JP6494703B2 - ヒストン変種含有ヌクレオソーム検出法 - Google Patents
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Description
本発明は、モノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソーム及び特定のヒストン変種を含
有するヌクレオソームの存在を検出及び測定する方法、並びに疾患の検出及び診断のため
のそのような測定の使用に関する。本発明はまた、疾患の検出及び診断のためにヒストン
変種バイオマーカーを同定する方法、並びに該方法により同定されたバイオマーカーに関
する。
ヒトの体は、数百種の細胞型を含んでいる。これらの細胞型は全て、同じゲノムを含ん
でいるが、広範に異なる表現型及び体内での異なる機能を有する。この表現型の多様性は
、異なる細胞型におけるゲノムの差次的発現によるものである。差次的遺伝子発現の制御
は、完全には理解されていないが、その基本的機構は、ユークロマチン又はヘテロクロマ
チンとしてのクロマチンパッキングの制御、ヌクレオソームポジショニング及びヌクレア
ーゼ到達可能部位の制御、DNAのメチル化、並びにその周りにDNAが巻き付いたヌクレオソ
ームの構造の変化を含む、遺伝子と関連する多数の相互接続されたエピジェネティックシ
グナルによる遺伝子調節を含んでいる。
ストンのタンパク質複合体(ヒストンH2A、H2B、H3及びH4の各々の対を含む)からなる。こ
の複合体の周りには、DNAのおよそ146塩基対が巻き付いている。別のヒストンであるH1又
はH5は、リンカーとして作用し、且つクロマチン凝縮に関与している。このDNAは、「ビ
ーズ-オン-ストリング」に似ていると言われることの多い構造で連続したヌクレオソーム
の周りに巻き付いており、且つこれは、オープン(open)又はユークロマチンの基本構造を
形成している。凝縮された又はヘテロクロマチンにおいて、このストリングは、閉じた複
雑な構造へ、コイル形成及びスーパーコイル形成される(Herranz及びEstellerの文献、20
07)。
ストンタンパク質の封入により、変動することができる。ヒストンタンパク質のPTMは典
型的には、コアヒストンテールで起こり、一般的な修飾は、リジン残基のアセチル化、メ
チル化又はユビキチン化に加え、アルギニン残基のメチル化及びセリン残基のリン酸化及
び多くのその他の修飾を含む。ヒストン修飾は、遺伝子発現のエピジェネティック調節に
関与していることがわかっている(Herranz及びEstellerの文献、2007)。ヌクレオソーム
の構造はまた、異なる遺伝子若しくはスプライシング産物であり、且つ異なるアミノ酸配
列を有する代替ヒストンアイソフォーム又は変種の封入により、変動することができる。
ヒストン変種は、個別の型に更に細分されている数多くのファミリーへ分類することがで
きる。多数のヒストン変種のヌクレオチド配列が公知であり、且つ例えば、米国立ヒトゲ
ノム研究所(NHGRI)ヒストンデータベース(Marino-Ramirez, L.、Levine, K.M.、Morales,
M.、Zhang, S.、Moreland, R.T.、Baxevanis, A.D.、及びLandsman, D.の文献、「ヒス
トンデータベース:ヒストン及びヒストン折り畳み含有タンパク質に関する統合リソース
(The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-cont
aining proteins)」、Database Vol.2011. (投稿)、及びhttp://genome.nhgri.nih.gov/h
istones/complete.shtml)、GenBank(NIH遺伝子配列)データベース、EMBLヌクレオチド配
列データベース、並びに日本DNAデータバンク(DDBJ)などにおいて公的に入手可能である
。
び主にアポトーシスによる同等数の細胞死が関与している。アポトーシスの過程において
、クロマチンは、モノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソームへ破壊され、これらは細
胞から放出される。通常の条件下で、健常対象において認められる循環ヌクレオソームの
レベルは、低いことが報告されている。多くの癌、自己免疫疾患、炎症状態、脳卒中及び
心筋梗塞を含む様々な状態の対象において、上昇したレベルが認められる(Holdenreider
及びStieberの文献、2009)。
により検出することができ、且ついくつかの方法が報告されている(Salgameらの文献、19
97;Holdenriederらの文献、2001;van Nieuwenhuijzeらの文献、2003)。これらのアッセ
イは典型的には、捕獲抗体として抗-ヒストン抗体(例えば、抗-H2B、抗-H3又は抗-H1、H2
A、H2B、H3及びH4)を、並びに検出抗体として抗-DNA又は抗-H2A-H2B-DNA複合抗体を利用
する。これらのアッセイを使用し、当該技術分野の研究者は、血清中のヌクレオソームの
レベルは、同じ患者から採取した血漿試料中よりも(最大一桁だけ)より高いことを報告し
ている。これはまた、PCRによる、生成されたDNAの血清及び血漿の測定値についても当て
はまる(Holdenriederらの文献、2005)。このことの理由は不明であるが、前記著者らは、
これは凝固過程におけるDNAの追加放出によるものであろうと仮説を立てている。しかし
本発明者らは、現在の技術のヌクレオソームELISAアッセイの結果は、互いに一致しない
ことを発見した。更に、血清又は血漿中のほとんどの循環DNAは、モノヌクレオソーム及
びオリゴヌクレオソームとして存在することが報告されているが(Holdenriederらの文献
、2001)、血清又は血漿中のヌクレオソーム及びDNAの測定されたレベルは、良くは一致し
ない。リアルタイムPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)により測定された循環無細胞系ヌクレオ
ソームレベルと循環DNAレベルのELISA結果の間の相関係数は、血清中r=0.531、及び血漿
中r=0.350であることが報告されている(Holdenriederらの文献、2005)。
方法として、使用され(Salgameらの文献、1997;Holdenriederらの文献、2001;van Nieu
wenhuijzeらの文献、2003)、且つ血清及び血漿中の循環無細胞系ヌクレオソームの測定の
ためにも使用される(Holdenriederらの文献、2001)。死滅しつつある細胞により循環中に
放出された無細胞系血清及び血漿ヌクレオソームレベルは、可能性のあるバイオマーカー
としてのそれらの使用を評価するために、数多くの異なる癌の研究においてELISA法によ
り測定されている(Holdenriederらの文献、2001)。平均循環ヌクレオソームレベルは、全
てではないがほとんどの試験された癌において、高いことが報告されている。最高の循環
ヌクレオソームレベルは、肺癌対象において観察された。最低レベルは、前立腺癌におい
て観察され、これは健常対象の正常範囲内であった。しかし悪性腫瘍を伴う患者は、かな
り変動する血清ヌクレオソーム濃度を有し、且つ進行した腫瘍疾患を伴う患者の一部は、
健常対象について測定された範囲内の低い循環ヌクレオソームレベルを有することが報告
されている(Holdenriederらの文献、2001)。このこと及び様々な非癌が上昇したヌクレオ
ソームレベルを引き起こすという理由で、循環ヌクレオソームレベルは、臨床上、癌のバ
イオマーカーとしては使用されない(Holdenrieder及びStieberの文献、2009)。驚くべき
ことに、本発明者らは、これらの現在の技術のヌクレオソームELISA法により測定された
その循環ヌクレオソームレベルが低いか又は検出不能である多くの癌対象は、実際には、
循環無細胞系ヌクレオソームの上昇したレベルを有することを示した。本発明者らは、現
在の技術のELISA法により検出されないヌクレオソームを検出するヌクレオソームに関す
る新規ELISA法をデザインし且つ明らかにしている。
ストンタンパク質(ヌクレオソーム複合体中の他のヒストン及びDNAに結合していない)中
のPTM検出のためのELISA法は、細胞溶解液から通常酸抽出により抽出されたヒストンにお
けるPTMの検出のために使用される。循環無細胞系ヌクレオソーム中のPTMの検出のための
免疫検定が、報告されている(Bawdenらの文献、2005)。マイクロタイターウェルに直接コ
ートされた精製されたヌクレオソームにおけるヒストンPTMのELISA検出の方法が、最近報
告された(Daiらの文献、2011)。この方法において、培養細胞からのクロマチン抽出物の
消化により得られたヌクレオソームは、マイクロタイターウェルへ直接コートされ、且つ
抗-PTM抗体と反応させられる。この方法は、比較的純粋なヌクレオソーム試料を必要とし
、且つ血液又は血清などの複合生物学的媒体中のヒストンPTMの直接測定には適していな
いことは、当業者には明らかであろう。
残基K9でモノメチル化されたヒストンH3)の検出のための改変クロマチン免疫沈降(ChIP)
法が、血漿中において報告されている。配列特異的ヒストンメチル化のレベルは、循環ヌ
クレオソームの濃度とは無関係であることが報告された(Deligezerらの文献、2008)。
造の両方に関して)により媒介されたエピジェネティックシグナル伝達に加え、細胞にお
ける遺伝子発現の制御も、DNAのシトシンメチル化状態を含む、DNAヌクレオチドへの修飾
により媒介される。DNAは、シトシンヌクレオチドの5位でメチル化され、5-メチルシトシ
ンを形成し得ることは、先般から当該技術分野において公知である。5-メチルシトシンの
形でメチル化されたDNAは、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドの隣にあるDNA
配列中の位置において起こることが報告されている。これらの位置は短縮して「CpG」と
称される。脊椎動物においてCpG位置の70%よりも多くが、メチル化されていることが報
告されている(Penningsらの文献、2005)。CpG部位を高い割合で含むゲノムの領域は、「C
pGアイランド」と称されることが多く、ヒト遺伝子プロモーター配列のおよそ60%は、そ
のようなCpGアイランドに関連している(Rodriguez-Paredes及びEstellerの文献、2011)。
活性遺伝子において、これらのCpGアイランドは、一般に低メチル化されている。遺伝子
プロモーター配列のメチル化は、安定した遺伝子不活化に関連している。DNAメチル化は
また通常、Alu反復エレメントを含む反復エレメント及び長い散在性ヌクレオチドエレメ
ントにおいて起こる(Herranz及びEstellarの文献、2007;Allenらの文献、2004)。
の文献、1983)。癌細胞において認められるDNAメチル化パターンは、健常細胞のそれとは
異なる。特に動原体周囲領域の周りの反復エレメントは、癌において、健常細胞と比べ低
メチル化されていることが報告されているが、特異的遺伝子のプロモーターは、癌におい
て過剰メチル化されていることが報告されている。これら二つの作用の釣り合いが、癌細
胞における全般的DNA低メチル化を生じることが報告されている(Rodriguez-Paredes;Est
ellerの文献、2007)。
ができる。例えば、血漿から抽出されたDNAのPCR増幅によるSeptin 9遺伝子の過剰メチル
化の検出のために報告された方法は、結腸癌の72%を検出し、偽陽性率は10%であること
が報告された(Grutzmannらの文献、2008)。特異的遺伝子又は遺伝子座のDNAメチル化状態
は、通常、5-メチルシトシンではなくシトシンのウラシルへの選択的亜硫酸水素塩脱アミ
ノ化により検出され、これはシークエンシング又は他の手段により検出され得るDNA一次
配列変化に繋がる(Allenらの文献、2004)。
ouetらの文献、2010)。全般的DNAメチル化は、免疫組織化学(IHC)技術を使用し、細胞に
おいて研究することができる。或いは、DNAは、分析のために細胞から抽出される。細胞
から抽出されたDNAの全般的メチル化の検出に関する数多くの方法が、報告されており、
これは、制限消化及び最短距離(nearest-neighbour)分析、クロルアセトアルデヒドを使
用する蛍光アッセイ、非メチル化CpGの量を算出するためのトリチウム-標識されたS-アデ
ノシルメチオニンと組合せてDNAメチル基転移酵素を使用する全てのCpG部位のメチル化に
よるインバース決定、並びに高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、又
は液体クロマトグラフィーとそれに続く質量分析による分析のためのDNAの単独ヌクレオ
チドへの消化を含む。これらの方法の欠点は、これらは労働集約的であること、及び/又
は品質の良い抽出されたDNAを大量に必要とすることである(Allenらの文献、2004)。亜硫
酸水素塩脱アミノ化が関与するPCRベースの方法は、大量のDNAの必要性は克服しているが
、5-メチルシトシンの全ゲノム含量の指標として、特定のゲノム領域、典型的には反復配
列を増幅しなければならない(Allenらの文献、2004)。全般的DNAメチル化測定に関するこ
れらの方法は、様々な細胞及び組織から抽出されたDNAを試験するために使用されている
。一部の研究者は、最小の侵襲的様式で入手することがより容易である全血中の白血球か
