WO2016111507A1 - 신규 간암 환자의 소라페닙 저항성 예측 마커 - Google Patents

신규 간암 환자의 소라페닙 저항성 예측 마커 Download PDF

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WO2016111507A1
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sorafenib
edn1
predicting
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PCT/KR2016/000006
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윤정환
유수종
조광현
원재경
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서울대학교 산학협력단
한국과학기술원
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to new biomarkers, and more particularly to sorafenib resistance predictive markers in new liver cancer patients.
  • Resistance to anticancer drugs can be divided into two categories, 'de novo' and 'acquired'.
  • Resistance acquired in oncology refers to the acquisition of a resistant phenotype, which refers to the progression of a tumor that has previously responded to treatment, a phenomenon largely due to continuous genetic changes.
  • New resistance means immediate resistance to initial treatment, either through existing mutations (intrinsic) or the interaction between cancer cells and the microenvironment (external).
  • Sorafenib has recently been developed as a target inhibitor for hepatocellular carcinoma and has been uniquely approved in phase III randomized controlled trials.
  • Sorafenib is a multiple kinase inhibitor that targets BRAF, VEGFR2, PDGFR, FLT3, RET, and c-KIT, and has a medial survival period of about 3 months compared to the control group in Western SHARP clinical trials.
  • Extended In addition, Asian patients also extended their median survival by 2.3 months compared to controls.
  • survival benefits are not sufficient considering that high prices and the effects depend on individual differences. Therefore, investigating the mechanism of resistance to sorafenib, identifying biomarkers that can predict their reactivity and developing therapeutic strategies to improve the effect of sorafenib is of great clinical importance.
  • the present invention is to solve various problems including the above problems, the present invention is to provide a biomarker that can accurately and effectively predict the sorafenib reactivity of cancer patients, especially hepatocellular carcinoma patients.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a kit for predicting sorafenib reactivity of cancer patients containing a probe molecule capable of detecting the level of the EDN1 protein or mRNA encoding the EDN1 protein in the sample as an active ingredient.
  • an information providing method for predicting sorafenib reactivity of cancer patients comprising measuring the level of EDN1 protein or mRNA encoding the same from a sample obtained from a cancer patient.
  • a method for predicting sorafenib responsiveness in a liver cancer patient comprising measuring the level of EDN1 protein or mRNA encoding it from a sample obtained from a liver cancer patient.
  • a method for predicting the prognosis of a liver cancer patient comprising measuring the level of EDN1 protein or mRNA encoding the same from a sample obtained from a liver cancer patient.
  • Sorafenib responsiveness kit of cancer patients of the present invention showed statistically very high correlation with the sorafenib reactivity of the patient when applied to biopsy and serum samples obtained from patients with hepatocellular carcinoma, sorafenib reactivity It can be useful to predict very accurately.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • FIG. 1 is a graph showing the difference in expression of EDN1 between a resistance group (A) and a sensitive group (B) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph (A) and table (B, C) showing the difference in mRNA expression of EDN1 between the resistance group and the sensitive group according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a comparison of EDN1 levels between reaction and non-response groups.
  • FIG. 3A is a series of EDN1-immunohistochemical staining results for representative samples of reaction (top) and non-response (bottom) groups.
  • 3B is an agarose gel electrophoresis picture showing RT-PCR results for EDN1 mRNA for the same sample as in FIG. 3A, and
  • FIG. 3C is between all reaction and non-reaction groups in the assay set experiment. This is a graph comparing the results of immunohistochemistry analysis for EDN1.
  • A disease progression time
  • B overall survival rate
  • FIG. 5 is a result of analyzing the level and clinical response of EDN1 in the serum samples of patients
  • Figure 5A is a graph comparing the serum level of EDN1 between the non-PD group and PD group
  • Figure 5B is a serum sample
  • a receiver operating characteristic (ROC) curve for the EDN1 level of is shown
  • Figure 5C is a graph showing the analysis results for the overall survival rate.
  • ROC receiver operating characteristic
  • Fab is a fragment of the antigen-binding antibody-binding (fragment antigen-binding) fragments generated by cleaving the antibody molecule with papain, a protease, two of V H -C H1 and V L -C L As dimers of peptides, other fragments produced by papain are referred to as fragment crystalisable (FC).
  • F (ab ′) 2 refers to a fragment containing an antigen binding site among fragments generated by cleaving an antibody with pepsin, a protease, and forms a tetramer in which two Fabs are linked by disulfide bonds. Indicates. Another fragment produced by pepsin is called pFc '.
  • Fab ' is an antibody fragment having a similar structure to the Fab, produced by reducing the F (ab') 2 , with a slightly longer length of the heavy chain portion than the Fab.
  • scFv refers to a recombinant chain fragment that is prepared as a single chain fragment variable in a single chain using variable linkers (V H and V L ) in the Fab of the antibody. do.
  • sdAb single doamain antibody
  • sdAb single doamain antibody
  • aptamer refers to an oligonucleotide or peptidic molecule that specifically binds to a target molecule. Aptamers are discovered by selecting sequences that specifically bind to specific target molecules from a random sequence pool. This process is called SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).
