之適當性。
本發明進一步實施態樣係提供一種將糞便樣本中糞便潛血陽性患者分配(allocate)為具有低CRC或息肉風險/可能性，或高CRC或息肉風險/可能性之方法，包括： (a) 檢測自患者取得之糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中缺氧誘發因子之數量；以及 (c) 使用步驟(b)所得之缺氧誘發因子結果，選擇性地與FIT結果和/或其他因子組合，用於判斷患者具有CRC和/或息肉之相對風險。
本發明揭示一種組合測試，優於任何辨認使用CEA篩檢FIT陽性者但具有低風險之次群之單一測試。本發明之方法可辨認599名FIT陽性(臨界值20µg Hb/g糞便)受試者中，150名(25%)CRC低風險之受試者次群。599名受試者中，118名被診斷出CRC。以FIT結果辨認之150名低風險者中，有6名CRC患者，顯示若僅提高臨界值以排除25%之結腸鏡檢查，將導致錯失118名CRC患者中的6名。低風險之150名受試者中，以年齡、CEA、或鐵蛋白等檢測，分別包括11、18、12名CRC患者。以包括FIT和年齡之組合測試可辨認低風險之150名受試者中，僅包括6名CRC患者。但以包括FIT、年齡、鐵蛋白、和CRA之組合測試可辨認低風險之150名受試者中，僅包括2名CRC患者。因此，本發明實施例可用於降低轉診至結腸鏡檢查之數量約25%，同時僅錯失低於2%之CRC患者。該組合測試亦可降低癌前腺瘤的數量。
FIT檢測可用於定性(qualitatively)(結果為陽性或陰性)或定量(quantitatively)(估算糞便血紅素濃度)檢測。定量糞便免疫化學測試提供糞便血紅素之量化結果，可使試驗執行者選擇糞便血紅素濃度之臨界值，用於辨認應進行結腸鏡檢查之患者。
於一較佳實施例，判斷患者不具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之方法，另包括使用其他患者資料用於演算。該資料可包括但不限於患者藉由FIT或FOBT試驗取得之糞便血紅素數量(而不是簡單之陽性/陰性結果)、患者之年齡、性別、身體質量指數(BMI)、抽菸習慣、和飲食習慣。以患者資料、以及無細胞核小體和/或鐵代謝生物標記和/或缺氧誘發因子和/或其他已知CRC生物標記之試驗數據，用於演算分析何者為CRC或息肉之存在與否之標記，或為CRC或息肉之存在與否之可能標記，或患者進行結腸鏡檢查之適當性之標記。
於一實施例，將患者之臨床資料(特別是患者之年齡和/或性別)，組合FIT或FOBT之量化結果，用於演算並判斷患者是否存在結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉。本實施例提供一種偵測和/或篩選糞便潛血陽性者之結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括： (i) 辨認糞便潛血陽性之患者； (ii) 使用糞便血紅素數量和其他患者資料，用於判斷受試者具有結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之可能性。
於一實施例，判斷患者不具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，另包括使用其他試驗數據於演算。該數據可包括任何相關試驗結果，包括但不限於患者血液或糞便之癌胚抗原(CEA)數量、C-反應蛋白數量(C-Reactive Protein，CRP)、鐵蛋白數量、血液血紅素數量、鐵代謝生物標記數量、缺氧誘發因子數量、和/或其他已知CRC生物標記。前述結果另可包括本說明書所述無細胞核小體試驗，或以其取代。
本發明進一步實施態樣提供一種判斷糞便潛血陽性患者是否需要結腸鏡檢查之方法，包括 (a) 辨認糞便潛血陽性之患者；以及 (b) 使用受試者之年齡和糞便血紅素數量，判斷受試者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之高風險或低風險。
高風險意指患者需要結腸鏡檢查。因此，於一實施例，前述方法另包括 (c) 使用步驟(b)所得之結果，用於判斷患者結腸鏡檢查之適當性。
本實施態樣之步驟(b)(使用受試者之年齡和糞便血紅素數量，判斷受試者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之高風險或低風險)可使用線性或非線性演算法。於一實施例，糞便血紅素數量(µg Hb / g 糞便)、和患者年齡用於線性表達式： 0.0129 × FIT量(µg Hb/g 糞便) + 0.0688 × 年齡(歲)
依據期望之結果，該表達式計算值可用於多種用途。特定而言，該表達式可用於提供一數值，其可與預定之臨界值比較，以判斷受試者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性或低可能性。例如，若期望之結果係達成降低結腸鏡檢查數量約25%，則臨界值約5可用於試驗中。若表達式之計算大於5，患者可視為CRC高風險並且需進一步以結腸鏡檢查。相對地，若表達式之計算小於5，患者可視為CRC低風險並且無需進一步以結腸鏡檢查。於一實施例，臨界值約為5.0，例如介於5.0-4.5，或介於4.9-4.7。於進一步實施例，臨界值約4.8。
習知技術者可知，該表達式所用的單位可變更(例如，年齡可以日、週、月等表示，或血紅素數量可以溶液或稀釋液之濃度、或任意單位(AU))，並且單位之改變並不會改變本發明方法之基礎。
使用本發明之方法，針對1907名FIT陽性之受試者群體，其中臨界值為20µg Hb/g 糞便，以及表達式臨界值為4.8，本發明揭示該方法可降低25%結腸鏡檢查量，同時維持96.6%之CRC患者轉診至結腸鏡檢查。相似地，可維持高風險腺瘤患者88.1%之轉診率。因此，結腸鏡檢查使用量可減少25%，同時僅錯失3.4%CRC患者以及11.9%高風險腺瘤患者。
