BR112014004584B1 - uso de uma variante de histona ou uma isoforma associada com um nucleossoma livre de células, kit para a detecção da dita variante de histona ou uma isoforma de histona, bem como métodos para detectar a presença das mesmas e métodos in vitro para detectar ou diagnosticar um estado de uma doença e para avaliar um animal ou indivíduo humano para adequação de um tratamento - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA DETECTAR NUCLEOSSOMAS CONTENDO VARIANTES DE HISTONA A invenção refere-se a um método para detectar e medir a presença de mono-nucleossomas e oligo-nucleossomas e nucleossomas que contêm variantes de histona particulares e a utilização de tais medições para a detecção e diagnóstico da doença. A invenção também refere-se a um método de identificar biomarcadores de variante de histona para a detecção e diagnóstico da doença e aos biomarcadores identificados pelo dito método.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A invenção refere-se a um método para detectar e medir a presença de mono-nucleossomas e oligo-nucleossomas e nucleossomas que contêm variantes de histona particulares e a utilização de tais medições para a detecção e diagnóstico da doença. A invenção também refere-se a um método de identificar biomarcadores de variante de histona para a detecção e diagnóstico da doença e aos biomarcadores identificados pelo dito método.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]O corpo humano compreende várias centenas de tipos de células. Todos destes tipos de células contêm o mesmo genoma, mas têm fenotipos muito diferentes e funções diferentes no corpo. Esta diversidade fenotípica é devido à expressão diferencial do genoma em tipos de células diferentes. O controle de expressão gênica diferencial não é inteiramente entendido, mas os mecanismos básicos incluem regulação gênica por vários sinais epigenéticos interconectados associados com o gene, incluindo controle do empacotamento cromatínico como eucromatina ou heterocroma- tina, controle de posicionamento do nucleossoma e sítios acessíveis de nuclease, me- tilação de DNA e variação na estrutura dos nucleossomas em torno de que o DNA está envolto.

[003]O nucleossoma é a unidade básica de estrutura da cromatina e consiste em um complexo de proteína de oito histonas nucleares altamente conservadas (compreendendo um par de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4). Em torno deste complexo são envoltos aproximadamente 146 pares de bases de DNA. Uma outra histona, H1 ou H5, atua como uma ligadora e é envolvida em compactação da croma- tina. O DNA enrola-se em torno de nucleossomas consecutivos em uma estrutura, dito muitas vezes se assemelhar a “contas em um colar” e este forma a estrutura básica de abertura ou eucromatina. Em compactada ou heterocromatina, este colar é enrolado e super enrolado em uma estrutura fechada e complexa (Herranz e Esteller, 2007).

[004]A estrutura de nucleossomas pode variar por Modificação Pós-Transcri- cional (PTM) de proteínas de histona e pela inclusão de proteínas de histona variantes. PTM de proteínas de histona, tipicamente, ocorre nas caudas das histonas do núcleo e as modificações comuns incluem acetilação, metilação ou ubiquitinação de resíduos de lisina, assim como metilação de resíduos de arginina e fosforilação de resíduos de serina e muitos outros. Modificações de histona são conhecidas ser envolvidas em regulação epigenéticas de expressão gênica (Herranz e Esteller, 2007). A estrutura do nucleossoma também pode variar pela inclusão de isoformas de his- tona alternativas ou variantes que são diferentes produtos de gene ou splice e têm sequências de aminoácidos diferentes. As variantes de histona podem ser classificadas em várias famílias que são subdivididas em tipos individuais. As sequências de nucleotídeos de um grande número de variantes de histona são conhecidas e publicamentedisponíveis, por exemplo, na Base de Dados de Histona do National Human Genome Research Institute NHGRI (Marino-Ramírez, L., Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D., e Landsman, D. The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol, 2011. (Apresentada) e http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), Base de Dados do GenBank (sequência genética de NIH), Base de Dados da Sequência de Nucleotídeos de EMBL e Banco de Dados de DNA do Japão (DDBJ).

[005]A renovação celular normal em seres humanos adultos envolve a criação por divisão celular de algumas células 1011diariamente e a morte de um número similar, principalmente, por apoptose. Durante o processo de apoptose, a cromatina é discriminada nos mononucleossomas e oligonucleossomas que são liberados a partir das células. Sob condições normais, o nível de nucleossomas circulantes encontrado em indivíduos saudáveis relatou-se ser baixo. Níveis elevados são encontrados em indivíduos com uma variedade de condições incluindo muitos cânceres, doenças auto- imunes, condições inflamatórias, acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio (Holdenreider & Stieber, 2009).

[006]Os mononucleossomas e oligonucleossomas podem ser detectados por Ensaio de Imunoabsorvência por Ligação Enzimática (ELISA) e vários métodos foram relatados (Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al, 2003). Estes ensaios, tipicamente, utilizam um anticorpo anti-histona (por exemplo, anti-H2B, anti-H3 ou anti-H1, H2A, H2B, H3 e H4) como anticorpo de captura e um anticorpo do complexo anti-DNA ou anti-H2A-H2B-DNA como anticorpo de detecção. Utilizando estes ensaios, os trabalhadores de campo relatam que o nível de nucleos- somas no soro é mais alto (por até uma ordem de magnitude), do que nas amostras de plasma tomadas a partir dos mesmos pacientes. Isto também é verdadeiro para medições de soro e plasma de DNA feitas por PCR (Holdenrieder et al, 2005). A razão para isto não é conhecida, mas os autores especulam que pode ser devido à liberação adicional de DNA durante o processo de coagulação. Entretanto, descobrimos que os resultados de ensaios ELISA de nucleossoma da técnica atual não concorrem entre si. Além disso, embora o DNA mais circulatante no soro ou plasma seja relatado existir como mono-nucleossomas e oligo-nucleossomas (Holdenrieder et al, 2001), os níveis medidos de nucleossomas e DNA no soro ou plasma não concorrem tão bem. O coeficiente de correlação entre resultados de ELISA para os níveis de nucleossomas livres de células circulantes e os níveis de DNA circulante como medidos por PCR em tempo real (Reação em Cadeia da Polimerase) foi relatado ser r = 0,531 no soro e r = 0,350 no plasma (Holdenrieder et al, 2005).

[007]Os métodos de ELISA para o nucleossoma atuais são utilizados em cultura celular, principalmente como um método para detectar apoptose (Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al, 2003), e também são utilizados para a medição de nucleossomas livres de células circulantes no soro e plasma (Holdenrieder et al, 2001). Os níveis de nucleossoma livres de células no soro e plasma liberados na circulação por células morrendo foram medidos por métodos de ELISA em estudos de vários cânceres diferentes para avaliar sua utilização como um biomarcador potencial (Holdenrieder et al, 2001). Os níveis de nucleossoma circulantesmédios relataram-se ser altos na maioria, mas nem todos, cânceres estudados. Os níveis de nucleossoma circulantes mais altos foram observados em indivíduos com câncer de pulmão. Os níveis mais baixos foram observados em câncer de próstata, que estavam dentro da faixa normal de indivíduos saudáveis. Entretanto, os pacientes com tumores malignos relataram-se ter concentrações de nucleossoma no soro que variaram consideravelmente e alguns pacientes com doença com tumor avançado verificaram-se ter níveis de nucleossoma circulantes baixos, dentro da faixa medida para indivíduos saudáveis (Holdenrieder et al, 2001). Por causa disto e da variedade de causas não-cancerosas de níveis de nucleossoma elevados, níveis de nucleossoma circulantes não são utilizados clinicamente como um biomarcador de câncer (Holden- rieder e Stieber, 2009). Surpreendentemente, demonstramos que muitos indivíduos com câncer dos quais os níveis de nucleossoma circulantes são baixos ou indetectá- veis como medido por estes métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual, de fato têm níveis elevados de nucleossomas livres de células circulantes. Projetamos e demonstramos novos métodos de ELISA para nucleossomas que detectam os nu- cleossomas não detectados por métodos de ELISA da técnica atual.

[008]Os métodos de ELISA para a detecção de PTMs de histona também são conhecidos na técnica. Os métodos de ELISA para a detecção de PTM em proteínas de histona livres (não ligadas a outras histonas e DNA em um complexo de nucleos- soma) são utilizados para a detecção de PTMs em histonas extraídas, usualmente, por extração de ácido, a partir de lisatos celulares. O imunoensaio para a detecção de PTMs em nucleossomas livres de células circulantes foi relatado (Bawden et al, 2005). Um método para a detecção por ELISA de PTMs de histona em nucleossomas purificados diretamente revestido em poços de microtitulação, recentemente foi relatado (Dai et al, 2011). Neste método, os nucleossomas obtidos por digestão de extratos de cromatina a partir de células cultivadas são revestidos diretamente em poços de mi- crotitulação e reagidos com anticorpos anti-PTM. Será claro para aqueles habilitados na técnica que este método necessita de amostras de nucleossoma relativamente puras e não é adequado para a medição direta de PTMs de histona no meio biológico complexo, tal como sangue ou soro.

[009]Um método de imunoprecipitação da cromatina modificada (ChIP) para a detecção de uma PTM de histona (H3K9Me, histona H3 monometilada em resíduo de lisina K9) em nucleossomas livres de células associados com uma sequência de DNA particular foi relatado no plasma. O nível de metilação de histona de sequência específica foi relatado ser independente da concentração de nucleossomas circulantes (Deligezer et al, 2008).

[0010]Além da sinalização epigenética mediada por posição do nucleossoma e estrutura do nucleossoma (em termos de tanto variante de proteína de histona constituinte e estruturas de PTM), controle de expressão gênica em células também é mediado por modificações de nucleotídeos de DNA incluindo a estado de metilação da citosina DE DNA. Tem sido conhecido na técnica durante algum tempo que o DNA pode ser metilado na posição 5 de nucleotídeos de citosina para formar 5-metilcito- sina. DNA metilado na forma de 5-metilcitosina relatou-se ocorrer em posições na Sequência de DNA onde um nucleotídeo de citosina ocorre próximo a um nucleotídeo de guanina. Estas posições são denominadas “CpG” para a forma abreviada. Tem sido relatado que mais do que 70 % de posições CpG são metilados em vertebrados (Pen- nings et al, 2005). As regiões do genoma que contêm uma alta proporção de sítios CpG são frequentemente denominadas “ilhas CpG”, e aproximadamente 60 % de sequências promotoras de gene humano são associados com tais ilhas CpG (Rodriguez- Paredes e Esteller, 2011). Nos genes ativos, estas ilhas CpG são geralmente hipome- tiladas. As sequências promotoras de metilação de gene é associada com a inativação do gene estável. Metilação de DNA também comumente ocorre em elementos repetitivos incluindo elementos repetitivos Alu e elementos de nucleotídeo intercalados longos (Herranz e Estellar, 2007; Allen et al, 2004).

[0011]O envolvimento de metilação de DNA no câncer foi relatado já no ano de 1983 (Feinberg e Vogelstein, 1983). Os padrões de metilação de DNA observados em células cancerosas diferem das de células saudáveis. Os elementos repetitivos, particularmente em torno de áreas pericentroméricas, relataram-se ser hipometiladas no câncer em relação às células saudáveis, mas os promotores de genes específicos foram relatados ser hipermetilados no câncer. O equilíbrio destes dois efeitos relatou- se resultar em hipometilação de DNA geral nas células cancerosas (Rodriguez-Pare- des; Esteller, 2007).

[0012]A hipermetilação de certos genes específicos pode ser utilizada como um biomarcador de diagnóstico para cânceres. Por exemplo, um método relatado para a detecção de hipermetilação do gene Septin 9 por amplificação de PCR de DNA extraído a partir do plasma foi relatado detectar 72 % de cânceres de cólon com uma taxa de falsos positivos de 10 % (Grutzmann et al, 2008). O estado de metilação de DNA de genes específicos ou lócus é usualmente detectado por desaminação de bis- sulfito seletiva de citosina, mas não 5-metilcitosina, para uracila, levando a uma mudança de sequência de DNA primária que pode ser detectada por sequenciamento ou outros meios (Allen et al, 2004).

[0013]A hipometilação de DNA geral é uma particularidade de células cancerosas (Estellar 2007 e Hervouet et al, 2010). A metilação de DNA geral pode ser estudado em células utilizando técnicas de imuno-histoquímica (IHC). Alternativamente, o DNA é extraído a partir das células para análise. Vários métodos foram relatados para a detecção de metilação geral em DNA extraído a partir de células incluindo digestão de restrição e análise de vizinho mais próximo, ensaios fluorescentes utili-zandocloracetaldeído, determinação inversa por metilação de todos os sítios CpG utilizando DNA metiltransferase em conjunto com S-adenosil metionina marcado com trítio para calcular a quantidade de CpG não metilada e digestão de DNA em nucleo- tídeos únicos para análise por cromatografia líquida de alto desempenho, cromatogra- fia de camada delgada, ou cromatografia líquida seguido por espectroscopia de massas. As desvantagens destes métodos são que eles são trabalho intenso e/ou necessitam de grandes quantidades de DNA extraído de boa qualidade (Allen et al 2004). Métodos à base de PCR envolvendo a desaminação de bissulfito supera a necessidade de grandes quantidades de DNA, mas deve amplificar regiões de genoma específicas, sequências tipicamente repetitivas, como indicativo do teor do genoma total de 5-metilcitosina (Allen et al 2004). Estes métodos para a metilação de medição geral de DNA foram utilizados para estudar o DNA extraído de uma variedade de células e tecidos. Alguns trabalhadores estudaram o DNA extraído de glóbulos brancos no sangue total como este é mais fácil de obter em uma maneira minimamente invasiva (Moore et al, 2008; Ting Hsiung et al, 2007; Mansour et al, 2010). A cromatografia líquida com espectrometria de massas é considerada o padrão ouro para a metilação de medição geral de DNA, mas ela é cara, e o DNA deve ser digerido ao nível de nucleotídeo único antes da análise (Vasser et al, 2009).

[0014]Os métodos recentes para a estimativa de metilação de DNA geral incluem cromatografia líquida ultra-alta pressão com espectrometria de massas de DNA extraído hidrolisado de tecido (Zhang et al, 2011) e um método de sequenciamento digital de metilação específica (MSDS) (Ogoshi et al 2011). Um imunoensaio competitivo clássico para a metilação de DNA geral (assim como, um ensaio similar para metilação de 5-hidroximetilcitosina geral) foi descrito. Neste método, DNA extraído a partir de células ou tecidos é adicionado a um poço de microtitulação revestido com um conjugado de citidina 5-metilada, um anticorpo anti-5-metilcitidina é adicionado e a distribuição de anticorpo que se liga entre o conjugado de 5-metilcitidina revestido e o DNA metilado na amostra extraída é comparada àquela de padrões conhecidos estimar o nível de metilação de DNA geral presente na amostra (Cell Biolabs, 2011). Em um outro imunoensaio semelhante ao método de DNA extraído de amostras de tecidos ou plasma ou soro é revestido a um poço de microtitulação e DNA metilado é detectado utilizando um anticorpo anti-5-metilcitosina (Vasser, et al, 2009; Epigentek, 2009). Uma desvantagem destes métodos é que eles necessitam de extração de DNA envolvendo a desnaturação e remoção de todos os nucleossomas e estrutura da cromatina a partir do DNA. Eles não são adequados, por exemplo; para a medição direta de metilação de DNA geral em fluidos biológicos, tais como lisato de tecido, sangue, plasma ou soro sem uma etapa de extração de DNA.