  • kits for predicting sorafenib reactivity of liver cancer patients containing a probe molecule capable of detecting the level of the EDN1 protein or mRNA encoding the EDN1 protein in the sample as an active ingredient.
  • the liver cancer may be hepatocellular carcinoma
  • the sample may be biopsy tissue, blood, plasma or serum.
  • the probe molecule is an antibody that specifically binds to the EDN1 protein, a functional fragment of the antibody, an aptamer, a variable lymphocyte receptor (VLR), or the mRNA May be a primer pair or probe capable of specifically detecting.
  • VLR variable lymphocyte receptor
  • the functional fragment of the antibody may be a Fab, F (ab ') 2 , Fab', single chain fragment variable (scFv), or single-domain antibody (sdAb) derived from an antibody that specifically binds to EDN1.
  • the variable lymphocyte receptor may be isolated from the vulgaris.
  • an information providing method for predicting sorafenib responsiveness of liver cancer patients comprising measuring the level of EDN1 protein or mRNA encoding the same from a sample obtained from a liver cancer patient.
  • the sample may be biopsy tissue, blood, plasma or serum.
  • the information providing method may further include determining that the liver cancer patient is resistant to sorafenib when the level of the EDN1 protein or the mRNA is significantly higher than the normal level.
  • a method for predicting sorafenib responsiveness of a liver cancer patient comprising measuring the level of EDN1 protein or mRNA encoding it from a sample obtained from a liver cancer patient.
  • the sample may be biopsy tissue, blood, plasma or serum
  • the liver cancer may be hepatocellular carcinoma.
  • the limit value may be 1.178 pg / mL, and the liver cancer may be hepatocellular carcinoma.
  • the liver cancer may be hepatocellular carcinoma, and the limit value may be 1.178 pg / mL.
  • a method for predicting the prognosis of a liver cancer patient comprising measuring the level of EDN1 protein or mRNA encoding the same from a sample obtained from a liver cancer patient.
  • the method for predicting the prognosis of the liver cancer patient may further include predicting that the prognosis of the liver cancer patient is not good when the level of the EDN1 protein or the mRNA is significantly higher than the normal level.
  • the liver cancer may be hepatocellular carcinoma
  • the sample may be biopsy tissue, blood, plasma or serum.
  • the inventors used CCLE (Cancer Cell Line Encyclopeida) having the reactivity data for the anticancer agent and the genomic information of the cell line.
  • CCLE Cancer Cell Line Encyclopeida
  • the inventors screened the reactivity of the 491 cell line therefrom, and selected 11 cell lines that exhibited a sensitive response with 355 cancer cell lines that are resistant to sorafenib (FIG. 1).
  • Analysis of transcripts between these two groups confirmed that EDN1 (endothelin 1) was significantly upregulated in the resistant group (Table 1). It also showed a difference in expression of EDN1 between the resistant and sensitive groups.
  • EDN1 (endothelin 1) analysis of transcripts of resistant groups Genes Raw p-value Adjusted p-value EDN1 1.00e-04 0.008 C1orf133 1.00e-04 0.064 CLIC3 4.00e-04 0.0651 PLCE1 1.00e-04 0.0773 LOC73075 1.00e-04 0.0834 L1CAM 3.00e-04 0.207 CDH3 5.00e-04 0.2361 ZCCHC3 1.00e-04 0.3473 LOXL4 3.00e-04 0.3716 MIR205HG 0.013 0.4215
  • the degree of expression of EDN1 expression in both groups was quantitatively analyzed (FIG. 2).
  • the usefulness of EDN1 in the identification was confirmed.
  • the expression of mRNA of EDN1 was significantly higher in the resistance group (Wilcoxon rank sum test p-value 0.00003). If the expression level of EDN1 was 5.5 or higher EDN1-high expression group, all cases were classified as resistance group.
  • the expression level of EDN1 represents the relative expression level when the average expression level of EDN1 in all cell lines is set to 1.0. As a result, when the expression level of EDN1 is set at 5.5, the predictive power of this criterion for the resistance group shows 70.1% sensitivity and 100% specificity, suggesting that it can be a useful biomarker.
  • Example 2 In order to investigate whether the actual EDN1 can be used as a predictive marker of sorafenib reactivity from the results of Example 1 of the present invention, a immunohistologic study using biopsy tissue of 20 hepatocellular carcinoma patients as a test set first Analysis was performed (Table 2). The 20 hepatocellular carcinoma patients were diagnosed with hepatocellular carcinoma at Seoul National University Hospital from 2013 to 2014. Hepatocellular carcinoma is the American Association for the Study of Liver Disease or the European Association for The study of the Liver was diagnosed by other histology or radiologic evaluations in Guideraen. All pathological samples of primary hepatocellular carcinoma were obtained by prior surgical resection before sorafenib treatment.
  • anti-EDN1 antibody polyclonal, 1: 100, Proteintech, USA
  • VOC Ventana Optiview system
  • the stained slides were scanned with Aperio SacnScope CS2 (Leica Biosystems, Germany) to generate image files for each region of interest (core).