ら抽出されたDNAを研究した(Mooreらの文献、2008;Ting Hsiungらの文献、2007;Mansou
rらの文献、2010)。質量分析を伴う液体クロマトグラフィーは、全般的DNAメチル化測定
に関する最良の標準であると考えられるが、これは経費がかかり、且つそのDNAは、分析
前に、単独のヌクレオチドレベルへ消化されなければならない(Vasserらの文献、2009)。
質量分析を伴う超高速液体クロマトグラフィー(Zhangらの文献、2011)、及びメチル化-特
異的デジタルシークエンシング(MSDS)法(Ogoshiらの文献、2011)を含む。全般的DNAメチ
ル化に関する古典的競合免疫検定(更には全般的5-ヒドロキシメチルシトシンメチル化に
関する類似のアッセイ)が、説明されている。この方法において、細胞又は組織から抽出
されたDNAは、5-メチル化されたシチジン複合体によりコートされたマイクロタイターウ
ェルへ添加され、抗-5-メチルシチジン抗体が添加され、且つコートされた5-メチルシチ
ジン複合体と抽出された試料中のメチル化されたDNAの間の抗体結合の分布が、既知の標
準の分布と比較され、該試料中に存在する全般的DNAメチル化レベルが概算される(Cell B
iolabs社の文献、2011)。別の免疫検定のような方法において、組織から又は血漿若しく
は血清試料から抽出されたDNAは、マイクロタイターウェルへコートされ、且つメチル化
されたDNAが、抗-5-メチルシトシン抗体を用いて検出される(Vasserらの文献、2009;Epi
gentek社の文献、2009)。これらの方法の欠点は、これらは、DNAからの全てのヌクレオソ
ーム及びクロマチン構造の変性及び除去に関与するDNAの抽出を必要とすることである。
これらは、例えば;DNA抽出工程を伴わない、組織溶解液、血液、血漿又は血清などの生
物学的液体中の全般的DNAメチル化の直接測定には適していない。
キシメチル化の役割は、まだ十分に理解されていないが、これは遺伝子調節に関与してい
るように思われる(Stroudらの文献、2011)。
処理量で、低コストの、最小の侵襲性の診断方法には適していない。同様に、他の修飾さ
れた塩基又は稀な塩基(例えば、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン)に関
するDNAの分析は、実質的に純粋な又は抽出されたDNAの分析によってのみ調べることがで
きる。そのような分析は、組織溶解液、血液、血漿又は血清などの、複合生物学的媒体に
おいては直接実行することができない。
ック調節因子であることがわかっている(Herranz及びEstellerの文献、2007)。ヒストン
変種は、特定の変種をコードしている遺伝子のノックダウン試験(例えば、RNAiノックダ
ウンを使用)、クロマチン免疫沈降、アミノ酸の安定した同位体標識及び定量的質量分析
プロテオミクス、免疫組織化学及びウェスタンブロットを含む様々な技術を使用し、イン
ビボ及びインビトロにおいて研究されている(Whittleらの文献、2008;Boulardらの文献
、2010;Spornらの文献、2009;Kapoorらの文献、2010;Zeeらの文献、2010;Huaらの文
献、2008)。
織試料中のヒストン変種発現の免疫組織化学試験が、報告されている。これらの免疫組織
化学試験は、切除された癌組織試料中のヒストンmacroH2A(mH2A)変種及びH2AZ変種の染色
は、これらの癌の予後判定で適用され得ることを報告している(Spornらの文献、2009、Hu
aらの文献、2008、Kapoorらの文献、2010)。臨床使用のための免疫組織化学法の一つの欠
点は、組織試料収集には手術又は生検を伴い、侵襲性であることである。免疫組織化学法
の別の欠点は、生検又は組織切除が行われる前に、通常疾患の理にかなった予測が既に存
在しなければならないので、これらは早期診断又はスクリーニング診断には適していない
ことである。最小の侵襲性の血液ELISA試験は、より広い範囲の適用に適しており、且つ
これらの欠点を克服し、患者にとって好ましいことに加え、医療提供者にとってより高速
、より低コスト、及びより高処理量であるであろう。
細胞系ヌクレオソームは、血液又は他の媒体中では測定されておらず、且つそのような測
定は示唆も企図もされていない。血液中の無細胞系ヌクレオソーム内のヌクレオチド、修
飾されたヌクレオチド又はヒストン変種の存在又は非存在に関する試験は、報告されてお
らず、これらは、疾患の血液バイオマーカーとして価値があるかどうかも報告されていな
い。現在、無傷の無細胞系ヌクレオソーム内のヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又
はヒストン変種の検出又は測定の方法は存在していない。本発明者らはここで、そのよう
な試験方法、並びにそれらの健常対象及び罹患対象から採取された血漿試料及び血清試料
中での使用を報告する。驚くべきことに、本発明者らは、そのヌクレオソームが現在の技
術のELISA法では検出されないか又は低レベルである血漿試料及び血清試料中で、特異的
ヒストン変種を含有する無傷のヌクレオソームを高レベルで検出することができることを
示している。
本発明の第一の態様に従い、癌、心筋症、全身性紅斑性狼瘡、大腸炎、慢性閉塞性肺疾
患、クローン病及び関節リウマチの診断用バイオマーカーとして使用するための、ヒスト
ン変種又はヒストンアイソフォームを含有する無細胞系ヌクレオソームが、提供される。
有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該試料を、該ヒストン変種又はヒストンアイソフォームに結合する結合剤(binding
agent)と接触させる工程;
(ii)該結合剤の、該試料中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームへの結合を検出
又は定量する工程;並びに
(iii)該試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソー
ムの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該試料を、ヌクレオソームに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は試料を、該ヒストン変種又はヒストンアイソフォームに結合
する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該試料中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームへの結
合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソーム
の存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該試料を、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームに結合する第一の結合剤と接
触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は試料を、ヌクレオソームに結合する第二の結合剤と接触させ
る工程;
(iii)該第二の結合剤の、試料中のヌクレオソームへの結合を検出又は定量する工程;
並びに
(iv)該試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソーム
の存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
イソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)遊離のヒストン変種又はアイソフォーム部分を生成するために、ヌクレオソーム複
合体から、ヒストン変種又はアイソフォームを除去、放出又は抽出する工程;
(ii)該試料中の遊離のヒストン変種又はアイソフォームを検出又は定量する工程;並び
に
(iii)該試料中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソーム
の存在の測定値として、遊離のヒストン変種又はアイソフォームの存在又は量を使用する
工程:
を含む方法が、提供される。
有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)細胞からクロマチンを単離する工程;
(ii)該クロマチンを消化するか、音波処理するか又は別様に破壊し、モノヌクレオソー
ム及び/又はオリゴヌクレオソームを形成する工程;並びに
(iii)本発明の方法に従い、該ヌクレオソーム内のヒストン変種又はヒストンアイソフ
ォームの存在を検出又は測定する工程:
を含む方法が、提供される。
法であって:
(i)対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソ
ームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象の疾患状態を同定するために検出されたヌクレオソームに会合されたヒスト
ン変種又はヒストンアイソフォームのレベルを使用する工程:
を含む方法が、提供される。
る方法であって:
(i)該対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオ
ソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象に関する好適な治療の選択のためのパラメータとして、検出されたヌクレオ
ソームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソフォームのレベルを使用する工程:
を含む方法が、提供される。
:
(i)該対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオ
ソームを検出又は測定する工程;
(ii)1回以上にわたって対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを
含有するヌクレオソームの検出又は測定を反復する工程;並びに
(iii)該対象の状態の何らかの変化に関するパラメータとして、検出されたヌクレオソ
ームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソフォームのレベルの何らかの変化を使
用する工程:
を含む方法が、提供される。
めのヒストン変種又はヒストンアイソフォームバイオマーカーを同定する方法であって:
(i)該対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオ
ソームを検出又は測定する工程;
(ii)健常対象又は対照対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含
有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(iii)ヒストン変種又はヒストンアイソフォームが、疾患状態のバイオマーカーとして
有用であるかどうかを同定するために、罹患対象及び対照対象において検出されたレベル
間の差異を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
供される。
の部分成分、又は該ヒストン変種若しくはヒストンアイソフォーム若しくはそれらの部分
成分の構造/形状の模倣体に特異的なリガンド又はバインダー(binder)を、該キットの使
用説明書と一緒に備える、ヌクレオソームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソ
フォームの検出のためのキットが、提供される。
本発明の第一の態様に従い、癌、心筋症、全身性紅斑性狼瘡、大腸炎、慢性閉塞性肺疾
患、クローン病及び関節リウマチの診断用バイオマーカーとしての使用するための、ヒス
トン変種又はヒストンアイソフォームを含有する無細胞系ヌクレオソームが提供される。
一実施態様において、前記ヌクレオソームは、モノヌクレオソーム又はオリゴヌクレオ
ソームである。
ヒストン変種又はヒストンアイソフォームの使用が提供される。
一実施態様において、前記癌は、膀胱、乳房、結腸、頸部、食道、腎臓、大腸、肺、口
腔、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、皮膚又は胃の癌である。言及され得る一つの特定の実施
態様において、癌は、結腸、肺、口腔又は膵臓の癌である。
するヌクレオソームを検出及び測定するためのELISA試験を開発した。本発明者らは、こ
れらのアッセイの捕獲抗体として抗-ヒストン抗体を、検出抗体として好適な特異的抗-ヒ
ストン変種抗体と組合せて使用する。本発明者らは、これらのELISA法は、別の抗ヌクレ
オソーム捕獲抗体により作用することを示している。本発明者らはまた、特異的ヒストン
変種を含有するヌクレオソームは、罹患対象から採取した血液試料中で測定することがで
き、且つ非侵襲性の又は最小の侵襲性のバイオマーカーとしての使用で識別することを示
すために、このアッセイを使用する。罹患対象から採取された血清試料及び血漿試料中の
ヌクレオソーム内で検出されたヒストン変種レベルは、他のヌクレオソームエピトープの
レベルと比べ、健常対象由来の試料中で検出されたレベルとは異なる。加えて、異なる疾
患由来の試料中のヌクレオソーム内に検出された異なるヒストン変種を含有するヌクレオ
ソームレベルのパターンは、異なる疾患で異なることが認められ、特にヌクレオソームに