[0015]A modificação de 5-hidroximetila de bases de citosina no DNA também foi relatada. O papel da 5-hidroximetilação não é ainda bem entendido, mas parece estar envolvida na regulação gênica (Stroud et al, 2011).

[0016]Os métodos atuais para a detecção de metilação de DNA geral envolve a extração ou purificação do DNA e não são adequados para os métodos de diagnósticosrápidos, de alto rendimento, de baixo custo, minimamente invasivos. Similarmente, a análise de DNA para outras bases modificadas ou não usuais (por exemplo, uracila, inosina, xantina e hipoxantina) pode ser apenas investigada pela análise de DNA substancialmente puro ou extraído. Tal análise não pode ser realizada diretamente em meio biológico complexo, tal como lisato de tecido, sangue, plasma ou soro.

[0017]As variantes de histona (também conhecidas como isoformas de his- tona) também são conhecidas ser reguladoras epigenéticas de expressão gênica (Herranz e Esteller, 2007). As variantes de histona foram estudadas in vivo e in vitro utilizando uma variedade de técnicas incluindo estudos de knock-down do gene que codifica uma variante particular (por exemplo, utilizando RNAi knock-down), imuno- precipitação de cromatina, marcação de isótopo estável de aminoácidos e proteômi- cas de espectrometria de massas quantitativas, imuno-histoquímica e Western Blotting (Whittle et al, 2008; Boulard et al, 2010; Sporn et al, 2009; Kapoor et al, 2010; Zee et al, 2010; Hua et al, 2008).

[0018]Estudos de imuno-histoquímica de expressão de variante de histona em amostras de tecido removidas em cirurgia ou por biópsia de indivíduos diagnosticados com câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma foram relatados. Estes estudos de imuno-histoquímica relatam que a coloração de histona macroH2A (mH2A) e variantes de H2AZ em amostras de tecido de câncer ressecadas pode ter aplicação prognósticanestes cânceres (Sporn et al, 2009, Hua et al, 2008, Kapoor et al, 2010). Uma desvantagem de métodos imuno-histoquímicos para a utilização clínica é que a coleta de amostra de tecido é invasiva envolvendo cirurgia ou biópsia. Uma outra desvantagem de métodos imuno-histoquímicos é que eles são inadequados para o diagnóstico precoce ou para os diagnósticos de triagem como uma expectativa razoável da do-ença deve usualmente já existir antes de uma biópsia ou ressecção de tecido ser feita. Os testes de ELISA no sangue minimamente invasivos são adequados para uma faixa mais ampla de aplicações e superariam estas desvantagens e seriam preferíveis para o paciente, assim como mais rápidos, de menor custo e de rendimento mais alto para o prestador de cuidados de saúde.

[0019]Entretanto, os nucleossomas livres de células contendo nucleotídeos particulares, nucleotídeos modificados ou variantes de histona não foram medidos no sangue ou qualquer outro meio e nenhuma tais medições foram sugeridas ou consideradas. Nenhum estudo na presença ou ausência de nucleotídeos, nucleotídeos modificados ou variantes de histona em nucleossomas livres de células no sangue foi relatado, nem se eles têm valor como biomarcadores sanguíneos de doença. Não existem correntemente métodos para a detecção ou medição de nucleotídeos, nucle- otídeos modificados ou variantes de histona em nucleossomas livres de células intactos. Vamos agora relatar os métodos para tais testes e sua utilização no plasma e amostras de soro tomadas de indivíduos saudáveis e doentes. Surpreendentemente, demonstramos que altos níveis de nucleossomas intactos compreendendo variantes de histona específicas podem ser detectados no plasma e nas amostras de soro para que nenhum nucleossoma, ou níveis baixos, sejam detectados por métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0020]De acordo com um primeiro aspecto da invenção é fornecido um nu- cleossoma livre de células compreendendo uma variante de histona ou isoforma de histona para a utilização como um biomarcador para o diagnóstico de câncer, cardio- miopatia, lúpus eritematoso sistêmico, colite, transtorno pulmonar obstrutivo crônico, doença de Crohn e artrite reumatoide.

[0021]De acordo com um segundo aspecto da invenção é fornecido um método para detectar a presença de um nucleossoma contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em uma amostra que compreende as etapas de: contatar a amostra com um agente de ligação que se liga à variante de histona ou isoforma de histona; detectar ou quantificar a ligação do dito agente de ligação à variante de his- tona ou isoforma de histona na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de nucleossomas contendo a variante de histona ou isoforma de histona na amostra.

[0022]De acordo com um terceiro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar a presença de um nucleossoma contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em uma amostra que compreende as etapas de: contatar a amostra com um primeiro agente de ligação que se liga aos nu- cleossomas; contatar os nucleossomas ou amostra com um segundo agente de ligação que se liga à variante de histona ou isoforma de histona; detectar ou quantificar a ligação do dito segundo agente de ligação à variante de histona ou isoforma de histona na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de nucleossomas contendo a variante de histona ou isoforma de histona na amostra.

[0023]De acordo com um quarto aspecto da invenção é fornecido um método para detectar a presença de um nucleossoma contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em uma amostra que compreende as etapas de: contatar a amostra com um primeiro agente de ligação que se liga à variante de histona ou isoforma de histona; contatar os nucleossomas ou amostra com um segundo agente de ligação que se liga aos nucleossomas; detectar ou quantificar a ligação do dito segundo agente de ligação aos nu- cleossomas na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de nucleossomas contendo a variante de histona ou isoforma de histona na amostra.

[0024]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar a presença de um nucleossoma contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em uma amostra de sangue, soro ou plasma que compreende as etapas de: remover, liberar ou extrair a variante ou isoforma de histona a partir do complexo de nucleossoma para produzir uma porção de variante ou isoforma de histona livre detectar ou quantificar a variante ou isoforma de histona livre na amostra; e utilizar a presença ou quantidade de variante ou isoforma de histona livre como uma medida da presença de nucleossomas contendo a variante de histona ou isoforma de histona na amostra.

[0025]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar a presença de um nucleossoma contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em uma célula que compreende as etapas de: isolar a cromatina a partir de uma célula; digerir, submeter a sonificação ou de outro modo quebrar a cromatina para formar mono-nucleossomas e/ou oligo-nucleossomas; e detectar ou medir a presença da variante de histona ou isoforma de histona nos ditos nucleossomas de acordo com um método da invenção.

[0026]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar ou diagnosticar um estado da doença em um animal ou um indivíduo humano que compreende as etapas de: detectar ou medir os nucleossomas contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em um corpo fluido de um indivíduo; e utilizar o nível de variante de histona ou isoforma de histona associada ao nucleossoma detectado para identificar o estado da doença do indivíduo.

[0027]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para avaliação de um animal ou um indivíduo humano de adequação para um tratamentomédico que compreende as etapas de: detectar ou medir os nucleossomas contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em um corpo fluido do indivíduo; e utilizar o nível de variante de histona ou isoforma de histona associada ao nucleossoma detectado como um parâmetro para a seleção de um tratamento adequado para o indivíduo.

[0028]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para monitorar um tratamento de um animal ou um indivíduo humano que compreende as etapas de: detectar ou medir os nucleossomas contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em um corpo fluido do indivíduo; repetir a detecção ou medição de nucleossomas contendo uma variante de histona ou isoforma de histona em um corpo fluido do indivíduo em uma ou mais ocasiões; e utilizar quaisquer alterações no nível de variante de histona ou isoforma de histona associada ao nucleossoma detectado como um parâmetro para quaisquer alterações na condição do indivíduo.

[0029]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método for identificar um biomarcador de variante de histona ou isoforma de histona para detectar ou diagnosticar um estado da doença em um animal ou um indivíduo humano que compreende as etapas de: detectar ou medir os nucleossomas contendo a variante de histona ou isoforma de histona em um corpo fluido do indivíduo; detectar ou medir os nucleossomas contendo a variante de histona ou isoforma de histona em um corpo fluido de um indivíduo saudável ou um indivíduo controle; e utilizar a diferença entre os níveis detectados em indivíduos doentes e controle para identificar se uma variante de histona ou isoforma de histona é útil como um biomarcador para o estado da doença.

[0030]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um biomar- cador identificado pelo dito método da invenção.

[0031]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um kit para a detecção de uma variante de histona ou isoforma de histona associada ao nucleos- soma que compreende um ligante ou ligando específico para a variante de histona ou isoforma de histona ou seu componente, ou um mimetismo estrutural/forma da variante de histona ou isoforma de histona ou seu componente, junto com as instruções para a utilização do kit.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032]Figura 1. Curva dose-resposta de ELISA para a detecção de nucleos- somas livres de células de seres humanos preparada por um método publicado (*Hol- denrieder et al, 2001) contendo variante de histona macroH2A1.1 diluída em soro de vitelo.

[0033]Figura 2. Curva dose-resposta de ELISA para a detecção de variante de histona macroH2A2 em nucleossomas livres de células em cromatina digerida por reticulação extraída de células MCF7 diluídas em soro de vitelo.

[0034]Figura 3. Curva dose-resposta de ELISA para a detecção de variante de histona H2AZ em nucleossomas livres de células em cromatina digerida por reticu- lação extraída de células MCF7 diluídas em soro de vitelo.

[0035]Figura 4. Níveis de nucleossoma detectados para as amostras de soro e plasma com EDTA tomadas de 20 voluntários saudáveis utilizando os métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual.

[0036]Figura 5. Níveis associados ao nucleossoma livre de células de variante de histona mH2A1.1 detectados para as amostras de soro e plasma com EDTA tomadas de 20 voluntários saudáveis utilizando o ELISA da invenção.

[0037]Figura 6. Níveis associados ao nucleossoma livre de células de variante de histona mH2A2 detectados para as amostras de soro e plasma com EDTA tomadas de 20 voluntários saudáveis utilizando o ELISA da invenção.

[0038]Figura 7. Níveis associados ao nucleossoma livre de células de variante de histona H2AZ detectados para as amostras de soro e plasma com EDTA tomadas de 20 voluntários saudáveis utilizando o ELISA da invenção.

[0039]Figura 8. Níveis associados ao nucleossoma livre de células de P H2AX(Ser139) detectados para as amostras de soro e plasma com EDTA tomadas de 20 voluntários saudáveis utilizando o ELISA da invenção.

[0040]Figura 9. Níveis associados ao nucleossoma livre de células de DNA metilado de 5-metilcitosina detectados para as amostras de soro e plasma com EDTA tomadas de 20 voluntários saudáveis utilizando o ELISA da invenção.

[0041]Figura 10. Níveis associados ao nucleossoma livre de células de DNA metilado de 5-hidroximetilcitosina detectados para as amostras de soro tomadas de 20 voluntários saudáveis utilizando o ELISA da invenção.

[0042]Figura 11. Níveis associados ao nucleossoma livre de células dos tipos de histonas e nucleotídeos detectados para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 3 indivíduos com câncer de cólon detectadas utilizando os métodos de ELISA da invenção.

[0043]Figura 12. Níveis associados ao nucleossoma livre de células dos tipos de histonas e nucleotídeos detectados para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 13 indivíduos com câncer de pulmão detectadas utilizando os métodos de ELISA da invenção.

[0044]Figura 13. Níveis associados ao nucleossoma livre de células dos tipos de histonas e nucleotídeos detectados para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 2 indivíduos com câncer pancreático detectadas utilizando os métodos de ELISA da invenção.

[0045]Figura 14. Níveis associados ao nucleossoma livre de células dos tipos de histonas e nucleotídeos detectado para uma amostra de plasma com EDTA tomada de 1 indivíduo com câncer de boca detectada utilizando os métodos de ELISA da invenção.

[0046]Figura 15. Níveis associados ao nucleossoma livre de células dos tipos de histonas e nucleotídeos detectados para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 4 doenças de câncer diferentes normalizadas como uma proporção de níveis de DNA metilado de 5-metilcitosina associado ao nucleossoma detectadas utilizando os métodos de ELISA da invenção. Níveis normalizados para uma amostra contendo nucleossomas de voluntários saudáveis produzidos pelo método de *Holdenrieder et al 2001 são mostrados para comparação.

[0047]Figura 16. Níveis de histona H2AZ associada ao nucleossoma livre de células de amostras de plasma com EDTA de seres humanos tomadas de pacientes com câncer medidos utilizando um anticorpo de detecção anti-H2AZ biotinilado com dois anticorpos de captura anti-histona monoclonais diferentes.

[0048]Figura 17. Níveis associados ao nucleossoma livre de células de mH2A1.1, H2AZ, P-H2AX(Ser139) e 5-metilcitosina (5mc) detectados em amostras de plasma com EDTA, plasma com citrato e plasma com heparina tomadas de voluntários saudáveis utilizando o método ELISA da invenção.

[0049]Figura 18. Níveis de 5-metilcitosina associada ao nucleossoma livre de células detectados para as amostras de soro tomadas de 3 voluntários saudáveis e 10 indivíduos com câncer de cólon detectadas utilizando o método ELISA da invenção.

[0050]Figura 19. Níveis de variante de histona H2AZ associada ao nucleos- soma livre de células detectados para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 13 voluntários saudáveis e 55 pacientes com câncer. Os pontos de corte definidos como o valor médio das amostras saudáveis mais um ou dois desvios padrão na médiasão mostrados.

[0051]Figura 20. Níveis de variante de histona H2AZ associada ao nucleos- soma livre de células detectados para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 10 voluntários saudáveis e 61 pacientes com câncer. O ponto de corte definido como o valor médio das amostras saudáveis mais dois desvios padrão na média é mostrado.

[0052]Figura 21. Níveis de variante de histona H2AZ associada ao nucleos- soma livre de células detectados para as amostras de soro tomadas de 4 voluntários saudáveis e 20 pacientes com câncer pancreático. O ponto de corte mostrado é definido como o valor médio das amostras saudáveis mais dois desvios padrão na média.

[0053]Figura 22. Níveis de variante de histona H2AZ associada ao nucleos- soma livre de células detectados para as amostras de plasma com EDTA tomadas de pacientes com câncer de pulmão com tamanho tumor aumentado, estágio e desenvolvimento nodal da doença.

