MX2014002444A - Metodo para detectar nucleosomas que contienen variantes de histonas. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con un método para detectar y medir la presencia de mono-nucleosomas y oligo-nucleosomas y nucleosomas que contienen variantes de histona particulares y el uso de estas mediciones para la detección y diagnóstico de enfermedad; La invención también se relaciona con un método para identificar biomarcadores de variante de histona para la detección y diagnóstico de enfermedad y con biomarcadores identificados por el método.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR NUCLEOSOMAS QUE CONTIENEN VARIANTES DE HISTONAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un método para detectar y medir la presencia de mono-nucleosomas y oligo-nucleosomas y nucleosomas que contienen variantes de histona particulares y el uso de estas mediciones para la detección y diagnóstico de enfermedades. La invención también se relaciona con un método para identificar biomarcadores de variantes de histona asociados con nucleótidos para la detección y diagnóstico de enfermedades y con los biomarcadores identificados por este método.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cuerpo humano comprende varios cientos de tipos de células. Todos estos tipos de células contienen el mismo genoma pero tienen fenotipos ampliamente diferentes y funciones diferentes en el cuerpo. Esta diversidad fenotípica se debe a la expresión diferencial del genoma en diferentes tipos de células. El control de la expresión de gen diferencial no se entiende completamente pero los mecanismos básicos incluyen regulación de genes por varias señales epigenéticas interconectadas asociadas con el gen que incluyen control del empacado de cromatina como eucromatina o heterocromatina, control de la colocación de nucleosoma y sitios accesibles a nucleasa, metilación de ADN y variación en la estructura de los nucleosoma alrededor de los cuales se envuelve el ADN.

El nucleosoma es la unidad básica de la estructura de cromatina y consiste de un complejo proteínico de ocho histonas de núcleo altamente conservadas (que comprenden un par de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4). Alrededor de este complejo se envuelven aproximadamente 146 pares de bases de ADN. Otra histona, H1 o H5, actúa como un enlazante y está involucrada en la compactación de cromatina. El ADN se enrolla alrededor de nucleosomas consecutivos en una estructura que con frecuencia recuerda a "perlas de un rosario" y esto forma la estructura básica de la forma abierta o eucromatina. La forma compactada o heterocromatina ésta cadena que se enrolla y se superenrolla en una estructura cerrada y compleja (Herranz and Esteller, 2007).

La estructura de nucleosomas puede variar por modificación post-transcripcional (PTM) de proteínas histonas y por la inclusión de proteínas histonas variantes. La PTM de proteínas histonas típicamente ocurre en falla de las histonas del núcleo y las modificaciones comunes incluyen acetilación, metilación o ubiquitinación de residuos lisina así como metilación de residuos arginina y fosforilación de residuos serina y muchos otros. Las modificaciones de histona son bien conocidas que están involucradas en la regulación epigenética de la expresión de genes (Herranz and Esteller, 2007). La estructura del nucleosoma también puede variar mediante la inclusión de isoformas de histona alternativas o variantes las cuales son genes diferentes o productos de empalme y tienen diferentes secuencias de aminoácidos. Las variantes de histona se pueden clasificar en varias familias las cuales se subdividen en tipos individuales. Las secuencias nucleotídicas de una gran cantidad de variantes de histona se conocen y están disponibles públicamente, por ejemplo, en el National Human Genome Research Institute NHGRI Histone DataBase (Mariño-Ramírez, L., Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D., and Landsman, D. The Histone Datábase: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Datábase Volumen 2011. (Enviado) y http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), la base de datos de GenBank (secuencia genética NIH) la base de datos de secuencia nucleotídica de EMBL y el banco de datos de ADN de Japón (DDBJ).

El recambio normal de células en humanos adultos involucra la creación por división celular de 1011 células diariamente y la muerte de un número similar, principalmente por apoptosis. Durante el proceso de apoptósis, la cromatina se descompone en mononucleosomas y oligonucleosomas los cuales se liberan de las células. Bajo condiciones normales los niveles de nucleosoma circulantes encontrados en sujetos sanos se reporta que es bajo. Se encuentran niveles elevados en sujetos con una diversidad de condiciones que incluyen muchos cánceres, enfermedades autoinmunes, condiciones inflamatorias, apoplejía e infarto al miocardio (Holdenreider & Stieber, 2009).

Los mononucleosomas y oligonucleosomas se pueden detectar por análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y se han reportado varios métodos (Sálgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001 ; van Nieuwenhuijze et al, 2003). Estos análisis típicamente utilizan un anticuerpo anti-histona (por ejemplo, anti-H2B, anti-H3 o anti-H1 , H2A, H2B, H3 y H4) como anticuerpo de captación y un complejo de anticuerpo anti-ADN o anti-H2A-H2B-ADN como anticuerpo de detección. Utilizando estos análisis, los investigadores en el campo han reportado que el nivel de nucleosomas en suero es mayor (hasta en un orden de magnitud) que en muestras plasmáticas tomadas de los mismos pacientes. Esto también es válido para las mediciones en suero y plasma de ADN constituido por PCR (Holdenrieder et al, 2005). El motivo para esto no se conoce pero los autores especulan que puede deberse a liberación adicional de ADN durante el proceso de coagulación. No obstante hemos encontrado que los resultados de los análisis de ELISA de nucleosoma de la técnica actual no concuerdan entre si. Además, aunque la mayor parte del ADN circulante en suero o en plasma se ha reportado que existe como mono-nucleosomas y oligo-nucleosomas (Holdenrieder et al, 2001), los niveles medidos de nucleosomas y ADN en suero o plasma no concuerdan bien. El coeficiente de correlación entre los resultados de ELISA para niveles de nucleosomas libres en células circulantes y niveles de ADN circulante medido por PCR (reacción en cadena de polimerasa) de tiempo real se ha reportado que es r = 0.531 en suero r = 0.350 en plasma (Holdenrieder et al, 2005).

Los métodos de ELISA para nucleosomas actuales se utilizan en cultivo celular, principalmente como un método para detectar apoptosis (Sálgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001 ; van Nieuwenhuijze et al, 2003), y también se utilizan para la medición de nucleosomas libre en células circulantes en suero y plasma (Holdenrieder et al, 2001). El suero libre de células y los niveles de nucleosoma en plasma nivelados en la circulación por células que han muerto se han medido por métodos de ELISA en estudios de numerosos cánceres diferentes para evaluar su uso como un biomarcador potencial (Holdenrieder et al, 2001). La media de los niveles de nucleosoma circulante se ha reportado que es alta en la mayor parte, pero no en todos los cánceres estudiados. Los niveles de nucleosoma circulantes más altos se observaron en sujetos con cáncer de pulmón. Los niveles más bajos se observaron en cáncer de próstata, los cuales están dentro del intervalo normal de sujetos sanos. No obstante, se ha reportado que los pacientes con tumores malignos presentan concentraciones de nucleosomas en suero que varían considerablemente y algunos pacientes con enfermedad tumoral avanzada va a ser encontrado que tienen niveles de nucleosoma circulantes bajos dentro del intervalo medido para sujetos sanos (Holdenrieder et al, 2001). Debido a esto y la variedad de causas diferentes de cáncer de niveles de nucleosoma elevados, los niveles de nucleosoma circulantes no se utilizan clínicamente como un biomarcador de cáncer (Holdenrieder and Stieber, 2009). Sorprendentemente, hemos encontrado que muchos sujetos con cáncer cuyos niveles de nucleosoma circulantes son bajos o indetectables medidos por estos métodos de ELISA para nucleosomas de la técnica actual, de hecho presentan niveles elevados de nucleosomas libres de células circulantes. Hemos diseñado y demostrado métodos de ELISA novedosos para nucleosomas que detectan nucleosomas no detectados por métodos de ELISA de la técnica actual.