会合されたヒストン変種パターンが、異なるヌクレオチド及びPTMを含むヌクレオソーム
について決定されたパターンと組合せて試験された場合に、疾患の鑑別診断が可能である
。異なる又は追加のヒストン変種又はヒストン修飾又はヌクレオチドを含有するヌクレオ
ソームに関する試験の包含は、恐らくそのようなパターンを使用する鑑別診断の識別を改
善するであろうことは、当業者には明らかであろう。
るために、本発明者らは、健常対象20名から採取した血清試料及び血漿試料中のヌクレオ
ソームを測定した。現在の技術の両方法は、健常対象から採取した血清試料中で、血漿試
料中よりも、より高いシグナルを生じた。これらの結果は、図4に示している。このこと
は、ヌクレオソームレベルは、血漿中よりも血清中でより高いという公開されたデータと
一致する(*Holdenriederらの文献、2001)。
ために、本発明者らは、健常対象20名の血清中及び健常ウシ血清中の、3種のヒストン変
種を含有するヌクレオソームを測定した。3種のELISA試験全てについて、血清の結果は、
健常対象20名全てについて低いか又は検出不能であった。本発明者らはまた、本発明の3
種のELISA法に関して、健常対象20名から採取されたEDTA血漿試料において類似の試験を
行い、驚くべきことに、より高いシグナルが認められた。図5〜8に示したように、ヒスト
ン変種mH2A1.1、mH2A2、H2AZに加え、ヒストンP-H2AX(Ser139)を含有する無細胞系ヌクレ
オソームの高レベルが、健常ヒトEDTA血漿中で本発明の方法により検出されたが、健常ヒ
ト血清中ではより低いレベルが検出された。図9及び図10は、他のヌクレオソーム構造に
ついて類似した結果が得られたことを示している。この知見は予想外であり、且つ公開さ
れた結果(*Holdenriederらの文献、2001)及び現在の技術のヌクレオソームELISA法に関し
て本発明者らが認めた結果の両方と異なる。従って驚くべきことに、本発明の方法は、血
清試料及びEDTA血漿試料中に生じるヌクレオソームの相対レベルについて、現在の技術の
方法とは反対の結果を生じる。
て検出可能であるかどうかを調べた。本発明者らは、無細胞系ヌクレオソームに会合され
たH2AZ、mH2A1.1及びP-H2AX(Ser139)の高いレベルが、EDTA血漿中で本発明の方法により
検出可能であり、且つ健常対象から採取したクエン酸血漿中でより低い程度であること、
しかしヌクレオソームに会合されたH2AZ、mH2A1.1及びP-H2AX(Ser139)は、健常対象から
採取したヘパリン血漿中において、緩衝液又はウマ血清バックグラウンドシグナルよりも
検出不能であることを認めた。一部のヘパリン血漿試料(5中2)は、検出可能なレベルのヌ
クレオソーム会合された5-メチルシトシンを含有することがわかった。これらの結果は、
図17に示している。まとめると、無細胞系ヌクレオソームは、本発明の方法を使用し、健
常対象から採取したほとんど又は全てのEDTA血漿試料及びクエン酸血漿試料中に、比較的
高濃度で認められるが、健常対象から採取したヘパリン血漿試料又は血清試料中では、低
いか又は存在しない。従って、試料型の正確な選択が、様々な適用にとって重要であるこ
とは明白である。
試料選択には、いくつかのパラメータが関与していることを示している。これらは、一般
に健常対象から採取した血清試料及びヘパリン血漿試料中に存在する無細胞系ヌクレオソ
ームの低いレベル、一般に健常対象から採取したEDTA及びクエン酸血漿試料中に存在する
より高いレベル、無細胞系ヌクレオソームを含有する血清試料は、血餅からの血清の分離
後のEDTA添加により安定化されるべきであるという推奨(*Holdenreiderらの文献、2001)
、並びに血清サンプリングプロトコールを含む。他の安定化剤(例えば、プロテアーゼイ
ンヒビター)を使用してもよい。可能であるならば、本発明者らは、静脈穿刺(venepunctu
re)の1時間以内に遠心分離し、その後10mM EDTAを添加し、試料を凍結した、血清試料を
使用した。
われなければならない。健常対象の血清中の本発明の方法による一貫して低いヌクレオソ
ームレベルという本発明者らの知見に従い、本発明者らは、様々な癌疾患を伴う対象から
採取した血清試料中のヒストン変種mH2A1.1及びH2AZを含有するヌクレオソームを測定し
た。肺癌について最大75%及び膵臓癌について80%の臨床感受性が観察された(図21)。本
発明者らはまた、癌患者由来の血清試料を、5-メチルシトシンを含有するヌクレオソーム
について試験し、結腸癌試料について図18に示したように、最大100%の臨床感受性を認
めた。
トン変種及び他のヌクレオソーム構造を含有する無細胞系ヌクレオソームの相対レベルを
測定した。無細胞系ヌクレオソームのレベルは、健常対象及び罹患対象の両方から採取さ
れたEDTA血漿試料中で高く、従ってEDTA血漿試料は、恐らく罹患対象と健常対象の感度の
識別のための最良の試料選択であるようには見えない。しかし本発明者らは、循環無細胞
系ヌクレオソームのレベル及び組成は、異なるヒストン変種を含有するヌクレオソーム(
更には他のヌクレオソーム構造)の相対レベルに関して、罹患個体と健常個体の間で変動
し、且つ異なる疾患間でも変動することを示している。従って本発明者らは、最初に、(i
)高レベルの循環ヌクレオソームは、健常及び罹患の両対象から採取された全ての又はほ
とんどのEDTA血漿試料中に存在するが、これは全ての血液試料型には当てはまらないこと
;並びに、同じく、(ii)驚くべきことに、疾患の検出及び疾患型の識別は、それにもかか
わらず罹患対象及び健常対象の血漿中に存在するヌクレオソーム構造の1種以上の相対型
のレベル及び構造プロファイルを基にした、これらのEDTA血漿ヌクレオソームの分析によ
り行われ得ることの両方を報告する。
て様々な癌型を伴う対象117名から採取したEDTA血漿中の無細胞系ヌクレオソームを測定
した。全体で癌試料の90%(117中105)が、健常対象に関する結果の平均+該平均の2標準
偏差のカットオフレベルを使い、ヌクレオソームに会合されたヒストン変種H2AZに関する
本発明の方法を使用し、癌について陽性と正確に同定された。
直腸、肺(小細胞癌及び様々な非小細胞癌)、乳房、卵巣、前立腺、腎臓の癌及び様々な口
腔癌(口腔、口蓋、咽頭及び喉頭)を伴う対象55名から採取したEDTA血漿中の無細胞系ヌク
レオソームを測定した。健常対象及び癌患者由来の試料は全て、無細胞系ヌクレオソーム
について陽性であった。しかし、癌対象から採取した試料中で検出されたレベルは、健常
対象由来の試料中で認められたレベルよりもより高く、且つこれらの結果は、健常対象及
び癌対象は識別できることを示した。例えば、H2AZヌクレオソームアッセイに関する、平
均±該平均の2標準偏差としてOD項目で計算された正常範囲は、0〜0.95であった。カット
オフレベル0.95を使用し;上昇したヌクレオソームH2AZレベルに関して、13名全員の健常
対象は陰性であった。対照的に、上昇したヌクレオソームH2AZレベルに関して陽性の結果
が、55種の癌試料中46で認められ(全般的臨床感受性84%)、これは胃100%(8中8)、大腸1
00%(5中5)、直腸67%(3中2)、小細胞肺83%(6中5)、非小細胞肺79%、乳房50%(6中3)、
卵巣100%(1中1)、前立腺83%(6中5)、腎臓100%(1中1)及び口腔100%(5中5)の癌試料を
含んだ。これらの結果は、図19に示している。
別するためのアッセイに関するカットオフレベルは、対照試料の結果に関して規定される
。これは、対照試料結果のレベルと等しい又は上回る又は下回るのいずれかの割合である
ことができる。このレベルを下回る患者結果は、陰性であると考えられ、且つこのレベル
を上回る患者結果は、陽性であると考えられる。カットオフレベルに非常に近い患者結果
の「灰色領域」範囲も存在することがあり、それに関して決定は、不確定と考えられるか
、及び/又は試験を繰り返すべきである。
であった。このカットオフ値を使用し、13種全ての健常試料は、陰性であり、癌試料の64
%(55中35)は陽性であった。ヌクレオソームに会合されたP-H2AX(Ser139)アッセイについ
て、正常範囲は、0〜1.08であった。このカットオフ値を使用し、13種全ての健常試料は
、陰性であり、癌試料の60%(55中33)は陽性であった。ヌクレオソームに会合された5-メ
チルシトシンも測定し、正常範囲は、0〜1.41であった。このカットオフ値を使用し、13
種全ての健常試料は、陰性であり、癌試料の55%(55中30)は陽性であった。従って一部の
ヌクレオソームアッセイは、他のものよりもより良い臨床感受性を示している。
使用することが可能である。これは、例えば、ヌクレオソームに会合されたH2AZアッセイ
のカットオフポイントを、最大0.69の範囲を生じる、平均+1標準偏差まで低下すること
により行うことができる。この場合、健常対象から採取された試料に関する疑陽性結果が
0%から23%(13中3)まで増加することを代償に、偽陰性の数は3まで減少され、改善され
た臨床感受性95%(55中52)を生じる。これらの結果は、図19に示されている。
た試料は、ヌクレオソーム構造プロファイルについて調べることができる。このヌクレオ
ソームプロファイルを使用し、図23及び図24に図示したように、健常者と罹患患者の間で
区別することができ、ここで罹患患者における様々なヌクレオソーム構造の相対割合は、
健常患者及び他の非癌疾患を伴う患者において認められたものに対して表されている。こ
れは、試験パネル中の複数のヌクレオソーム構造の調査は、より良い臨床鑑別を促進する
ことができることを示している。
組み合わせることにより、増大することができる。例えば、ヌクレオソームに会合された
H2AZ:mH2A1.1の比の使用である。
従って、本発明の方法は、癌患者から採取された血漿試料及び血清試料の両方において
癌を検出することができる。
採取したEDTA血漿試料中の3種の異なるヒストン変種を含有する循環無細胞系ヌクレオソ
ームのレベルを測定し、且つこれらを、健常対象20名由来の血液試料中に存在するレベル
に加え、文献(*Holdenreiderらの文献、2001)に記載されたように調製した健常対象由来
のヌクレオソームの人工的に作製した調製品中に存在するレベルと比較した。本発明者ら
はまた、異なるエピトープを含有するヌクレオソームのレベルの比として規準化された形
で観察されたレベルを表し、そのような比又は比のパターンは、全般的癌の診断のため及
び特異的癌型の鑑別診断のための両方に有用であることを示した。本発明者らはまた、ヌ
クレオソームに会合されたヒストンH2AZのレベルは、疾患進行により変動するかどうかを
調べた。本発明者らは、ヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームの平均レベルは
、疾患の重症度により増加し、且つリンパ節への疾患の広がりの増加と共に並びに腫瘍サ
イズの増大及び病期と共に上昇することを認めた。このことは、検出されたヌクレオソー
ムは、腫瘍に関連していることの証拠を提供する。
の癌試料中に存在するヌクレオソームを測定した。試験した癌対象19名の大半は、現在の
技術のヌクレオソームELISA 1及び2により決定されたように、低いEDTA血漿ヌクレオソー
ムレベルを有することがわかった。この結果は、現在の技術のアッセイをルーチンの臨床
目的には使用することができない理由の一つを例示している。
クレオソームを測定するために、本発明のELISA法を使用した。ヒストン変種、特にmH2A2
及びH2AZを含有するヌクレオソームは、19試料中16で検出可能であった。従って一実施態
様において、本発明は、現在の技術のヌクレオソームアッセイにより検出されないヌクレ
オソームを検出することが可能である新規ヌクレオソームELISA法を提供する。
の文献、2001)に記載された方法により健常対象から作製したヌクレオソーム試料中の、2
種の異なるヌクレオチド及びヒストンPTMを含有するヌクレオソームのレベルを測定した
。本発明者らは、これらの測定値を、4種の異なる癌型を伴う対象から採取した生物学的
液体中に存在する多種多様な無細胞系ヌクレオソーム及び健常対象から作製したヌクレオ
ソームのパネルとして、ここに記載のヌクレオソームに会合されたヒストン変種測定値と
一緒に使用した。驚くべきことに、調べた4種の癌型(肺、結腸、膵臓及び口腔)中に認め
られたヌクレオソームのパターンは、健常対象から作製したヌクレオソーム試料中に認め
られたものから、全て区別可能であった。更に異なる癌型も、対象の血液中に検出可能な
無細胞系ヌクレオソームのパターンを基に、互いに区別可能であった。従って本発明の一
実施態様において、対象の健康又は疾患状態の指標として、異なるヒストン変種又は1以
上のDNAヒストン変種及び1以上のヒストンDNA塩基及び/若しくは1以上のヒストン修飾の
組合せを含有するヌクレオソームの2種以上の測定値、並びに/又はヌクレオソームそれ
自身の測定値、或いはこれらの任意の組合せ又は比からなる異なるヌクレオソームエピト
ープのパネルに関して、試料を試験することにより、疾患の存在、型、再発若しくは重症
度を検出若しくは診断する方法、又は最適な薬物若しくは他の治療選択肢を評価する方法
が、提供される。
ームのヒストン及びヌクレオチド構造の変動性を検出するために、本発明のELISA法を使
用し、且つこれらを健常対象11名において認められるヌクレオソームの構造と比較した。
ヌクレオソームは、調べた全ての癌疾患及び非癌疾患において存在することが認められ、
且つ健常対象のプロファイルとは異なるプロファイルを有することがわかった。