[0054]N1 Metástase em linfonodos peribrônquicos ipsilaterais e/ou hilares ipsilaterais e nódulos intrapulmonares, incluindo envolvimento por extensão direta

[0055]N2 Metástase em linfonodo(s) mediastinal Iipsilateral e/ou subcarinal

[0056]N3 Metástase em linfonodo(s) mediastinal contralateral, hilar contralateral, escalênico ipsilateral ou contralateral, ou supraclavicular

[0057]T1: tumor < 3 cm

[0058]T2: 3 cm < tumor < 7 cm

[0059]T3: tumor > 7 cm

[0060]T4: tumor de qualquer tamanho que invade outro órgão, tecido

[0061]M0: nenhuma disseminação da doença além dos nódulos ninfa regionais

[0062]M1: propagação da doença em metastases à distância.

[0063]Figura 23. Níveis associados ao nucleossoma livre de células médios de nucleotídeos e tipos de histonas detectados utilizando os métodos de ELISA da invenção para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 10 doenças de câncer diferentes normalizadas como uma proporção de níveis de DNA metilado de 5-metil- citosina (5mc) associados ao nucleossoma e expressados em relação às proporções médias encontradas em 11 indivíduos saudáveis.

[0064]Figura 24. Níveis associados ao nucleossoma livre de células médios de nucleotídeos e tipos de histonas detectados utilizando os métodos de ELISA da invenção para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 2 pacientes com cardiomiopatia, 10 pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (lúpus), 12 pacientes com colite ulcerativa, 10 pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), 8 pacientes com doença de Crohn e 10 pacientes com artrite reumatoide (RA) normalizada como uma proporção de níveis de DNA metilado de 5-metilcitosina (5mc) associado ao nucleossoma e expressados em relação às proporções médias encontradas em 11 indivíduos saudáveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0065]De acordo com um primeiro aspecto da invenção é fornecido um nu- cleossoma livre de células compreendendo uma variante de histona ou isoforma de histona para a utilização como um biomarcador para o diagnóstico de câncer, cardio- miopatia, lúpus eritematoso sistêmico, colite, transtorno pulmonar obstrutivo crônico, doença de Crohn e artrite reumatoide.

[0066]Em uma forma de realização, o nucleossoma é um mononucleossoma ou oligonucleossoma.

[0067]De acordo com um aspecto particular da invenção que pode ser mencionado,é fornecido a utilização de uma variante de histona ou isoforma de histona como um biomarcador para o diagnóstico de câncer.

[0068]Em uma forma de realização, o câncer é um câncer de bexiga, mama, cólon, cérvix, esôfago, rim, intestino grosso, pulmão, cavidade oral, ovário, pâncreas, próstata, reto, pele ou estômago. Em uma forma de realização particular que pode ser mencionada, o câncer é um câncer de cólon, pulmão, cavidade oral ou pâncreas.

[0069]Desenvolvemos os testes de ELISA para a detecção e medição de nu- cleossomas contendo a variantes de histona macroH2A1.1 (mH2A1.1), macroH2A2 (mH2A2) e H2AZ. Utilizamos um anticorpo anti-histona como anticorpo de captura para estes ensaios em combinação com um anticorpo anti-variante de histona específica apropriado como anticorpo de detecção. Demonstramos que estes métodos de ELISA trabalham com anticorpos de captura anti-nucleossoma alternativos. Utilizamos também os ensaios para mostrar que os nucleossomas contendo variantes de histona específicas podem ser medido em amostras sanguíneas tomadas de indivíduos doentes e são discriminantes para a utilização como biomarcadores não-invasivos ou minimamente invasivos. Os níveis de variante de histona detectados em nucleosso- mas no soro e as amostras de plasma tomadas de indivíduos doentes, em relação a níveis de outros epítopos de nucleossoma, diferem daqueles detectados em amostras de indivíduos saudáveis. Além disso, o padrão de níveis de nucleossomas contendo variantes de histona diferentes detectados em nucleossomas em amostras de doenças diferentes verificou-se diferir para doenças diferentes, particularmente quando os padrões de variante de histona associada ao nucleossoma foram examinados em combinação com os padrões determinados para os nucleossomas contendo nucleotí- deos e PTMs diferentes, tal que um diagnóstico diferencial da doença foi possível. Será claro para aqueles habilitados na técnica que a inclusão de testes para nucleos- somas contendo modificações de variantes de histona ou histona ou nucleotídeos diferentes ou adicionais seria suscetível de melhorar a discriminação de diagnóstico diferencial utilizando tais padrões.

[0070]Aos níveis investigados de nucleossomas encontrados em indivíduos saudáveis utilizando os métodos da técnica atual, medimos os nucleossomas no soro e as amostras de plasma, tomados de 20 indivíduos saudáveis. Ambos os métodos da técnica atual produziram sinais mais altos em amostras de soro tomadas de indivíduossaudáveis do que em amostras de plasma. Os resultados são mostrados na Figura 4. Isto é compatível com os dados publicados, os quais os níveis de nucleos- soma são mais altos no soro do que no plasma (*Holdenrieder et al, 2001).

[0071]Aos níveis investigados de nucleossomas encontrados em indivíduos saudáveis utilizando os métodos da invenção, medimos os nucleossomas contendo as três variantes de histona no soro de 20 indivíduos saudáveis e em soro bovino saudável. Os resultados de soro para todos os três testes de ELISA foram todos baixos ou indetectáveis para todos os 20 indivíduos saudáveis. Conduzimos também um teste similar em amostras de plasma com EDTA, tomadas de 20 indivíduos saudáveis, para os três métodos de ELISA da invenção e, surpreendentemente, os sinais mais altos foram observados. Altos níveis de nucleossomas livres de células contendo a variantes de histona mH2A1.1, mH2A2, H2AZ assim como histona P-H2AX(Ser139) foram detectáveis por métodos da presente invenção no plasma com EDTA humano saudável, mais níveis mais baixos foram detectados em soro humano saudável como mostrado nas Figuras 5 a 8. As Figuras 9 e 10 mostram que resultados similares foram obtidos para outras estruturas do nucleossoma. Esta descoberta é inesperada e diferente tanto para resultados publicados (*Holdenrieder et al, 2001) quanto para os resultados que encontramos para os métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual. Assim, surpreendentemente, os métodos da invenção produzem resultados opostos aos métodos da técnica atual para os níveis relativos de nucleossomas que ocorrem nas amostras de soro e plasma com EDTA.

[0072]Investigamos se as estruturas do nucleossoma são detectáveis em todos os vários tipos comuns de plasma que podem ser coletados. Descobrimos que altos níveis de H2AZ, mH2A1.1 e P-H2AX(Ser139) associadas ao nucleossoma livre de células foram detectáveis pelo método da invenção no plasma com EDTA e, a uma extensão menor, no plasma com citrato tomado de indivíduos saudáveis, mas estas H2AZ, mH2A1.1 e P-H2AX(Ser139) associadas ao nucleossoma foram indetectáveis em sinais de fundo de tampão ou soro de cavalo no plasma com heparina tomado de indivíduos saudáveis. Algumas amostras de plasma com heparina (2 de 5) verificaram-se conter níveis detectáveis de 5-metilcitosina associada ao nucleossoma. Os resultados são mostrados na Figura 17. Para resumir, os nucleossomas livres de célulassão encontrados em concentrações relativamente altas na maioria das ou todas as amostras de plasma com EDTA e plasma com citrato tomadas de indivíduos saudáveis utilizando o método da invenção, mais são baixas ou ausentes nas amostras de plasma com heparina ou de soro tomadas de indivíduos saudáveis. Portando, é claro que a escolha precisa de tipo de amostra será crítico para aplicações diferentes.

[0073]Demonstramos que a seleção de amostra para a detecção de nucleos- somas livres de células contendo estruturas de histona particulares envolve vários parâmetros. Estes incluem os níveis baixos de nucleossomas livres de células geralmente presentes no soro e amostras de plasma com heparina tomadas de indivíduos saudáveis, os níveis mais altos geralmente presentes em amostras de plasma com EDTA e com citrato tomadas de indivíduos saudáveis, a recomendação de que as amostras de soro contendo nucleossomas livres de células devem ser estabilizadas pela adição de EDTA depois da separação do soro a partir do coágulo (*Holdenreider et al, 2001), e o protocolo de recolha de amostras de soro. Outros agentes estabili- zantes (por exemplo, inibidores de protease) também podem ser utilizados. Onde pos-sível, utilizamos as amostras de soro centrifugadas dentro de 1 hora de punção venosa depois de que EDTA 10mM foi adicionado e a amostra congelada.

[0074]A escolha do tipo de amostra sanguínea para amostras clínicas deve ser feita na base de discriminação clínica ideal para o teste particular. Seguindo a nossa constatação de níveis de nucleossoma consistentemente baixos pelo método da invenção no soro de indivíduos saudáveis, medimos os nucleossomas contendo as variantes de histona mH2A1.1 e H2AZ em amostras de soro tomadas de indivíduos com uma variedade de doenças de câncer. Sensibilidades clínicas de até 75 % para o câncer de pulmão e 80 % para o câncer pancreático (Figura 21) foram observadas. Testamos também as amostras de soro de pacientes com câncer para nucleossomas contendo 5-metilcitosina e observamos as sensibilidades clínicas de até 100 % como mostrado na Figura 18 para amostras de câncer de cólon.

[0075]Medimos também os níveis relativos de nucleossomas livres de células contendo várias variantes de histona e outras estruturas do nucleossoma em amostras de plasma com EDTA tomadas de indivíduos com uma variedade de doenças. Os níveis de nucleossomas livres de células são altos em amostras de plasma com EDTA tomadas tanto de indivíduos saudáveis quanto de indivíduos doentes e as amostras de plasma com EDTA seriam, portanto, provável de ser a melhor escolha de amostra para um discriminador sensível de indivíduos doentes e saudáveis. Entretanto, demonstramos que os níveis e a composição de nucleossomas livres de células circulantes, em termos dos níveis relativos de nucleossomas contendo variantes de histona diferentes (assim como, outras estruturas do nucleossoma), variam entre os indivíduos doentes e saudáveis e também entre doenças diferentes. Somos assim, o pri-meiro a relatar que tanto os (i) altos níveis de nucleossomas circulantes estão presentes em todas as ou na maioria das amostras de plasma com EDTA tomadas tanto de indivíduos saudáveis quanto de doentes, mas isto não é verdade para todos os tipos de amostras sanguíneas; quanto também que (ii) surpreendentemente, a detecção de doença e discriminação do tipo de doença pode, todavia, se feita por análise deste nucleossomas do plasma com EDTA na base dos níveis e perfil estrutural de um ou mais dos tipos relativos de estruturas do nucleossoma presentes no plasma de indivíduos doentes e saudáveis.

[0076]Medimos os nucleossomas livres de células no plasma com EDTA tomados de indivíduos saudáveis e 117 indivíduos com uma variedade de tipos de câncer em dois experimentos que consistem em 55 e 62 indivíduos com câncer, respectivamente. No total, 90 % (105 de 117) de amostras de câncer foram corretamente identificadas como positivo para câncer utilizando o método da invenção para a variante de histona H2AZ associada ao nucleossoma utilizando um nível de corte do resultadomédio para os indivíduos saudáveis + 2 desvios padrão da média.

[0077]No primeiro destes 2 experimentos, medimos os nucleossomas livres de células no plasma com EDTA tomados de 13 indivíduos saudáveis e 55 indivíduos com câncer de estômago, intestino grosso, reto, pulmão (carcinoma de células pequenas e vários carcinomas de células não-pequenas), mama, ovário, próstata, rim e vários cânceres de boca (cavidade oral, palato, faringe e laringe). Todas das amostras de indivíduos saudáveis e pacientes com câncer foram positivas para nucleossomas livres de células. Entretanto, os níveis detectados em amostras tomadas de indivíduos com câncer foram mais altos do que os encontrados em amostras de indivíduos saudáveis e os resultados mostraram que os indivíduos saudáveis e com câncer podem ser discriminados. Por exemplo, a faixa normal calculada em termos de OD como a média de ± 2 desvios padrão na média, para o ensaio de H2AZ de nucleossoma foi de 0 a 0,95. Utilizando este nível de corte de 0,95; todos os 13 indivíduos saudáveis foram negativos para os níveis de H2AZ de nucleossoma elevados. Ao contrário, um resultado positivo para os níveis de H2AZ de nucleossoma elevados verificou-se para 46 das 55 amostras de câncer (uma sensibilidade clínica geral de 84 %) incluindo as amostras de câncer sendo 100 % (8 de 8) de estômago 100 % (5 de 5) de intestino grosso, 67 % (2 de 3) de reto, 83 % (5 de 6) de pulmão de células pequenas, 79 % de pulmão de células não-pequenas, 50 % (3 de 6) de mama, 100 % (1 de 1) de ovário, 83 % (5 de 6) de próstata, 100 % (1 de 1) de rim e 100 % (5 de 5) de boca. Os resultadossão mostrados na Figura 19.

[0078]Em uma forma de realização da invenção, uma amostra controle é fornecida e o nível de corte para o ensaio para distinguir entre resultados positivos ou negativos é definido em relação ao resultado para a amostra controle. Isto pode ser qualquer proporção igual a acima ou abaixo do nível do resultado da amostra controle. Os resultados do paciente abaixo deste nível são considerados negativos e os resultados do paciente acima deste nível são considerados positivos. Também pode haver uma faixa “área cinzenta” de resultados do paciente muito próximos ao nível de corte para que a decisão seja considerada indeterminada e/ou o teste deva ser repetido.

[0079]Similarmente, para o ensaio de mH2A1.1 associada ao nucleossoma a faixa normal foi de 0 a 0,91. Utilizando este valor de corte, todas as 13 amostras saudáveis foram negativas e 64 % (35 de 55) das amostras de câncer foram positivas. Para o ensaio de P-H2AX(Ser139) associada ao nucleossoma a faixa normal foi de 0 a 1,08. Utilizando este valor de corte, todas as 13 amostras saudáveis foram negativas e 60 % (33 de 55) das amostras de câncer foram positivas. 5-metilcitosina associada ao nucleossoma também foi medida e a faixa normal foi de 0 a 1,41. Utilizando este valor de corte todas as 13 amostras saudáveis foram negativas e 55 % (30 de 55) das amostras de câncer foram positivas. Assim, alguns ensaios de nucleossoma exibem melhor sensibilidade clínica do que outros.

[0080]Além disso, é possível utilizar o padrão de estruturas do nucleossoma para melhorar a utilidade clínica da invenção. Isto pode ser feito, por exemplo, diminuindo o ponto de corte do ensaio de H2AZ associada ao nucleossoma à média de + 1 desvio padrão que fornece uma faixa de até 0,69. Neste caso, o número de falsos negativos é reduzido para 3 fornecendo uma sensibilidade clínica melhorada de 95 % (52 de 55) à custa de um aumento nos resultados falsos positivos para as amostras tomadas de indivíduos saudáveis de 0 % a 23 % (3 de 13). Os resultados são mostrados na Figura 19.