於一實施例，本發明之演算法係用於先建立任何年齡可變FIT數值。例如，前述表達式可轉換為變動之FIT臨界值以及漸增年齡之圖表，如圖1所示。在1907名受試者群體中，可變臨界值低於20µg Hb/g並不適用，因為所有1907名受試者若臨界值為20µg Hb/g糞便均為陽性。因此，表1中，最小臨界值為20µg Hb/g糞便。但，亦可使用更低的臨界值，我們已經說明了這點，本說明書表1揭示10 and 16µg Hb/g糞便作為臨界值，但並非作為限制。亦可設定臨界值為0µg Hb/g 糞便。相似地，亦可設定臨界值最大值，本說明書表1揭示臨界值最大為80µg Hb/g糞便、最小為10µg Hb/g糞便，但並非作為限制。任何臨界值之最大值或/和最小值均可使用，或不限定之。
表1
本發明揭示使用表1中可變FIT臨界值，較低的臨界值20µg Hb/g 糞便可降低25%結腸鏡檢查量，同時維持96.6%CRC患者以及88.1%高風險腺瘤患者之轉診率。
目前臨床實務上，20µg Hb/g糞便之FIT臨界值最常使用，並且為廠商所建議。該臨界值可提供可接受的70-75%敏感性以及約95%之特異性，並且代表錯失的CRC患者數量以及無病變患者之非必要之結腸鏡檢查數量之間，權宜性的中間值；但仍剩餘約25-30%之CRC病例未檢出，結腸鏡檢查轉診率約5%。轉診至結腸鏡檢查者，約5%診斷出CRC(較篩檢者多1%)，以及另有約30%診斷出可能之癌前腺瘤(息肉)。因此，多數結腸鏡檢查用於無須檢查者。使用上述動態臨界值可降低結腸鏡檢查數量約25%，同時增加結腸鏡檢查出CRC患者至將近7%，以及增加結腸鏡檢查出可能之癌前腺瘤至將近34%。
若CRC篩選計畫顯示上述臨界值之中間值(20µg Hb/g糞便)不適當，可行的方法有：(i)增加臨界值以降低結腸鏡轉診率，但增加錯失罹癌患者的數量；或(ii)降低臨界值以減少錯失罹癌患者數，但增加結腸鏡檢查量。20µg Hb/g糞便作為FIT檢測臨界值為簡單且穩定的臨界值，無論任何其他患者資料為何。相似地，其他較高或較低臨界值為簡單且穩定的臨界值。但，CRC發生率以及FIT量化結果並非與其他患者資料相符。實際上，本發明使用可變或動態臨界值可排除年輕患者但具有相對低FIT量化結果(但高於20µg Hb/g糞便)進行結腸鏡檢查，其CRC風險較低；相對地，年紀較大的FIT陽性者，具有較高CRC風險，則進行結腸鏡檢查。
進一步地，雖然前述1907名受試者中，FIT量化結果均大於20µg Hb/ g糞便，但仍可再降低該線性動態臨界值之下限。例如，針對年齡大於66歲之受試者，其罹患CRC之風險較高，使用低於20µg Hb/ g糞便的FIT臨界值，可提高試驗的靈敏性；同時降低結腸鏡檢查量，避免較年輕且低CRC風險之受試者因FIT量稍微提高而進行結腸鏡檢查。相似地，亦可應用於上限值，即參照表1中FIT最高臨界值。
本發明揭示年齡大於50歲的FIT陽性受試者族群，於較低臨界值10µg Hb/g糞便時，篩檢結果包括4名CRC患者、8名可能之癌前進展性腺瘤患者、以及20名健康者。前述受試者中，4名中有2名、8名中有3名、以及20名中有1名受試者具有大於16µg Hb/g糞便之FIT數值。以上數據顯示，本發明提供之方法，如表1所示，其具有較低之臨界值16µg Hb/g糞便並可用於增加整體FIT靈敏性，以及降低臨界值之最小值(例如，降低至16µg Hb/g糞便)偵測更多CRC患者，同時降低結腸鏡檢查轉診率，即於20-105µg Hb/g糞便之FIT結果之間，增加年長者檢查量以及減少年輕者檢查量。
本發明實施例亦可使用非線性演算法。本發明揭示非線性演算法，包括log[FIT]或[FIT]-0.1 (FIT數量提升至-0.1次方)，特別可用於本發明。於一實施例，糞便血紅素量(µg Hb / g糞便)，以及患者年齡(歲)用於表達式：
0.063 × 年齡(歲) – 19.2 × (5×FIT數量)-0.1
於另一實施例，糞便血紅素量(µg Hb / g糞便)，以及患者年齡(歲)用於2為底對數表達式： 0.063 × 年齡 (歲) -1.58 × LOG(FIT數量)
依據期望之結果，該表達式計算值可用於多種用途。特定而言，該表達式可用於提供一數值，其可與預定之臨界值比較，以判斷受試者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性或低可能性。例如，若期望之結果係達成降低結腸鏡檢查數量約25%，則臨界值約7.4或9.5可分別用於表達式(5 x FIT 數量)-0.1 或LOG(FIT數量)。若表達式輸出值分別高於7.4或9.5，則判斷患者為高CRC風險，應進行結腸鏡檢查。相對地，若表達式輸出值分別低於7.4或9.5，則判斷患者為低CRC風險，無需結腸鏡檢查。習知技術者可知，非線性表達式可轉換為特定年齡之FIT臨界值，如前述線性表達式所示。
前述本發明實施例中任一者用於7943名FIT陽性(臨界值20µg Hb/g糞便)受試者群體時，可辨認25%之低風險群體中僅包括5%CRC患者(430名患者中23名)。
於一實施例，本說明書所述之方法，另包括測量患者之至少一臨床參數，並且用於解釋結果。可使用之參數包括相關臨床資訊，例如性別、體重、BMI、抽菸習慣、和飲食習慣，但非為限制。因此，於進一步實施例，該臨床參數係選自性別和BMI。
於一實施例，該方法另包括，針對步驟(b)中判斷具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之高可能性之受試者，以結腸鏡、和/或手術、和/或給予治療藥物進行治療。
因此，本發明進一步實施態樣係提供一種治療人類或動物之結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤、或息肉之方法，包括： (a) 測試糞便樣本中之糞便潛血； (b) 使用年齡和糞便血紅素量，將受試者分配為具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之高或低可能性；以及 (c) 針對步驟(b)中判斷具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之高可能性之受試者，以結腸鏡、和/或手術、和/或給予治療藥物進行治療。