2名、慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者10名、クローン病患者8名及び関節リウマチ(RA)患者10
名から採取したEDTA血漿試料を試験し、且つヌクレオソームに会合された5-メチルシトシ
ンレベルの割合として様々なヌクレオソーム構造のレベルを規準化し、且つこれらを健常
対象において認められたレベルに対して表した。本発明者らは、これらの疾患は、健常対
象又は癌対象のものとは異なるヌクレオソーム構造プロファイルと関連していることを認
めた。従って、ヌクレオソーム構造プロファイルは、多種多様な非癌疾患における検出、
予後予測、モニタリング及び治療的有効性予測のための診断ツールとして使用することが
できる。これらの結果は、図24に示している。
して本発明のELISA法を使用し、検出されたヒストン型及びヌクレオチドに関して、無細
胞系ヌクレオソームの構造の変動性を試験し、ヌクレオソームに会合された5-メチルシト
シン(5mc)でメチル化されたDNAレベルの割合として規準化し、且つ健常対象11名において
認められた平均割合に対して表した。本発明者らは、全ての対象において存在するヌクレ
オソーム、並びに癌疾患対象、非癌疾患対象及び健常対象の間で変動するヌクレオソーム
構造プロファイルを認めた。従って、ヌクレオソーム構造プロファイルは、癌及び他の疾
患における検出、予後予測、モニタリング及び治療的有効性予測のための診断ツールとし
て使用することができる。これらの結果は、図23及び図24に示している。
他方でヒストンH4は、単独の形として存在することが報告されている(Tachiwanaらの文献
、2011)。ヒストンH4に結合する様に標的化された抗体又はバインダーを使用する本発明
のELISA法は、試料中の事実上全てのヌクレオソームに結合することは、当業者には明ら
かであろう。従って一実施態様において、本発明は、共通のヒストン変種を含有するヌク
レオソームが、全て又はほとんどのヌクレオソームが検出されることを確実にする様式で
測定される、ヌクレオソームそれ自身の検出の新規方法を提供する。更に、この適用のた
めに作製された好適な抗体又はリガンドは、PTM修飾を受けないヒストンH4の領域を標的
化することができることは、当業者には明らかであろう。これは更に、全て又はほとんど
のヌクレオソームに共通なエピトープとして選択されたエピトープの普遍性を増大するで
あろう。同様に、類似した好適な抗体は、選択された他のヒストン部分の領域へ結合する
ように標的化することができ、その結果それらの領域は、該ヒストン部分の全て又はほと
んどのヒストン変種又はアイソフォームに共通であること、並びにPTMを受けないこと(例
えば、非限定的に;ヒストンH2A、H2B又はH3の共通領域)ことは、当業者に明らかであろ
う。従って説明された発明は、構成性ヒストンアイソフォーム及びPTMが変動するにもか
かわらず、試料中の全て又はほとんどのヌクレオソームを検出する手段を提供する。
クレオソームの検出及び測定のための成功した方法であること、この方法はまた、ヌクレ
オソームそれ自身の検出のための方法として使用することができること、並びにこれは、
ヌクレオソームそれ自身の検出に関して現在の技術の方法よりも優れた方法であることを
結論付けている。従って本発明の方法は、現在の技術のヌクレオソームを測定する方法に
優る利点を有する。例えばヌクレオソームが、細胞、又は血液試料、血清試料若しくは血
漿試料などの生物学的液体から抽出されたクロマチンの消化により得られた試料中に生じ
る場合、本発明の方法を使用し、任意の試料中のヌクレオソームを直接検出及び測定する
ことができることは、当業者には明らかであろう。本明細書に記載の方法は、それについ
て抗体又は他のバインダーを作製することができる任意のヒストン変種又は修飾されたヒ
ストン変種について開発することができることも明らかであろう。
ることがわかった。これは、現在の技術のヌクレオソーム試験により検出不能であると報
告されている前立腺癌症例(Holdenriederの文献、2001)の検出を含んでいる。本発明は、
全て又はほとんどの癌の検出に有効であることは、明らかである。本発明の臨床成果は、
更なるヌクレオソーム構造試験の包含、及び存在する異なるヌクレオソーム構造の比の検
討により、更に改善され得ることは、当業者に明らかであろう。
アイソフォームを含有する無細胞系ヌクレオソームを検出及び測定する方法であって:
(i)該試料を、ヒストン変種に結合する抗体又は他のバインダーと接触させる工程;
(ii)該抗体又は他のバインダーの、該試料中のヒストン変種の種類(species)への結合
を検出及び/又は定量する工程;並びに
(iii)該試料中の、ヌクレオソーム会合されたヒストン変種の存在の測定値として、当
該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
する無細胞系ヌクレオソームを検出及び測定するための、二重抗体、免疫測定的又はサン
ドイッチ免疫検定の方法が、提供される。この態様の一実施態様は:
(i)ヌクレオソームを含有し得る試料を、ヌクレオソームに結合する一次抗体又は他の
バインダーと接触させる工程;
(ii)ヌクレオソーム又は試料を、ヒストン変種に結合する二次抗体又は他のバインダー
と接触させる工程;
(iii)該二次抗体又は他のバインダーの、試料中のヒストン変種の種類への結合を検出
及び/又は定量する工程;並びに
(iv)試料中のヌクレオソームに会合されたヒストン変種の存在の測定値として、当該結
合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、免疫検定である。
ムを含有する無細胞系ヌクレオソームを検出し且つ測定する方法であって:
(i)ヌクレオソームを含有し得る試料を、ヒストン変種に結合する一次抗体又は他のバ
インダーと接触させる工程;
(ii)ヌクレオソーム又は試料を、ヌクレオソームに結合する二次抗体又は他のバインダ
ーと接触させる工程;
(iii)該二次抗体又は他のバインダーの、試料中のヌクレオソームへの結合を検出及び
/又は定量する工程;並びに
(iv)試料中のヌクレオソームに会合されたヒストン変種の存在の測定値として、当該結
合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
本発明において利用することができる。これらは、無傷のヌクレオソーム中で生じ、且つ
遊離のヒストン中では生じないエピトープに結合するよう指向されたバインダー(例えば
;ヌクレオソーム内の2つのヒストンの間の接合部で認められたエピトープ)、及び同じく
共通ヌクレオソームタンパク質、ヒストン又は核酸のエピトープを含む、任意のヌクレオ
ソーム成分へ指向されたバインダーを含む。本発明者らは、2種の異なる捕獲抗体を使用
し、本発明の方法により試料を試行し、且つ使用した特定の捕獲抗体は、本発明の方法の
結果に著しくは影響を及ぼさないことを示した。これらの結果は、図16に示している。
び例えば事実上免疫測定的であってよい、米国のForteBio社から市販されている型の非標
識アッセイを含む、多種多様な実施態様を含むことは、当業者には明らかであろう。
ソフォーム若しくは変種、又はヌクレオソームに会合されたヒストンアイソフォーム若し
くは変種を検出及び測定する方法であって:
(i)試料を、ヒストンアイソフォーム又は変種に結合する抗体又は他のバインダーと接
触させる工程;
(ii)試料中のヒストンアイソフォーム又は変種への該抗体又は他のバインダーの結合を
検出及び/又は定量する工程;並びに
(iii)試料中のヒストンアイソフォーム若しくは変種又はヌクレオソームに会合された
ヒストンアイソフォーム若しくは変種の存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を
使用する工程:
を含む方法が、提供される。
ソフォーム若しくは変種、又はヌクレオソームに会合されたヒストンアイソフォーム若し
くは変種を検出及び測定する方法であって:
(i)試料を、ヒストンアイソフォーム又は変種に結合する抗体又は他のバインダーと接
触させる工程;
(ii)試料中のヒストンアイソフォーム又は変種への該抗体又は他のバインダーの結合を
検出及び/又は定量する工程;並びに
(iii)試料中のヒストンアイソフォーム又は変種の存在の測定値として、当該結合の存
在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
の割合を検出する方法であって:
(i)試料中のヌクレオソームのレベルを検出又は測定する工程;
(ii)本発明の方法に従い、ヌクレオソーム会合されたヒストンアイソフォームのレベル
を検出又は測定する工程;並びに
(iii)前記ヒストンアイソフォームを含むヌクレオソームの割合を決定するために、2つ
の測定値を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
のヌクレオソームに会合されたヒストン変種のレベルの両方が、本発明の方法を用いて測
定される。別の実施態様において、現在の技術のヌクレオソームELISA法を使用し、総ヌ
クレオソームレベルを決定する。更に別の実施態様において、総DNAの測定を、総ヌクレ
オソームレベルの代理として使用する。
出及び測定を、癌を伴う対象を同定し、且つこれらの対象を健常対象から鑑別する診断方
法として使用することができることを示している。更に本発明者らは、異なるヒストン変
種、ヌクレオチド及びヒストンPTMのパネルを含むヌクレオソームのパターンは、異なる
癌の間の区別に使用することができることを示している。これは、対象における癌を検出
し、且つ癌陽性対象において癌型間を区別するために使用することができる、癌血液試験
の基礎を提供することは、当業者には明らかであろう。本発明の別の態様に従い、体液中
のヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームの存在及び/又はレベル若しくは濃度
を測定又は検出し、且つ検出されたレベルを、非限定的に、疾患の臨床診断、疾患型若し
くは亜型の鑑別診断、又は疾患予後、又は疾患再発、或いは治療レジメンに対する対象の
感受性の診断を含む、対象の疾患状態のバイオマーカーとして使用することにより、疾患
の存在を検出又は診断する方法が、提供される。診断試験に使用した体液は、非限定的に
、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液及び他の液体を含むことは、当業者により理解される
であろう。好ましい実施態様において、試料として選択される体液は、血液、血清又は血
漿である。体液中のヌクレオソームに会合されたヒストン変種のアッセイ反応、レベル、
濃度又は量は、例えば、非限定的に、存在する総ヌクレオソーム若しくは総DNAのレベル
の割合として、又は別のヒストン変種若しくはヌクレオチド若しくはPTMを含有するヌク
レオソームのレベルに対する比として、絶対項又は相対項として表すことができる。
の存在及び/又はレベルを検出又は測定する方法であって:
(i)細胞からクロマチンを単離する工程;
(ii)該クロマチンを破壊し、モノヌクレオソーム及び/又はオリゴヌクレオソームを形
成する工程;並びに
(iii)本明細書記載の免疫検定法により、該モノヌクレオソーム及び/又はオリゴヌク
レオソーム中のヒストン変種の存在を検出又は測定する工程:
を含む方法が、提供される。
、当該技術分野において周知であり、且つ酵素消化及び音波処理を含む(Daiらの文献、20
11)。本発明者らは、標準手順を使用し、MCF7細胞から、無細胞系ヌクレオソームを作製
し、且つ本発明の方法を使用し、これらのMCF7ヌクレオソームは、ヒストン変種mH2A1.1
、H2AZに加え、P-H2AX(Ser139)を含有するヌクレオソームを含むことを示した。
ほとんど無傷のヌクレオソーム中に生じる、一般に生じるアイソフォームであり、ヌクレ
オソームそれ自身の検出又は測定の方法を提供する。別の実施態様において、本方法によ
る検出のために選択されたヒストンアイソフォーム上のエピトープは、該ヒストンの全て
又はほとんどのアイソフォーム、従って全て又はほとんどの無傷のヌクレオソームに共通
であり且つ生じるヒストンアイソフォームの領域に位置し、並びに更PTMを受けることは
なく、ヌクレオソームそれ自身の検出又は測定の方法を提供する。
は、IHC、ウェスタンブロット又はFACSを含む、現在使用されている方法よりも、簡単で
、より高速、より安価で、より定量的及び/又はより再現性がある。特定のヌクレオソー
ムに会合されたヒストン変種のレベル、濃度又は量は、例えば存在する総ヌクレオソーム
若しくは総DNAの割合として、又は別のヒストン変種若しくはPTM若しくはヌクレオチドを
含有するヌクレオソームのレベルに対する比として、絶対項又は相対項として表すことが
できる。
はないが、特定の分子又は実体に結合することが可能である任意のバインダーを含むこと
が意図されていること、並びに任意の好適なバインダーを本発明の方法において使用する
ことができることは、当業者に明らかであろう。同じく、用語ヌクレオソームは、液体媒
体中で分析することができるモノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソーム及びそのよう
なクロマチン断片を含むことが意図されていることも明らかであろう。
ム若しくはそれらの部分成分の構造/形状の模倣体に特異的なリガンド又はバインダーを
、本明細書に規定したいずれかの方法に従うキットの使用説明書と一緒に備える、ヌクレ
オソームの検出又は測定のためのキットが提供される。