[0081]As amostras encontradas positivas para nucleossomas associados a H2AZ, ou quaisquer nucleossomas, pode ser interrogadas para o perfil da estrutura do nucleossoma. O perfil do nucleossoma pode ser utilizado para distinguir entre os pacientes saudáveis e doentes como ilustrados nas Figuras 23 e 24 onde as proporções relativas de várias estruturas do nucleossoma em pacientes doentes são expressas em relação àquelas encontradas em pacientes saudáveis e pacientes com outras doenças não-cancerosas. Isto mostra que a investigação de múltiplas estruturas do nucleossoma em um painel de teste pode facilitar melhor discriminação clínica.

[0082]Similarmente, a especificidade e/ou sensibilidade do diagnóstico da invenção pode aumentar através de dados de combinação de mais do que um teste na forma de proporções. Por exemplo, através da utilização da proporção de H2AZ:mH2A1.1 associada ao nucleossoma.

[0083]Assim, os métodos da invenção são capazes de detectar o câncer nas amostras tanto de plasma quanto de soro tomadas de pacientes com câncer.

[0084]Medimos os níveis de nucleossomas livres de células circulantes contendotrês variantes de histona diferentes em amostras de plasma com EDTA tomadas de 3 pacientes com câncer de cólon, 13 pacientes com câncer de pulmão, 2 pacientes com câncer pancreático e 1 paciente com câncer de boca e comparamos estes com os níveis presentes nas amostras sanguíneas de 20 indivíduos saudáveis, assim como com uma preparação artificialmente produzida de nucleossomas de indivíduos saudáveis preparadas como descrito na literatura (*Holdenreider et al, 2001). Expressamostambém os níveis observados em uma forma normalizada como proporções do nível de nucleossomas contendo epítopos diferentes e mostramos que tais proporções ou padrões de proporções são úteis para o diagnóstico de câncer em geral e para o diagnóstico diferencial de tipos de câncer específicos. Investigamos também se o nível de histona H2AZ associada ao nucleossoma varia com a progressão da doença. Observamos que o nível médio de nucleossomas livres de células contendo variantes de histona aumenta com a severidade da doença e sobe com o aumento da propagação da doença para os linfonodos e com o tamanho e estágio do tumor aumentado. Isto fornece evidências de que os nucleossomas detectados estão associados ao tumor.

[0085]Medimos também os nucleossomas presentes nestas 19 amostras de câncer utilizando dois métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual. Dos 19 indivíduos com a maioria dos cânceres estudados verificaram-se ter níveis de nu- cleossoma no plasma com EDTA baixos como determinado por ELISA 1 e 2 de nu- cleossoma da técnica atual. Este resultado ilustra uma razão pela qual os ensaios da técnica atual não são utilizados para propósitos clínicos de rotina.

[0086]Utilizamos os métodos de ELISA da presente invenção para medir os nucleossomas contendo as variantes de histona mH2A1.1, mH2A2 e H2AZ nas mesmas 19 amostras. Nucleossomas contendo variantes de histona, particularmente mH2A2 e H2AZ, foram detectáveis em 16 das 19 amostras. Assim, em uma forma de realização, a invenção fornece um novo método ELISA de nucleossoma capaz de detectar os nucleossomas não detectados por ensaios de nucleossoma da técnica atual.

[0087]Medimos também os níveis de nucleossomas contendo 2 nucleotídeos diferentes e uma PTM de histona nas mesmas 19 amostras tomadas de indivíduos com câncer, assim como uma amostra de nucleossomas gerada de indivíduos saudáveis por um método descrito na literatura (*Holdenrieder et al, 2001). Utilizamos estas medições junto com as medições de variante de histona associadas ao nucleossoma aqui descritas, como um painel da variedade de nucleossomas livres de células presentes em fluidos biológicos tomados de indivíduos com 4 tipos diferentes de cânceres e com nucleossomas gerados de indivíduos saudáveis. Surpreendentemente, o padrão de nucleossomas encontrado nos 4 tipos de câncer investigados (pulmão, cólon, pancreático e boca) foram todos distinguíveis daqueles encontrados em uma amostra de nucleossoma gerada de indivíduos saudáveis. Além disso, os tipos de câncer dife-rentestambém foram distinguíveis entre si com base no padrão de nucleossomas livres de células detectável no sangue de indivíduos. Assim, em uma forma de realização da invenção, é fornecido um método para detectar ou diagnosticar a presença, tipo, ocorrência ou severidade de uma doença ou avaliar o fármaco ideal ou outras opções de tratamento testando uma amostra para um painel de epítopos diferentes de nucleossoma que consiste de duas ou mais medições de nucleossomas contendo variantes de histona diferentes ou uma combinação de uma ou mais variantes de his- tona de DNA e uma ou mais bases de DNA de histona e/ou uma ou mais modificações de histona e/ou medições de nucleossomas por si, ou qualquer combinação ou razão de qualquer um destes, como um indicador da saúde ou estado da doença de um indivíduo.

[0088]Utilizamos similarmente os métodos de ELISA da invenção para detectar variabilidade nas estruturas de histona e nucleotídeo de nucleossomas livres de células circulantes em uma variedade de câncer e doenças não-cancerosas e com-paramos esta à estrutura de nucleossomas encontradas em 11 indivíduos saudáveis. Nucleossomas verificaram-se estar presentes em todos os cânceres e doenças não- cancerosas investigados e verificaram-se ter perfis que diferem dos de indivíduos sau-dáveis.

[0089]Estudamos as amostras de plasma com EDTA tomadas de 2 pacientes com cardiomiopatia, 10 pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (lúpus), 12 pacientes com colite ulcerativa, 10 pacientes doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), 8 pacientes com doença de Crohn e 10 pacientes com artrite reumatoide (RA) e normalizamos os níveis de várias estruturas do nucleossoma como uma proporção dos níveis de 5-metilcitosina associada ao nucleossoma e expressamos estes em relação aos níveis encontrados em indivíduos saudáveis. Descobrimos que as doenças estavam associadas com perfis da estrutura do nucleossoma que diferiram dos de indivíduossaudáveis ou com câncer. Assim, os perfis da estrutura do nucleossoma podem ser utilizados como um instrumento de diagnóstico para a detecção, previsão de prognóstico, monitoramento e previsão da eficácia terapêutica em uma ampla variedade de doenças não-cancerosas. Os resultados são mostrados na Figura 24.

[0090]Estudamos também a variabilidade em estrutura de nucleossomas livres de células em termos dos tipos de histonas e nucleotídeos detectados utilizando os métodos de ELISA da invenção para as amostras de plasma com EDTA tomadas de 55 pacientes com 10 doenças de câncer diferentes normalizadas como uma proporção de níveis de DNA metilado de 5-metilcitosina (5mc) associada ao nucleossoma e expressamos em relação às proporções médias encontradas em 11 indivíduos saudáveis. Encontramos os nucleossomas presentes em todos indivíduos e perfis da estrutura do nucleossoma que variaram entre os indivíduos com doenças cancerosas, doenças não-cancerosas e saudáveis. Assim, os perfis da estrutura do nucleossoma podem ser utilizados como um instrumento de diagnóstico para a detecção, previsão de prognóstico, monitoramento e previsão da eficácia terapêutica em câncer e outras doenças. Os resultados são mostrados nas Figuras 23 e 24.

[0091]Múltiplas isoformas ou variantes foram relatadas para as histonas H2A, H2B e H3. A histona H4, por outro lado, é relatada existir como uma forma única (Ta- chiwana et al, 2011). Será claro para aqueles habilitados na técnica que um método ELISA da invenção utilizando um anticorpo ou ligando direcionado para ligar à histona H4 ligará a todos os nucleossomas virtualmente em uma amostra. Assim, em uma forma de realização, a invenção fornece um novo método para a detecção de nucleos- somas por si, em que os nucleossomas contendo uma variante de histona comum são medidos como uma maneira de garantir que todos ou a maioria dos nucleotídeos sejam detectados. Será ainda claro para aqueles habilitados na técnica que anticorpos ou ligantes adequados produzidos para esta aplicação podem ser direcionados em regiões de histona H4 que não são sujeitas à modificação PTM. Isto ainda aumentará a universabilidade do epítopo selecionado como um epítopo comum a todos ou a mai-oria dos nucleossomas. Similarmente, será claro para aqueles habilitados na técnica que anticorpos adequados similares podem ser direcionados para ligar as regiões de outras porções de histona selecionadas, tais que as regiões são comuns para todas ou a maioria das variantes ou isoformas de histona das ditas porções de histona e que não são sujeitas à PTM (por exemplo, sem limitação; regiões comuns de histonas H2A, H2B ou H3). Assim, a presente invenção descrita, fornece um meio para detectar todos ou a maioria dos nucleossomas em uma amostra apesar da variação em isoformas de histona constituintes e PTMs.

[0092]Concluímos que o método da presente invenção é um método bem sucedido para a detecção e medição de nucleossomas contendo isoformas ou variantes de histona específicas, em que este método também pode ser utilizado como um método para a detecção de nucleossomas por si e que é um método superior para a detecção de nucleossomas por si, do que os métodos da técnica atual. Os métodos da invenção, assim utilizados têm vantagens sobre os métodos para medir nucleos- somas da técnica atual. Será claro para aqueles habilitados na técnica que os métodos da invenção podem ser utilizados para detectar e medir os nucleossomas diretamente em quaisquer amostras onde eles ocorrem, por exemplo, em amostras obtidas por digestão de cromatina extraída a partir de células ou em fluidos biológicos, tais como amostras de sangue, soro ou plasma. Também será claro que os métodos aqui descritos podem ser desenvolvidos para qualquer variante de histona ou variante de histona modificada para que um anticorpo ou outro ligando possa ser produzido.

[0093]A invenção foi testada em muitas doenças cancerosas e não-cancerosas e verificou-se ser eficaz na detecção de todas as doenças testadas. Isto inclui a detecção de câncer de próstata, em casos que relatou-se ser indetectável pelos testes de nucleossoma da técnica atual (Holdenrieder, 2001). É claro que a invenção é eficaz para a detecção de todos ou a maioria dos cânceres. Será claro para aqueles habilitados na técnica que o desempenho clínico da invenção pode ser melhorado ainda por inclusão de outros testes de estrutura de nucleossoma e por examinação das proporções de presentes estruturas do nucleossoma diferentes.

[0094]De acordo com um aspecto da invenção é fornecido um método para detectar e medir nucleossomas livres de células contendo variantes de histona específicas ou isoformas em uma amostra por um imunoensaio que compreende as etapas de: contatar a amostra com um anticorpo ou outro ligando que se liga a uma variante de histona; detectar e/ou quantificar a ligação do dito anticorpo ou outro ligando à variante de histona espécie na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de um nucleossoma associada variante de histona na amostra.

[0095]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um anticorpo duplo, método de imunoensaio imunométrico ou sanduíche para detectar e medir os nucleossomas livres de células contendo variantes de histona específicas ou isoformas em uma amostra. Uma forma de realização deste aspecto é um imunoensaio que compreende as etapas de: contatar a amostra que pode conter nucleossomas com um primeiro anticorpo ou outro ligando que se liga aos nucleossomas; contatar os nucleossomas ou amostra com um segundo anticorpo ou outro ligando que se liga a uma variante de histona; detectar e/ou quantificar a ligação do dito segundo anticorpo ou outro ligando a uma espécie de variante de histona na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de uma variante de histona associada ao nucleossoma na amostra.

[0096]De acordo com uma outra forma de realização é fornecido um método para detectar e medir nucleossomas livres de células contendo variantes de histona específicas ou isoformas em uma amostra por um imunoensaio que compreende as etapas de: contatar a amostra que pode conter nucleossomas com um primeiro anticorpo ou outro ligando que se liga a uma variante de histona; contatar os nucleossomas ou amostra com um segundo anticorpo ou outro ligando que se liga aos nucleossomas; detectar e/ou quantificar a ligação do dito segundo anticorpo ou outro ligando aos nucleossomas na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de uma variante de histona associada ao nucleossoma na amostra.

[0097]Uma variedade de anticorpos ou outros ligantes podem ser utilizados na invenção como um ligando que se liga aos nucleossomas. Estes incluem ligantes dirigidos para se ligar aos epítopos que ocorrem nos nucleossomas intactos e não em histonas livres (por exemplo; um epítopo encontrado na junção entre duas histonas em um nucleossoma) e também os ligantes dirigidos a qualquer componente de nu- cleossoma incluindo proteína, histona ou epítopos de ácido nucleico de nucleossoma comuns. Conduzimos as amostras com o método da invenção utilizando dois anticorpos de captura diferentes e mostramos que o anticorpo de captura particular utilizado não afeta materialmente os resultados do método da invenção. Os resultados são mostrados na Figura 16.

[0098]Será claro para aqueles habilitados na técnica que os métodos da invenção descritos incluem uma variedade de formas de realização incluindo imunoen- saios competitivos clássicos, assim como ensaios do tipo biossensor e ensaios label- free do tipo comercializado, por exemplo, por ForteBio Incorporated dos EUA que podem ser imunométricos em natureza.

[0099]De acordo com uma forma de realização da invenção é fornecido um método para detectar e medir uma isoforma ou variante de histona, ou uma isoforma ou variante de histona associada ao nucleossoma, em uma amostra por um imunoen- saio imunométrico label-free que compreende as etapas de: contatar a amostra com um anticorpo ou outro ligando que se liga a uma isoforma ou variante de histona; detectar e/ou quantificar a ligação do dito anticorpo ou outro ligando a uma isoforma ou variante de histona na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de uma isoforma ou variante de histona ou uma isoforma ou variante de histona associada ao nucleossoma na amostra.

[00100]De acordo com um outro forma de realização da invenção é fornecido um método para detectar e medir uma isoforma ou variante de histona livre de células, ou uma isoforma ou variante de histona associada ao nucleossoma, em uma amostra por um imunoensaio competitivo que compreende as etapas de: contatar a amostra com um anticorpo ou outro ligando que se liga a uma isoforma ou variante de histona; detectar e/ou quantificar a ligação do dito anticorpo ou outro ligando a uma isoforma ou variante de histona na amostra; e utilizar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de uma isoforma ou variante de histona na amostra.

[00101]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar a proporção de nucleossomas que compreende uma isoforma de his- tona em uma amostra compreendendo as etapas de: detectar ou medir o nível de nucleossomas em uma amostra; detectar ou medir o nível de uma isoforma de histona associada ao nucleos- soma de acordo com um método da invenção; e utilizar as duas medições para determinar a proporção de nucleossomas que contêm a isoforma de histona.

[00102]De acordo com uma forma de realização deste aspecto da invenção; tanto o nível de nucleossoma total na amostra quanto o nível de variante de histona associada ao nucleossoma de interesse são medidos utilizando o método da invenção. Em uma outra forma de realização, os métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual são utilizados para determinar os níveis de nucleossoma totais. Ainda em uma outra forma de realização uma medida de DNA total é utilizada como um substituto para o nível de nucleossoma total.