  • the generated image file was analyzed using Aperio ImageScope's positive pixel counting algorithm, and the immunohistochemistry (IHC) value of EDN1 was calculated as follows:
  • N wp number of weak positive pixels
  • N p number of positive pixels
  • N sp number of strong positive pixels
  • N total Total number of pixels.
  • the signal strength is derived by correcting the ratio of strong positive pixels among positive pixels with respect to the ratio of positive pixels. Therefore, the maximum value of signal strength is 2.0.
  • sorafenib was administered twice daily at a 400 mg dose, and if drug-related side effects were observed, dose reduction such as discontinuation or first day of 400 mg, and 400 mg doses every two days Allowed. Treatment continued until radiological progression appeared, as defined by the Modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (mRECIST). Treatment response to sorafenib was determined according to the criteria of mRECIST, assessed at 6-8 week intervals by enhanced comtuted tomography or magnetic resonance imaging.
  • baseline sum is defined as a reduction of at least 30% or more in the sum of the longest diameters of the underlying visible target disease sites
  • progressive disease (PD) is the smallest sum of the diameters of the targeted target disease sites recorded since initiation of treatment. At least 20% increase in the sum of the diameters of the visible target disease
  • SD stable disease condition is defined as a partial response (PR) or Which state of the two planet disease state (PD) has been determined in some cases not.
  • the present inventors confirmed the immunohistochemistry of 74 patients from different populations in order to confirm whether prediction of sorafenib reactivity in hepatocellular carcinoma patients is possible using the expression level of EDN1 from the experimental results of Example 2.
  • the analysis was performed.
  • the method used for analysis was the same as in Example 2 above.
  • the 74 hepatocellular carcinoma patients were diagnosed as hepatocellular carcinoma at Seoul National University Hospital from 2007 to 2012.
  • the set analysis revealed age, sex, pathogenesis of chronic liver disease, child-pugh score, AFP, tumor size, number of tumors, coronary infiltration, or Edmonson between responders and non-responders. There were no significant differences in any clinical parameters such as Edmonson grade.
  • the present inventors performed a survival evaluation of the subjects analyzed in Examples 2 and 3 in order to determine the correlation between EDN1 expression and sorafenib reactivity, and the correlation between EDN1 expression and the prognosis of hepatocellular carcinoma. .
  • TTP The median time to progression
  • Sorafenib administration period was 12.1 ⁇ 6.3 months in the low-EDN1 expression group and 9.5 ⁇ 11.5 months in the high-EDN1 expression group.
  • OS overall survival
  • TTP time to progression
  • the present inventors quantified the EDN1 protein by ELISA analysis in serum samples of hepatocellular carcinoma patients to determine whether sorafenib reactivity can be predicted by quantitative analysis of protein in serum samples instead of biopsy tissue of hepatocellular carcinoma patients.
  • serum samples were obtained before sorafenib treatment and serum EDN1 levels were measured according to the manufacturer's instructions using a commercially available ELISA kit (Botrak-Amersham, USA).
  • EDN1 may be a useful serological biomarker for predicting sorafenib reactivity.
  • Kits and methods according to one embodiment of the present invention can be very useful in predicting the sorafenib reactivity and prognosis of hepatocellular carcinoma patients, as well as in the planning of clinical treatment of hepatocellular carcinoma patients.

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Abstract

본 발명은 새로운 바이오 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 시료 내의 EDN1 단백질 또는 상기 EDN1 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있는 탐침분자를 유효성분으로 함유하는 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트에 관한 것이다.

Description

신규 간암 환자의 소라페닙 저항성 예측 마커
본 발명은 새로운 바이오 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 새로운 간암 환자의 소라페닙 저항성 예측 마커에 관한 것이다.
특정 신호전달 분자를 차단하는 몇몇 표적 저해제는 특정 종류의 종양의 치료에 효과적인 것으로 확인된 이래 주목받고 있으며, 개별 맞춤형 암치료 시대를 열고 있다. 그러나, 새로 개발된 저해제를 포함하는 표적 저해제들은 약물 저항성에 기인하여 덜 효과적인 경우가 많다. 항암제에 대한 저항성은 '새로운(de novo)' 및 '획득(acquired)'의 두 가지 카테고리로 나뉠 수 있다. 종양학에서 획득된 저항성은 저항성 표현형의 취득을 지칭하는데 이는 치료에 대하여 종전에 반응하던 종양의 진행을 의미하는데 이는 크게 연속적인 유전학적 변화에 기인하는 현상이다. 새로운 저항성은 기존의 돌연변이(내재적) 또는 암세포와 미세환경 사이의 상호작용(외재적)을 통해 최초 치료에 대한 즉각적인 저항성을 의미한다. 시스템적인 관점으로부터 복잡한 생물학적 네트워크에 대한 이해의 최근 진전에 따라 우회 또는 잉여 경로의 활성화가 새로운 저항성에 있어서 중요한 인자임이 밝혀지고 있다.