ーム若しくはそれらの部分成分の構造/形状の模倣体に特異的なリガンド又はバインダー
を、本明細書に規定したいずれかの方法に従うキットの使用説明書と一緒に備える、ヌク
レオソームの検出又は測定のためのキットが提供される。
ストン変種バイオマーカーを同定する方法であって:
(i)罹患対象の体液中の、ヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを
検出又は測定する工程;
(ii)対照対象の体液中の、ヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを
検出又は測定する工程;並びに
(iii)特定のヒストン変種が、その疾患のバイオマーカーとして有用であるかどうかを
同定するために、罹患対象及び対照対象において検出されたレベル間の差異を使用する工
程:
を含む、方法。
か、又は異なる疾患を伴う対象であってよい(例えば;鑑別診断の検査のために)など様々
なことを基に選択され得ることは、当業者には明らかであろう。
ン変種バイオマーカーを同定する方法であって:
(i)罹患対象の体液中のヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを検
出又は測定する工程;並びに
(ii)罹患対象の体液中で検出されたヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームの
レベルを、該対象の疾患転帰と相関させる工程:
を含む方法が、提供される。
レジメンの選択に使用されるべきヒストン変種バイオマーカーを同定する方法であって:
(i)罹患対象の体液中のヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを検
出又は測定する工程;並びに
(ii)罹患対象の体液中のヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを、
それらの対象における治療レジメンの認められた有効性と相関させる工程:
を含む方法が、提供される。
に使用されるべきヒストン変種バイオマーカーを同定する方法であって:
(i)罹患対象の体液中の、ヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを
検出又は測定する工程;
(ii)対象の疾患進行時、1回以上にわたって、該検出又は測定を反復する工程;並びに
(iii)罹患対象の体液中に検出されたヒストン変種を含有する無細胞系ヌクレオソーム
のレベルを、対象における疾患進行と相関させる工程:
を含む方法が、提供される。
マーカーが提供される。
トン変種タンパク質の抽出、それに続く抽出された遊離のヒストン変種タンパク質の検出
又は定量の方法が関与する手順により、血液、血漿、血清及び尿を含む生物学的液体中に
検出され得ることは、当業者には明らかであろう。好適な抽出手順は、ヒストンタンパク
質の塩基性の性質を利用する常用のヒストンの酸抽出手順を含む。遊離のヒストン変種の
検出は、例えば、遊離のヒストン部分の免疫検定により行うことができる。従って本発明
の一実施態様において、ヒストン変種は、血液、血漿、血清及び尿を含む生物学的液体か
ら抽出され、且つこの抽出物が、ヒストン変種の存在について試験される。
ることができることは、当該技術分野において公知であろう。ヒストン変種を含有する無
細胞系ヌクレオソームは、生物学的液体中のヒストン変種それ自身の直接免疫検定が関与
する手順により、血液、血漿、血清及び尿を含む生物学的液体中に検出され得ることは、
当業者には明らかであろう。この手順において、ヒストン変種上に存在するエピトープに
対する抗体を利用する単独抗体免疫検定、又はヒストン変種上に存在する2つのエピトー
プに対する2つの抗体を利用する2-サイト免疫検定が、ヌクレオソーム内のヒストン変種
の存在を検出するために使用される。従って本発明の別の実施態様において、ヌクレオソ
ーム内に含有されるヒストン変種は、ヒストン変種に関する免疫検定法の使用により、血
液、血漿、血清及び尿を含む生物学的液体中で、直接検出される。
生物学的液体から抽出され、この抽出物は、ヒストン変種の存在について試験される。
又は化学的に合成された化合物などの、リガンド又はバインダーを提供する。本発明のリ
ガンド又はバインダーは、バイオマーカーに特異的に結合することが可能である、ペプチ
ド、抗体若しくはそれらの断片、又はプラスチック抗体などの合成リガンド、又はアプタ
マー若しくはオリゴヌクレオチドを含んでよい。この抗体は、バイオマーカーに特異的に
結合することが可能である、モノクローナル抗体又はそれらの断片であることができる。
本発明のリガンドは、ルミネセンス、蛍光、酵素又は放射性マーカーなどの検出可能なマ
ーカーにより標識されてよく;或いは又は加えて、本発明のリガンドは、親和性タグ、例
えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン若しくはHis(例えばhexa-His)タグにより
標識されてよい。或いは、リガンド結合は、非標識技術、例えばForteBio社の技術を用い
、決定されてよい。
能である、バイオマーカー又はそれらの構造/形状の模倣体を含んでよい。同じく、本明
細書記載のリガンド又は模倣体を含むアレイも提供される。
ド、抗体若しくはそれらの断片、アプタマー若しくはオリゴヌクレオチドである、本明細
書記載のような1種以上のリガンドの使用、又はそのバイオマーカーを検出及び/又は定
量するための、本発明のバイオセンサー、若しくは本発明のアレイ、若しくは本発明のキ
ットの使用が提供される。これらの使用において、検出及び/又は定量は、本明細書記載
のように生物学的試料について実行することができる。
うなキットは好適には、バイオマーカーの検出及び/若しくは定量のための、本発明のリ
ガンド、並びに/又はバイオセンサー、並びに/又は本明細書記載のアレイを、任意にこ
のキットの使用説明書と一緒に含むであろう。
量することが可能であるバイオセンサーを含む、疾患状態の存在を検出するためのキット
である。
規標的及び薬物分子の発見に必須の標的である。バイオマーカーのレベルは、障害及び薬
物反応の指標であるので、このバイオマーカーは、インビトロアッセイ及び/又はインビ
ボアッセイにおける新規治療的化合物の同定に有用である。本発明のバイオマーカーは、
バイオマーカーの活性を変更する化合物のスクリーニング法において利用することができ
る。
はアプタマー若しくはオリゴヌクレオチドであることができる、記載のようなバインダー
又はリガンドの使用;或いは、本発明のバイオセンサー、又は本発明のアレイの使用;或
いは、バイオマーカーの生成を促進及び/又は抑制することが可能である物質を同定する
ための、本発明のキットが提供される。
を同定する方法であって、試験物質を、対象動物へ投与すること、並びに対象由来の試験
試料中に存在するバイオマーカーのレベルを検出及び/又は定量することを含む方法が、
提供される。
確認、及び/又は特徴決定を包含している。本発明の検出、モニタリング及び診断の方法
は、疾患の存在を確認するため、開始及び進行を評価することにより疾患の発症をモニタ
リングするため、又は疾患の改善若しくは退縮を評価するために有用である。検出、モニ
タリング及び診断の方法はまた、臨床スクリーニング、予後、療法選択、治療的恩恵の評
価、すなわち薬物スクリーニング及び創薬に関する、評価方法においても有用である。
同定を可能にし(従って有害な薬物副作用への不要な曝露の減少)、且つ再発率を低下する
ことにより、改善された予後の可能性を伴う非常に強力な「患者解決策(patient solutio
ns)」を提供する。
更なる態様に従い、(i)腫瘍細胞に会合された又は腫瘍細胞から放出された生物学的試料
中のバイオマーカーを測定する工程、並びに(ii)該バイオマーカーのレベルが、腫瘍のサ
イズ、病期、攻撃性又は播種度に関連していることを明らかにする工程を含む、腫瘍成長
を検出する方法が提供される。
の循環レベルに繋がることは公知である(Holdenriederらの文献、2001)。循環する無細胞
系ヌクレオソームのレベルは、非特異的指標であり、且つ炎症疾患、非常に多様な良性及
び悪性の状態、自己免疫疾患に加え、外傷又は虚血に続発を含む、多種多様な状態におい
て起こる(Holdenriederらの文献、2001)。本発明は、循環ヌクレオソームが対象において
認められる多様な疾患領域における適用を有することは、当業者には明らかであろう。こ
れらは、非限定的に、外傷(例えば;重度の損傷又は手術)、極端な運動(例えばマラソン
の走り)、脳卒中及び心臓発作、及び敗血症又は他の重篤な感染症を含む。本発明者らは
、ヌクレオソームレベルを測定し、且つ心筋症、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、慢性
閉塞性肺疾患、クローン病及び関節リウマチを含む、多様なそのような疾患におけるそれ
らのヒストン及びヌクレオチド構造の変動性を調べるために、本発明の免疫検定法を使用
し、且つこれらを健常対象の結果と比較している。本発明者らは、これらの疾患全てにお
いて、ヌクレオソームを検出し、且つそれらの相対構造(ヒストン及びヌクレオチド組成
に関して)を決定することができる。当該発明の方法は、現在のヌクレオソームELISA法よ
りも広範なヌクレオソームの検出が可能であるので、本発明の方法は、多種多様な癌及び
非癌疾患領域における適用を有する。
多様な標識物の種類による、酵素検出法(例えばELISA)を利用する免疫測定アッセイ、蛍
光標識免疫測定アッセイ、時間分解蛍光標識免疫測定アッセイ、化学発光免疫測定アッセ
イ、免疫比濁アッセイ、粒子標識免疫測定アッセイ及び免疫放射線測定アッセイ、並びに
標識抗原及び標識抗体の競合免疫検定法を含む競合免疫検定法を含む。該免疫検定法は全
て、当該技術分野において周知であり、例えば、Salgameらの文献、1997及びvan Nieuwen
huijzeらの文献、2003を参照されたい。
試験することができる生物学的試料は、脳脊髄液(CSF)、全血、血液の血清、血漿、月経
血、子宮内膜の液体、尿、唾液、又は他の体液(糞便、涙液、滑液、痰)、例えば濃縮され
た呼気(condensed breath)のような呼気、又はそれらからの抽出物若しくは精製物、又は
それらの希釈物を含む。生物学的試料はまた、生存対象由来の標本、又は剖検時に採取さ
れた標本を含む。試料は、例えば、適切に希釈又は濃縮など調製することができ、且つ通
常の様式で貯蔵される。
が経時的にモニタリングされることを可能にするという利点を提供する。そのような設定
は、疾患状態の治療の有効性をモニタリング又は評価する上での恩恵を提供するであろう
。そのような本発明のモニタリング方法を使用し、発症、進行、安定化、改善、再発及び
/又は寛解をモニタリングすることができる。
及び/又は定量することを含む、そのような疾患を有する疑われる対象における疾患状態
に関する療法の有効性をモニタリングする方法を提供する。モニタリング法において、試
験試料は、2回以上にわたって採取されてよい。本方法は更に、試験試料中に存在するバ
イオマーカーのレベルを、1以上の対照と比較すること、並びに/又は同じ試験対象から
より早い時点で、例えば療法の開始前に採取された、及び/若しくは療法のより早い段階
にある同じ試験対象から採取された、1以上の以前の試験試料と比較することを含んでよ
い。この方法は、異なる機会に採取された試験試料中のバイオマーカーの性質又は量の変
化を検出することを含んでよい。
有効性をモニタリングする方法であって:
(i)本明細書に規定されたバイオマーカーの量を定量する工程;並びに
(ii)試験試料中の該バイオマーカーの量を、1以上の対照及び/又は同じ試験対象から
より早い時点で採取した1以上の以前の試験試料中に存在する量と比較する工程:
を含む方法が、提供される。
の試験試料中のレベルに対する変化は、障害又は疑われる障害に対する、該療法の、例え
ば安定化又は改善などの有益な作用の指標であり得る。更に一旦治療が完了すると、疾患
の再発をモニタリングするために、本発明の方法が定期的に反復されてよい。
において、現存する療法及び新規療法の治療的効果をモニタリングするために使用するこ
とができる。これらのモニタリング法は、新規薬効物質及び物質の組合せのスクリーニン
グに組み込むことができる。
更なる実施態様において、素早く作用する療法に起因した、より迅速な変化のモニタリ
ングを、数時間又は数日の短い間隔で行うことができる。
る方法が提供される。本明細書において使用される用語「同定する」とは、生物学的試料
中に存在するバイオマーカーの存在を確認することを意味する。試料中に存在するバイオ
マーカーの量の定量は、試料中に存在するバイオマーカーの濃度を決定することを含んで
よい。同定及び/又は定量は、試料について直接的に、又はそれらからの抽出物若しくは
それらの希釈物について間接的に実行することができる。
象の体により生成される、バイオマーカーに特異的に結合することが可能である、従って
疾患状態を有する対象に由来する生物学的試料中に存在する、抗体又はそれらの断片の検
出及び/又は定量により評価される。
は抽出物若しくはそれらの希釈物中の、特異的タンパク質の存在及び/又は量を同定する
のに適した任意の方法により実行することができる。本発明の方法において、定量は、1
又は複数の試料中のバイオマーカーの濃度を測定することにより実行することができる。
本発明の方法により試験され得る生物学的試料は、本明細書において先に規定されたもの
を含む。試料は、例えば、適切に希釈又は濃縮など調製されることができ、且つ通常の様
式で貯蔵される。