Los métodos de ELISA para la detección de los PTM de histona también se conocen en el ámbito. Los métodos de ELISA para detección de PTM en proteínas libres de histona (no unidas a otras histonas y ADN en un complejo de nucleosomas) se utilizan para la detección de PTM en histonas extraídas, habitualmente por extracción acida, de lisados de células. Se ha reportado inmunoanálisis para la detección de PTM en nucleosomas libres de células circulantes (Bawden et al, 2005). Se ha reportado un método de detección de ELISA de PTM de histona en nucleosomas purificados recubiertos directamente a pozos de microtitulación (Dai et al, 201 1). En este método, los nucleosomas obtenidos por digestión de extractos de cromatina a partir de células cultivadas se recubren directamente a pozos de microtitulación y se hacen reaccionar con anticuerpos anti-PTM. Será claro para aquellos expertos en el ámbito que este método requiere muestras de nucleosomas relativamente puras y no es adecuado para medición directa de PTM de histonas en medios biológicos complejos tales como sangre o suero.

Se ha reportado en plasma un método de inmunoprecipitación de cromatina modificado (ChIP) para la detección de una PTM de histona (H3K9Me, histona H3 monometilada en el residuo lisina K9) en nucleosomas libres de células asociados con una secuencia de ADN particular se han reportado en plasma. El nivel de metilación de histona específico de secuencia se ha reportado que es independiente de la concentración de nucleosomas circulantes (Deligezer et al, 2008).

Además de la señalización epigenética mediada por la posición del nucleosoma y la estructura del nucleosoma (en términos tanto de la variante de proteina histona constitutiva como de las estructuras PTM), el control de la expresión del gen en células también es mediada por modificaciones a nucleótidos de ADN que incluyen el estado de metilación de citosina del ADN. Se ha sabido en el ámbito durante cierto tiempo que el ADN puede estar metilado en la posición 5 de nucleótidos de citosina para formar 5-metilcitosina. El ADN metilado en forma de 5-metilcitosina se ha reportado que se presente en posiciones en la secuencia de ADN en donde se encuentra un nucleótido citosina cercano a un nucleótido guanina. Estas posiciones se denominan "CpG", por brevedad. Se ha reportado que más de 70% de las posiciones CpG están metiladas en vertebrados (Pennings et al, 2005). Las regiones del genoma que contienen una alta proporción de sitios CpG con frecuencia se denominan "islas CpG", y aproximadamente 60% de las secuencias promotoras de los genes humanos se asocian con estas islas CpG (Rodriguez-Paredes and Esteller, 2011). En genes activos, estas islas CpG generalmente están hipometiladas. La metilación de la secuencias promotoras de gen se asocia con inactivación estable del gen. La metilación de ADN también se produce comúnmente en elementos repetitivos que incluyen elementos repetitivos Alu y elementos nucleotídicos interpuestos largos (Herranz and Estellar, 2007; Alien et al, 2004).

La relación de metilación de ADN en cáncer se ha reportado en un momento tan temprano como 1983 (Feinberg and Vogelstein, 1983). Los patrones de metilación de ADN observados en células cancerosas difieren de aquellos en células sanas. Se ha reportado que los elementos repetitivos, particularmente alrededor de áreas pericentroméricas están hipometilados en cáncer en relación a células sanas pero los promotores de genes específicos se han reportado que están hipermetilados en cáncer. El equilibrio de estos dos efectos se reporta que resulta en hipometilación de ADN global en células de cáncer (Rodriguez-Paredes; Esteller, 2007).

La hipermetilación de ciertos genes específicos se puede utilizar como un biomarcador de diagnóstico para cánceres. Por ejemplo, un método reportado para detección de hipermetilación del gen septina 9 por amplificación por PCR de ADN extraído de plasma se ha reportado que detecta 72% de los cánceres de colon con una tasa de positivos falsos de 10% (Grutzmann et al, 2008). El estado de metilación de ADN de genes o loci específicos habitualmente se detecta por desaminación bisulfito selectiva de citosina pero no 5-metilcitosina a uracilo, lo que genera un cambio de secuencia de ADN primario que se puede detectar por secuenciado u otros medios (Alien er al, 2004).

La hipometilación de ADN global es una marca distintiva de células de cáncer (Estellar 2007 and Hervouet et al, 2010). La metilación de ADN global se puede estudiar en células utilizando técnicas de immunohistoquímica (IHC). De manera alternativa, el ADN es extraído de las células para análisis. Se han reportado numerosos métodos para la detección de metílación global de ADN extraído de células que incluyen digestión por restricción y análisis del vecino más cercano, análisis fluorescentes utilizando cloroacetaldehído, determinación inversa por metilación de todos los sitios CpG utilizando ADN metiltransferasa junto con S-adenosil metionina marcada con tritio para calcular la cantidad de CpG no metilado y digestión de ADN en nucleótidos únicos para análisis por cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía en capa delgada o cromatografía líquida post-seguida de espectrometría de masas. Las desventajas de estos métodos es que requieren mucho trabajo y/o requieren grandes cantidades de ADN extraído de buena calidad (Alien et al 2004). Los métodos basados en PCR que involucran desaminación de bisulfito superan la necesidad de cantidades grandes de ADN pero deben amplificar regiones de genoma específicos, típicamente secuencias repetitivas, como indicativo del contenido de genoma total de 5-metilcitosina (Alien et al 2004). Estos métodos para medición de metilación de ADN global se han utilizado para estudiar ADN extraído de una diversidad de células y tejidos. Algunos investigadores han estudiado ADN extraído de leucocitos en sangre completa dado que es más fácil obtener de una manera mínimamente invasiva (Moore et al, 2008; Ting Hsiung et al, 2007; Mansour et al, 2010). La cromatografía líquida con espectrometría de masas se considera la norma dada medición de metilación de ADN global pero es costosa y el ADN debe ser digerido a nivel de nucleótido único antes del análisis (Vasser et al, 2009).

Métodos recientes para el cálculo de metilación de ADN global incluyen cromatografía líquida de ultra alta presión con espectrometría de masas de ADN hidrolizado extraído de tejido (Zhang et al, 201 1) y el método de secuenciado digital específico de metilación (MSDS) (Ogoshi et al 2011). Un inmunoanálisis competitivo clásico para metilación de ADN global (así como un análisis similar para metilación de 5-hidroxímetilcitosina global) ha sido descrito. En este método, el ADN extraído de células o tejido se agrega a un pozo de microtitulación recubierto con un conjugado de citidina 5-metilada y anticuerpo anti-5-metilcitidina se agrega y la distribución de la unión de anticuerpo entre el conjugado de 5-metilcitidina recubierto y el ADN metilado en la muestra extraída se compara con el de estándares conocidos para calcular el nivel de metilación de ADN global presente en la muestra (Cell Biolabs 201 ). En otro método similar a inmunoanálisis, ADN extraído de tejidos o de plasma o muestras de suero se recubre en un pozo de microtitulación y se detecta ADN metilado utilizando anticuerpo anti-5-metilcitosina (Vasser, et al, 2009; Epigentek, 2009). Una desventaja de estos métodos es que requieren extracción de ADN que involucra la desnaturalización y separación de todo nucleosoma y estructura de cromatina del ADN. No son adecuados, por ejemplo, para la medición directa de metilación de ADN global en fluidos biológicos tales como lisados de tejido, sangre, plasma o suero sin una etapa de extracción de ADN.

La modificación 5-hidroximetilo de bases de citosina en ADN también se ha reportado. El papel de la 5-hidroximetilación aún no se ha entendido bien pero parece estar involucrado en la regulación de genes (Stroud et al, 201 ).