최근 소라페닙(sorafenib)이 간세포암에 대한 표적 저해제로 개발되었고 III상 무작위 대조 임상시험을 통해 유일하게 승인을 받았다. 소라페닙은 BRAF, VEGFR2, PDGFR, FLT3, RET 및 c-KIT를 표적으로 하는 다중 인산화효소 저해제로서 서양인을 대상으로 한 SHARP 임상에서 대조군과 비교하여 약 3개월 정도 중간 생존기간(medial survival period)이 연장되었다. 아울러, 동양인 환자의 경우도 대조군과 비교하여 2.3 개월 정도 중간 생존기간을 연장시켰다. 그러나, 시험관 내 실험에서 암세포의 증식 및 신생혈관생성을 저해하는 명백한 효과를 보였음에도 불구하고, 생존 상의 이익은 높은 가격과 그 효과가 개인의 차이에 따라 다르다는 점을 고려하면 충분하지 않다. 따라서, 소라페닙에 대한 저항성의 기전을 조사하고, 이의 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커를 발굴하고 소라페닙의 효과를 향상시킬 수 있는 치료전략을 개발하는 것은 임상적으로 매우 중요한 일이다.
선행문헌을 살펴보면, 미국 공개특허 제2012/0004129호에 암환자의 약물 반응성에 대한 EDN1의 마커로서의 용도가 개시되어 있다. 암환자의 약물 반응성에 대한 EDN1의 마커로서의 용도가 개시되어 있다는 점이 유사하나 현재까지 간암 환자의 소라페닙 저항성 예측 마커는 개발되지 않고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 정확하고 효과적으로 암환자 특히 간세포암 환자의 소라페닙 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 시료 내의 EDN1 단백질 또는 상기 EDN1 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있는 탐침분자를 유효성분으로 함유하는 암환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트가 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 암환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암환자의 소라페닙 반응성 예측을 위한 정보제공 방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 다르면 간암 환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측 방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 EDN1 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 EDN1의 수준이 제한값 이상이면 소라페닙에 대한 반응성이 없을 것으로 판정하고 제한값 미만이면 소라페닙에 대한 반응성이 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 EDN1 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 EDN1의 수준이 제한값 이상이면 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 간암 환자의 예후 예측방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 환자의 예후 예측방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 암환자 특히 간세포암 환자의 소라페닙 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커를 제공하며, 아울러 바이오마커를 이용한 소라페닙 반응성 예측 진단키트를 제공할 수 있게 된다. 본 발명의 암환자의 소라페닙 반응성 예측키트는 간세포암 환자로부터 수득된 생검시료(biopsy) 및 혈청시료에 대하여 적용한 결과 해당 환자의 소라페닙 반응성과 통계학적으로 매우 높은 상관관계를 나타내어, 소라페닙 반응성을 매우 정확하게 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 저항성 그룹(A)과 민감성 그룹(B) 사이에서 EDN1의 발현의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 저항성그룹과 민감성그룹 사이에서 EDN1의 mRNA 발현의 차이를 나타낸 그래프(A) 및 표(B, C)이다.
도 3은 반응 그룹 및 비-반응 그룹 사이의 EDN1 수준을 비교한 것으로서, 도 3A는 반응 그룹(상단) 및 비-반응 그룹(하단)의 대표적인 시료에 대한 EDN1-면역조직화학 염색 결과를 나타내는 일련의 사진이고, 도 3B는 상기 도 3A와 동일 시료에 대한 EDN1 mRNA에 대한 RT-PCR 결과를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이며, 도 3C는 확인세트 실험에서의 모든 반응 그룹 및 비-반응 그룹 사이에서의 EDN1에 대한 면역조직화학 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 4는 EDN1 반현 수준에 따른 생존 분석결과로서 고-EDN 발현 그룹 및 저-EDN1 발현 그룹 사이의 질병 진행시간(A) 및 전체 생존율(B)을 비교한 그래프이다.
도 5는 환자의 혈청시료에서의 EDN1의 수준 및 임상적 반응을 분석한 결과로서, 도 5A는 비-PD 그룹 및 PD 그룹 사이의 EDN1의 혈청 수준을 비교한 그래프이고, 도 5B는 혈청 시료에서의 EDN1 수준에 대한 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic, ROC) 커브이며, 도 5C는 전체 생존율에 대한 분석결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
이하 본 문서에서 사용되는 용어를 정의한다:
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystalisable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원 결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 Fab와 유사한 구소를 갖는 항체단편으로서 상기 F(ab')2를 환원시켜 생성되며, Fab에 비해 중쇄 부분의 길이가 약간 더 길다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable)로서 항체의 Fab 중 가변영역(VH 및 VL)을 링커를 이용하여 단일쇄로 제조한 재조합 항체 단편을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single doamain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "앱타머(aptamer)"는 표적 분자(target molecμle)에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩타이 분자를 의미한다. 앱타머는 무작위 서열 풀로부터 특정 표적분자에 특이적으로 결합되는 서열을 선별하는 과정을 통해 발굴된다. 상기와 같은 과정을 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 지칭한다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 시료 내의 EDN1 단백질 또는 상기 EDN1 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있는 탐침분자를 유효성분으로 함유하는 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트가 제공된다.