末端切断を伴う断片、又はN-末端切断を伴う断片の検出により実行することができる。断
片は、好適には、長さが4個よりも大きいアミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のアミノ酸である。特にヒストンテール
の配列と同じ又は関連した配列のペプチドが、特に有用なヒストンタンパク質の断片であ
ることは、注目される。
。或いは、バイオマーカーは、抗体若しくはそれらのバイオマーカー-結合断片、又は他
のペプチドなどの、1種又は複数のリガンドとの相互作用、或いは例えばバイオマーカー
に特異的に結合することが可能であるアプタマー又はオリゴヌクレオチドなどのリガンド
との相互作用を介して、直接的に又は間接的に検出されてよい。リガンド又はバインダー
は、ルミネセント、蛍光又は放射性標識などの、検出可能な標識、及び/又は親和性タグ
を有することができる。
Dゲル-ベース分析、質量分析(MS)、逆相(RP)LC、サイズ透過(ゲル濾過)、イオン交換、ア
フィニティ、HPLC、UPLC及び他のLC又はLC MS-ベースの技術からなる群から選択される1
種以上の方法により、実行することができる。適切なLC MS技術は、ICAT(登録商標)(Appl
ied Biosystems社、CA、米国)、又はiTRAQ(登録商標)(Applied Biosystems社、CA、米国)
を含む。液体クロマトグラフィー(例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又は低速
液体クロマトグラフィー(LPLC))、薄層クロマトグラフィー、NMR(核磁気共鳴)分光法も、
使用することができる。
するために、SELDI TOF又はMALDI TOFにより試料を分析することを含んでよい。これらの
方法は同じく、臨床スクリーニング、予後、療法の結果のモニタリング、特定の治療的処
置に対し最も反応する可能性がある患者の同定、薬物スクリーニング及び創薬、並びに薬
物治療に関する新規標的の同定に適している。
ることが可能である抗体、又はそれらの断片が関与する、免疫学的方法を用いて実行され
てよい。好適な免疫学的方法は、被検体バイオマーカーの検出が被検体バイオマーカー上
の異なるエピトープを認識する2種の抗体を用いて実行される、サンドイッチELISAなどの
、サンドイッチ免疫検定;放射免疫測定(RIA)、直接的、間接的又は競合酵素結合免疫吸
着アッセイ(ELISA)、酵素免疫検定(EIA)、蛍光免疫検定(FIA)、ウェスタンブロット、免
疫沈降及び任意の粒子-ベースの免疫検定(例えば、金、銀、若しくはラテックス粒子、磁
気粒子、又はQ-dotsを使用する)を含む。免疫学的方法は、例えば、マイクロタイタープ
レート又はストリップフォーマットにおいて実行されてよい。
ーカーの上流又は下流に認められる分子、又は分子の測定可能な断片と置き換えることが
できる。
である。予測的バイオマーカーを使用し、バイオセンサーなどの適切な診断ツールを開発
することができ;従って、本発明の方法及び使用において、同定及び定量を、バイオセン
サー、マイクロ分析システム、マイクロ操作システム、マイクロ分離システム、イムノク
ロマトグラフィーシステム又は他の好適な分析装置を用いて、実行することができる。バ
イオセンサーは、これらのバイオマーカーの検出のための免疫学的方法、電気技術、熱技
術、磁気技術、光学技術(例えばホログラム)又は音響技術を組み込んでよい。そのような
バイオセンサーを使用し、生物学的試料中に認められる予測された濃度で標的バイオマー
カーを検出することが可能である。
することが可能であるいずれかを意味する。バイオセンサーの例は、本明細書に記載され
ている。
本発明のバイオセンサーは、バイオマーカーへの特異的結合が可能である本明細書記載
のリガンドバインダー又はリガンドを含んでよい。そのようなバイオセンサーは、本発明
のバイオマーカーの検出及び/又は定量において有用である。
したバイオセンサー組み入れ技術を用いて検出することができ、そのようなシステムは特
に「バーコード」又はアレイ構成に適している。
ラフィー像は、バイオマーカーと特異的に反応するように増感されている薄いポリマーフ
ィルム上に保存される。露光時に、バイオマーカーはポリマーと反応し、ホログラムによ
り表示された画像の変化に繋がる。この試験結果の読み取りは、輝度(optical brightnes
s)、画像、色及び/又は画像の位置における変化であることができる。定性的及び半定量
的適用のためには、センサーホログラムは、肉眼により読み取ることができ、従って検出
装置が不要となる。定量的測定値が必要である場合は、簡単な色センサーを使用し、シグ
ナルを読み取ることができる。試料の不透明性又は色は、このセンサーの操作とは干渉し
ない。このセンサーのフォーマットは、いくつかの物質の同時検出のための多重化(multi
plexing)を可能にする。可逆センサー及び不可逆センサーを、様々な必要要件に合致する
ように設計することができ、且つ関心対象の特定のバイオマーカーの連続モニタリングが
実現可能である。
分子認識を、試料中のバイオマーカーの存在の検出又は定量をシグナルへ変換するのに適
切な手段と組合せている。バイオセンサーは、例えば病棟、外来患者部門、手術室、自宅
、野外及び職場など、「代替場所」での診断試験のために適合させることができる。
、プラズモン共鳴センサー、ホログラフィーセンサー、バイオ-レーヤー干渉(BLI)センサ
ー及びマイクロ操作センサーを含む。インプリンティング認識エレメント、薄膜トランジ
スタ技術、磁気音響共振装置及び他の新規音響-電気システムを、本発明の1種以上のバイ
オマーカーの検出のためのバイオセンサーにおいて利用してよい。
において実行することができるか、或いは例えば医師の診療所又は患者のベッド脇など、
非実験室環境で使用することができる、使い捨ての診断又はモニタリング用のプラットフ
ォームに組み込むことができる。本発明の方法を実行するのに適したバイオセンサーは、
光学リーダー又は音響リーダーを備える、「クレジット(credit)」カードを含む。バイオ
センサーは、収集されたデータが、解釈のために医師に電送されることを可能にするよう
に構成することができ、従ってe-医療(e-medicine)の基礎を形成することができる。
ている。一実施態様において、このキットは追加的に、バイオマーカーの同定及び/又は
定量が可能であるバイオセンサーを含む。本発明のキットは好適なことに、バイオマーカ
ー又はバイオマーカーの構造/形状の模倣体に特異的な、リガンドバインダー、又はリガ
ンド、1種以上の対照、1種以上の試薬及び1種以上の消耗品の群から選択される1種以上の
成分を;任意に、本明細書に規定される方法のいずれかに従うキットの使用説明書と一緒
に、含んでよい。
る。本発明のバイオマーカーの検出は、臨床試験への対象の参加前の、対象のスクリーニ
ングに使用することができる。これらのバイオマーカーは、治療反応、反応不良、好まし
くない副作用プロファイル、服薬遵守の程度及び適切な血清薬物レベルの達成を示す手段
を提供する。これらのバイオマーカーを使用し、有害な薬物反応の警告を提供することが
できる。反応の評価は、用量の微調整、処方薬の数の最小化、有効な療法への到達の遅延
の減少、及び有害薬物反応の回避に使用することができるので、バイオマーカーは、個人
化された療法の開発において有用である。従って、本発明のバイオマーカーをモニタリン
グすることにより、患者の管理(care)を、患者の障害及び薬理ゲノミクスプロファイルに
より決まる必要性と合致するように正確に作ることができ、従ってこのバイオマーカーを
使用し、適量まで漸増し、陽性治療反応を予測し、且つ重度の副作用のリスクが高いそれ
らの患者を同定することができる。
測定を用いては達成され得ない、正確で迅速な診断のための客観的測定を提供する。
更に、診断用バイオマーカー試験は、軽度の又は無症候性の疾患を伴うか、或いは症候
性疾患を発症するリスクの高い、家族の一員又は患者を同定するために有用である。この
ことは、適切な療法の開始、又は予防的対策、例えばリスク因子の管理を可能にする。こ
れらの方策は、転帰を改善し、且つ該障害の顕性の発症を防止することができることが認
められる。
増悪に起因するかどうかを医師が決定することを可能にするための、患者をモニタリング
するツールとしても不可欠である。薬学的治療が不適切であると評価される場合は、療法
を復元若しくは増加することができ;適切ならば、療法が変更される。これらのバイオマ
ーカーが該障害の状態に感受性がある場合、これらは、薬物療法の影響の指標を提供する
。
(実施例1)
Holdenriederにより説明された方法(*Holdenriederらの文献、2001)に従い、健常対象
から調製した無細胞系ヌクレオソームを含有するヒト血液試料を、無傷のヌクレオソーム
に結合する固相抗-ヒストン捕獲抗体、及びビオチン化されたアフィニティ精製されたポ
リクローナル抗-ヒストン変種macroH2A1.1検出抗体を使用する、ヌクレオソームに会合さ
れたヒストン変種macroH2A1.1に関するELISAを使用し、試験した。ヒト試料を、ウシ胎仔
血清中に連続希釈し、未希釈並びに1:2、1:4、及び1:8の希釈を、ELISAにおいて2つ組
で試験した。未希釈のウシ胎仔血清もまた、無細胞系ヌクレオソームを含有しない対照試
料として、ELISAにおいて試行した。アッセイ法は、下記に従う:0.1Mリン酸緩衝液(pH7.
4)中の抗-ヒストン抗体の溶液を、マイクロタイターウェルに添加し(100μL/ウェル)、4
℃で一晩インキュベーションし、ウェルを捕獲抗体により被覆した。過剰な抗-ヒストン
抗体をデカントした。ウシ血清アルブミン(20g/L)の溶液をウェルへ添加し(150μL/ウェ
ル)、室温で60分間インキュベーションし、ウェル上の過剰なタンパク質結合部位をブロ
ックした。過剰なウシ血清アルブミン溶液をデカントし、これらのウェルを、洗浄緩衝液
(200μL/ウェル、1%Tween 20を含有する0.05Mトリス/HCl緩衝液(pH7.5))により2回洗浄
した。試料(10μL/ウェル)及びアッセイ緩衝液(50μL/ウェル、0.9%NaCl、0.05%デオキ
シコール酸ナトリウム及び1% Nonidet P40置換体(substitute)を含有する0.05Mトリス/H
Cl(pH7.5))を、ウェルへ添加し、室温で90分間、穏やかに攪拌しながらインキュベーショ
ンした。試料とアッセイ緩衝液の混合物をデカントし、ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウ
ェル)により3回洗浄した。ビオチン化されたアフィニティ精製されたポリクローナル抗-
ヒストン変種macroH2A1.1検出抗体の溶液を添加し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに攪拌し
ながら、室温で90分間インキュベーションした。過剰な検出抗体をデカントし、再度ウェ
ルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。ストレプトアビジン−ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ複合体を含有する溶液を添加し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに
攪拌しながら、室温で30分間インキュベーションした。過剰な複合体をデカントし、ウェ
ルを再度、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。呈色基質溶液(100μL/ウェル
、2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩)を添加
し、穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベーションした。1%ドデシル硫酸ナ
トリウムを含有するストップ溶液(100μL/ウェル)を添加し、ウェルの光学密度(OD)を、
標準マイクロタイタープレートリーダーを用い、波長405nmで測定した。ヌクレオソーム
に会合されたヒストン変種macroH2A1.1濃度を増加することにより増加する色の再現可能
な用量反応曲線が認められ、ヌクレオソームに会合されたヒストン変種macroH2A1.1非存
在(ウシ胎仔血清)下では、低いバックグラウンドシグナルが認められた。陽性ELISAシグ
ナルは、使用される捕獲抗体は、無傷のヌクレオソーム内のヒストンに結合し、ヒストン
H2には結合しないので、ELISAにより検出されたヒストン変種macroH2A1.1は、ヌクレオソ
ーム内に組み込まれていることを指摘している。これらの結果は、図1に示している。
ヌクレオソーム内のDNA及びタンパク質が安定のために架橋されているMCF7細胞から抽
出されたクロマチンの消化により生成された市販のヌクレオソーム調製品(その調製品中
に存在する全てのヒストンが無傷のヌクレオソーム中に組み込まれていることを確実にす
るため)を、無傷のヌクレオソームに結合する固相抗-ヒストン捕獲抗体、及びビオチン化
されたアフィニティ精製されたポリクローナル抗-ヒストン変種macroH2A2検出抗体を使用
する、ヌクレオソーム会合されたヒストン変種macroH2A2に関するELISA法を用い、アッセ
イした。ヌクレオソーム試料を、ウシ胎仔血清中に連続希釈し、且つELISAにおいて2つ組
で試験した。未希釈のウシ胎仔血清もまた、無細胞系ヌクレオソームを含有しない対照試
料として、ELISAにおいて試行した。アッセイ法は、下記に従う:0.1Mリン酸緩衝液(pH7.