[00103]Demonstramos que a detecção e medição de nucleossomas contendo variantes de histona no sangue tomados de indivíduos podem ser utilizadas como um método de diagnóstico para identificar indivíduos com câncer e para diferenciá-los de indivíduos saudáveis. Além disso, demonstramos que os padrões de nucleossomas contendo um painel de variantes de histona diferentes, nucleotídeos e PTMs de histona pode ser utilizado para distinguir entre cânceres diferentes. Será claro para aqueles habilitados na técnica que isto fornece a base para um exame de sangue de câncer que detectará o câncer em indivíduos e pode ser utilizado para distinguir entre tipos de câncer em indivíduos positivos de câncer. De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar ou diagnosticar a presença de uma doença medindo ou detectando a presença e/ou o nível ou concentração de nucleos- somas livres de células contendo uma variante de histona em um corpo fluido, e utilizando o nível detectado como um biomarcador do estado da doença de um indivíduo incluindo, sem limitação, um diagnóstico clínico de uma doença, um diagnóstico diferencial do tipo ou subtipo de doença, ou um prognóstico da doença, ou uma reincidência da doença, ou um diagnóstico da suscetibilidade do indivíduo para regimes de tratamento. Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que os fluidos do corpo utilizados para testes de diagnóstico incluem sem limitação sangue, soro, plasma, urina, fluido cerebrospinal e outros fluidos. Em uma forma de realização preferida, o fluido do corpo selecionado como a amostra é sangue, soro ou plasma. O nível de resposta de ensaio, concentração ou quantidade de uma variante de histona associada ao nucleossoma em um fluido do corpo pode ser expressado em termos absolutos ou termos relativos, por exemplo, sem limitação, como uma proporção do nível de nucleossoma total ou DNA total presente ou como uma proporção ao nível de nucleos- somas contendo uma outra variante de histona ou nucleotídeo ou PTM.

[00104]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar ou medir a presença e/ou o nível de nucleossomas contendo uma variante particular de histona em uma célula que compreende as etapas de: isolar a cromatina a partir de uma célula; quebrar a cromatina para formar mono-nucleossomas e/ou oligo-nucleosso- mas; e detectar ou medir a presença de uma variante de histona nos mono- nucleossomas e/ou oligo-nucleossomas por meio de um método de imunoensaio como aqui descrito.

[00105]Os métodos para produzir mono-nucleossomas e/ou oligo-nucleosso- mas de cromatina são bem conhecidos na técnica e incluem digestão e sonicação enzimática (Dai et al, 2011). Produzimos nucleossomas livres de células de células MCF7 utilizando procedimentos padrão e utilizamos o método da invenção para mostrar que estes nucleossomas de MCF7 incluem nucleossomas contendo as variantes de histona mH2A1.1, H2AZ, assim como, P-H2AX(Ser139) .

[00106]Em uma forma de realização, a variante de histona selecionada para a detecção pelo método é uma isoforma que ocorre comumente que ocorrem em todos ou a maioria dos nucleossomas intactos, fornecendo um método para a detecção ou medição de nucleossomas por si. Em uma outra forma de realização, o epítopo em uma isoforma de histona selecionado para a detecção pelo método é localizado em uma região da isoforma de histona que é comum a, e ocorre em, todas ou a maioria das isoformas da dita histona e consequentemente em todos ou a maioria dos nu- cleossomas intactos e não está ainda sujeito à PTM, fornecendo um método para a detecção ou medição de nucleossomas por si.

[00107]Será avaliado por aqueles habilitados na técnica que o método descrito de detectar variantes de histona associadas ao nucleossoma em células ou tecidosé mais simples, mais rápido, mais barato, mais quantitativo e/ou mais reproduzível do que os métodos correntemente utilizados incluindo IHC, Western Blotting ou FACS. O nível, concentração ou quantidade de uma variante de histona associada ao nu- cleossoma particular pode ser expressado em termos absolutos ou termos relativos, por exemplo, como uma proporção dos nucleossomas totais ou DNA total presentes ou como uma proporção ao nível de nucleossomas contendo uma outra variante de histona ou PTM ou nucleotídeo.

[00108]Será claro para aqueles habilitados na técnica que os termos anticorpo, ligando ou ligante em relação com qualquer aspecto da invenção não são limitantes, mas destinam-se a incluir qualquer ligando capaz de se ligar às moléculas ou entidades específicas e que qualquer ligando adequado pode ser utilizado no método da invenção. Também será claro que o termo nucleossomas destina-se a incluir mononucleossomas e oligonucleossomas e quaisquer fragmentos de cromatina que pode ser analisado em meios fluidos.

[00109]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um kit para detectar ou medir nucleossomas que compreende um ligante ou ligando específico para a variante de histona ou seu componente, ou um mimetismo estrutural/forma do nucleossoma ou seu componente, junto com as instruções para a utilização do kit de acordo com qualquer um dos métodos aqui definidos.

[00110]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um kit para detectar ou medir nucleossomas contendo uma variante particular de histona que compreende um ligante ou ligando específico para a variante de histona ou seu componente, ou um mimetismo estrutural/forma do nucleossoma ou seu componente, junto com as instruções para a utilização do kit de acordo com qualquer um dos métodos aqui definidos.

[00111]De acordo com outro aspecto da invenção é fornecido um método para identificar um biomarcador de variante de histona para detectar ou diagnosticar o estado da doença em animais ou seres humanos que compreende as etapas de: detectar ou medir o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona em um fluido do corpo de indivíduos doentes; detectar ou medir o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona em um fluido do corpo de indivíduos controle; e utilizar a diferença entre os níveis detectados em indivíduos doentes e controle para identificar se uma variante particular de histona é útil como um biomarcador para esta doença.

[00112]Será claro para aqueles habilitados na técnica que os indivíduos controle podem ser selecionados em uma variedade de bases que podem incluir, por exemplo, indivíduos conhecidos ser livres da doença ou podem ser indivíduos com uma doença diferente (por exemplo; para a investigação de diagnóstico diferencial).

[00113]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para identificar um biomarcador de variante de histona para avaliar o prognóstico de um indivíduo animal ou humano doente que compreende as etapas de: detectar ou medir o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona em um fluido do corpo de indivíduos doentes; e correlacionar o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona detectada em um fluido do corpo de indivíduos doentes com o resultado da doença dos indivíduos.

[00114]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para identificar um biomarcador de variante de histona para ser utilizado para a seleção de um regime de tratamento para um indivíduo animal ou humano doente em necessidade de tratamento que compreende as etapas de: detectar ou medir o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona em um fluido do corpo de indivíduos doentes; e correlacionar o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona detectado em um fluido do corpo de indivíduos doentes com a eficácia observada de um regime de tratamento naqueles indivíduos.

[00115]De acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para identificar um biomarcador de variante de histona para ser utilizado para monitorar o tratamento de um indivíduo animal ou humano doente que compreende as etapas de: detectar ou medir o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona em um fluido do corpo de um indivíduo doente; repetir a dita detecção ou medição em uma ou mais ocasiões durante a progressão da doença do indivíduo; e correlacionar o nível de nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona detectado em um fluido do corpo de um indivíduo doente com a progressão da doença no indivíduo.

[00116]De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um biomar- cador identificado pelo método como aqui definido.

[00117]Será claro para aqueles habilitados na técnica que os nucleossomas livres de células contendo uma variante de histona também podem ser detectados em um fluido biológico incluindo sangue, plasma, soro e urina por um procedimento que envolve a extração da proteína de variante de histona a partir do complexo de nu- cleossoma seguido por um método para a detecção ou quantificação da proteína de variante de histona livre extraída. Procedimentos de extração adequados incluem os procedimentos de extração de ácido comumente utilizados para as histonas que utilizam a natureza básica de proteínas de histonas. A detecção da variante de histona livre pode ser realizada, por exemplo, por um imunoensaio para a porção de histona livre. Assim, em uma forma de realização da invenção, uma variante de histona é extraída de um fluido biológico incluindo sangue, plasma, soro e urina e o extrato é testado quanto a presença de uma variante de histona.

[00118]É conhecido na técnica que um pode detectar a presença de uma proteína que é compreendida como parte de um complexo contendo outras porções por métodos de imunoensaio. Será claro para aqueles habilitados na técnica que os nu- cleossomas livres de células contendo uma variante de histona podem ser detectados em um fluido biológico incluindo sangue, plasma, soro e urina por um procedimento que envolve o imunoensaio direto da variante de histona por si no fluido. Neste procedimento, um imunoensaio de anticorpo único, utilizando um anticorpo dirigido a um epítopo presente em uma variante de histona, ou um imunoensaio de 2-sítio, utilizando dois anticorpos dirigidos a dois epítopos presentes em uma variante de histona, é utilizado para detectar a presença de uma variante de histona dentro de um nucleos- soma. Assim, em uma outra forma de realização da invenção, uma variante de histona contida dentro de um nucleossoma é detectada diretamente em um fluido biológico incluindo sangue, plasma, soro e urina através da utilização de um método de imuno- ensaio para uma variante de histona.

[00119]Assim, em uma forma de realização da invenção, uma variante de his- tona é extraída de um fluido biológico incluindo sangue, plasma, soro e urina e o extratoé testado quanto a presença de uma variante de histona.

[00120]Um outro aspecto da invenção fornece ligantes, tais como compostos que ocorrem naturalmente ou quimicamente sintetizados, capazes de se ligar ao bio- marcador específico. Um ligante ou ligando, de acordo com a invenção, pode compreender um peptídeo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo, ou um ligante sintético tal como um anticorpo plástico, ou um aptâmero ou oligonucleotídeo, capaz de se ligar ao biomarcador específico. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo capaz de se ligar ao biomarcador específico. Um ligante, de acordo com a invenção, pode ser marcado com um marcador detectável, tal como um marcador luminescente, fluorescente, de enzima ou radioativo; alternativamente ou adicionalmente um ligante, de acordo com a invenção, pode ser marcado com uma etiqueta de afinidade, por exemplo, uma etiqueta de biotina, avidina, estreptavidina ou His (por exemplo, hexa-His). Alternativamente, a ligação do ligante pode ser determinada uti-lizando uma tecnologia do tipo label-free, por exemplo, de ForteBio Inc.

[00121]Um biossensor, de acordo com a invenção, pode compreender o bio- marcador ou um mimetismo estrutural/forma do mesmo capaz de se ligar a um anticorpoespecífico contra o biomarcador. É também fornecido uma ordem compreendendo um ligante ou mimetismo como aqui descrito.

[00122]Também fornecido pela invenção é a utilização de um ou mais ligantes como aqui descrito, que podem ser que ocorram naturalmente ou quimicamente sin-tetizado, e é adequadamente um peptídeo, anticorpo ou fragmento do mesmo, aptâ- mero ou oligonucleotídeo, ou a utilização de um biossensor da invenção, ou uma ordem da invenção, ou um kit da invenção para detectar e/ou quantificar o biomarcador. Nestas utilizações, a detecção e/ou quantificação pode ser realizada em uma amostra biológica como aqui definido.

[00123]Kits de diagnósticos ou de monitoramento são fornecidos para realizar os métodos da invenção. Tais kits, adequadamente, compreenderão um ligante de acordo com a invenção, para a detecção e/ou quantificação do biomarcador, e/ou um biossensor, e/ou uma ordem como aqui descrito, opcionalmente, junto com as instruções para a utilização do kit.

[00124]Um outro aspecto da invenção é um kit para detectar a presença de um estado da doença, compreendendo um biossensor capaz de detectar e/ou quantificar um ou mais dos biomarcadores como aqui definido.

[00125]Os biomarcadores para detectar a presença de uma doença são alvos essenciais para a descoberta de novos alvos e moléculas de fármaco que retardam ou param a progressão do transtorno. Como o nível do biomarcador é indicativo da resposta do transtorno e de fármaco, o biomarcador é útil para a identificação de novos compostos terapêuticos em ensaios in vitro e/ou in vivo. Os biomarcadores da invenção podem ser utilizados em métodos para o rastreio de compostos que modulam a atividade do biomarcador.

[00126]Assim, em um outro aspecto da invenção, é fornecido a utilização de um ligando ou ligante, como descrito, que pode ser um peptídeo, anticorpo ou fragmento do mesmo ou aptâmero ou oligonucleotídeo, de acordo com a invenção; ou a utilização de um biossensor de acordo com a invenção, ou uma ordem de acordo com a invenção; ou um kit de acordo com a invenção, para identificar uma substância capaz de promover e/ou de suprimir a geração do biomarcador.

[00127]Também é fornecido um método de identificar uma substância capaz de promover ou suprimir a geração do biomarcador em um indivíduo, compreendendo administrar uma substância de teste a um indivíduo animal e detectar e/ou quantificar o nível do biomarcador presente em uma amostra de teste a partir do indivíduo.

[00128]O termo “biomarcador” significa um indicador biológico ou biologicamente distintivo derivado de um processo, evento ou condição. Os biomarcadores podem ser utilizados em métodos de diagnóstico, por exemplo, triagem clínica, e avaliação de prognósticos e em monitoramento dos resultados de terapia, identificando os pacientes mais prováveis de responder a um tratamento terapêutico particular, triagem de fármaco e desenvolvimento. Os biomarcadores e utilização dos mesmos são de grande valor para a identificação de novos tratamentos com fármaco e para a descoberta de novos alvos para tratamento com fármaco.

[00129]Os termos “detectar” e “diagnosticar”, como aqui utilizado, abrangem a identificação, confirmação, e/ou caracterização de um estado da doença. Os métodos de detectar, monitorar e diagnosticar, de acordo com a invenção, são úteis para confirmar a existência de uma doença, para monitorar o desenvolvimento da doença avaliando o início e progressão, ou para avaliar a melhoria ou regressão da doença. Os métodos de detectar, monitorar e diagnosticar também são úteis em métodos para avaliação de triagem clínica, prognóstico, escolha de terapia, avaliação do benefício terapêutico, isto é, para a triagem do fármaco e desenvolvimento do fármaco.

[00130]Os métodos de diagnóstico e monitoramento eficientes fornecem “soluções ao paciente” muito potentes com o potencial para prognóstico melhorado, através do estabelecimento de diagnóstico correto, permitindo rápida identificação do tratamento mais apropriado (assim, diminuindo exposição desnecessária aos efeitos colaterais de fármaco nocivos), e reduzindo as taxas de reincidência.

[00131]Em uma forma de realização, o dito biomarcador é liberado a partir das células de um tumor. Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção é fornecido um método para a detecção de um crescimento de tumor que compreende as etapas de (i) medir um biomarcador em uma amostra biológica que está associada com ou liberada a partir das células de um tumor e (ii) demonstrar que o nível do dito biomar- cador está associado com o tamanho, estágio, agressividade ou disseminação do tumor.