Los métodos actuales para la detección de metilación de ADN global involucran extracción o purificación del ADN y no son adecuados para métodos de diagnóstico mínimamente invasivos, de bajo costo y, alto rendimiento y rápidos. De manera similar, el análisis de ADN para otras bases modificadas o poco comunes (por ejemplo, uracilo, inosina, xantina, hipoxantina) únicamente pueden ser investigados mediante el análisis de ADN sustancialmente puro o extraído. Este análisis no se puede llevar a cabo directamente en medios biológicos complejos tales como lisado de tejido, sangre, plasma o suero.

Las variantes de histona (también conocidas como isoformas de histona) también se conoce que son reguladores epigenéticos de la expresión de genes (Herranz and Esteller, 2007). Se han estudiado variantes de histona in vivo e in vitro utilizando una diversidad de técnicas que incluyen estudios de bloqueo de expresión del gen que codifica para una variante particular (por ejemplo utilizando un bloqueo de ARNi), inmunoprecipitación cromatina, marcado con isótopos estables de aminoácidos y proteómica de espectrometría de masas cuantitativa, inmunohistoquímica y transferencia Western (Whittie et al. 2008; Boulard et al. 2010; Sporn et al, 2009; Kappor et al, 2010; Zee et al, 2010; Hua et al, 2008).

Los estudios de inmunohistoquímica de expresión de variantes de histona en muestras de tejido extraídas en cirugía o por biopsia de sujetos en quienes de ha diagnosticado cáncer de pulmón, cáncer de mama y melanoma han sido reportados. Estos estudios de inmunohistoquímica reportan que la tinción de la histona macroH2A (mH2A) y las variantes H2AZ en muestras de tejido de cáncer extraídas pueden tener aplicación pronostica en estos cánceres (Sporn et al, 2009, Hua et al, 2008; Kapoor et al, 2010). Una desventaja de los métodos inmunohistoquímicos para uso clínico es que la recolección de muestra de tejido es invasiva involucrando cirugía o biopsia. Otra desventaja de los métodos de inmunohistoquímica es que no son adecuados para el diagnóstico temprano o para el diagnóstico de cribado dado que habitualmente existe de antemano una esperanza razonable de la enfermedad antes de que se realice la biopsia o la extirpación de tejido. Las pruebas de ELISA en sangre, mínimamente invasivas, son adecuadas para una amplia gama de aplicaciones y podrían superar estas desventajas y ser preferibles para los pacientes así como una manera más rápida, de menor costo y de un rendimiento más alto para los proveedores de cuidados de la salud.

No obstante, los nucleosomas libres de células que contienen nucleótidos particulares, nucleótidos modificados o variantes de histona no se han medido en sangre o cualquier otro medio y no se han sugerido ni contemplado estas mediciones. No se han reportado estudios respecto a la presencia o ausencia de nucleótidos, nucleótidos modificados o variantes de histona en nucleosomas libres de células ni tampoco se ha determinado su valor como biomarcadores de enfermedad en sangre. Actualmente no hay métodos para la detección o división de nucleótidos, nucleótidos modificados o variantes de histona en nucleosomas libres de células intactas. Aquí reportamos métodos para estas pruebas y su uso en muestras de plasma y suero tomadas de sujetos sanos y enfermos. Sorprendentemente, hemos encontrado que niveles altos de nucleosomas intactos que comprenden variantes de histona específicos se pueden detectar en muestras de plasma y suero para los cuales no se detectan nucleosomas o se detectan a niveles bajos por métodos de ELISA para nucleosoma de la técnica actual.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un nucleosoma libre de células que comprende una variante de histona o isoforma de histona para uso como un biomarcador para el diagnóstico de cáncer, cardiomiopatía, lupus eritematoso sistémico, colitis, trastorno pulmonar obstructivo crónico, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene variante de histona o isoforma de histona en una muestra, el cual comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un agente de unión en cual se une a la variante de histona o isoforma de histona; (ii) detectar o cuantificar la unión del agente de unión a la variante de histona o isoforma de histona en la muestra; y (iii) utilizar la presencia o grado de esta unión como una medida de la presencia de nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en la muestra.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención se proporciona un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o isoforma de histona en una muestra, el cual comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un primer agente de unión el cual se une a los nucleosomas; (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión el cual se une a la variante de histona o isoforma de histona; (iii) detectar o cuantificar la unión del segundo agente de unión a la variante de histona o isoforma de histona en la muestra; y (iv) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de los nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en la muestra.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o isoforma de histona en una muestra, el cual comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un primer agente de unión el cual se une a la variante de histona o isoforma de histona; (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión el cual une los nucleosomas; (iii) detectar o cuantificar la unión del segundo agente de unión a los nucleosomas en la muestra; y (iv) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en la muestra: De acuerdo con aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o isoforma de histona en una muestra de sangre suero o plasma, el cual comprende las etapas: (i) remover, liberar o extraer una variante de histona o isoforma del complejo de nucleosoma para producir una variante de histona libre o porción de histona; (ii) detectar o cuantificar la variante de histona libre o isoforma en la muestra; y (iii) utilizar la presencia o cantidad de la variante de histona libre o isoforma como una medida de la presencia de nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en la muestra.

De acuerdo con un tercer aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene variantes de histona o isoforma de histona en una célula, la cual comprende las etapas de: (i) aislar cromatina de una célula; (ii) digerir, someter a sonicado o descomponer de alguna otra manera la cromatina para formar mono-nucleosomas y/u oligo-nucleosomas; y (ii¡) detectar o medir la presencia de la variante de histona o isoforma de histona en los nucleosomas de acuerdo con el método de la invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un método para detectar o diagnosticar un estado de enfermedad en un animal o un sujeto humano, el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contienen una variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal de un sujeto; y (ii) utilizar el nivel detectado de nucleosoma asociado a la variante de histona o isoforma de histona para identificar el estado de enfermedad del sujeto.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un método para determinación en un animal o un sujeto humano de los adecuado para un tratamiento médico el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contienen una variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto; y (ii) utilizar el nivel detectado de nucleosoma asociado a la variante de histona o isoforma de histona como un parámetro para selección de un tratamiento adecuado para el sujeto.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un método para monitorear un tratamiento de un animal o un sujeto humano el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contienen una variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto; (ii) repetir la detección o medición de nucleosomas que contienen una variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto en una o más ocasiones; y (¡ii) utilizar cualquier cambio en el nivel detectador de nucleosoma asociado a la base variante de histona o isoforma de histona como un parámetro para cualquiera de los cambios en la condición del sujeto.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar una variante de histona o isoforma de histona como biomarcador para detectar o diagnosticar un estado de enfermedad en un animal o un sujeto humano, el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contiene la variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto; (ii) detectar o medir nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal de un sujeto sano o un sujeto control; y (¡ü) utilizar la diferencia entre los niveles detectados en sujetos enfermos o control para identificar si una variante de histona o isoforma de histona es útil como un biomarcador para el estado de enfermedad .

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un biomarcador identificado por el método de la invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona un kit para la detección de un nucleosoma asociado a una variante de histona o isoforma de histona el cual comprende un ligando o enlazante específico para la variante de histona o isoforma de histona o una parte del componente del mismo, o un imitador estructural/de forma de la variante de histona o isoforma de histona o parte componente del mismo, junto con instrucciones para utilizar el kit.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 muestra la curva dosis-respuesta de ELISA para la detección de nucleosomas libres de célula humanos preparados por el método publicado (*Holdenrieder et al, 2001 ) que contiene la variante de histona macroH2A1.1. diluida en suero bovino.

La figura 2 muestra la curva dosis-respuesta de ELISA para la detección de histona variante H2A2 en nucleosomas libres de células en cromatina digerida y reticulada extraída de células MCF7 diluido en suero bovino.