於一實施例，步驟(b)包括使用本說明書所述之演算法。
於一實施例，該方法另包括，偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中核小體或/和無細胞核小體之表觀遺傳特徵數量。
於一實施例，本說明書所述之方法包括偵測或測量核小體數量。習知技術者可知測量核小體數量之方法，例如使用文獻中已知之核小體之免疫試驗方法。ELISA方法和其他多種方法已發表於文獻(Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; and van Nieuwenhuijze et al, 2003)。前述試驗通常使用核小體抗體(例如H2B抗體、H3抗體、或H1、H2A、H2B、H3和H4之抗體)作為捕捉抗體，以及DNA抗體或H2A-H2B-DNA複合物抗體作為偵測抗體。
於一實施例，無細胞核小體係單核小體、寡核小體、或其他染色體片段。
核小體為染色質結構之基本重複單元，由8個高度保守之核心組織蛋白(包括H2A、H2B、H3、和H4各一對)之蛋白質複合體組成。約146對DNA鹼基纏繞該複合體。其他組織蛋白，H1或H5，則作為連結體，使染色質緊密纏繞。DNA纏繞於連續的核小體，其結構類似於「串珠」，形成真染色質或開放結構。於異染色質或緊密結構，串珠結構以環繞或超旋扭形成閉合且複合結構(Herranz and Esteller, 2007)。
細胞染色質之核小體結構具有多種變化，係由於組織蛋白之轉譯後修飾(Post Translational Modification，PTM)以及包含有組織蛋白變異體。組織蛋白之轉譯後修飾通常、但不僅出現於8個核心組織蛋白尾端，另常見之修飾包括離胺酸之乙醯化、甲基化、或泛素化(ubiquitination)，以及精胺酸之甲基化和絲胺酸之磷酸化。組織蛋白修飾參與在細胞表現之表觀調控(Herranz and Esteller, 2007)。核小體之結構可因包括不同組織蛋白異構體或變異體而不同，其為不同基因或剪接形成之產物，具有不同胺基酸序列。組織蛋白變異體可分為多個群組，在進一步區分為個別類型。多種組織蛋白變異體之核苷酸序列已發表且公開於，例如，美國國家人類基因體研究所(National Human Genome Research Institute，NHGRI)組織蛋白資料庫(Histone DataBase) (http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank(NIH genetic sequence)資料庫、EMBL核苷酸序列資料庫、以及日本DNA資料庫(DDBJ)。
組織蛋白變異體以及組織蛋白修飾型於健康及疾病細胞中已被許多研究(主要是免疫組織化學)證明是不同的。(Herranz and Esteller, 2007)。
核小體結構依據其DNA組成之化學修飾而不同，包括DNA甲基化狀態(Herranz and Esteller, 2007)。習知技術者可知，DNA可於胞嘧啶第5位置甲基化以形成5-甲基胞嘧啶，其於癌症中的參與早在1983年就已有報導(Feinberg and Vogelstein, 1983)。在癌細胞中觀察到的DNA甲基化模式與健康細胞中不同。報導指出，癌細胞之重複性序列，特別是鄰近中粒周圍之區域(pericentromeric area)，相較於健康細胞，表現低度甲基化；另有報導指出，癌細胞之特定基因之啟動子具有高度甲基化。報導指出，前述二種型態之間的平衡造成全面性的DNA低度甲基化，為癌細胞之特性(Esteller 2007, Hervouet et al, 2010, Rodriguez-Paredes & Esteller, 2011)。
依據核小體結合至任何其他染色質上多種蛋白質以形成核小體加合物，核小體結構亦有所不同。染色質包括大量且多種類型之非組織蛋白，具有多種功能，包括轉錄因子、轉錄增強因子、轉錄抑制因子、組織蛋白修飾酶、DNA損壞修復蛋白、核賀爾蒙受體、或其他。針對染色質結合蛋白質的研究，可採用染色質免疫沉澱方法(ChIP)。該方法已廣為發表於文獻，但該方法複雜、費工、且昂貴。
先前技術已公開具有特定表觀遺傳訊息之核小體之ELISA試驗，包括具有特定組織蛋白修飾之核小體、特定組織蛋白變異體和特定DNA修飾，另包括特定核小體加合物(WO 2005/019826、WO 2013/030579、WO 2013/030577、WO 2013/084002)。我們之前已經使用這些測定，揭示循環無細胞核小體之表觀遺傳改變可於病患血液中被偵測。因此，於一實施例，前述偵測或測量(例如步驟(b))包括： (i) 使樣本接觸一第一結合劑，該第一結合劑可與無細胞核小體或其部分結合； (ii) 使樣本或無細胞核小體接觸一第二結合劑，該第二結合劑可與無細胞核小體之表觀遺傳特徵結合；以及 (iii) 偵測或定量該第二結合劑與該無細胞核小體之表觀遺傳特徵之結合。
於一替代實施例，步驟(b)之偵測或測量包括： (i) 使樣本接觸一第一結合劑，該第一結合劑可與無細胞核小體之表觀遺傳特徵結合； (ii) 使樣本或無細胞核小體接觸一第二結合劑，該第二結合劑可與無細胞核小體或其部分結合；以及 (iii) 偵測或定量該第二結合劑與該無細胞核小體或其部分結合之結合。
於一實施例，該方法包括偵測或測量無細胞核小體之表觀遺傳改變或其他修飾。因此，例如步驟(b)可包括偵測無細胞核小體之表觀遺傳特徵。
於一實施例，該表觀遺傳特徵係選自組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白變異體或異構體、DNA修飾、或加合至核小體之蛋白質。