상기 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트에 있어서, 상기 간암은 간암세포암일 수 있고, 상기 시료는 생검조직, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.
상기 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트에 있어서, 상기 탐침분자는 EDN1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 앱타머, 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR), 또는 상기 mRNA를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머쌍 또는 프루브일 수 있다.
상기 항체의 기능성 단편은 EDN1에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래한 Fab, F(ab')2, Fab', scFv(single chain fragment variable), 또는 단일-도메인 항체(single-domain antibody, sdAb)일 수 있고, 상기 가변 림프구 수용체는 무악류로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측을 위한 정보제공 방법이 제공된다.
상기 정보제공 방법에 있어서, 상기 시료는 생검조직, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.
아울러, 상기 정보제공 방법에 있어서, 상기 EDN1 단백질 또는 상기 mRNA의 수준이 정상 수준과 비교하여 유의하게 높을 경우 해당 간암 환자가 소라페닙에 대한 저항성이 있는 것으로 판정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측 방법이 제공된다.
상기 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측방법에 있어서, 상기 시료는 생검조직, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있고, 상기 간암은 간세포암일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 EDN1 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 EDN1의 수준이 제한값 이상이면 소라페닙에 대한 반응성이 없을 것으로 판정하고 제한값 미만이면 소라페닙에 대한 반응성이 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측방법이 제공된다.
상기 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측방법에 있어서, 상기 제한값은 1.178 pg/mL일 수 있고, 상기 간암은 간세포암일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 EDN1 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 EDN1의 수준이 제한값 이상이면 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 간암 환자의 예후 예측방법이 제공된다.
상기 간암 환자의 예후 예측방법에 있어서, 상기 간암은 간세포암일 수 있고, 상기 제한값은 1.178 pg/mL일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 간암 환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 환자의 예후 예측방법이 제공된다.
상기 간암 환자의 예후 예측방법은 상기 EDN1 단백질 또는 상기 mRNA의 수준이 정상 수준과 비교하여 유의하게 높을 경우, 해당 간암 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 간암 환자의 예후 예측 방법에 있어서, 상기 간암은 간세포암일 수 있고, 상기 시료는 생검조직, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
실시예 1: 소라페닙 예측용 바이오마커
본 발명에서 소라페닙에 대한 감수성을 예측할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해, 본 발명자들은 항암제에 대한 반응성 데이터 및 세포주의 게놈 정보를 보유하고 있는 CCLE(Cancer Cell Line Encyclopeida)를 이용하였다. 본 발명자들은 그로부터 491 세포주의 반응성을 스크리닝한 결과, 소라페닙에 대하여 저항성을 보이는 355 암세포주와 민감한 반응을 나타내는 11개 세포주를 선별하였다(도 1). 이들 두 그룹 사이의 전사체에 대한 분석 결과 EDN1(endothelin 1)이 저항성 그룹에서 유의하게 상향조절 되었음을 확인하였다(표 1). 또한 저항성 그룹과 민감성 그룹 사이에서 EDN1의 발현의 차이를 나타냈다.
EDN1(endothelin 1)이 저항성 그룹의 전사체에 대한 분석 결과
Genes Raw p-value Adjusted p-value
EDN1 1.00e-04 0.008
C1orf133 1.00e-04 0.064
CLIC3 4.00e-04 0.0651
PLCE1 1.00e-04 0.0773
LOC73075 1.00e-04 0.0834
L1CAM 3.00e-04 0.207
CDH3 5.00e-04 0.2361
ZCCHC3 1.00e-04 0.3473
LOXL4 3.00e-04 0.3716
MIR205HG 0.013 0.4215
본 발명에서 실제 EDN1이 소라페닙 저항성 그룹과 민감성 그룹 사이를 구분할 수 있는지 확인하기 위해, 양 그룹의 EDN1 발현 정도를 정량 분석하였으며(도 2), 그 결과 EDN1의 발현 차이와 소라페닙에 대한 감수성을 규명하는데 있어서의 EDN1의 유용성을 확인하였다. 도 2에 나타난 바와 같이 EDN1의 mRNA의 발현은 저항성 그룹에서 현저하게 높았다(Wilcoxon rank sum test p-value 0.00003). EDN1의 발현 정도가 5.5 이상의 EDN1-고발현 그룹이면, 모든 경우는 저항성 그룹으로 분류되었다. 상기 EDN1의 발현 정도는 전체 세포주에서의 평균 EDN1 발현 정도를 1.0로 정하였을 때에 대한 상대적인 발현정도를 나타낸 것이다. 분석결과, EDN1의 발현정도를 5.5를 기준으로 정할 경우, 저항성 그룹에 대한 이 기준의 예측력은 70.1% 민감도 및 100% 특이도를 보여주며 유용한 바이오마커가 될 수 있음을 시사한다.