La figura 3 muestra la curva dosis-respuesta de ELISA para la detección de histona variante H2AZ en nucleosomas libres de células en cromatina digerida reticulada extraída de células MCF7 diluida en suero bovino.

La figura 4 muestra los niveles de nucleosoma detectados para suero y muestras de plasma tratada con EDTA tomada de 20 voluntarios sanos utilizando métodos de ELISA para nucleosoma de la técnica actual.

La figura 5 muestra los niveles asociados a nucleosoma libre de células de la variante de histona mH2A1.1 detectada para muestras de suero y plasma tratado con EDTA tomada de 20 voluntarios sanos utilizando la prueba de ELISA de la invención.

La figura 6 muestra los niveles asociados a nucleosoma libre de células de la variante de histona mH2A2 detectada para muestras de suero y plasma tratada con EDTA tomadas de 20 voluntarios sanos usando la prueba de ELISA de la invención.

La figura 7 muestra los niveles asociados a nucleosoma libre de células de la variante de histona H2AZ detectada para suero y muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 20 voluntarios sanos usando la prueba de ELISA de la invención.

La figura 8 muestra los niveles asociados a nucleosoma libre de células de P-H2AX (Ser139) detectada para suero y muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 20 voluntarios sanos usando la prueba de ELISA de la invención.

La figura 9 muestra los niveles asociados con nucleosoma libre de células de ADN metilado con 5-metilcitosina metilada detectado para suero y muestras de plasma tratada con EDTA tomadas de 20 voluntarios sanos usando la prueba de ELISA de la invención.

Figura 10 muestra el nucleosoma libre de células asociado a niveles de ADN metilado con 5-hidroximetilcitosina detectado de muestras de suero tomadas de 20 voluntarios sanos utilizando la prueba de ELISA de la invención.

La figura 1 1 muestra los niveles asociados a nucleosoma libres de células de tipos de histonas y nucleótidos detectados para muestras de plasma tratado con EDTA tomado de 3 sujetos con cáncer de colon detectados utilizando métodos de ELISA de la invención.

La figura 12 muestra los niveles asociados a nucleosoma libres de células de tipos de histonas y nucleótidos detectados para muestras de plasma tratado con EDTA de 13 sujetos con cáncer de pulmón detectados utilizando métodos de ELISA de la invención.

La figura 13 muestra los niveles asociados a nucleosoma libres de células de tipos de histonas y nucleótidos detectados para muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 2 sujetos con cáncer de páncreas detectados utilizando métodos de ELISA de la invención.

La figura 14 muestra los niveles asociados a nucleosoma libres de células de tipos de histonas y nucleótidos detectados para una muestra de plasma tratada con EDTA tomada de 1 sujetos con cáncer en la cavidad bucal detectado utilizando métodos de ELISA de la invención.

La figura 15 muestra los niveles asociados de nucleosoma libre de células de tipos de histonas y nucleótidos para muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 4 diferentes enfermedades de cáncer normalizadas como una proporción de los niveles de ADN metilados de 5-metilcitosina asociados a nucleosoma detectados utilizando los métodos de ELISA de la invención. Los niveles normalizados para una muestra que contiene nucleosomas de voluntarios sanos producidos por el método de *Holdenrieder et al 2001 se muestran para comparación.

La figura 16 muestra los niveles de nucleosoma libres de células asociado con histona H2AZ de muestras de plasma humano tratadas con EDTA tomadas de pacientes con cáncer medida utilizando un anticuerpo de detección anti-H2AZ biotinado con dos anticuerpos de captación anti-histona monoclonales diferentes.

La figura 17 muestra los niveles asociados de nucleosoma libre de células de mH2A1.1 , H2AZ y P-H2AX (Ser139) y 5-metilcitosina (5mc), detectado en plasma tratado con EDTA, plasma tratado con citrato y muestras de plasma tratadas con heparina tomada de voluntarios sanos utilizando el método de ELISA de la invención.

La figura 18 son los niveles de 5-metilcitosina asociados con nucleosoma libre de células detectados para muestras de suero tomadas de 3 voluntarios sanos y 10 sujetos con cáncer de colon detectado utilizando el método de ELISA de la invención.

La figura 19 son los niveles de histona variante H2AZ asociados con nucleosoma libre de células detectados para muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 13 voluntarios sanos y 55 pacientes con cáncer. Se muestran los puntos de valor límite definidos como la media del valor de las muestras sanas más una o dos desviaciones estándar en la media.

La figura 20 muestra los niveles histona variante H2AZ asociados con nucleosoma libre de células detectados para muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 10 voluntarios sanos y 61 pacientes con cáncer. Se muestra el punto límite definido como la media del valor de las muestras sanas más dos desviaciones estándar en la media.

La figura 21 muestra los niveles de nucleosoma libres de células asociado con histona variante H2AZ detectados para muestras de suero tomadas de 4 voluntarios sanos y 20 pacientes con cáncer de páncreas. El punto límite mostrado se define como la media del valor de las muestras sanas más dos desviaciones estándar en la media.

La figura 22 muestra los niveles de nucleosoma libres de células asociados con histona variante H2AZ detectados para muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de pacientes con cáncer de pulmón, con incremento en el tamaño de tumor, etapa y desarrollo de la enfermedad en los nodulos.

La metástasis N1 en los nodulos linfáticos ipsilaterales peribronquiales y/o ipsilaterales hilares y los nodulos intrapulmonares, que incluyen involucramiento por extensión directa N2 metástasis en nodulos linfáticos ipsilaterales del mediastino y/o subcraneales.

N3, metástasis en los nodulos linfáticos contralaterales del mediastino, contralaterales hilares, ipsilaterales o contralaterales del escaleno o supraclaviculares.

T1 : tumor < 3 cm T2: 3 cm < tumor < 7 cm T3: tumor > 7 cm 14: el tumor de cualquier tamaño invade otro órgano, o tejido M0: sin diseminación de enfermedad más allá de los nodulos linfáticos regionales.

M1 : diseminación de la enfermedad a metástasis distante La figura 23 muestra los niveles de la media de nucleosoma libre de células asociados de nucleótidos y tipos de histona detectados utilizando métodos de ELISA de la invención par muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 10 enfermedades de cáncer diferentes normalizadas como una proporción de los niveles de ADN metilados con 5-metilcitosina (5mc) asociados a nucleosoma y expresados en relación a la media de proporciones encontradas en 11 sujetos sanos.

La figura 24 muestra la media de los niveles asociados con nucleosoma libre de célula de nucleótidos y tipos de histonas detectados utilizando métodos de ELISA de la invención para muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 2 pacientes con cardiomiopatia, 10 pacientes con lupus eritematoso sistémico (lupus), 12 pacientes con colitis ulcerativa, 10 pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), 8 pacientes con enfermedad de Crhon y 10 pacientes con artritis reumatoide (RA) normalizados como una proporción de los niveles de ADN metilados con 5-metilcitosina (5mc) asociados a nucleosoma y expresados en relación a la media de proporciones encontradas en 11 sujetos sanos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con primer aspecto de la invención, se proporciona un nucleosoma libre de células que comprende una variante de histona o isoforma de histona para uso como un biomarcador para el diagnóstico de cáncer, cardiomiopatia, lupus eritematoso sistémico, colitis, trastorno pulmonar obstructivo crónico, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide.

En una modalidad, el nucleosoma es un mononucleosoma u oligonucleosoma.

De acuerdo con un aspecto particular de la invención el cual puede ser mencionado, se proporciona el uso de una variante de histona o isoforma de histona como un biomarcador para el diagnóstico de cáncer.