於進一步實施例，無細胞核小體之表觀遺傳特徵包括一或多組織蛋白轉譯後修飾。多種組織蛋白轉譯後修飾已公開於文獻，並且隨著新發表之修飾而增加。例如，組織蛋白在多個位置具有多種氨基酸殘基，包括組織蛋白H2、H3、和H4之賴胺酸、絲胺酸、精胺酸、和蘇胺酸，以及其異構體或序列變異體，但非為限制。前述之修飾包括但不限於，賴胺酸之乙醯化、泛素化、生物素化(biotinylation)、或單、二、三甲基化。任何組織蛋白修飾之適當特徵，可用於本發明中偵測或測量個別修飾組織蛋白程度、或偵測或測量無細胞單核小體、寡核小體、或其他染色質片段之組織蛋白部分，例如，使用層析法、質譜、生物感測、ChIP、免疫試驗、或其他偵測方法。於一較佳實施例，核小體相關之修飾組織蛋白以2位置免疫試驗(immunometric)方法測量，其中使用抗體或其他選擇性結合劑結合至核小體抗原決定位和待偵測之另一特定組織蛋白修飾。
於一實施例，本發明係偵測相關組織蛋白修飾之群組或類型(而非單一修飾)。本實施例可為但不限於2位置免疫試驗方法，其中使用抗體或其他選擇性結合劑結合至核小體抗原決定位和待偵測之另一特定組織蛋白修飾。結合至組織蛋白修飾之群組之該抗體，可為但不限於抗泛乙醯化(anti-pan-acetylation)抗體(例如泛乙醯H4抗體)、抗瓜胺酸化(anti-citrullination)抗體、或抗泛素化(anti-ubiquitination)抗體。
於一實施例，組織蛋白轉譯後修飾係選自H2AK119Ub、pH2AX、H3K9Me3、H3K9Ac、H3K27Me3、H3K36Me3、H3S10Ph、H4K16Ac、H4K20Me3、泛素化-H2A、和H4PanAc(泛乙醯化H4)。於進一步實施例，組織蛋白轉譯後修飾係選自H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3、H3S10Ph、和H4PanAc。於更進一步實施例，組織蛋白轉譯後修飾係選自H2AK119Ub、pH2AX、和H3K36Me3。
於一替代實施例，無細胞核小體之表觀遺傳特徵包括一或多組織蛋白變異體或異構體。多種核小體變異體(例如，組織蛋白H2之變異包括H2A1、H2A2、mH2A1、mH2A2、H2AX、和H2AZ)已揭示於文獻，並且該數目隨著新確定的修飾而增加。組織蛋白結構亦可經轉錄後修飾而改變。例如，H2A變異體：H2AX可藉由轉譯後修飾將Ser139磷酸化，該部分通常稱為gamma-H2AX。任何組織蛋白片異體，包括任何修飾變異體，可用於本發明作為偵測或測量組織蛋白變異體部分之適當特徵。例如，可使用免疫試驗、層析法、質譜法、ChIP、生物感測、或其他偵測組織蛋白異構物部分之方法，或偵測或測量包含組織蛋白變異體之無細胞單核小體、寡核小體、或其他染色質片段之組織蛋白部分。於一較佳實施例，核小體相關組織蛋白變異體之測量方法為2位置免疫試驗，其中使用抗體或其他選擇性結合劑結合至核小體抗原決定位和待偵測之另一特定組織蛋白變異體或異構體。
於一實施例，組織蛋白變異體或異構體係選自mH2A1.1、H2AZ、和gamma-H2AX。
於一替代實施例，無細胞核小體之表觀遺傳特徵包括一或多DNA修飾。多種DNA修飾(例如，胞嘧啶之甲基化、羥甲基化、或羧甲基化)已揭示於文獻，並且該數目隨著新確定的修飾而增加。任何核苷酸或核苷修飾，或任何DNA修飾，可用於本發明作為偵測或測量分離之DNA、核酸、核苷酸、或核苷部分之適當特徵。例如，可使用免疫試驗、層析法、質譜法、ChIP、生物感測、或其他偵測修飾核酸部分之方法，或偵測或測量包含特定DNA修飾之無細胞單核小體、寡核小體、或其他染色質片段之部分。於一較佳實施例，核小體相關DNA修飾之測量方法為2位置免疫試驗，其中使用抗體或其他選擇性結合劑結合至核小體抗原決定位和待偵測之另一特定DNA修飾。
於一實施例，DNA修飾係選自5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。
於一較佳實施例，測量染色質片段中核苷酸之表觀遺傳修飾係5-甲基胞嘧啶或甲基化DNA。為了清楚本發明之態樣，不應與偵測基因甲基化之方法混淆，其包括偵測特定基因或DNA序列之胞嘧啶甲基化狀態，例如使用糞便分子檢測(Cologuard)。相對地，本發明係涉及全體5-甲基胞嘧啶的判斷，與基因序列無關。
於一替代實施例，無細胞核小體之表觀遺傳特徵包括一或多蛋白質-核小體加合物或複合體。目前已知為數眾多的蛋白質-核小體加合物或複合體存在於染色質(例如，轉錄因子、HMGB1、EZH2、以及細胞核賀爾蒙受體-核小體加合物)，並且該數目隨著新確定的與染色質相關的蛋白質而增加。任何蛋白質-核小體加合物可為用於本發明偵測或測量之適當特徵，無論是透過任何方法偵測或測量無細胞單核小體加合物、寡核小體加合物、或其他包括特定蛋白質之染色質片段加合物等方法；例如，2位置免疫試驗，包括使用一抗體或其他可結合至核小體抗原決定位之選擇性結合劑，以及另一可結合至加合物中特定蛋白質之抗體或結合劑。
於一實施例，加合至核小體之蛋白質係選自：轉錄因子、高遷移率族蛋白(High Mobility Group Protein)、或染色質修飾酵素。用語「轉錄因子」係指結合至DNA並且藉由啟動(即活化子)或抑制(即抑制子)轉錄而調控基因表現之蛋白質。轉錄因子包括一或多DNA結合域(DNA-binding domain，DBD)，其附著於其調控的基因鄰近之特定DNA序列。
於一實施例，該核小體加合物包括高遷移率族蛋白、多梳家族蛋白(Polycomb proteins)、染色質修飾酵素、或細胞核賀爾蒙受體。
於一實施例，該加合至核小體之蛋白質係選自HMGB1和EZH2。
於一實施例，步驟(b)中偵測或測量之方法包括免疫試驗、免疫化學方法、質譜法、層析法、染色質免疫沉澱、或生物感測。
於一實施例，該方法包括二或多測量無細胞核小體核/或無細胞核小體表觀遺傳特徵之核小體特徵套組。