실시예 2: 임상 시료에한 시험세트 면역조직화학 분석
본 발명의 상기 실시예 1의 결과로부터 실제 EDN1이 소라페닙 반응성의 예측마커로 활용될 수 있는지 조사하기 위해, 시험세트(test set)으로 우선 20명의 간세포암 환자의 생검조직을 이용하여 면역조직학적 분석을 수행하였다(표 2). 상기 20명의 간세포암 환자는 2013년부터 2014년까지 서울대학교 병원에서 간세포암으로 진단을 받은 환자로, 간세포암은 미국간학회(American Association for the Study of Liver Disease) 또는 유럽간학회(European Association for the Study of the Liver) 가이드라엔에 다른 조직학 또는 방사선 평가에 의해 진단되었다. 원발성 간세포암의 모든 병리학적 시료는 소라페닙 처리 이전 사전 외과적 절제에 의해 수득되었다.
구체적으로, 항-EDN1 항체(다클론, 1:100, Proteintech, USA)를 면역염색을 위해 사용하였고 면역조직학 분석은 Ventana Optiview system(Roche Diagnostics, Germany)를 이용하여 수행하였다. 염색된 슬라이드는 Aperio SacnScope CS2(Leica Biosystems, Germany)로 스캐닝하여 각각의 관심영역(코어)에 대한 화상 파일을 생성하였다. 생성된 화상 파일은 Aperio ImageScope의 양성 픽셀 계수 알고리즘을 이용하여 분석하였으며, EDN1의 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 값은 하기와 같이 계산되었다:
신호 강도 = (Nwp + Np + Nsp)/Ntotal + Nsp/(Nwp + Np + Nsp).
Nwp: 약한 양성 픽셀의 수;
Np: 양성 픽셀의 수;
Nsp: 강한 양성 픽셀의 수;
Ntotal: 전체 픽셀의 수.
즉 상기 신호강도는 양성 픽셀의 비율에 대하여 양성 픽셀 중 강한 양성 픽셀의 비율을 보정하여 도출된 것이다. 따라서, 신호강도의 최대값은 2.0이다.
각각의 경우에 대하여, 둘 또는 그 이상의 관심영역을 조사하였고 각 케이스에 대하여 가장 높은 값을 대표값으로 정하였다.
그 결과 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 20명의 환자 중, 완전반응(complete response, CR) 및 부분반응(partial response, PR)는 각각 2건(2/20, 10.0%) 및 0건(0/20, 0%)이었고 안전병변(stable disease, SD)는 7건(7/20, 35.0%)으로 나타나 전반적인 질병통제(disease control, CR + PR + SD, non-PD) 상태인 경우가 9건(9/20, 45.0%)으로 나타났고, 진행성 질환(progressive disease, PD) 상태가 11건(11/20, 55.0%)인 것으로 나타났다. 그런데 EDN1의 발현수준을 분석한 결과, EDN1의 발현수준이 0.85 이하인 그룹에서는 질병통제 상태(non-PD)인 경우가 8건이었고, 진행성 질병 상태가 1건이었으며, EDN1 발현수준이 0.85 초과인 그룹에는 질병통제 상태인 경우가 1건이었고 진행성 질환 상태가 10건으로 나타나, EDN1 저발현군의 소라페님 반응율은 89.0%에 이르렀고, EDN1 고발현군의 소라페닙 반응율은 9%에 불과했다.
소라페닙 반응성과 관련하여 소라페닙은 400 mg 투여량으로 하루 두 번 투여하였고, 약물-관련 부작용이 나타난 경우에는 복용중단이나 첫날은 400 mg 투여, 그리고 이틀 간격으로 400 mg 투여와 같은 투여량 감소를 허용하였다. 치료는고형암에서의 변형 반응성 평가 기준(modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors(mRECIST)에 의해 규정된 바와 같이, 방사선상의 진행(radiological progression)이 나타날 때까지 계속되었다. 조영-증강 컴퓨터 단층촬영(contrast-enhanced comtuted tomography) 또는 자기공명영상에 의해 6-8주 간격으로 평가하여, 소라페닙에 대한 치료반응성을 상기 mRECIST의 기준에 따라 결정하였다. 부분방응(PR)은 표적 질환부위의 직경의 기준치 합(baseline sum)을 기준으로 할 때, 기저가시적 표적질환부위의 최장 직경의 합에서 적어도 30% 이상의 감소로 정의되었고, 진행성 질병(PD)은 치료개시 이후 기록된 기시적 표적 질환 부위 직경의 가장 작은 합을 기준으로 할 때 가시적 표적 질환 직경의 합에서 적어도 20% 이상의 증가로 정의되었으며, 안정적 질병(SD) 상태는 부분반응(PR) 또는 진행성 질환 상태(PD) 둘 중 어느 상태도 아닌 경우로 판정되었다.