En una modalidad, el cáncer es cáncer de vejiga, mama, colon, cuello uterino, esófago, riñon, intestino grueso, pulmón, cavidad bucal, ovario, páncreas, próstata, recto, piel o estomago. En una modalidad particular la cual se puede mencionar, el cáncer es un cáncer de colon, pulmón, cavidad bucal o páncreas.

Hemos desarrollado pruebas de ELISA para la detección y medición de nucleosomas que contienen las variantes histona macroH2A1.1 (mH2A1.1), macroH2A2 (mH2A2) y H2AZ. Hemos utilizado un anticuerpo anti-histona como anticuerpo de captación para estos análisis en combinación con un anticuerpo anti-variante de histona específico apropiado como anticuerpo de detección. Hemos demostrado que estos métodos de ELISA funcionan con anticuerpos de captación anti-nucleosoma alternativos. También hemos utilizado los análisis que muestran que los nucleosomas que contienen variantes de histona específicos se pueden medir en muestras de sangre tomadas de sujetos enfermos y son elementos de diferenciación para uso como biomarcadores no invasivos o mínimamente invasivos. Los niveles de variante de histona detectados en nucleosoma en muestras de suero y plasma tomados de sujetos enfermos, en relación a los niveles de otros epítopos de nucleosoma difiere de aquellos detectados en muestras de sujetos sanos. Además, el patrón de niveles de nucleosomas que contiene diferentes variantes de histona detectadas en nucleosomas en muestras de diferentes enfermedades se ha encontrado que difieren para diferentes enfermedades, particularmente cuando los patrones de variante de histona asociados a nucleosomas se examinan en combinación con los patrones determinados para nucleosomas que contienen diferentes nucleótidos y PT de manera tal que es posible un diagnóstico diferencial de la enfermedad. Deberá quedar claro para los expertos en el ámbito que la inclusión de pruebas para nucleosomas que contienen variantes de histona diferentes o adicionales o modificaciones de histona o nucleótidos es probable que mejoren la diferenciación del diagnóstico diferencial utilizando estos patrones.

Para investigar los niveles de nucleosomas encontrados en sujetos sanos utilizando los métodos de la técnica actual se midieron los nucleosomas en muestras de suero y plasma, tomados de 20 sujetos sanos. Ambos métodos de la técnica actual producen señales más fuertes en muestras de suero tomadas de sujetos sanos que en muestras de plasma. Los resultados se muestran en la figura 4. Esto es consistente con los datos publicados de que los niveles de nucleosomas son más altos en suero que en plasma (*Holdenrieder et al, 2001).

Para investigar los niveles de nucleosomas encontrados en sujetos sanos utilizando los métodos de la invención medimos nucleosomas que contienen las tres variantes de histona en los sueros de 20 sujetos sanos y en suero bovino sano. Los resultados de suero de la totalidad de las tres pruebas de ELISA fueron todas muy bajas o indetectables para la totalidad de los 20 sujetos sanos. También se llevo a cabo similar de muestras de plasma tratadas con EDTA, tomadas de 20 sujetos sanos, para los tres métodos de ELISA de la invención y, sorprendentemente, observamos señales mayores. Los altos niveles de nucleosomas libres de células que contienen las variantes de histona MH2A1.1 , MH2A2, H2AZ así como la histona P-H2AX(Ser139) fueron detectables por métodos de la presente invención en plasma de EDTA humano sano pero se detectaron niveles menores en suero humano sano, como se muestra desde la figura 5 hasta la figura 8. La figura 9 y la figura 10 muestran que se obtienen resultados similares para otras estructuras de nucleosoma. Este hallazgo es inesperado y es diferente de los resultados publicados (*Holdenrieder et al, 2001) así como de resultados que hemos encontrado para métodos de ELISA para nucleosoma de la técnica actual. De esta manera, sorprendentemente, los métodos de la invención producen resultados contrastantes con los métodos de la técnica actual para los niveles relativos de nucleosomas que se presentan en suero y en muestras de plasma tratadas con EDTA.

Investigamos si las estructuras de nucleosoma son detectables en todos los demás diversos tipos comunes de plasma que pueden recolectarse. Hemos encontrado que los niveles altos de nucleosoma libres de célula asociados con H2AZ, mH2A1.1 y P-H2AX(Ser139) son detectables por el método de la invención en plasma tratado con EDTA y, en menor medida, en plasma tratado con citrato tomado de sujetos sanos, pero que el nucleosoma asociado a H2AZ, mH2Al .l y P-H2AX(Serl39) es indetectable sobre las señales de fondo de amortiguador o de suero de caballo en muestras de plasma tratadas con heparina tomadas de sujetos sanos. Algunas muestras de plasma tratadas con heparina (2 de 5) se encontró que contienen niveles detectables de nucleosoma asociado con 5-metilcitosina. Los resultados se muestran en la figura 17. Resumiendo, los nucleosomas libres de células se encuentran en concentraciones relativamente altas en la mayor parte o la totalidad de las muestras de plasma tratadas con EDTA y plasma tratado con citrato tomadas de sujetos sanos utilizando el método de la invención pero son bajas o ausentes en la mayor parte de las muestras de plasma o suero tratadas con heparina tomadas de sujetos sanos. Por lo tanto es evidente que la elección precisa del tipo de muestra será crítica para diferentes aplicaciones.

Hemos demostrado que la selección de muestra para la detección de nucleosomas libres de células que contienen estructuras de histonas particulares involucra varios parámetros. Estos incluyen niveles bajos de nucleosomas libres presentes generalmente en muestras de suero y plasma tratado con heparina tomado de sujetos sanos, los niveles más altos generalmente están presentes en muestras de plasma tratadas con EDTA y citrato tomadas de sujetos sanos, la recomendación de que las muestras de suero que contienen nucleosomas libres de células deben ser estabilizadas por la adición de EDTA después de separación del suero del coágulo (*Holdenrieder et al, 2001) y el protocolo de muestreado de suero. También se pueden utilizar otros agentes estabilizantes (por ejemplo, inhibidores de proteasa). Siempre que fue posible se utilizaron muestras de suero centrifugadas en la siguiente 1 hora posterior a la punción venosa después de lo cual se agregó EDTA 10 mM y se congeló la muestra.

La selección del tipo de muestra de sangre para muestras clínicas debe realizarse en base en la discriminación clínica óptima para la prueba particular. Siguiendo nuestro hallazgo de niveles de nucleosoma consistentemente bajos por el método de la invención en el suero de sujetos sanos, se midieron los nucleosomas que contienen las variantes de histonas mH2A1.1 y H2AZ en muestras de suero tomadas de sujetos con cáncer. Se observó una sensibilidad clínica de hasta 75% de cáncer pulmonar y 80% para cáncer pancreático (figura 21) se observaron. También probamos muestras de suero de pacientes con cáncer para nucleosomas que contienen 5-metilcitosina y observamos sensibilidades clínicas de hasta 100%, como se muestra en la figura 18 para muestras de cáncer de colon.

También medimos los niveles relativos de nucleosomas libres de células que contienen diversas variantes de histona y otras estructuras de nucleosoma y muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de sujetos con una diversidad de enfermedades. Los niveles de nucleosomas libres de células son altos en muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas tanto de sujetos sanos como de sujetos enfermos y las muestras de plasma tratadas con EDTA por lo tanto se puede considerar que es poco probable que sean la mejor selección de muestra para un discriminador sensitivo de sujetos enfermos y sanos. No obstante, hemos demostrado que los niveles y la composición de nucleosomas libres de células circulantes, en términos de los niveles relativos de nucleosomas que contienen diferentes variantes de histonas (así como otras estructuras de nucleosoma) varía entre individuos enfermos y sanos y también entre diferentes enfermedades. Por lo tanto, somos los primeros en reportar que: (i) niveles altos de nucleosomas circulantes están presentes en la totalidad o la mayor parte de las muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de sujetos tanto sanos como enfermos pero esto no es cierto para todos los tipos de muestras de sangres; y también que (ii) sorprendentemente, la detección de enfermedad y discriminación de tipo de enfermedad puede realizarse, por lo menos, mediante análisis de estos nucleosomas de plasma tratado con EDTA en base en los niveles y perfil estructural de uno o más de los tipos relativos de estructuras de nucleosoma presentes en el plasma de sujetos enfermos y sanos.