於一實施例，該核小體特徵套組包括二或多個核小體特徵，選自：5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、 pH2AX、H3K36Me3、H2AZ、和HMGB1。於進一步實施例，該核小體特徵套組包括二或多個核小體特徵，包括：5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3、和HMGB1。該核小體特徵套組可另包括測量核小體之數量。
於進一步實施例，該方法包括測量核小體生物標記之套組，係選自核小體數量、一或多特定組織蛋白修飾或包括特定組織蛋白修飾之無細胞核小體、組織蛋白變異體或包括特定組織蛋白變異體之無細胞核小體、DNA修飾或包括特定DNA修飾之無細胞核小體或其加合物。由於不同族群可能不具有相同或相似表觀遺傳特徵，針對不同動物或不同族群之理想的套組亦有所不同。因此，用於排除或確診(例如)人類具有CRC之生物標記之套組，不必與用於另一動物(例如貓或狗)之套組相同。相似地，用於排除或確診男性和女性人類(或任何其他動物)具有CRC之生物標記之套組亦相異。相似地，用於排除或確診不同人類次群或種族具有CRC之生物標記之套組可能相異。可替代地，相同套組可用於不同族群(例如用於男性和女性)，但偵測目標具有不同比重。例如，三試驗之測試值和患者資料參數套組包括試驗A、B、和C，可藉由數學表達式(測試值= A + 2B + 3C)計算例如男性受試者之臨界值X，以及藉由不同數學表達式(測試值= 3A + 2B + C) 計算例如女性受試者之臨界值Y。
於一實施例，偵測或測量樣本中無細胞核小體之表觀遺傳特徵之方法包括： (i) 自受試者取得樣本； (ii) 使該樣本接觸一第一結合劑和一第二結合劑，該些結合劑其中一者結合至無細胞核小體或其部分，以及另一者結合至該無細胞核小體之表觀遺傳特徵；以及 (iii) 偵測或定量該些結合劑其中一者或全部之結合。
習知技術者可知，本說明書所述之表觀遺傳特徵亦可分別測試其是否包含於核小體中。故，於一實施例，偵測或測量樣本中無細胞核小體之表觀遺傳特徵之方法包括： (i) 自受試者取得樣本；以及 (ii) 偵測或測量樣本中特定組織蛋白變異體、組織蛋白異構體、包括特定轉譯後修飾之組織蛋白、或核小體加合物。
於一較佳實施例，本發明提供2位置免疫試驗，用以於原位(in situ )測量具有表觀遺傳特徵之核小體，其中使用固定相之抗核小體結合劑，以及帶有標記之抗核小體修飾、抗核小體變異體、抗DNA修飾、或抗蛋白質加合物之結合劑。於另一實施例，本發明提供2位置免疫試驗，其中使用具有標記之抗核小體偵測結合劑，以及固定相之抗核小體修飾、抗核小體變異體、抗DNA修飾、或抗蛋白質加合物之結合劑。
習知技術者可知，於糞便潛血試驗中診斷為陽性者可藉由自患者取得之糞便樣本之糞便潛血試驗而診斷。於一實施例，糞便潛血試驗係選自糞便免疫化學試驗(FIT，或iFOBT)、癒創木脂糞便潛血試驗(stool guaiac test for fecal occult blood，gFOBT)、或糞便紫質量化試驗(Fecal porphyrin quantification)(例如HemoQuant)。於進一步實施例，該糞便潛血試驗係FIT。FIT產物可使用特定抗體偵測血球蛋白，目前為最常用於結腸癌篩選的試驗之一。
收集糞便樣本可使用市售的裝置，例如可於市面購得之FIT試驗。該裝置包括用於刮下小量糞便之樣本採集棒。再將探針伸入試管，從棒上移去多餘樣本並且於10mg糞便樣本中加入2ml緩衝液。試管另包括過濾系統，以移除其中固體，僅需部分液體樣本用於分析。習知技術者可知，任何糞便樣本可被稀釋、過濾、分離、純化等，以用於本發明之分析。
習知技術者可知，雖然糞便潛血試驗係測試患者之糞便樣本，相同或另一形式樣本亦可使用，以試驗另一或其他部分，例如核小體數量。於一實施例，該樣本為體液樣本，例如選自血液、血清、或血漿(特定而言，血液樣本)。習知技術者可知，偵測體液中核小體加合物具有最小侵入性之優勢，無須活體切片。
於一實施例，偵測之疾病係選自癌症，例如結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉。
此外，本發明之方法可包括進一步試驗，以提高臨床準確性，包括例如測試血紅素、其他已知腫瘤標記包括癌胚抗原(CEA)、和/或特定突變或甲基化基因序列。因此，於一實施例，該方法另包括偵測或測量患者樣本中癌胚抗原(CEA)之數量。
於一實施例，另包括測試特定突變或甲基化基因序列。例如，目前用於偵測CRC之糞便測試，包括分析糞便中DNA序列、以及分析血紅素。該些方法中，自糞便分離DNA並且分析，以辨認癌症相關序列突變和/或基因特異DNA甲基化改變。前述方法例如精密科學公司(Exact Sciences Corporation)所提供之Cologuard試驗。該試驗包括糞便中11個CRC標記之套組，包括血紅素、7個DNA序列突變、2個DNA序列甲基化、和β肌動蛋白(作為試驗結果標準化之控制組)。該試驗中，患者之糞便樣本於實驗室中分離DNA並且擴增，使用量化對偶基因特異即時目標和訊號擴增(quantitative allele-specific real-time target and signal amplification)，分析NDRG4和BMP3基因甲基化。另使用該些試驗方法分析癌症相關KRAS突變，並且對所有這些通過β肌動蛋白擴增評估的總DNA量進行評估。DNA甲基化、突變、和血紅素試驗結果組合後，提供陽性或陰性結果。Cologuard試驗較一般FOBT或FIT精準，可偵測出92%之癌症以及42%之息肉，且具有87%之特異性(The Medical Letter, 2014)。組合該試驗與本發明之核小體試驗結合，可進一步增加試驗之準確性。
於一實施例，該方法另包括測量患者之至少一臨床參數。該些參數可包括任何相關臨床資訊，例如年齡、性別、BMI、抽菸習慣、和飲食習慣，但非為限制。因此，於進一步實施例，該臨床參數係選自年齡、性別、和BMI。
於一實施例，一或多結合劑包括配體或結合劑，可專一結合至無細胞核小體或其部分、或核小體或其部分之模擬結構/形狀。