[00132]É conhecido que a remoção celular aumentada, morte celular e apop- tose conduzem a níveis circulatórios aumentados de nucleossomas livres de células (Holdenrieder et al, 2001). O nível de nucleossomas livres de células circulantes é um indicador não-específico e ocorre em uma variedade de condições incluindo doenças inflamatórias, uma grande variedade de condições benignas e malignas, doenças au- toimunes, assim como, após o trauma ou isquemia (Holdenrieder et al 2001). Será claro para aqueles habilitados na técnica que a invenção terá aplicação em uma variedade de áreas de doença onde os nucleossomas circulantes foram encontrados em indivíduos. Estas incluem, sem limitação, trauma (por exemplo; lesão severa ou cirurgia),exercício extremo (por exemplo, correr em uma maratona), acidente vascular cerebral e ataque cardíaco e sepsia ou outra infecção séria. Utilizamos o método de imunoensaio da invenção para medir os níveis de nucleossoma e investigamos sua variabilidade de estrutura de histona e nucleotídeo em uma variedade de doenças incluindo cardiomiopatia, lúpus eritematoso sistêmico, colite ulcerativa, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença de Crohn e artrite reumatoide e comparamos estas com os resultados de indivíduos saudáveis. Podemos detectar os nucleossomas e determinar sua estruturas relativas (em termos da composição de histona e nucleotídeo) em todas estas doenças. Como os métodos da invenção atual são capazes da detec-ção de uma faixa mais ampla de nucleossomas do que os métodos de ELISA para o nucleossoma atuais, os métodos da invenção têm aplicações em uma ampla gama de áreas de doença cancerosa e não-cancerosa.

[00133]Os imunoensaios da invenção incluem ensaios imunométricos utilizando métodos de detecção de enzima (por exemplo, ELISA), ensaios imunomé- tricos marcados com fluorescência, ensaios imunométricos com fluorescência resolvida no tempo marcado, ensaios imunométricos quimioluminescentes, ensaios imu- noturbidimétricos, ensaios imunométricos marcados particulados e ensaios imunorra- diométricos e métodos de imunoensaio competitivos incluindo métodos de imunoen- saio competitivos de antígeno marcado e anticorpo marcado com uma variedade de tipos de etiquetas incluindo etiquetas radioativas, de enzima, fluorescentes, fluores-centes resolvidos no tempo e particuladas. Todos dos ditos métodos de imunoensaio são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Salgame et al, 1997 e van Nieu- wenhuijze et al, 2003.

[00134]Em uma forma de realização, a dita amostra biológica compreende um fluido do corpo. Por exemplo, as amostras biológicas que podem ser testadas em um método da invenção incluem fluido cerebrospinal (CSF), sangue total, soro sanguíneo, plasma, sangue menstrual, fluido endometrial, urina, saliva, ou outro fluido corpóreo (fezes, fluido lacrimal, fluido sinovial, escarro), respiração, por exemplo, como respiração condensada, ou um extrato ou purificação, ou diluição da mesma. As amostras biológicas também incluem espécimes de um indivíduo vivo, ou tomadas post-mortem. As amostras podem ser preparadas, por exemplo, onde diluídas ou concentradas apropriadas, e armazenadas na maneira usual.

[00135]Em uma forma de realização, o método da invenção é repetido em múltiplas ocasiões. Esta forma de realização fornece a vantagem de permitir os resultados de detecção ser monitorados durante um período tempo. Um tal disposição fornecerá o benefício de monitoramento ou avaliação da eficácia do tratamento de um estado da doença. Tais métodos de monitoramento da invenção podem ser utilizados para monitorar o início, progressão, estabilização, melhoria, reincidência e/ou remissão.

[00136]Assim, a invenção também fornece um método de eficácia de monitoramento de uma terapia para um estado da doença em um indivíduo, suspeito de ter uma tal doença, compreendendo detectar e/ou quantificar o biomarcador presente em uma amostra biológica do dito indivíduo. Em métodos de monitoramento, as amostras de teste podem ser tomadas em duas ou mais ocasiões. O método pode compreender ainda comparar o nível do(s) biomarcador(s) presente(s) na amostra de teste com um ou mais controles e/ou com uma ou mais amostras de teste anteriores tomadas mais cedo do mesmo indivíduo de teste, por exemplo, antes do começo da terapia, e/ou do mesmo indivíduo de teste em um estágio anterior da terapia. O método pode compreender detectar uma mudança na natureza ou quantidade do(s) bio- marcador(s) em amostras de teste tomadas em diferente ocasiões.

[00137]Assim, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para monitorar eficácia da terapia para um estado da doença em um indivíduo humano ou animal, compreendendo: quantificar a quantidade do biomarcador como aqui definido; e comparar a quantidade do dito biomarcador em uma amostra de teste com a quantidade presente em um ou mais controles e/ou uma ou mais amostras de teste anteriores tomadas em um tempo mais cedo do mesmo indivíduo de teste.

[00138]Uma mudança no nível do biomarcador na amostra de teste em relação ao nível em uma amostra de teste anterior tomada mais cedo do mesmo indivíduo de teste pode ser indicativa de um efeito benéfico, por exemplo, estabilização ou melhoria, da dita terapia no transtorno ou transtorno suspeito. Além disso, uma vez concluído o tratamento, o método da invenção pode ser periodicamente repetido de modo a monitorar para a ocorrência de uma doença.

[00139]Os métodos para monitorar a eficácia de uma terapia podem ser utilizados para monitorar a efetividade terapêutica de terapias existentes e novas terapias em indivíduos humanos e em animais (por exemplo, em modelos animais). Estes métodos de monitoramento podem ser incorporados em telas para novas substâncias de fármaco e combinações de substâncias.

[00140]Em um outra forma de realização, o monitoramento de alterações mais rápidas devido às terapias de ação rápida pode ser conduzido em intervalos curtos de horas ou dias.

[00141]De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para identificar um biomarcador para detectar a presença de um estado da doença. O termo “identificar”, como aqui utilizado, significa confirmar a presença do biomarcador presente na amostra biológica. A quantificação da quantidade do biomarcador presente em uma amostra pode incluir determinar a concentração do biomarcador presente na amostra. A identificação e/ou quantificação podem ser realizadas diretamente na amostra, ou indiretamente em um extrato, ou em uma diluição da mesma.

[00142]Em aspectos da invenção alternativos, a presença do biomarcador é avaliado detectando e/ou quantificando o anticorpo ou fragmentos do mesmo capazes de se ligar ao biomarcador específico que são gerados pelo corpo do indivíduo em resposta ao biomarcador e, assim, estão presentes em uma amostra biológica de um indivíduo tendo um estado da doença.

[00143]A identificação e/ou quantificação podem ser realizadas por qualquer método adequado para identificar a presença e/ou quantidade de uma proteína específica em uma amostra biológica de um paciente ou uma purificação ou extrato de uma amostra biológica ou uma diluição da mesma. Em métodos da invenção, a quantificação pode ser realizada medindo a concentração do biomarcador na amostra ou amostras. As amostras biológicas que podem ser testadas em um método da invenção incluem aquelas como antes definido. As amostras podem ser preparadas, por exemplo, onde diluídas ou concentradas apropriadas, e armazenadas na maneira usual.

[00144]A identificação e/ou quantificação dos biomarcadores podem ser realizadas por detecção do biomarcador ou de um fragmento do mesmo, por exemplo, um fragmento com truncamento C-terminal, ou com truncamento N-terminal. Os fragmentos são adequadamente maiores do que 4 aminoácidos em comprimento, por exemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 aminoácidos em comprimento. Observou-se em particular que os peptídeos da mesma sequência ou relacionada àquela de caudas de histona são fragmentos particularmente úteis de proteínas de histona.

[00145]O biomarcador pode ser diretamente detectado, por exemplo, por SELDI ou MALDI-TOF. Alternativamente, o biomarcador pode ser detectado diretamente ou indiretamente por intermédio da interação com um ligante ou ligantes, tais como um anticorpo ou um fragmento ligado ao biomarcador do mesmo, ou outro pep- tídeo, ou ligante, por exemplo, aptâmero, ou oligonucleotídeo, capaz de se ligar especificamente ao biomarcador. O ligante ou ligando pode possuir uma etiqueta detectá- vel, tal como uma etiqueta luminescente, fluorescente ou radioativa, e/ou uma etiqueta de afinidade.

[00146]Por exemplo, a detecção e/ou quantificação pode ser realizada por um ou mais métodos selecionados a partir do grupo que consiste de: SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), uma análise à base de gel 1-D, uma análise à base de gel 2-D, espec- trometria de massas (MS), LC em fase reversa (RP), permeação de tamanho (filtração em gel), troca iônica, afinidade, HPLC, UPLC e outras técnicas à base de LC ou LC MS. As técnicas de LC MS apropriadas incluem ICAT®(Applied Biosystems, CA, EUA), ou iTRAQ®(Applied Biosystems, CA, EUA). Cromatografia líquida (por exemplo, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) ou cromatografia líquida de baixa pressão (LPLC)), cromatografia de camada delgada, espectroscopia por RMN (ressonância magnética nuclear) também podem ser utilizadas.

[00147]Os métodos de diagnosticar ou monitorar, de acordo com a invenção, podem compreender analisar uma amostra por SELDI TOF ou MALDI TOF para detectar a presença ou nível do biomarcador. Estes métodos também são adequados para a triagem clínica, prognóstico, monitoramento dos resultados de terapia, identificação dos pacientes com mais probabilidade de responder a um tratamento terapêutico particular, para triagem e desenvolvimento do fármaco, e identificação de novos alvos para o tratamento de fármaco.

[00148]A identificação e/ou quantificação de biomarcadores de analito podem ser realizadas utilizando um método imunológico, envolvendo um anticorpo, ou um fragmento do mesmo capaz de se ligar ao biomarcador específico. Os métodos imu- nológicos adequados incluem imunoensaios sanduíche, tais como ELISA sanduíche, em que a detecção dos biomarcadores de analito é realizada utilizando dois anticorpos que reconhecem os epítopos diferentes em um biomarcador de analito; radioimuno- ensaios (RIA), ensaios de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA) diretos, indiretos ou competitivos, imunoensaios enzimáticos (EIA), imunoensaios de fluorescência (FIA), western blotting, imunoensaio à base de imunoprecipitação e qualquer partícula (por exemplo, utilizando ouro, prata, ou partículas de látex, partículas magnéticas ou Q-dots). Os métodos imunológicos podem ser realizados, por exemplo, em placa de microtitulação ou formato de tiras.

[00149]Em uma forma de realização, um ou mais dos biomarcadores podem ser substituídos por uma molécula, ou um fragmento mensurável da molécula, encontrada a montante ou a jusante do biomarcador em uma via biológica.

[00150]A identificação de biomarcadores específicos importantes a uma doença é central para a integração de procedimentos de diagnóstico e regimes terapêuticos. Utilizando instrumentos de diagnóstico apropriados aos biomarcadores prediti- vos, tais como os biossensores podem ser desenvolvidos; consequentemente, em métodos e utilizações da invenção, a identificação e quantificação pode ser realizada utilizando um biossensor, sistema microanalítico, sistema microengendrado, sistema de micro-separação, sistema de imunocromatografia ou outros dispositivos analíticos adequados. O biossensor pode incorporar um método imunológico para a detecção do(s) biomarcador(s), tecnologias eléctricas, térmicas, magnéticas, ópticas (por exemplo, holograma) ou acústicas. Utilizando tais biossensores, é possível detectar o(s) biomarcador(s) alvo(s) nas concentrações antecipadas encontradas em amostras biológicas.

[00151]Como aqui utilizado, o termo “biossensor” significa algo capaz de detectar a presença do biomarcador. Os exemplos de biossensores são aqui descritos.

[00152]Os biossensores, de acordo com a invenção, podem compreender um ligante ligando ou ligantes, como aqui descrito, capaz de se ligar ao biomarcador específico. Tais biossensores são úteis em detectar e/ou quantificar um biomarcador da invenção.

[00153]Os biomarcadores da invenção podem ser detectados utilizando um biossensor incorporando tecnologias à base em hologramas “inteligentes”, ou sistemasacústicos de alta frequência, tais sistemas são particularmente responsáveis às configurações “código de barra” ou ordem.

[00154]Em sensores de holograma inteligentes (Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK), uma imagem holográfica é armazenada em uma película polimérica fina que é sensibilizada para reagir especificamente com o biomarcador. Em exposição, o biomarcador reage com o polímero levando a uma alteração na imagem exibida pelo holograma. A leitura fora do resultado do teste pode ser uma alteração no brilho óptico, imagem, cor e/ou posição da imagem. Para aplicações qualitativas e semi-quantitati- vas, um holograma do sensor pode ser lido a olho nu, assim tirando a necessidade de equipamento de detecção. Um sensor de uma única cor pode ser utilizado para ler o sinal quando medições quantitativas são necessárias. A opacidade ou cor da amostra não interfere com a operação do sensor. O formato do sensor permite multiplexação para a detecção simultânea de várias substâncias. Os sensores reversíveis e irreversíveis podem ser projetados para satisfazer requisitos diferentes, e o monitoramento contínuo de um biomarcador de interesse particular é factível.

[00155]Adequadamente, os biossensores para a detecção de um ou mais biomarcadores da invenção combina reconhecimento biomolecular com meios apro-priados para converter a detecção da presença, ou quantificação, do biomarcador na amostra em um sinal. Os biossensores podem ser adaptados para testes de diagnóstico de “local alternativo”, por exemplo, na enfermaria, departamento ambulatorial, centro cirúrgico, casa, em campo e local de trabalho.

[00156]Os biossensores para detectar um ou mais biomarcadores da invenção incluem sensores acústicos, de ressonância de plasma, holográficos, de Interfe- rometria de Bio-Camada (BLI) e microengendrados. Elementos de reconhecimento impressos, tecnologia de transístor de película fina, dispositivos ressonadores acústicosmagnéticos e outros novos sistemas acústicos-elétricos podem ser utilizados em biossensores para a detecção de um ou mais biomarcadores da invenção.

[00157]Os métodos envolvendo a identificação e/ou quantificação de um ou mais biomarcadores da invenção podem ser realizados em instrumentos de bancada, ou podem ser incorporados em plataformas descartáveis, de diagnóstico ou monitoramento que podem ser utilizadas em um ambiente não-laboratorial, por exemplo, no consultório médico ou na cabeceira do paciente. Os biossensores adequados para realizar os métodos da invenção incluem cartões de “crédito” com leitores ópticos ou acústicos. Os biossensores podem ser configurados para permitir que os dados coletados sejam transmitidos eletronicamente ao médico para a interpretação e, assim, pode formar a base para a e-medicina.

[00158]Os kits de diagnóstico para o diagnóstico e monitoramento da presença de um estado da doença são aqui descritos. Em uma forma de realização, os kits adicionalmente contêm um biossensor capaz de identificar e/ou quantificar um biomarcador. Adequadamente, um kit de acordo com a invenção, pode conter um ou mais componentes selecionados a partir do grupo: um ligante ligando, ou ligantes, específicos para o biomarcador ou um mimetismo estrutural/forma do biomarcador, um ou mais controles, um ou mais reagentes e um ou mais consumíveis; opcionalmente, junto com as instruções para a utilização do kit, de acordo com qualquer um dos métodos aqui definidos.