시험세트 분석에서의 소라페닙 반응성 및 EDN1 발현수준과의 상관관계
EDN1 발현수준 시료수
EDN1 ≤ 0.85 EDN1 > 0.85
임상적 반응 non-PD 8 1 9
PD 1 10 11
반응율 89.0% 9% 20
p-value 0.001 (Fisher's exact test)
실시예 3: 임상 시료에 대한 확인세트 분석
이에 본 발명자들은 실시예 2의 실험결과로부터 실제 EDN1의 발현수준을 이용하여 간세포암 환자의 소라페닙 반응성에 대한 예측이 가능한지 확인하기 위해, 다른 집단의 74명의 환자를 대상으로 한 확인세트 면역조직화학 분석을 수행하였다. 분석에 사용한 방법은 상기 실시예 2와 동일하였다. 상기 74명의 간세포암 환자는 2007년부터 2012년까지 서울대학교 병원에서 간세포암으로 진단을 받은 환자들이다.
그 결과, 완전반응(CR) 및 부분반응(PR)는 각각 1건(1/74, 1.4%)으로서 객관적인 반응율은 2.8%이었고, 안정상태(SD)는 5건(5/74, 6.8%)이었다. 따라서 질병통제(CR + PR + PD)는 7건(7/74, 9.5)이었고, 진행성 질병(PD) 상태는 67건(67/74, 90.5%)로 나타났다.
확인세트 분석 결과, 반응그룹 및 비-반응 그룹 사이에 나이, 성별, 만성 간질환의 병인, 차일드-푸 점수(child-pugh score), AFP, 종양크기, 종양의 수, 관상 침윤, 또는 에드몬슨 등급(Edmonson grade)와 같은 그 어떠한 임상적 파라미터 상의 유의한 차이는 없었다.
상기 시험세트 분석에서 제안된 제한값(cut-off value)을 이용하여 소라페닙에 대한 반응성과 EDN1 발현과의 상관관계를 분석한 결과, 저 EDN1 발현군(≤ 0.85)은 고 EDN1 발현군(> 0.85)과 비교하여 유의하게 더 나은 반응성을 나타냈다(각각, 63.6% 대 0%; P < 0.0001, 표 3). 상기 시험세트 집단에서와 마찬가지로 간세포암 환자 시료에서의 EDN1 발현은 반응 그룹에서보다 비-반응 그룹에서 유의하게 높게 나타났다(도 3 참조). 이러한 결과는 EDN1이 소라페닙에 대한 반응성을 예측하는 유용한 바이오마커가 될 수 있음을 시사하는 것이다.
확인세트 분석에서의 소라페닙에 대한 반응성 및 EDN1 발현 수준과의 상관관계
EDN1 발현수준 시료수
EDN1 ≤ 0.85 EDN1 > 0.85
임상적 반응 CR+PR+SD 7 0 7
무반응 4 63 67
반응율 63.6% 0% 74
p-value 0.0001 (Fisher's exact test)
실시예 4: EDN1 발현과 간세포암 예후와의 상관관계 분석
본 발명자들은 EDN1 발현과 소라페닙 반응성과의 상관관계에 이어, EDN1 발현과 간세포암의 예후와의 상관관계를 파악하기 위해, 상기 실시예 2 및 3에서의 분석대상 환자들의 생존기간 평가를 수행하였다.
진행 시간(time to progression, TTP)의 중간값은 2.5개월(범위: 0.1 내지 16.2 개월)이었다. 3, 6, 및 12개월 시점에서의 누적 무-진행 생존율(progression-free survival rate)은 각각 32%, 15% 및 1%이었다. 47 환자는 관찰기간 말기에 살아있었던 반면, 47 환자는 사망하였다. 사망의 원인은 종양 진행(n=44) 및 간부전(n=3)이었다. 생존기간 중간값은 7.5개월(범위: 1.0-76.0개월)이었다. 3, 6 및 12개월시의 누적 생존율은 각각 73%, 64% 및 25%이었다.
소라페닙 투여 후의 환자의 예후에 대한 간세포암 조직에서의 EDN1의 발현의 영향을 조사하였다. 환자들은 0.85를 제한값으로 설정하여 고-EDN1 발현 그룹과 저-EDN1 발현 그룹으로 구분하였다. 그 결과, 도 4A에서 나타난 바와 같이, Kaplan-Meimer 방법에 따라 측정한 결과, 고-EDN1 발현 그룹과 비교하여 저-EDN1 발현 그룹에서 유의한 진행시간(TTP) 상의 신장이 나타났다(P=0.008). 아울러, 고-EDN1 발현 그룹과 비교하여 저-EDN1 발현 그룹에서 전체 생존율(overall survival, OS) 상의 유의한 신장이 나타났다(P=0.041, 도 4B). 소라페닙 투여 기간은 저-EDN1 발현 그룹에서 12.1±6.3 개월이었고 고-EDN1 발현 그룹에서는 9.5±11.5 개월이었다. EDN1의 예후 관련성을 평가하기 위해, 간세포암의 알려진 임상적 및 병리학적 예후인자와 EDN1에 대한 일변량(univariate) 및 다변량(multivariate) 분석을 수행하였다. Cox 회귀분석을 이용한 다변량 분석은 EDN1 발현이 전체 생존율(OS) 및 진행시간(TTP)에 대한 독립 예후 인자인지 확인하기 위해 수행되었다. 그 결과, EDN1 발현은 OS 및 TTP에 대한 독립적인 예후 인자임이 확인되었다. EDN1 발현은 나쁜 OS에 대한 독립 예후 인자였다(위험율, 2.374; 95% 신뢰구간, 1.051-5.360, P=0.037). 아울러, EDN1 발현은 신속한 종양 진행에 대한 독립 예견자인 것으로 나타났다(위험율, 1.907; 95% 신뢰구간, 1.085-3.350; P=0.025).