於一實施例，抗體或其他選擇性結合劑作為抗核小體結合劑對於腫瘤原之核小體增生具有選擇性。於一較佳實施例，該抗體或其他核小體選擇性結合劑係用於結合組織蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t。對於腫瘤原之核小體具有選擇性的結合劑，可用於任何試驗包括測定(腫瘤原)核小體數量、任何特定組織蛋白修飾或具有特定組織蛋白修飾之無細胞核小體、組織蛋白變異體或具有特定組織蛋白變異體之無細胞核小體、DNA修飾或具有特定DNA修飾之無細胞核小體、或核小體加合物。
任何分離和/或偵測或測量樣本中作為標記之特定組織蛋白修飾或具有特定組織蛋白修飾之無細胞核小體、組織蛋白變異體或具有特定組織蛋白變異體之無細胞核小體、DNA修飾或具有特定DNA修飾之無細胞核小體、或核小體加合物之方法可用於本發明。前述偵測或測量方法之例示，包括層析法、光譜法(特別是質譜法)、生物感測、ChIP、和免疫化學方法。某些偵測或測量方法可以包括先分離或增幅樣本中分析物，例如使用層析或使用選擇性抗體結合劑或其他特定分析物結合劑之親和力純化/分離方法。DNA修飾之分離或純化可使用本領域已知之DNA萃取技術。
習知技術者可知，本發明實施態樣之用語「抗體」、「結合劑」、或「配體」包括但不限於，任何可結合至特定分子或對象之結合劑，任何適當之結合劑可用於本發明。習知技術者可知，用語「核小體」包括單核小體和寡核小體，以及任何具有前述特徵之染色質片段，其可用於液體介質中分析。
於一實施例，本發明之配體或結合劑包括天然或化學合成化合物，可專一結合至待測目標。配體或結合劑可包括胜肽、抗體或其片段、或合成配體，例如塑膠抗體、或適體或寡核苷酸，可專一結合至待測目標。該抗體可為單株抗體或其片段。該配體可標定可偵測之標記，例如冷光、螢光、酵素、或放射性標記。本發明中，替代或額外的配體可標定親和力標記，例如生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素(streptavidin)、或His(例如hexa-His)標記。替代的配體可藉由無標定技術例如ForteBio Inc.提供之方法而決定。
說明書用語「偵測」或「診斷」包括辨認、確認、和/或疾病之定性。本發明之偵測、監測、和診斷方法可用於確認疾病存在、評估病勢以監測疾病發展、或評估疾病之改善或減緩。偵測、監測、和診斷之方法亦可用於評估臨床篩檢、預後、療程選擇、評估治療功效，例如藥物篩選和藥物研發。
本發明之免疫試驗，包括任何使用一或多抗體或其他可專一結合至核小體或其部分或核小體表觀遺傳特徵之方法。免疫試驗包括2位置免疫試驗或使用酵素偵測法之免疫試驗(例如ELISA)、螢光標定免疫試驗、時序螢光標定免疫試驗、化學發光免疫試驗、免疫濁度(immunoturbidimetric)試驗、粒子標記免疫試驗、以及免疫放射試驗，另有單位置免疫試驗、反應劑限制免疫試驗、競爭型免疫試驗包括標定抗原和標定單株抗體免疫試驗，其中包括放射標記、酵素、螢光、時序螢光和粒子標記等多種標記類型。前述免疫試驗已揭示於先前技術，例如Salgameet al , 1997和van Nieuwenhuijzeet al , 2003。
可藉由任何適當方法辨認和/或定量患者、純化物、稀釋物樣本中特定蛋白之存在或/和數量。本發明之方法藉由測量樣本中目標濃度以進行定量。樣本可藉由本發明之方法試驗，包括前述方法。樣本可藉由，例如，適當稀釋或純化而製備，並以一般方法儲存。
生物標記之辨認和/或定量，可偵測該生物標記或其片段，例如具有C端截斷之片段，或N端截斷片段。適當之片段長度大於4個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸。特別注意的是，與組織蛋白尾端相同或相關序列之胜肽，為特別有用的組織蛋白片段。
例如，偵測或/和定量之方法可選自SELDI (-TOF)、MALDI (-TOF)、1-D膠體分析、2-D膠體分析、質譜法(MS)、逆相(RP)層析法、顆粒滲透(膠體過濾)、離子交換、親和力、HPLC、UPLC、和其他LC或LC MS相關技術所構成之群組中一或多種方法。適當LC MS技術包括ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA)或iTRAQ® (Applied Biosystems, CA, USA)。另可使用液相層析法(例如高壓液相層析法(HPLC)或低壓液相層析法(LPLC))、薄膜層析法、NMR(核磁共振)光譜。
本發明進一步實施態樣提供一種治療人類或動物結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括： (a) 測試患者糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量血液、血清、或血漿中一或多部分之數量，其中該部分係選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、或缺氧誘發因子； (c) 藉由步驟(b)之結果判斷具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之標記之可能性；以及 (d) 使用結腸鏡和/或手術和/或給予藥物，治療步驟(c)判斷之患者，該患者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性。
本發明進一步實施態樣提供一種治療人類或動物結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括 (a) 測試患者糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量血液、血清、或血漿中無細胞核小體和/或無細胞核小體之表觀遺傳特徵； (c) 藉由步驟(b)之結果判斷具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之標記之可能性；以及 (d) 使用結腸鏡和/或手術和/或給予藥物，治療步驟(c)判斷之患者，該患者具有結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性。