Medimos los nucleosomas libres de células en plasma tratado con EDTA tomado de sujetos sanos y 1 17 sujetos con una diversidad de tipos de cáncer en dos experimentos que consisten de 55 y 62 sujetos con cáncer, respectivamente. En total, 90% (105 de 117) de las muestras de cáncer se identificaron correctamente como positivas para cáncer utilizando el método de la invención para las histona variante H2AZ asociado a nucleosoma utilizando un nivel límite de la media del resultado para sujetos sanos + 2 desviaciones estándar de la media.

En el primero de estos 2 experimentos se midieron los nucleosomas libres de células en plasma tratado con EDTA tomado de 13 sujetos sanos y 55 sujetos con cáncer de estómago, intestino grueso, recto, pulmón (carcinoma microcítico y diversos carcinomas amicrociticos), mama, ovario, próstata, riñon y diversos cáncer bucales (cavidad bucal, paladar, faringe y laringe). La totalidad de las 13 muestras de sujetos sanos y pacientes con cáncer fueron positivas para nucleosomas libres de células. No obstante, los niveles detectados en muestras tomadas de sujetos con cáncer fueron mayores que los encontrados en muestras de sujetos sanos y los resultados muestran que los sujetos sanos y con cáncer se pueden diferenciar. Por ejemplo, el intervalo normal calculado en términos de DO como la media ± 2 desviaciones estándar de la media, para el análisis de nucleosona H2AZ es de 0 - 0.95. Utilizando este nivel de límite de 0.95; la totalidad de 13 sujetos sanos fueron negativos para niveles elevados de nucleosoma H2AZ. En contraste se encontró un resultado positivo para niveles de nucleosoma elevados H2AZ para 46 de 55 muestras de cáncer (una sensibilidad clínica general de 84%) que incluye 100% (8 de 8) de estomago 100% (5 de 5) de intestino grueso, 67% (2 de 3) de rectal, 83% (5 de 6) de pulmón microcítico, 79% de pulmón amicrocítico, 50% (3 de 6) de mama, 100% (1 de 1) de ovario, 83% (5 de 6) de próstata, 100% (1 de 1) de riñon y 100% (5 de 5) de muestras de cáncer bucal. Los resultados se muestran en la figura 19.

En una modalidad de la invención se proporciona una muestra control y un nivel límite para el análisis para distinguir entre resultados positivos o negativos se definen en relación al resultado para la muestra control. Esto puede ser cualquier proporción igual a, superior o por debajo del nivel del resultado de la muestra control. Los resultados del paciente por debajo de este nivel se consideran negativos y los resultados del paciente por encima de este nivel se consideran positivos. También puede existir un intervalo de "área gris" de resultados de pacientes muy cercanos al nivel límite para el cual la decisión se puede considerar no concluyente y/o la prueba debe repetirse.

De manera similar, para el análisis de nucleosoma asociado a mH2A1.1 , el intervalo normal es de 0 - 0.91. Utilizando este valor límite la totalidad de 13 muestras sanas fueron negativas y 64% (35 de 55) de muestras con cáncer fueron positivas. Para el análisis de nucleosoma asociado a P-H2AX (Ser139), el intervalo normal fue de 0 - 1.08. Utilizando este valor límite la totalidad de las 13 muestras sanas fueron negativas y 60% (33 de 55) de muestras de cáncer fueron positivas. Nucleosoma asociado a 5-metilcitosina también se mide y el intervalo normal es de 0-1.41 , utilizando este valor límite la totalidad de las 13 muestras sanas fueron negativas y 55% (30 de 55) de las muestras de cáncer fueron positivas. Así, algunos análisis de nucleosoma presentan mejor sensibilidad clínica que otros.

Además, es posible utilizar el patrón de estructura de nucleosoma para mejorar la utilidad clínica de la invención. Esto se puede realizar, por ejemplo, al disminuir el punto límite del análisis de nucleosoma asociado a H2AZ a una media + 1 desviación estándar lo que proporciona un intervalo de 0.69. En este caso, el número de negativos falsos se redujo a 3 lo que proporciona una sensibilidad clínica mejorada de 95% (52 de 55) a costa de un incremento en resultados positivos falsos para muestras tomadas de sujetos sanos, de 0% a 23% (3 de 13). Los resultados se muestran en la figura 19.

Las muestras encontradas positivas para nucleosomas asociados a H2AZ, o cualquier nucleosoma, se pueden analizar para el perfil de estructura de nucleosoma. El perfil de nucleosoma se puede utilizar para diferenciar entre pacientes sanos y enfermos como se ilustra en la figura 23 y en la figura 24, en donde las proporciones relativas de las diversas estructuras de nucleosoma en pacientes enfermos se expresan en relación a aquellas encontradas en pacientes sanos y pacientes con otras enfermedades que no son cáncer. Esto muestra que la investigación de estructuras de nucleosoma múltiples en un panel de prueba puede facilitar una mejor discriminación clínica.

De manera similar, la especificidad y/o sensibilidad diagnóstica de la invención se puede incrementar al combinar datos de más de una prueba en forma de relaciones. Por ejemplo, mediante el uso de la relación de nucleosoma asociado a H2AZ:mH2A1.1.

De esta manera los métodos de la invención son capaces de detectar cáncer tanto en plasma como en muestras de suero tomadas de pacientes con cáncer.

Medimos los niveles de nucleosomas libres de células circulantes que contienen tres variantes de histona diferentes en muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 3 pacientes con cáncer de colon, 13 pacientes con cáncer pulmonar, 2 pacientes con cáncer pancreático y 1 paciente con cáncer bucal y se compararon estos niveles con los niveles presentados en muestras de sangre de 20 sujetos sanos así como con preparación producida artificialmente de nucleosomas de suero de sujetos sanos preparados como se describe en la literatura (*Holdenreider et al, 2001). También expresamos los niveles observados en forma normalizada como relaciones de nivel de nucleosomas que contienen diferentes epítopos y se demuestra que estas relaciones o patrones de relaciones son útiles para el diagnóstico tanto de cáncer en general como para el diagnóstico diferencial de tipos de cáncer específicos. También investigamos si el nivel de nucleosoma asociado a histona H2AZ varía con el progreso de la enfermedad. Se observa que la media del nivel de nucleosoma libre de célula que contiene variantes de histona aumenta con la gravedad de la enfermedad y se incrementa ai aumentar la diseminación de la enfermedad a nodulos linfáticos y con un incremento en el tamaño del tumor y de la etapa. Esto proporciona evidencia de que los nucleosomas detectados están asociados a tumor.

También medimos los nucleosomas presentes en estas 19 muestras de cáncer utilizando dos métodos de ELISA para nucleosoma de la técnica actual. De los 19 sujetos con cáncer estudiados la mayor parte se encontró que presentaban niveles de nucleosoma en plasma tratado con EDTA bajos, determinados por las pruebas ELISA 1 y 2 para nucleosomas de la técnica actual. Este resultado ilustra un motivo por el cual los análisis de la técnica actual no se utilizan para propósitos clínicos rutinarios.