실시예 5: 혈청시료를 이용한 EDN1의 소라페닙 반응성 관련성 검증
본 발명자들은 간세포암 환자의 생검조직 대신 혈청시료에서의 단백질 정량분석을 통해 소라페닙 반응성 여부를 예측할 수 있는지 확인하기 위해, 간세포암 환자의 혈청시료를 대상으로 EDN1 단백질을 ELISA 분석으로 정량하였다.
구체적으로 혈청시료는 소라페닙 처리 전에 수득된 것으로서 혈청내 EDN1 수준은 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(Botrak-Amersham, USA)를 이용하여 제조사의 지시대로 측정하였다.
그 결과 도 5A에서 나타난 바와 같이, 비-PD 그룹 보다 PD 그룹에서 혈청 EDN1 수준이 유의하게 더 높게 나타났다(각각, 1.87 대 0.93 pg/mL; P<0.001). 아울러, 도 5B에서 나타난 바와 같이, 소라페닙 투여 이후 PD 반응을 예측하는데 있어서 특이도 및 민감도의 합의 최대값을 나타낸 제한값(cut-off value)인 1.178 pg/mL을 이용하여 환자들을 두 그룹으로 구분하는 것이 가능하였다(민감도, 73.9%; 특이도, 87.5%; AUC, 0.79; 95% 신뢰구간, 0.64-0.89). 다음으로, 상기 제한값을 이용하여 생존분석을 수행한 결과, 고-혈청 EDN1 환자들은 소라페닙 투여 후 더 유의하게 더 나쁜 전체 생존율을 나타냈다(도 5C 참조). 아울러 혈청 EDN1 수준이 전체 생존율에 대한 독립적인 예후 인자인지 확인하기 위해 Cox 회귀분석을 이용한 다변량 분석을 수행하였다. 그 결과 혈청 EDN1 수준은 전체 생존율에 대한 독립적인 예후 인자였다(위험율, 2.462; 95% 신뢰구간, 1.023-5.928; P=0.044).
위와 같은 결과들은, EDN1이 소라페닙 반응성을 예측할 수 있는 유용한 혈청학적 바이오마커가 될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법은 간세포암 환자의 소라페닙 반응성 및 예후을 예측하는데는 물론 간세포암 환자의 임상적 치료계획을 수립하는데 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (19)

  1. 시료 내의 EDN1 단백질 또는 상기 EDN1 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있는 탐침분자를 유효성분으로 함유하는 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 간암은 간암세포암인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탐침분자는 EDN1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 가변 림프구 수용체, 또는 앱타머 또는 EDN1 단백질을 암호화하는 mRNA에 특이적으로 혼성화하는 핵산분자인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 기능성 단편은 EDN1에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래한 Fab, F(ab')2, Fab', scFv(single chain fragment variable), 또는 단일-도메인 항체(single-domain antibody, sdAb)인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 생검조직, 혈액, 혈장 또는 혈청인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측용 키트.
  6. 간암 환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 EDN1 단백질 또는 상기 mRNA의 수준이 정상 수준과 비교하여 유의하게 높을 경우, 해당 간암 환자가 소라페닙에 대한 저항성을 갖는 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 시료는 생검조직, 혈액, 혈장 또는 혈청인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 간암은 간세포암인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측 방법.
  10. 간암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 EDN1 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    EDN1의 수준이 제한값 이상이면 소라페닙에 대한 반응성이 없을 것으로 판정하고 제한값 미만이면 소라페닙에 대한 반응성이 있을 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 제한값은 1.178 pg/mL인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 간암은 간세포암인, 간암 환자의 소라페닙 반응성 예측 방법.
  13. 간암 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 EDN1 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    EDN1의 수준이 제한값 이상이면 예후가 나쁜 것으로 예측하고 제한값 미만이면 예후가 좋을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 간암 환자의 예후 예측방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 제한값은 1.178 pg/mL인, 간암 환자의 예후 예측방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 간암은 간세포암인, 간암 환자의 예후 예측 방법.
  16. 간암 환자로부터 수득된 시료로부터 EDN1 단백질 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 환자의 예후 예측방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 EDN1 단백질 또는 상기 mRNA의 수준이 정상 수준과 비교하여 유의하게 높을 경우, 해당 간암 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 간암 환자의 예후 예측방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 간암은 간세포암인, 간암 환자의 예후 예측 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 생검조직, 혈액, 혈장, 또는 혈청인, 간암 환자의 예후 예측 방법.
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