[00159]A identificação de biomarcadores para um estado da doença permite a integração de procedimentos de diagnóstico e regimes terapêuticos. A detecção de um biomarcador da invenção pode ser utilizada para peneirar os indivíduos antes de suas participações em ensaios clínicos. Os biomarcadores fornecem os meios para indicar a resposta terapêutica, incapacidade de responder, perfil de efeito colateral desfavorável, grau de adesão à medicação e realização de níveis de fármaco no soro adequados. Os biomarcadores podem ser utilizados para fornecer aviso de resposta adversa do fármaco. Os biomarcadores são úteis no desenvolvimento de terapias personalizadas, como avaliação da resposta pode ser utilizada para afinar a dosagem, minimizar o número de medicações prescritas, reduzir o atraso em alcançar a terapia eficaz e evitar reações adversas do fármaco. Assim, monitorando um biomarcador da invenção, o cuidado ao paciente pode ser ajustado com precisão para coincidir com as necessidades determinadas pelo transtorno e o perfil farmacogenômico do paciente, o biomarcador pode ser, assim, utilizado para titular a dose ideal, predizer uma resposta terapêutica positiva e identificar os pacientes em alto risco de efeitos colaterais severos.

[00160]Os testes à base de biomarcador fornecem uma primeira linha de avaliação de ‘novos’ pacientes, e fornecem medidas objetivas para um diagnóstico exato e rápido, não viáveis utilizando as medidas atuais.

[00161]Além disso, os testes de biomarcador de diagnóstico são úteis para identificar os membros da família ou pacientes com doença leve ou assintomática ou que pode estar em alto risco de desenvolver doença sintomática. Isto permite a iniciação de terapia apropriada, ou medidas preventivas, por exemplo, gerenciar os fatores de risco. Estas abordagens são reconhecidas para melhorar o resultado e podem prevenir o aparecimento do transtorno.

[00162]Os métodos de monitoramento de biomarcador, biossensores e kits também são vitais como instrumentos de monitoramento do paciente, para permitir o médico determinar se a reincidência é devido à piora do transtorno. Se o tratamento farmacológico é avaliado ser inadequado, então, a terapia pode ser reintegra ou aumentada; uma mudança na terapia pode ser fornecida se apropriado. Como os bio- marcadores são sensíveis ao estado do transtorno, eles fornecem uma indicação do impacto da terapia medicamentosa.

[00163]A invenção será agora ilustrada com referência aos exemplos não li- mitantes seguintes.

EXEMPLO 1

[00164]Uma amostra sanguínea humana contendo nucleossomas livres de células de indivíduos saudáveis preparadas de acordo com o método descrito por Hol- denrieder (*Holdenrieder et al, 2001) foi testada utilizando um ELISA para a variante de histona macroH2A1.1 associada ao nucleossoma utilizando um anticorpo de captura anti-histona em fase sólida que se liga aos nucleossomas intactos e um anticorpo de detecção anti-variante de histona macroH2A1.1 policlonal purificado por afinidade biotinilado. A amostra humana foi diluída em série em soro fetal de vitelo e foi testada em duplicata no ELISA não diluído e em diluições de 1:2, 1:4 e 1:8. Soro fetal de vitelo puro também foi conduzido no ELISA como uma amostra controle não contendo nu- cleossomas livres de células. O método de ensaio foi como segue: Uma solução de anticorpo anti-histona em tampão fosfato 0,1M de pH 7,4 foi adicionada a poços de microtitulação (100 μL/poço) e incubada durante a noite a 4 °C para revestir os poços com anticorpo de captura. Anticorpo anti-histona em excesso foi decantado. Uma solução de albumina de soro bovino (20 g/L) foi adicionada aos poços (150 μL/po^o) e incubada por 60 minutos na temperatura ambiente para bloquear os sítios de ligação de proteína em excesso nos poços. Solução de albumina de soro bovino em excesso foi decantada e os poços foram lavados, duas vezes, com tampão de lavagem (200 μL/poço, tampão TRIS/HCl 0,05M de pH 7,5 contendo Tween 20 a 1 %). A amostra (10 μL/poço) e tampão de ensaio (50 μL/poço, TRIS/HCl 0,05M de pH 7,5 contendo NaCl a 0,9 %, desoxicolato de sódio a 0,05 % e substituto Nonidet P40 a 1 %) foram adicionados aos poços e incubados por 90 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. A mistura de amostra e tampão de ensaio foi decantada e os poços foram lavados três times com tampão de lavagem (200 μL/poço). Uma solução de anticorpo de detecção anti-variante de histona macroH2A1.1 policlonal purificado por afinidade biotinilado foi adicionada (50 μL/po^o) e incubada por 90 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. Anticorpo de detecção em excesso foi decantado e os poços foram lavados novamente, três vezes, com tampão de lavagem (200 μL/poço). Uma solução contendo um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre-maior foi adicionada (50 μL/poço) e incubada por 30 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. Conjugado em excesso foi decantado e os poços foram lavados novamente, três vezes, com tampão de lavagem (200 μL/poço). Uma solução de substrato colorida (100 μL/poço, sal de 2,2’-azinobis[ácido 3-etilben- zotiazolina-6-sulfônico]-diamônio) foi adicionado e incubada por 30 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. Uma solução de STOP (100 μL/poço) contendo dodecil sulfato de sódio a 1 % foi adicionada e a densidade óptica (OD) dos poços foi medida a um comprimento de onda de 405 nm utilizando um leitor de placa de microtitulação padrão. Uma curva dose-resposta reproduzível de cor aumentada com concentração de variante de histona macroH2A1.1 associada ao nucleossoma aumentada foi observada com um sinal de fundo baixo observado na ausência de variante de histona macroH2A1.1 associada ao nucleossoma (soro fetal de vitelo). O sinal de ELISA positivo indica que a variante de histona macroH2A1.1 detectada pelo ELISA é incorporada dentro de um nucleossoma como o anticorpo de captura utilizado se liga a histonas dentro de nucleossomas intactos e não se liga a histona H2. Os resultados são mostrados na Figura 1.

EXEMPLO 2

[00165]Uma preparação de nucleossoma comercialmente disponível produzida por digestão de cromatina extraída de células MCF7, em que o DNA e as proteínas no nucleossoma são reticulados para a estabilidade (garantindo que todas as his- tonas presentes na preparação sejam incorporadas nos nucleossomas intactos) foi avaliada utilizando um método ELISA para a variante de histona macroH2A2 associada ao nucleossoma utilizando um anticorpo de captura anti-histona em fase sólida que se liga aos nucleossomas intactos e um anticorpo de detecção anti-variante de histona macroH2A2 policlonal purificado por afinidade biotinilado. A amostra de nu- cleossoma foi diluída em série em soro fetal de vitelo e foi testada em duplicata no ELISA. Soro fetal de vitelo puro também foi conduzido no ELISA como uma amostra controle não contendo nucleossomas livres de células. O método de ensaio foi como segue: Uma solução de anticorpo anti-histona em tampão fosfato 0,1M de pH 7,4 foi adicionada aos poços de microtitulação (100 μL/poço) e incubada durante a noite a 4 °C para revestir os poços com anticorpo de captura. Anticorpo anti-histona em excesso foi decantado. Uma solução de albumina de soro bovino (20 g/L) foi adicionada aos poços (200 μL/poço) e incubada por 30 minutos na temperatura ambiente para bloquear os sítios de ligação de proteína em excesso nos poços. Solução de albumina de soro bovino em excesso foi decantada e os poços foram lavados, três vezes, com tampão de lavagem (200 μL/poço, tampão TRIS/HCl 0,05M de pH 7,5 contendo Tween 20 a 1 %). Amostra (10 μL/poço) e tampão de ensaio (50 μL/poço, TRIS/HCl 0,05M de pH 7,5 contendo NaCl a 0,9 %, desoxicolato de sódio a 0,05 % e substituto Nonidet P40 a 1 %) foram adicionados aos poços e incubados durante a noite a 4 °C. A mistura de amostra e tampão de ensaio foi decantada e os poços foram lavados, três vezes, com tampão de lavagem (200 μL/poço). Uma solução de anticorpo de detecção anti-variante de histona macroH2A1.1 policlonal purificado por afinidade bioti- nilado foi adicionada (50 μL/poço) e incubada por 90 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. Anticorpo de detecção em excesso foi decantado e os poços foram lavados novamente, três vezes, com tampão de lavagem (200 μL/poço). Uma solução contendo um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre- maior foi adicionada (50 μL/poço) e incubada por 30 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. Conjugado em excesso foi decantado e os poços foram lavados novamente, três vezes, com tampão de lavagem (200 μL/poço). Uma solução de substrato colorida (100 μL/poço, sal de 2,2’-azinobis[ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfô- nico]-diamônio) foi adicionado e incubado 20 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. A densidade óptica (OD) dos poços foi medida a um comprimento de onda de 405 nm utilizando um leitor de placa de microtitulação padrão. Um curva dose- resposta de cor aumentada com concentração de variante de histona macroH2A2 associada ao nucleossoma aumentada foi observada com um sinal de fundo baixo observado na ausência de variante de histona macroH2A2 (soro fetal de vitelo). O sinal de ELISA positivo indica que a variante de histona macroH2A2 detectada pelo ELISA é incorporada dentro de um nucleossoma como (i) nenhuma das histonas livres estão presentes na amostra e (ii) o anticorpo de captura utilizado se liga a histonas dentro de nucleossomas intactos e não se liga a histona H2. Os resultados são mostrados na Figura 2.

EXEMPLO 3

[00166]Uma preparação de nucleossoma comercialmente disponível produzida por digestão de cromatina extraída de células MCF7, em que o DNA e as proteínas foram reticulados para a estabilidade (garantindo que todas as histonas presentes sejam incorporadas em nucleossomas intactos) foi testada utilizando um método ELISA para variante de histona H2AZ associada ao nucleossoma utilizando um anticorpo de captura anti-histona em fase sólida que se liga aos nucleossomas intactos e não se liga a histona H2 e um anticorpo de detecção anti-variante de histona H2AZ policlonal purificado por afinidade biotinilado. Os detalhes do procedimento de ensaio são similares àqueles descritos no Exemplo 2 acima. Uma curva dose-resposta reproduzívelde cor aumentada com concentração de variante de histona H2AZ associada ao nucleossoma aumentada foi observada com um sinal de fundo baixo observado na ausência de variante de histona H2AZ associada ao nucleossoma (soro fetal de vitelo). O sinal de ELISA positivo indica que a variante de histona macroH2A2 detectada é incorporada dentro de um nucleossoma como (i) nenhuma das histonas livres estão presentes na amostra e (ii) o anticorpo de captura utilizado se liga a histonas dentro de nucleossomas intactos e não se liga a histona H2. Os resultados são mostrados na Figura 3.

EXEMPLO 4

[00167]Utilizamos dois métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual para medir o teor de nucleossoma livre de células circulante de amostras de soro e plasma sanguíneos tomadas de 20 indivíduos saudáveis. O primeiro método ELISA atual (ELISA 1) foi o Roche Cell Death ELISA e o outro (ELISA 2) um ELISA que utiliza um complexo de anticorpo de captura anti-histona e anticorpo de detecção anti-his- tona-DNA. Os níveis de nucleossoma detectados por ambos os métodos de ELISA para o nucleossoma atuais foram tanto menores no plasma normal quanto no soro normal. A faixa normal (expressada em unidades de densidade óptica) para o nível de soro de nucleossomas foi calculada (média de ± 2 desvios padrão da média dos resultados de 20 indivíduos de soro saudável) ser 0 a 4,3 OD unidades para ELISA 1 e 0 a 1,4 para ELISA 2. As faixas respectivas para o plasma foram de 0 a 0,95 e 0 a 0,96. Os resultados são mostrados na Figura 4.

[00168]Medimos também os níveis de nucleossomas contendo uma PTM de histona e dois nucleotídeos, assim como as três variantes de histona mH2A1.1, mH2A2 e H2AZ associadas ao nucleossoma, nas mesmas amostras. Os resultados mostram que as amostras de soro tomadas de indivíduos saudáveis têm níveis uniformemente baixos de nucleossomas contendo variantes de histona ou PTM ou nucleotídeos. As faixas normais (expressadas como densidade óptica) para o nível de soro de nucleossomas contendo variantes de histona, PTM ou nucleotídeos foram; (a) 0 a 0,36 para mH2A1.1, (b) 0,05 a 0,78 para mH2A2, (c) 0,11 a 0,58 para H2AZ, (d) 0,06 a 0,61 para P-H2AX (Ser139), (e) 0,06 a 0,36 para 5-metilcitosina e (f) 0,03 a 0,36 para 5-hidroximetilcitrosina. O plasma medido com resultados de EDTA foram mais altos para todos os 20 indivíduos saudáveis. Os resultados são mostrados nas Figuras 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

EXEMPLO 5

[00169]Medimos os nucleossomas livres de células no plasma com EDTA tomados de 13 indivíduos saudáveis e 55 indivíduos com câncer de estômago, intestino grosso, reto, pulmão (carcinoma de células pequenas e vários carcinomas de células não-pequenas), mama, ovário, próstata, rim e vários cânceres de boca (cavidade oral, palato, faringe e laringe). Todas das amostras de indivíduos saudáveis e pacientes com câncer foram positivas para nucleossomas livres de células. Entretanto, os níveis detectados em amostras tomadas de indivíduos com câncer foram mais altos do que os encontrados em amostras de indivíduos saudáveis e os resultados mostraram que os indivíduos saudáveis e com câncer podem ser discriminados. Por exemplo, a faixa normal calculada em termos de OD como a média de ± 2 desvios padrão na média, para o ensaio de H2AZ de nucleossoma foi de 0 a 0,95. Utilizando este nível de corte de 0,95; todos os 13 indivíduos saudáveis foram negativos para os níveis de H2AZ de nucleossoma elevados. Ao contrário, um resultado positivo para os níveis de H2AZ de nucleossoma elevados verificou-se para 46 das 55 amostras de câncer (uma sensibilidadeclínica geral de 84 %) incluindo as amostras de câncer sendo 100 % (8 de 8) de estômago, 100 % (5 de 5) de intestino grosso, 67 % (2 de 3) de reto, 83 % (5 de 6) de pulmão de células pequenas, 79 % de pulmão de células não-pequenas, 50 % (3 de 6) de mama, 100 % (1 de 1) de ovário, 100 % (1 de 1) de pâncreas, 80 % (4 de 5) de próstata, 100 % (1 de 1) de rim e 100 % (5 de 5) de boca. Os resultados são mostrados na Figura 19.

[00170]Similarmente, para o ensaio de mH2A1.1 associada ao nucleossoma, a faixa normal foi de 0 a 0,91. Utilizando este valor de corte, todas as 13 amostras saudáveis foram negativas e 64 % (35 de 55) de amostras de câncer foram positivas. Para o ensaio de P-H2AX(Ser139) associada ao nucleossoma, a faixa normal foi de 0 a 1,08. Utilizando este valor de corte, todas as 13 amostras saudáveis foram negativas e 60 % (33 de 55) de amostras de câncer foram positivas. 5-Metilcitosina associada ao nucleossoma também foi medida e no ensaio a faixa normal foi de 0 a 1,41. Utilizando este valor de corte, todas as 13 amostras saudáveis foram negativas e 55 % (30 de 55) de amostras de câncer foram positivas.