Utilizamos métodos de ELISA de la presente invención para medir nucleosomas que contienen las avariantes de histona mH2A1.1 , mH2A2 y H2AZ en las mismas 19 muestras. Los nucleosomas que contienen variantes de histona, particularmente mH2A2 y H2AZ son detectables en 16 de las 19 muestras. Así, en una modalidad, la invención proporciona un método de ELISA para nucleosoma novedoso capaz de detectar nucleosomas que no son detectados por análisis para nucleosomas de la técnica actual.

También medimos los niveles de nucleosomas que contienen 2 nucleótidos diferentes y un PTM de histona en las mismas 19 muestras tomadas de sujetos con cáncer así como una muestra de nucleosomas generada de sujetos sanos por un método descrito en la literatura (*Holdenrieder et al, 2001). Hemos utilizado estas mediciones junto con las mediciones de variantes de histona asociados a nucleosomas descritas aquí, como un panel de la diversidad de nucleosomas libres de células presentes en fluidos biológicos tomados de sujetos con 4 tipos diferentes de cánceres y con nucleosomas generados de sujetos sanos. Sorprendentemente, el patrón de nucleosomas encontrados en los 4 tipos de cáncer investigados (pulmón, colon, pancreático y bucal) todos son distinguibles de lo encontrado en una muestra de nucleosoma generada de sujetos sanos. Además, los diferentes tipos de cáncer también son distinguibles entre si en base en el patrón de nucleosomas de células libres detectables en la sangre de sujetos. Así, en una modalidad de la invención, se proporciona un método para detectar o diagnosticar la presencia, tipo, recurrencia o gravedad de una enfermedad o para determinar el fármaco óptimo u otras opciones de tratamiento al probar una muestra para un panel de epítopos de nucleosoma diferentes que consisten de dos o más mediciones de nucleosomas que contienen variantes de histona o una combinación de una o más ADN de variantes de histona y uno o más ADN de histona base y/o una o más y una o más variantes de historia y/o una o más modificaciones de histona y/o mediciones de nucleosomas, por si mismos, o cualquier combinación o relación de cualquiera de estas, como un indicador del estado de salud o enfermedad de un sujeto.

De manera similar utilizamos métodos de ELISA de la invención para detectar la variabilidad en las estructuras de histonas y nucleótidos de nucleosomas libres de células circulantes en una diversidad de enfermedades cancerosas y no cancerosas y comparamos estos con la estructura de nucleosomas encontrados en 11 sujetos sanos. Se encontró que los nucleosomas están presentes en la totalidad de enfermedades cancerosas y no cancerosas investigadas y se encontró que presentan perfiles que difieren de los que se obtienen de sujetos sanos.

Estudiamos muestras plasmáticas tratadas con EDTA tomadas de 2 pacientes con cardiomiopatía, 10 pacientes con lupus eritematoso sistémico (lupus), 12 pacientes con colitis ulcerativa, 10 pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), 8 pacientes con enfermedad de Crohn y 10 pacientes con artritis reumatoide (RA) y normalizamos los niveles de diversas estructuras de nucleosomas detectadas como una proporción de la media de los niveles de nucleosoma asociados a 5-metilcitosina y se expresaron los resultados en relación a los encontrados en sujetos sanos. Encontramos que las enfermedades se asocian con perfiles de estructura de nucleosoma que difieren de los de sujetos sanos o con cáncer. De esta manera, los perfiles de estructura de nucleosomas se pueden utilizar como una herramienta de diagnóstico para la detección, predicción de pronóstico, monitoreo y predicción de eficacia terapéutica en una amplia variedad de enfermedades que no son cáncer. Los resultados se muestran en la figura 24.

También estudiamos la variabilidad en la estructura de nucleosomas libres de células en términos de nucleótidos y tipos de histonas y nucleótidos detectados utilizando métodos de ELISA de la invención para muestras de plasma tratadas con EDTA tomadas de 55 pacientes con 10 enfermedades de cáncer diferentes normalizados como una proporción de los niveles de ADN metilado de nucleosoma asociado a 5-metilcitosina (5mc) y expresado en relación a la media de proporciones encontradas en 1 1 sujetos sanos. Encontramos nucleosomas presentes en todos los sujetos y perfiles de estructura de nucleosoma que varían entre enfermedades cancerosas, enfermedades que no son cáncer y sujetos sanos. Así, los perfiles de estructura de nucleosomas se pueden utilizar como una herramienta de diagnóstico para la detección, predicción de pronóstico, monitoreo y predicción de eficacia terapéutica en cáncer y otras enfermedades. Los resultados se muestran en la figura 23 y en la figura 24.

Se han reportado isoformas o variantes múltiples para las histonas H2A, H2B y H3. Por otra parte, la histona H4 se ha reportado que existe como una forma única (Tachiwana et al, 2011 ). Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que un método de ELISA de la invención utilizando un anticuerpo o aglutinante dirigido para unir a histona H4 se unirá virtualmente a todos los nucleosomas en una muestra. De esta manera, en una modalidad, la invención proporciona un método novedoso para la detección de nucleosomas por si mismos en el cual los nucleosomas que contienen una variante de histona común se miden como una manera de asegurar que la totalidad o la mayor parte de los nucleótidos sean detectados. Será evidente además para los expertos en el ámbito que los anticuerpos o ligandos adecuados producidos para esta solicitud se pueden dirigir a regiones de histona H4 que no son sujeto a modificación por PTM. Esto incrementará aún más la universalidad del epítopo seleccionado como un epítopo común para la totalidad o la mayor parte de los nucleosomas. De manera similar, será evidente para aquellos expertos en el ámbito que anticuerpos adecuados similares se pueden dirigir para que se unan a regiones de otras porciones de histona seleccionadas de manera que las regiones sean comunes para la totalidad o la mayor parte de las variantes de histona o isoformas de la porción de histona y que no sean sujeto de PTM (por ejemplo, sin limitación; regiones comunes de histona H2A, H2B o H3). De esta manera, la presente invención descrita proporciona un medio para detectar la totalidad o la mayor parte de los nucleosomas en una muestra pese a la variación en las isoformas de histona constitutivas y los PTM.

Concluimos que el método de la presente invención es un método exitoso para la detección y medición de nucleosomas que contienen isoformas o variantes de histona específicas, que este método también se puede utilizar como un método para la detección de nucleosomas por si mismos y que es un método superior para la detección de nucleosomas por si mismos en comparación con los métodos de la técnica actual. Los métodos de la invención utilizados de esta manera tienen ventajas sobre métodos para medir nucleosomas de la técnica actual. Será evidente para los expertos en el ámbito que los métodos de la invención se pueden utilizar para detectar y medir nucleosomas directamente en cualquier muestra en que se presenten, por ejemplo en muestras obtenidas por digestión de cromatina extraída de células o en fluidos biológicos tales como sangre, suero o muestras de plasma. También será evidente que los métodos descritos aquí se pueden desarrollar para cualquier variante de histona o variante de histona modificada para la cual se pueda producir un anticuerpo u otro aglutinante.

La invención se ha probado en muchas enfermedades cancerosas y no cancerosas y se ha encontrado que es eficaz en la detección de la totalidad de las enfermedades probadas. Esto incluye la detección de casos de cáncer de próstata la cual se ha reportado que no es detectable por las pruebas para nucleosoma de la técnica actual (*Holdenrieder et al, 2001 ). Es evidente que la invención es eficaz para la detección de la totalidad o la mayor parte de los cánceres. Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que el desempeño clínico de la invención puede mejorarse aún más por inclusión de pruebas de estructura de nucleosoma adicionales y por examen de las relaciones de las diferentes estructuras de nucleosoma presentes.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar y medir nucleosomas libres de células que contienen variantes de histona específicas o isoformas en una muestra por un inmunoanálisis el cual comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un anticuerpo u otro aglutinante el cual se une a una variante de histona; (ii) detectar y/o cuantificar la unión del anticuerpo u otro aglutinante a la especie variante de histona en la muestra; y (iii) utilizar la presencia o grado de esta unión como una medida de la presencia de un nucleosoma asociado a variante de histona en la muestra.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método doble de inmunoanálisis de anticuerpo, inmunométrico o tipo emparedado para detectar y medir nucleosomas libres de células que contienen variantes o isoformas de histona específicos en una muestra. Una modalidad de este aspecto es un inmunoanálisis el cual comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra la cual puede contener nucleosomas con un primer anticuerpo u otro aglutinante el cual se une a los nucleosomas; (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo anticuerpo u otro aglutinante el cual se une a una variante de histona; (iii) detectar y/o cuantificar la unión del segundo anticuerpo u otro aglutinante una especia variante de histona en la muestra; y (iv) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de un nucleosoma asociado a variante de histona en la muestra.