本發明進一步實施態樣係提供一種治療結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括向患者使用結腸鏡和/或手術和/或給予藥物：(i) 在糞便樣本中糞便潛血檢測為陽性；以及(ii) 藉由不同或相似之一或部分之核小體、無細胞核小體表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、或缺氧誘發因子之數量，比較其控制組數量差異。
本發明進一步實施態樣係提供一種治療結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之方法，包括使用結腸鏡檢查和/或手術和/或給予藥物治療患者：(i)在糞便樣本中糞便潛血檢測為陽性；以及(ii) 藉由不同或相似之核小體和/或無細胞核小體表觀遺傳特徵之數量，比較其控制組數量差異。
於一實施例，該控制組為健康/無疾病個體。故，於此實施例，習知技術者可知，在樣本中不同數量之核小體本身和/或無細胞核小體之表觀遺傳特徵可用於判斷患者是否具有結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之高可能性而需進一步治療。於一替代實施例，該控制組為診斷出CRC(即，確診具有CRC之患者)、結腸直腸腺瘤或息肉者。於此實施例，習知技術者可知，在樣本中不同數量之核小體本身和/或無細胞核小體之表觀遺傳特徵可用於判斷患者是否具有結腸直腸癌(CRC)、結腸直腸腺瘤或息肉之低可能性而無需進一步治療。
治療結腸直腸癌之方法有多種，例如針對患者使用結腸鏡檢查和/或手術和/或給予治療藥物。直腸癌之手術治療可包括腹腔鏡(laparoscopic)術或結腸造口術(colostomy)。治療亦可包括放射治療，例如體外放射治療(external beam radiotherapy)或手術中(intraoperative)放射治療(即，於手術中進行)。於一實施例，該治療藥物可包括化學治療，例如選自卡培他濱(Capecitabine或Xeloda)、5-氟尿嘧啶(5-FU或Adrucil)、愛萊諾迪肯(Irinotecan或Camptosar)、奧沙利鉑(Oxaliplatin或Eloxatin)、貝伐珠單抗(Bevacizumab或Avastin)、西妥昔單抗(Cetuximab或Erbitux)、帕尼單抗(Panitumumab或Vectibix)、雷莫司單抗(Ramucirumab或Cyramza)、瑞戈非尼(Regorafenib或Stivarga)、Ziv-阿柏西普(Zaltrap)或其組合(例如Xelox係Oxaliplatin和Capecitabine之組合)。亦可使用標靶治療，例如抗血管新生治療或表皮生長因子(EGFR)抑制劑。
本說明書揭示診斷或監測疾病存在之診斷套組。故，本發明進一步實施態樣係提供一種診斷結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之套組，包括： (a) 糞便潛血試驗(FOBT)和/或糞便免疫化學試驗(FIT)；以及 (b) 專一結合一或多部分選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、或缺氧誘發因子之一配體或結合劑。
本發明進一步實施態樣係提供一種診斷結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤或息肉之套組，包括： (a) 糞便潛血試驗(FOBT)和/或糞便免疫化學試驗(FIT)；以及 (b) 專一結合無細胞核小體之表觀遺傳特徵和/或無細胞核小體本身之一配體或結合劑。
本發明適當之套組可包括一或多組成物，係選自配體結合劑或配體可專一結合至無細胞核小體之表觀遺傳特徵和/或無細胞核小體本身或其模擬結構/形狀、一或多控制組、一或多反應物、和一或多消耗品構成之群組；選擇性地，組合依據本說明書所述之方法使用該套組。
習知技術者可知，本說明書之實施例可應用於本發明之全部實施態樣。此外，本說明書引用之任何文件，包括但不限於專利和專利申請，均提供於引用文獻。
本發明茲配合以下實施例說明，但非為限制。
實施例1
1907名具有FIT陽性並進行結腸鏡檢查之受試者，於其同意後提供血液樣本，並且用於匿名患者資料。結腸鏡檢查之前，抽取血液樣本並使用多種試驗分析無細胞核小體，包括分析核小體本身、及包括5-甲基胞嘧啶修飾之DNA之表關遺傳特徵之核小體、組織蛋白變異體H2AZ和mH2A1.1、組織蛋白修飾pH2AX、H2AK119Ub、H3K36Me3、H4K20Me3、H4PanAc、和H3S10Ph、和核小體加合物如核小體-HMGB1和核小體-EZH2。
該些核小體試驗均可用於本發明之方法。包括5種核小體試驗(5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3、和核小體-HMGB1加合物)之套組，組合個人FIT量化結果和年齡，用於判斷是否具CRC，並且比較於結腸鏡檢查無發現之受試者，其ROC曲線結果揭示於圖1。ROC曲線顯示，若特異性為25%，則該試驗套組之敏感性為100%(118名受試者中，118名診斷出具CRC並且正確地辨認為需要結腸鏡檢查)。前述結果表示，該25%受試者無須結腸鏡檢查，並且若無進一步篩檢並不會錯失任何CRC案例。故，該25%受試者代表1907名FIT陽性者中低CRC風險次群，並且可於進行結腸鏡檢查前辨認。此外，特異性可增加至33%，同時維持敏感性為97.4%(118名受試者中，115名診斷出具CRC並且正確地辨認為需要結腸鏡檢查)。故，轉診結腸鏡檢查可降低約四分之一，且無錯失任何CRC案例；或降低約三分之一，但錯失約2.6%。相較於前述結果，若增加FIT/FOBT試驗臨界值，錯失CRC案例高達10%。