[00171]Utilizamos também os métodos da invenção para medir uma variedade de outras estruturas associadas ao nucleossoma nas mesmas amostras. Os resultados destes imunoensaios foram compilados para fornecer um perfil das estruturas do nucleossoma em amostras tomadas de pacientes com câncer normalizado em relação a níveis detectados de nucleossomas contendo 5-metilcitosina. Comparamos os perfis resultantes à estrutura do nucleossoma de amostras tomadas de indivíduos saudáveis. O perfil da estrutura do nucleossoma de nucleossomas livres de células verificou ser diferente àquele de indivíduos saudáveis. Os resultados são mostrados na Figura 23. Compilamos similarmente os perfis da estrutura do nucleossoma para as amostras tomadas de uma variedade de doenças não-cancerosas e comparamos esta ao perfil de nucleossomas em amostras tomadas de pacientes com câncer e de indivíduos saudáveis. Os resultados são mostrados na Figura 24.

[00172]Realizamos depois um outro experimento similar incluindo as amostras de 10 indivíduos saudáveis e outros 62 pacientes com câncer de vários tipos. Os resultados foram similares ao primeiro experimento. Por exemplo, utilizando os resultados para a variante de histona H2AZ associada ao nucleossoma e um corte de média de + 2 desvios padrão da média dos resultados para indivíduos saudáveis, os resultados negativos foram obtidos para todos os 10 indivíduos saudáveis e resultados positivos foram obtidos para 95 % (59 de 62) de pacientes com câncer incluindo 9 de 9 pacientes com câncer de próstata, 5 de 5 pacientes com câncer de pele, 6 de 8 pacientes com câncer de esôfago, 12 de 13 pacientes com câncer de bexiga, 2 de 2 pacientes com câncer de cérvix e 1 de 1 pacientes com câncer de cólon, 4 de 4 pacientes com câncer de mama, 7 de 7 pacientes com câncer ovário, 7 de 7 pacientes com câncer de laringe, 3 de 3 pacientes com câncer de pulmão e 3 de 3 pacientes com câncer renal. Este resultado indica que variantes de histona associadas ao nu- cleossoma são biomarcadores clinicamente sensíveis para o câncer. Os resultados são mostrados na Figura 20.

EXEMPLO 6

[00173]Utilizamos dois métodos de ELISA para o nucleossoma da técnica atual para medir o teor de nucleossoma livre de células circulante de amostras de plasma com EDTA tomadas de 3 indivíduos com câncer de cólon, 13 indivíduos com câncer de pulmão, 2 indivíduos com câncer pancreático, 1 indivíduo com câncer de boca e uma amostra de nucleossoma produzida de indivíduos saudáveis de acordo com método de Holdenrieder (*Holdenrieder et al, 2001). O primeiro método ELISA atual (ELISA 1) foi o Roche Cell Death ELISA e o outro (ELISA 2) um ELISA utilizando um complexo de anticorpo de captura anti-histona e anticorpo de detecção anti-his- tona-DNA.

[00174]Medimos também os níveis de nucleossomas contendo três variante histonas, uma PTM de histona e dois nucleotídeos. Os resultados mostram que, embora os resultados baixos de nucleossoma para os métodos de ELISA da técnica atual foram detectados para a maioria dos indivíduos, particularmente, para paciente com câncer pancreático e de boca, a maioria destas amostras têm níveis detectáveis mais altos de nucleossomas que contêm uma ou mais variantes de histona associadas ao nucleossoma. Os resultados para as amostras tomadas de 3 indivíduos com câncer de cólon, 13 indivíduos com câncer de pulmão, 2 indivíduos com câncer pancreático e 1 indivíduo com câncer de boca são mostrados nas Figuras 11, 12, 13 e 14, respectivamente.Níveis de variante de histona associada ao nucleossoma significantes foram detectados em 16 das 19 amostras de câncer (todos, mas 3 amostras de câncer de pulmão). Além disso, a 5-hidroximetilcitosina associada ao nucleossoma foi detectada em 12 das 19 amostras de câncer e 5-metilcitosina associada ao nucleossoma foi detectada em todas as 19 amostras de câncer.

[00175]Além disso, o padrão de níveis de nucleossoma contendo níveis de variante de histona diferentes não é uniforme para todos os indivíduos, mas exibe padrões diferentes para os cânceres diferentes testados. Para facilitar a comparação entre os resultados para os indivíduos com os mesmos cânceres ou diferentes; os resultados para os testes de nucleossoma (para nucleossomas contendo ma- croH2A1.1, macroH2A2, H2AZ, P-H2AX(Ser139), 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcito- sina) foram normalizados como uma proporção do sinal de OD observado para nu- cleossomas contendo 5-metilcitosina. Os resultados normalizados (com barras de erro que mostram o desvio padrão nos resultados onde as amostras de mais do que um indivíduo foram testadas) são mostrados para cada câncer na Figura 15, assim como, os mesmos resultados para a amostra de nucleossoma produzidas de indivíduos saudáveis (mH2A2 e 5-hidroximetilcitosina não foram medidas para esta amostra). A Figura 15 mostra que a distribuição padrão de nucleossomas contendo as variantes de histona normalizadas diferentes, nucleotídeos ou PTM em todos os quatro cânceres investigados difere bastante marcadamente à distribuição de nucleossomas na amostra de indivíduos saudáveis. Assim, a presente invenção pode ser utilizada como um método para a detecção de câncer em um teste de triagem à base de sangue simples. Será claro aos habilitados na técnica que a invenção inclui o teste de nucleossomas contendo outras variantes de histona, modificações de nucleotídeos e/ou histona para ainda ou melhor discriminar entre os nucleossomas livres de células circulantes de tumor ou outra origem da doença.

[00176]Além disso, o padrão de tipos de nucleossoma observado difere de tipos de câncer diferentes. Por exemplo; a amostra tomada de um indivíduo com câncer de boca tem níveis normalizados mais baixos de ambos os nucleossomas contendo mH2A2 ou P-H2AX(Ser139) do que qualquer um dos outros três tipos de câncer. Similarmente, as amostras de indivíduos com câncer pancreático podem ser distinguidas de amostras de indivíduos com câncer de cólon na base de um nível normalizado diferente de nucleossomas contendo variante macroH2A1.1. Assim, a presente invenção pode ser utilizada como um método para diagnosticar câncer geralmente e para distinguir um tipo de câncer particular. Será claro aos habilitados na técnica que a invenção inclui o teste de nucleossomas contendo outras variantes de histona e/ou modificações de histona e/ou nucleotídeos para ainda, ou melhor, discriminar entre os nucleossomas livres de células circulantes de origem do tumor específica diferente ou outra origem da doença.

EXEMPLO 7

[00177]Medimos os níveis de variante de histona associada ao nucleossoma em amostras de soro tomadas de 4 indivíduos saudáveis e 20 amostras de soro tomadas de indivíduos com câncer pancreático utilizando o método da invenção como descrito acima. Utilizando um nível de corte de 0,27 (média de + 2 desvios padrão dos níveis encontrados em pacientes saudáveis), os níveis de H2AZ associada ao nu- cleossoma foram elevados em 80 % (16 de 20) das amostras tomadas de pacientes com câncer pancreático e nenhuma dos indivíduos saudáveis. Os resultados são mostrados na Figura 21.

EXEMPLO 8

[00178]Medimos os níveis de histona H2AZ associada ao nucleossoma de algumas amostras humanas tomadas de pacientes com câncer utilizando um anticorpo de detecção anti-H2AZ biotinilado como descrito no Exemplo 3. O método foi realizado duas vezes utilizando dois anticorpos de captura anti-histona clonais mono- clonais diferentes para determinar se os resultados de H2AZ foram repetidos para anticorpos de captura diferentes. Os resultados na Figura 16 mostram que os níveis de histona H2AZ associada ao nucleossoma dos dois ensaios são linearmente relacionados com uma linha de melhor ajuste que intercepta em aproximadamente zero. As unidades são leituras de densidade óptica simples.

EXEMPLO 9

[00179]Medimos os níveis de histona H2AZ associada ao nucleossoma de amostras de plasma com EDTA de seres humanos tomadas de pacientes com câncer de pulmão como descrito no Exemplo 3. Os níveis detectados foram correlacionados com a progressão da doença dos pacientes. Os resultados mostrados na Figura 22, indicam que os níveis de histona H2AZ associada ao nucleossoma aumentam com a severidade da doença em termos de tamanho, estágio, propagação nodal e propagação de metastática distante e os níveis de histona H2AZ associada ao nucleossoma podem ser utilizados, sozinhos ou como parte de um painel de diagnóstico, como indicadores de doença nodal, tamanho, estágio ou progressão metastática.

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[00208]Ting Hsiung et al, Global DNA Methylation Level in Whole Blood as a Biomarker in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention: 16(1), 108-114, 2007

[00209]van Nieuwenhuijze et al, Time between onset of apoptosis and release of nucleosomes from apoptotic cells: putative implications for sysytemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis; 62: 10-14, 2003

[00210]Vasser et al, Measurement of Global DNA Methylation. Genetic Engineering and Biotechnology News: 29(7), 2009

[00211]Whittle et al, The Genomic Distribution and Function of Histone Variant HTZ-1 during C. elegans Embryogenesis. PLoS Genet 4(9): 1-17, 2008

[00212]Zee et al, Global turnover of histone post-translational modifications and variants in human cells Epigenetics & Chromatin. 3(22): 1-11, 2010

[00213]Zhang et al, Analysis of global DNA methylation by hydrophilic interaction ultra high-pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry: 413(2), 164-170, 2011

Claims (17)

1. Uso de uma variante de histona ou isoforma associada com um nucleos- soma livre de células CARACTERIZADO pelo fato de que é um biomarcador em uma amostra de fluido corporal para o diagnóstico de câncer, cardiomiopatia, lúpus erite- matoso sistêmico, colite, transtorno pulmonar obstrutivo crônico, doença de Crohn e artrite reumatoide.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o nucleossoma é um mononucleossoma ou um oligonucleossoma.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o nucleossoma livre de células compreendendo uma variante de histona ou uma isoforma de histona é medido em uma amostra sanguínea.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer de bexiga, mama, cólon, cérvix, esôfago, rim, intestino grosso, pulmão, cavidade oral, ovário, pâncreas, próstata, reto, pele ou estômago.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer de cólon, pulmão, cavidade oral ou pâncreas.

6. Método para detectar a presença de uma variante de histona ou uma isoforma de histona associada com um nucleossoma livre de células em uma amostra de fluido corporal CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (i) contatar a amostra de fluido corporal com um agente de ligação que se liga à variante de histona ou à isoforma de histona; (ii) detectar ou quantificar a ligação do dito agente de ligação à variante de histona ou à isoforma de histona na amostra de fluido corporal; e (iii) usar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença da variante de histona ou da isoforma de histona ou nucleossomas contendo a variante de histona ou a isoforma de histona na amostra de fluido corporal.

7. Método para detectar a presença de uma variante de histona ou uma isoforma de histona associada com um nucleossoma livre de células em uma amostra de fluido corporal CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (i) contatar a amostra de fluido corporal com um primeiro agente de ligação que se liga aos nucleossomas; (ii) contatar os nucleossomas ligados na etapa (i) com um segundo agente de ligação que se liga à variante de histona ou à isoforma de histona; (iii) detectar ou quantificar a ligação do dito segundo agente de ligação à variante de histona ou à isoforma de histona na amostra de fluido corporal; e (iv) usar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de nucleossomas contendo a variante de histona ou a isoforma de histona na amostra de fluido corporal.

8. Método para detectar a presença de uma variante de histona ou uma isoforma de histona associada com um nucleossoma livre de células em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (i) contatar a amostra de fluido corporal com um primeiro agente de ligação que se liga à variante de histona ou à isoforma de histona; (ii) contatar a amostra, ligada na etapa (i), com um segundo agente de ligação que se liga aos nucleossomas; (iii) detectar ou quantificar a ligação do dito segundo agente de ligação aos nucleossomas na amostra de fluido corporal; e (iv) usar a presença ou grau de tal ligação como uma medida da presença de nucleossomas contendo a variante de histona ou a isoforma de histona na amostra de fluido corporal.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a isoforma de histona é uma isoforma de histona comum que ocorre em todos ou na maioria dos nucleossomas para testar os nucleossomas per se.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de ligação usado para ligar uma histona é direcionado para ligar uma região da dita histona que é comum a todas ou a maioria das variantes ou isoformas de histona das ditas porções de histona e ocorre em todos ou na maioria dos nucleossomas para testar os nucleossomas per se.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de ligação é um anticorpo.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é sangue, soro ou plasma.

13. Método in vitro para detectar ou diagnosticar o estado de uma doença em um animal ou em um indivíduo humano CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (i) detectar ou medir uma variante de histona ou uma isoforma de histona associada com um nucleossoma livre de células em um fluido corporal de um indivíduo usando o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8; e (ii) usar a variante de histona ou a isoforma de histona associada com um nucleossoma de nível detectado para identificar o estado de uma doença do indivíduo.

14. Método in vitro para avaliação de um animal ou indivíduo humano para adequação de um tratamento médico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (i) detectar ou medir uma variante de histona ou uma isoforma de histona associada com um nucleossoma livre de células em um fluido corporal de um indivíduo usando o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8; e (ii) usar a variante de histona ou a isoforma de histona associada com um nucleossoma de nível detectado como um parâmetro para a seleção de um tratamento adequado para o indivíduo.

15. Método in vitro para monitorar um tratamento de um animal ou um indivíduo humano CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (i) detectar ou medir uma variante de histona ou uma isoforma de histona associada com um nucleossoma livre de células em um fluido corporal de um indivíduo usando o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8; (ii) repetir a detecção ou a medição da variante de histona ou isoforma de histona associada com nucleossomas livre de células em um fluido corporal de um indivíduo em uma ou mais ocasiões; e (iii) usar qualquer uma das modificações na variante de histona ou na isoforma de histona associada com um nucleossoma de nível detectado como um parâmetro para qualquer uma das modificações na condição do indivíduo.

16. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a variante de histona ou a isoforma de histona associada com um nucleossoma é detectada ou medida como uma de um painel de medidas usando o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8.

17. Kit para a detecção de uma variante de histona ou uma isoforma de his- tona associada com um nucleossoma livre de células CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ligante ou ligando específico para a variante de histona ou uma isoforma de histona ou uma parte componente desta, ou um mimetismo estrutural/de forma da variante de histona ou uma isoforma de histona ou uma parte componente desta, junto com instruções para uso do kit, de acordo com qualquer um dos métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 6 a 16.

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