4)中の抗-ヒストン抗体の溶液を、マイクロタイターウェルに添加し(100μL/ウェル)、4
℃で一晩インキュベーションし、ウェルを捕獲抗体により被覆した。過剰な抗-ヒストン
抗体をデカントした。ウシ血清アルブミン(20g/L)の溶液をウェルへ添加し(200μL/ウェ
ル)、室温で30分間インキュベーションし、ウェル上の過剰なタンパク質結合部位をブロ
ックした。過剰なウシ血清アルブミン溶液をデカントし、これらのウェルを、洗浄緩衝液
(200μL/ウェル、1%Tween 20を含有する0.05Mトリス/HCl緩衝液(pH7.5))により3回洗浄
した。試料(10μL/ウェル)及びアッセイ緩衝液(50μL/ウェル、0.9%NaCl、0.05%デオキ
シコール酸ナトリウム及び1% Nonidet P40置換体を含有する0.05Mトリス/HCl(pH7.5))を
、ウェルへ添加し、4℃で一晩インキュベーションした。試料及びアッセイ緩衝液の混合
物をデカントし、ウェルを洗浄緩衝液(200μL/ウェル)で3回洗浄した。ビオチン化されア
フィニティ精製されたポリクローナル抗-ヒストン変種macroH2A1.1検出抗体の溶液を添加
し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに攪拌しながら、室温で90分間インキュベーションした。
過剰な検出抗体をデカントし、再度ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄
した。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を含有する溶液
を添加し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベーション
した。過剰な複合体をデカントし、ウェルを再度、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回
洗浄した。呈色基質溶液(100μL/ウェル、2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6
-スルホン酸]-ジアンモニウム塩)を添加し、穏やかに攪拌しながら、室温で20分間インキ
ュベーションした。ウェルの光学密度(OD)を、標準マイクロタイタープレートリーダーを
用い、波長405nmで測定した。ヌクレオソームに会合されたヒストン変種macroH2A2濃度を
増加することにより増加する色の用量反応曲線が認められ、ヒストン変種macroH2A2非存
在(ウシ胎仔血清)下では、低いバックグラウンドシグナルが認められた。陽性ELISAシグ
ナルは、(i)試料中に、遊離のヒストンは存在せず、且つ(ii)使用した捕獲抗体は、無傷
のヌクレオソーム内のヒストンに結合し、且つヒストンH2には結合しないので、ELISAに
より検出されたヒストン変種macroH2A2は、ヌクレオソーム内に組み込まれていることを
指摘している。これらの結果は、図2に示している。
DNA及びタンパク質が安定のために架橋されているMCF7細胞から抽出されたクロマチン
の消化により生成された市販のヌクレオソーム調製品(存在する全てのヒストンが無傷の
ヌクレオソーム中に組み込まれていることを確実にするため)を、無傷のヌクレオソーム
に結合し且つヒストンH2には結合しない固相抗-ヒストン捕獲抗体、及びビオチン化され
たアフィニティ精製されたポリクローナル抗-ヒストン変種H2AZ検出抗体を使用する、ヌ
クレオソームに会合されたヒストン変種H2AZに関するELISA法を用い、試験した。アッセ
イ手順の詳細は、先の実施例2に説明したものに類似している。ヌクレオソームに会合さ
れたヒストン変種H2AZ濃度を増加することにより増加する色の再現可能な用量反応曲線が
認められ、ヌクレオソームに会合されたヒストン変種H2AZ非存在(ウシ胎仔血清)下では、
低いバックグラウンドシグナルが認められた。陽性ELISAシグナルは、(i)試料中に、遊離
のヒストンは存在せず、且つ(ii)使用した捕獲抗体は、無傷のヌクレオソーム内のヒスト
ンに結合し、且つヒストンH2には結合しないので、検出されたヒストン変種macroH2A2は
、ヌクレオソーム内に組み込まれていることを指摘している。これらの結果は、図3に示
している。
本発明者らは、健常対象20名から採取した血清及び血漿の血液試料の循環無細胞系ヌク
レオソーム含量を測定するために、現在の技術の2つのヌクレオソームELISA法を使用した
。第一の現在のELISA法(ELISA 1)は、ロッシュ細胞死検出ELISAであり、他方(ELISA 2)は
、抗-ヒストン捕獲抗体及び抗-ヒストン-DNA複合体検出抗体を利用するELISAである。両
方の現在のヌクレオソームELISA法により検出したヌクレオソームレベルは両方共、正常
血漿中において、正常血清中よりもより低かった。ヌクレオソームの血清レベルに関する
正常範囲(光学密度単位で表される)を計算し(20名の健常対象の血清の結果の平均±平均
の2標準偏差)、ELISA 1に関して0〜4.3 OD単位、及びELISA 2に関して0〜1.4であった。
血漿に関する各々の範囲は、0〜0.95及び0〜0.96であった。これらの結果は、図4に示し
ている。
種のヌクレオソームに会合されたヒストン変種mH2A1.1、mH2A2及びH2AZを含むヌクレオソ
ームのレベルも測定した。これらの結果は、健常対象から採取した血清試料は、ヒストン
変種又はPTM又はヌクレオチドを含有するヌクレオソームの、均一に低いレベルを有する
ことを示している。ヒストン変種、PTM又はヌクレオチドを含有するヌクレオソームの血
清レベルに関する正常範囲(光学密度で表される)は以下であった;(a)mH2A1.1について、
0〜0.36、(b)mH2A2について、0.05〜0.78、(c)H2AZについて、0.11〜0.58、(d)P-H2AX(Se
r139)について、0.06〜0.61、(e)5-メチルシトシンについて、0.06〜0.36、及び(f)5-ヒ
ドロキシメチルシトシンについて、0.03〜0.36。測定したEDTA血漿の結果は、健常対象20
名全てについてより高かった。これらの結果は、図5、図6、図7、図8、図9及び図10に示
している。
本発明者らは、健常対象13名、並びに胃、大腸、直腸、肺(小細胞癌及び様々な非小細
胞癌)、乳房、卵巣、前立腺、腎臓の癌及び様々な口腔癌(口腔、口蓋、咽頭及び喉頭)を
伴う対象55名から採取したEDTA血漿中の無細胞系ヌクレオソームを測定した。健常対象及
び癌患者由来の試料全てが、無細胞系ヌクレオソームについて陽性であった。しかし、癌
対象から採取した試料中に検出されたレベルは、健常対象由来の試料において認められた
レベルよりも高く、これらの結果は、健常対象と癌対象を識別することができることを示
した。例えば、H2AZヌクレオソームアッセイに関する、平均±該平均の2標準偏差として
のOD項目において算出された正常範囲は、0〜0.95であった。このカットオフレベル0.95
を使用すると;上昇したヌクレオソームH2AZレベルについて、健常対象13名全員陰性であ
った。対照的に、上昇したヌクレオソームH2AZレベルについて陽性の結果が、55種の癌試
料中46について認められ(全般的臨床感受性84%)、これは胃癌試料の100%(8中8)、大腸
癌試料の100%(5中5)、直腸癌試料の67%(3中2)、小細胞肺癌試料の83%(6中5)、非小細
胞肺癌試料の79%、乳癌試料の50%(6中3)、卵巣癌試料の100%(1中1)、膵臓癌試料の100
%(1中1)、前立腺癌試料の80%(5中4)、腎臓癌試料の100%(1中1)及び口腔癌試料の100%
(5中5)であった。これらの結果は、図19に示している。
あった。このカットオフ値を使用し、13種の健常試料は全て陰性であり、且つ癌試料の64
%(55中35)は陽性であった。ヌクレオソームに会合されたP-H2AX(Ser139)アッセイに関し
て、正常範囲は0〜1.08であった。このカットオフ値を使用し、13種の健常試料は全て陰
性であり、且つ癌試料の60%(55中33)は陽性であった。ヌクレオソームに会合された5-メ
チルシトシンも測定し、このアッセイの正常範囲は、0〜1.41であった。このカットオフ
値を使用し、13種の健常試料は全て陰性であり、且つ癌試料の55%(55中30)は陽性であっ
た。
会合された構造を測定した。これらの免疫検定の結果を集計し、5-メチルシトシンを含有
するヌクレオソームの検出されたレベルに対し規準化された、癌患者から採取した試料中
のヌクレオソーム構造のプロファイルを提供した。本発明者らは、得られたプロファイル
を、健常対象から採取した試料のヌクレオソーム構造と比較した。無細胞系ヌクレオソー
ムのヌクレオソーム構造プロファイルは、健常対象のプロファイルとは異なることがわか
った。これらの結果は、図23に示している。本発明者らは同様に、様々な非癌疾患から採
取した試料に関するヌクレオソーム構造プロファイルを集計し、これらを、癌患者から及
び健常対象から採取した試料中のヌクレオソームのプロファイルと比較した。これらの結
果は、図24に示している。
の試料を含む、別の類似実験を行った。その結果は、第一の実験に類似していた。例えば
、ヌクレオソームに会合されたヒストン変種H2AZに関する結果及び健常対象に関する結果
の平均+該平均の2標準偏差のカットオフを使用し、陰性結果が、健常対象10名全員につ
いて得られ、陽性結果が、癌患者の95%(62中59)について得られ、これは前立腺癌患者の
9名中9名、皮膚癌患者5名中5名、食道癌患者8名中6名、膀胱癌患者13名中12名、頸部癌患
者2名中2名及び結腸癌患者1名中1名、乳癌患者4名中4名、卵巣癌患者7名中7名、喉頭癌患
者7名中7名、肺癌患者3名中3名及び腎臓癌患者3名中3名を含んだ。この結果は、ヌクレオ
ソームに会合されたヒストン変種は、癌の臨床感受性のあるバイオマーカーであることを
指摘している。これらの結果は、図20に示している。
本発明者らは、現在の技術の2種のヌクレオソームELISA法を使用し、Holdenriederの方
法(*Holdenriederらの文献、2001)に従い、結腸癌対象3名、肺癌対象13名、膵臓癌対象2
名、口腔癌対象1名から採取したEDTA血漿試料、及び健常対象から生成されたヌクレオソ
ーム試料の循環無細胞系ヌクレオソーム含量を測定した。第一の現在のELISA法(ELISA 1)
は、ロッシュ細胞死検出ELISAであり、他方(ELISA 2)は、抗-ヒストン捕獲抗体及び抗-ヒ
ストン-DNA複合体検出抗体を利用するELISAである。
するヌクレオソームのレベルも測定した。これらの結果は、ほとんどの対象について、特
に膵臓癌及び口腔癌の患者について、現在の技術のELISA法について低いヌクレオソーム
結果が検出されたが、これらの試料のほとんどは、1種以上のヌクレオソームに会合され
た変種ヒストンを含むヌクレオソームのより高い検出可能なレベルを有したことを示して
いる。結腸癌対象3名、肺癌対象13名、膵臓癌対象2名、及び口腔癌対象1名から採取した
試料に関する結果は、各々、図11、図12、図13及び図14に示している。有意なヌクレオソ
ームに会合されたヒストン変種レベルが、癌試料19種中16(3種の肺癌試料以外全て)にお
いて検出された。加えて、ヌクレオソームに会合された5-ヒドロキシメチルシトシンが、
癌試料19種中12において検出され、及びヌクレオソームに会合された5-メチルシトシンが
、19種の癌試料全てにおいて検出された。
の対象に関して均一ではないが、試験した異なる癌について異なるパターンを示している
。同じ癌又は異なる癌を伴う対象の結果間の比較を促進するために;ヌクレオソーム試験
(macroH2A1.1、macroH2A2、H2AZ、P-H2AX(Ser139)、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメ
チルシトシンを含有するヌクレオソームに関して)の結果を、5-メチルシトシンを含有す
るヌクレオソームに関して観察されたODシグナルの割合として規準化した。これらの規準
化された結果(2以上の対象由来の試料を試験した場合の結果の標準偏差を示すエラーバー
を伴う)を、各癌について図15に示し、更に健常対象から生成されたヌクレオソーム試料
に関する同じ結果を示した(mH2A2及び5-ヒドロキシメチルシトシンは、この試料について
測定しなかった)。図15は、調べた4種の癌全てにおいて、異なる規準化されたヒストン変
種、ヌクレオチド又はPTMを含有するヌクレオソームの分布パターンは、健常対象由来の
試料中のヌクレオソームの分布とは極めて顕著に異なることを示している。従って本発明
は、単純な血液ベースのスクリーニング試験において癌を検出する方法として使用するこ
とができる。本発明は、腫瘍又は他の疾患起源の循環無細胞系ヌクレオソーム間の更なる
又はより良い識別のために、他の更なるヒストン変種、ヌクレオチド及び/又はヒストン
修飾を含有するヌクレオソームの試験を含むことは、当業者には明らかであろう。
;口腔癌を伴う対象から採取した試料は、他の3種の癌型のいずれかよりも、mH2A2又はP-
H2AX(Ser139)を含有する両ヌクレオソームのより低い規準化されたレベルを有する。同様
に、膵臓癌対象由来の試料は、変種macroH2A1.1を含有するヌクレオソームの異なる規準
化されたレベルを基に、結腸癌対象由来の試料から区別することができる。従って本発明
は、一般に癌を診断し、且つ特定の癌型を区別する方法として使用することができる。本
発明は、様々な特異的腫瘍起源の又は他の疾患起源の循環無細胞系ヌクレオソームの間を
更に又はより良く識別するために、他の更なるヒストン変種及び/又はヒストン修飾及び
/又はヌクレオチドを含有するヌクレオソームを試験することを含むことは、当業者には
明らかであろう。
本発明者らは、先に記載した本発明の方法を使用し、健常対象4名から採取した血清試
料及び膵臓癌対象から採取した20種の血清試料中の、ヌクレオソームに会合されたヒスト
ン変種レベルを測定した。カットオフレベル0.27(健常患者において認められたレベルの
平均+2標準偏差)を使用し、ヌクレオソームに会合されたH2AZレベルは、膵臓癌患者から
採取した試料の80%(20中16)において上昇したが、健常対象では上昇しなかった。これら
の結果は、図21に示している。
本発明者らは、実施例3に説明したように、ビオチン化された抗-H2AZ検出抗体を使用し
、癌患者から採取したいくつかのヒト試料のヌクレオソームに会合されたヒストンH2AZレ
ベルを測定した。この方法は、2種の異なるモノクローナルのクローン性抗-ヒストン捕獲
抗体を使用し2回行い、H2AZの結果が異なる捕獲抗体について再現可能であるかどうかを
決定した。図16の結果は、これら2つのアッセイのヌクレオソームに会合されたヒストンH
2AZレベルは、切片ほぼ0であるベストフィットのラインに関して線形であることを示して
いる。これらの単位は、単純な光学密度測定値である。