實施例2
1907名具有FIT陽性並進行結腸鏡檢查之受試者，於其同意後提供血液樣本，並且用於匿名患者資料。各受試者之糞便血紅素(Hb)數量(µg Hb / g 糞便)以及患者年齡，用於線性表達式：
0.0129 × FIT 結果(µg Hb/g 糞便) + 0.0688 × 年齡(歲)
若該表達式輸出值大於4.8，則該患者具有CRC高風險，並且需結腸鏡檢查。相對地，若該表達式輸出值小於4.8，則該患者具有CRC低風險，並且無需結腸鏡檢查。
針對118名偵測出CRC者，使用本發明之方法，正確地判斷114名受試者需結腸鏡檢查。相似地，252名高風險腺瘤者(88.1%)中，正確地判斷其中222名需結腸鏡檢查。ROC曲線顯示，若特異性為25%，則本方法之敏感性高於95%，代表該些受試者無進一步篩檢，僅會錯失小於5%CRC案例。故，該些25%受試者代表1907名FIT陽性者中具有CRC低風險之次群，並且可於進行結腸鏡檢查前辨認。相較於前述結果，若增加FIT/FOBT試驗臨界值，錯失CRC案例高達10%。
實施例3
599名具有FIT陽性並進行結腸鏡檢查之受試者，於其同意後提供血液樣本，並且用於匿名患者資料。結腸鏡檢查之前，抽取血液樣本並分析其鐵蛋白和CEA。前述結果，結合患者年齡和FIT量化結果，用於線性表達式：
0.51 × 年齡 (歲) + 0.17 × CEA (ng/ml) – 17.85 × (5×FIT)-0.1 (µg 血紅素/g 糞便) - 0.17 × 鐵蛋白(ng/ml)
藉由該表達式可降低25%結腸鏡轉診。若該表達式輸出值大於-8.6，則該患者具有CRC高風險且需結腸鏡檢查。相對地，若該表達式輸出值小於-8.6，則該患者具有CRC低風險且需無結腸鏡檢查。針對118名偵測出CRC者中，使用本發明之方法，正確地判斷116名受試者需結腸鏡僅查，顯示可避免該25%需結腸鏡檢查者，同時錯失低於2%之癌症案例。相似地，87名具有腺瘤高風險者中，79名正確地判斷需結腸鏡檢查，顯示錯失9%之具有腺瘤高風險之受試者。
習知技術者可知，本說明書所述之表達式特定用於降低結腸鏡轉診數量。該些表達式可因其他用途修正，但所有表達式均於本案中實施。
引用文獻 Allen et al. (2004) Nucleic Acids Research: 32(3) e38 Esteller, (2007) Nature Reviews Genetics: 8, 286-298 Feinberg and Vogelstein, (1983) Nature: 301, 89–92, 1983 Grutzmann et al. (2008) PLoS ONE 3(11): e3759 Hervouet et al. (2010) PLoS ONE 5(6): e11333 Herranz and Esteller, (2007) Methods Mol. Biol.: 361, 25-62 Holdenrieder et al. (2001) Int. J. Cancer (Pred. Oncol.): 95, 114–120 The Medical Letter on Drugs and Therapeutics (2014) 56, 100-101 Rodriguez-Paredes and Esteller, (2011) Nature Medicine: 17(3), 330-339 Salgame et al. (1997) Nucleic Acids Research: 25(3), 680-681 van Nieuwenhuijze et al. (2003) Ann. Rheum. Dis.: 62: 10–14
圖1 1907名FIT陽性受試者之接收者操作曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)，顯示CRC偵測套組之敏感性和特異性，包括使用量化FIT結果以及ELISA試驗偵測核小體上5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3、以及核小體-HMGB1加合物之表觀遺傳特徵，以及受試者年齡。

Claims (5)

  1. 一種偵測和/或篩檢患者之結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之方法，包括： (a) 辨認糞便潛血陽性之患者；以及 (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中一或多部分；其中，該部分係選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、以及缺氧誘發因子所構成之群組； 其中，步驟(b)所得之結果係用於判斷患者罹患結腸直腸癌、結腸直腸腺瘤、或息肉之可能性。
  2. 一種評估患者結腸鏡檢查之適當性之方法，包括： (a) 測試患者糞便樣本中糞便潛血； (b) 偵測或測量患者血液、血清、或血漿樣本中一或多部分；其中，該部分係選自無細胞核小體、無細胞核小體之表觀遺傳特徵、癌胚抗原、鐵代謝生物標記、以及缺氧誘發因子所構成之群組；以及 (c) 使用步驟(b)所得之結果判斷患者結腸鏡檢查之適當性。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，另包括於步驟(b)中使用糞便潛血之數據做為參數。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一所述之方法，另包括於步驟(b)中使用臨床參數。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該臨床參數係選自年齡、性別、和身體質量指數(BMI)。
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