本発明者らは、実施例3に説明されたように、肺癌患者から採取したヒトEDTA血漿試料
のヌクレオソームに会合されたヒストンH2AZレベルを測定した。検出したレベルを、患者
の疾患進行と相関させた。図22に示した結果は、ヌクレオソームに会合されたヒストンH2
AZレベルは、サイズ、病期、結節の播種及び遠位転移性播種に関する疾患の重篤度と共に
増加し、且つヌクレオソームに会合されたヒストンH2AZレベルは、結節、サイズ、病期又
は転移の疾患進行の指標として、単独で又は診断パネルの一部として、使用することがで
きることを指摘している。
(構成1)
癌、心筋症、全身性紅斑性狼瘡、大腸炎、慢性閉塞性肺疾患、クローン病及び関節リウマチの診断用バイオマーカーとして使用するための、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有する、無細胞系ヌクレオソーム。
(構成2)
前記ヌクレオソームが、モノヌクレオソーム又はオリゴヌクレオソームである、構成1記載の使用のためのヌクレオソーム。
(構成3)
前記ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有する無細胞系ヌクレオソームが、血液試料中で測定される、構成1又は2記載の使用のためのヌクレオソーム。
(構成4)
前記癌が、膀胱、乳房、結腸、頸部、食道、腎臓、大腸、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、皮膚又は胃の癌である、構成1〜3のいずれか一項記載の使用のためのヌクレオソーム。
(構成5)
前記癌が、結腸、肺、口腔又は膵臓の癌である、構成4記載の使用のためのヌクレオソーム。
(構成6)
試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該試料を、該ヒストン変種又はヒストンアイソフォームに結合する結合剤と接触させる工程;
(ii)該結合剤の、該試料中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iii)該試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォーム又はヒストン変種若しくはヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成7)
試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該試料を、ヌクレオソームに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は試料を、該ヒストン変種又はヒストンアイソフォームに結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該試料中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成8)
試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該試料を、該ヒストン変種又はヒストンアイソフォームに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は試料を、ヌクレオソームに結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該試料中のヌクレオソームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該試料中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成9)
前記ヒストンアイソフォームが、ヌクレオソームそれ自身を試験するために、全ての又はほとんどのヌクレオソームにおいて生じる共通ヒストンアイソフォームである、構成6〜8のいずれか一項記載の方法。
(構成10)
前記ヒストンに結合するために使用される結合剤が、該ヒストン部分の全て又はほとんどのヒストン変種又はアイソフォームに共通であり、且つヌクレオソームそれ自身を試験するために、全ての又はほとんどのヌクレオソームにおいて生じる、該ヒストンの領域に結合するように標的化される、構成6〜9のいずれか一項記載の方法。
(構成11)
前記結合剤が、抗体である、構成6〜10のいずれか一項記載の方法。
(構成12)
前記試料が、生物学的液体である、構成6〜11のいずれか一項記載の方法。
(構成13)
前記試料が、血液、血清又は血漿である、構成6〜12のいずれか一項記載の方法。
(構成14)
細胞中の、構成6〜13のいずれか一項記載のヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)細胞からクロマチンを単離する工程;
(ii)該クロマチンを消化するか、音波処理するか又は別様に破壊し、モノヌクレオソーム及び/又はオリゴヌクレオソームを形成する工程;並びに
(iii)構成6〜13のいずれか一項記載の方法に従い、該ヌクレオソーム中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームの存在を検出又は測定する工程:
を含む、前記方法。
(構成15)
血液、血清又は血漿試料中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)遊離のヒストン変種又はアイソフォーム部分を生成するために、ヌクレオソーム複合体から、ヒストン変種又はアイソフォームを除去、放出又は抽出する工程;
(ii)該試料中の遊離のヒストン変種又はアイソフォームを検出又は定量する工程;並びに
(iii)該試料中のヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、遊離のヒストン変種又はアイソフォームの存在又は量を使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成16)
動物又はヒト対象における疾患状態を検出又は診断する方法であって:
(i)対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象の疾患状態を同定するために検出されたヌクレオソームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソフォームレベルを使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成17)
医学治療に関する適性について動物又はヒト対象を評価する方法であって:
(i)対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象に関する好適な治療の選択のためのパラメータとして、検出されたヌクレオソームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソフォームレベルを使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成18)
動物又はヒト対象の治療をモニタリングする方法であって:
(i)該対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;
(ii)1回以上にわたって対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの検出又は測定を反復する工程;並びに
(iii)該対象の状態の何らかの変化に関するパラメータとして、検出されたヌクレオソームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソフォームレベルの何らかの変化を使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成19)
前記ヌクレオソームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソフォームが、測定のパネルの一つとして検出又は測定される、構成16〜18のいずれか一項記載の方法。
(構成20)
動物又はヒト対象における疾患状態を検出又は診断するためのヒストン変種又はヒストンアイソフォームバイオマーカーを同定する方法であって:
(i)該対象の体液中の、ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;
(ii)健常対象又は対照対象の体液中の、該ヒストン変種又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(iii)ヒストン変種又はヒストンアイソフォームが、疾患状態のバイオマーカーとして有用であるかどうかを同定するために、罹患対象及び対照対象において検出されたレベル間の差異を使用する工程:
を含む、前記方法。
(構成21)
構成20記載の方法により同定されるバイオマーカー。
(構成22)
ヒストン変種又はヒストンアイソフォーム若しくはそれらの部分成分、又はヒストン変種若しくはヒストンアイソフォーム若しくはそれらの部分成分の構造/形状の模倣体に特異的なリガンド又はバインダーを、構成6〜20記載の方法のいずれか一つに従う該キットの使用説明書と一緒に備える、ヌクレオソームに会合されたヒストン変種又はヒストンアイソフォームの検出のためのキット。
Claims (16)
- 体液試料中の癌の診断用バイオマーカーであって、ヒストンアイソフォームを含有する、無細胞系ヌクレオソームを含む、前記バイオマーカー。
- 前記ヌクレオソームが、モノヌクレオソーム又はオリゴヌクレオソームである、請求項1記載のバイオマーカー。
- 前記ヒストンアイソフォームを含有する無細胞系ヌクレオソームが、血液試料中で測定される、請求項1又は2記載のバイオマーカー。
- 前記癌が、膀胱、乳房、結腸、頸部、食道、腎臓、大腸、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、皮膚又は胃の癌である、請求項1〜3のいずれか一項記載のバイオマーカー。
- 前記癌が、結腸、肺、口腔又は膵臓の癌である、請求項4記載のバイオマーカー。
- 体液試料中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該体液試料を、該ヒストンアイソフォームに結合する結合剤と接触させる工程;
(ii)該結合剤の、該体液試料中のヒストンアイソフォームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iii)該体液試料中の、ヒストンアイソフォーム又はヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、前記方法。 - 体液試料中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該体液試料を、ヌクレオソームに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は体液試料を、該ヒストンアイソフォームに結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該体液試料中のヒストンアイソフォームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該体液試料中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、前記方法。 - 体液試料中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在を検出する方法であって:
(i)該体液試料を、該ヒストンアイソフォームに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は体液試料を、ヌクレオソームに結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該体液試料中のヌクレオソームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該体液試料中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、前記方法。 - 前記ヒストンアイソフォームが、ヌクレオソームそれ自身を試験するために、全ての又はほとんどのヌクレオソームにおいて生じる共通ヒストンアイソフォームである、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記ヒストンに結合するために使用される結合剤が、該ヒストン部分の全て又はほとんどのヒストンアイソフォームに共通であり、且つヌクレオソームそれ自身を試験するために、全ての又はほとんどのヌクレオソームにおいて生じる、該ヒストンの領域に結合するように標的化される、請求項6〜9のいずれか一項記載の方法。
- 前記結合剤が、抗体である、請求項6〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記体液試料が、血液、血清又は血漿である、請求項6〜11のいずれか一項記載の方法。
- 動物又はヒト対象における疾患状態を検出又は診断するためのデータを取得する方法であって:
(i)対象から得られた体液中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象の疾患状態を同定するために検出されたヌクレオソームに会合されたヒストンアイソフォームレベルを使用する工程:
を含み、
該疾患が癌である、前記方法。 - 医学癌治療に関する適性について動物又はヒト対象を評価するためのデータを取得する方法であって:
(i)対象から得られた体液中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象に関する好適な癌治療の選択のためのパラメータとして、検出されたヌクレオソームに会合されたヒストンアイソフォームレベルを使用する工程:
を含む、前記方法。 - 動物又はヒト対象の癌治療をモニタリングする方法であって:
(i)該対象から得られた体液中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;
(ii)1回以上にわたって対象から得られた体液中の、ヒストンアイソフォームを含有するヌクレオソームの検出又は測定を反復する工程;並びに
(iii)該対象の癌の状態の何らかの変化に関するパラメータとして、検出されたヌクレオソームに会合されたヒストンアイソフォームレベルの何らかの変化を使用する工程:
を含む、前記方法。 - 前記ヌクレオソームに会合されたヒストンアイソフォームが、測定のパネルの一つとして検出又は測定される、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
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