De acuerdo con otra modalidad, se proporciona un método para detectar y medir nucleosomas libres de células que contienen variantes o isoformas de histona en una muestra por un inmunoanálisis el cual comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra la cual puede contener nucleosomas con un primer anticuerpo u otro aglutinante el cual se une a una variante de histona; (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo anticuerpo u otro aglutinante el cual se une a nucleosomas; (iii) detectar y/o cuantificar la unión del segundo anticuerpo u otro aglutinante a nucleosomas en la muestra; y (iv) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de un nucleosoma asociado a la variante de histona en la muestra.

Se pueden utilizar una diversidad de anticuerpos u otros aglutinantes de la invención como un aglutinante el cual se une a nucleosomas. Estos incluyen aglutinantes dirigidos para unir a epítopos que se presentan en nucleosomas intactos y que no están en histonas libres (por ejemplo; un epítopo encontrado en la unión entre dos histonas en un nucleosoma) y también aglutinantes dirigidos a cualquier componente de nucleosoma que incluye proteína de nucleosoma común, histona o epítopos de ácido nucleico. Hemos corrido muestras con el método de la invención utilizando dos anticuerpos de captación diferentes y hemos demostrado que el anticuerpo de captación particular utilizado no afecte materialmente los resultados del método de la invención. Los resultados se muestran en la figura 16.

Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que los métodos de la invención descritos incluyen una diversidad de modalidades que incluyen inmunoanálisis competitivo clásico así como análisis de tipo de biosensor y análisis libres de marca del tipo comercializado, por ejemplo, por ForteBio Incorporated de Estados Unidos, el cual puede ser de naturaleza inmunométrica.

De acuerdo con una modalidad de la invención, se proporciona un método para detectar y medir una isoforma o variante de histona o un nucleosoma asociado a la isoforma o variante de histona en una muestra por un inmunoanálisis inmunométrico libre de marcas el cual comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un anticuerpo u otro aglutinante el cual se une a una isoforma o variante de histona; (ii) detectar y/o cuantificar la unión del anticuerpo u otro aglutinante a una isoforma o variante de histona en la muestra; y (iii) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de isoforma de histona o variante o un nucleosoma asociado a la isoforma de histona o variante en la muestra.

De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, se proporciona un método para detectar y medir una isoforma de histona o variante, libre de células, o un nucleosoma asociado a isoforma de histona o variante, en una muestra mediante un inmunoanálisis competitivo el cual incluye las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un anticuerpo u otro aglutinante el cual se une a una isoforma o variante de histona; (ii) detectar y/o cuantificar la unión del anticuerpo u otro aglutinante una isoforma o variante de histona en la muestra; y (iii) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de una isoforma o variante de histona en la muestra.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar la proporción de nucleosomas que comprenden una isoforma de histona en una muestra que comprende las etapas de: (i) detectar o medir el nivel de nucleosomas en una muestra; (ii) detectar o medir el nivel de un nucleosoma asociada a isoforma de histona de acuerdo con un método de la invención; y (iii) utilizar las dos mediciones para determinar la proporción de nucleosomas que contiene la isoforma de histona.

De acuerdo con una modalidad de este aspecto de la invención; tanto el nivel de nucleosoma total en la muestra como el nivel de variante de historia asociado a nucleosoma de interés se mide utilizando el método de la invención. En otra modalidad, los métodos de ELISA para nucleosoma de la técnica actual se utilizan para determinar los niveles de nucleosoma totales. En otra modalidad adicional se utiliza una medida del ADN total como una representación para el nivel de nucleosoma total.

Hemos demostrado que la detección y medición de nucleosomas que contienen variantes de histona en la sangre tomada de sujetos se puede utilizar como un método de diagnóstico para identificar sujetos con cáncer y para diferenciarlos de los sujetos sanos. Además hemos demostrado que los patrones de nucleosomas que contienen un panel de variantes de histona diferentes, nucleótidos y PTM de histonas se pueden utilizar para distinguir entre diferentes cánceres. Será evidente para los expertos en la técnica que esto proporciona las bases para una prueba sanguínea de cáncer que detectará cáncer en sujetos y que puede ser utilizada para distinguir entre tipos de cáncer en sujetos positivos a cáncer. De acuerdo con otro aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar o diagnosticar la presencia de una enfermedad al medir o detectar la presencia y/o el nivel o concentración de nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona en un fluido corporal y utilizar el nivel detectado como un biomarcador del estado de enfermedad de un sujeto que incluyen, sin limitación, un diagnóstico clínico de una enfermedad, un diagnóstico diferencial del tipo o subtipo de enfermedad, o un pronóstico de enfermedad, o una recaída de enfermedad o un diagnóstico de la susceptibilidad de un sujeto a regímenes de tratamiento. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que los fluidos corporales utilizados para pruebas de diagnóstico incluyen, sin limitación, sangre, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo y otros fluidos. En una modalidad preferida, el fluido corporal seleccionado como la muestra es sangre, suero o plasma. La el nivel de respuesta del análisis, la concentración o cantidad de un nucleosoma asociado a una variante de histona en un fluido corporal se puede expresar en términos absolutos o términos relativos, por ejemplo, sin limitación como una proporción del nivel de nucleosoma total o de ADN total presente o como una relación respecto al nivel de nucleosomas que contienen otra variante de histona o nucleótido o PTM.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar o medir la presencia y/o el nivel de nucleosomas que contienen una variante de histona particular en una célula, el cual comprende las etapas de: (i) aislar cromatina de una célula; (ii) descomponer la cromatina para formar mono-nucleosomas y/o oligo-nucleosomas; y (iii) detectar o medir la presencia de una variante de histona en los mono-nucleosomas y/u oligo-nucleosomas por medio de un método de inmunoanálisis como se describe en la presente.

Los métodos para producir mono-nucleosomas y/u oligo-nucleosomas a partir de cromatina son bien conocidos en el ámbito e incluyen digestión de enzimas y sonicación (Dai et al, 201 1). Hemos producido nucleosomas libres de células a partir de células MCF7 utilizando procedimientos estándar y hemos utilizado el método de la invención para mostrar que estos nucleosomas de MCF7 incluyen nucleosomas que contienen las variantes de histona mH2A1.1 , H2AZ así como P-H2AX(Ser139).

En una modalidad, la variante de histona seleccionada para detección por el método es una isoforma que se encuentra de manera común la cual se encuentra en la totalidad o en la mayor parte de los nucleosomas intactos, proporcionando un método para la detección o medición de nucleosomas por sí mismo. En otra modalidad, el epítopo sobre una isoforma de histona seleccionado para detección por el método se localiza en una región de la isoforma de histona que es común y que se presenta en la totalidad o en mayor parte de las isoformas de la histona y por lo tanto en la totalidad o la mayor parte de los nucleosomas intactos y adicionalmente no se somete a PTM, proporcionando un método para la detección o medición de nucleosomas por sí mismos.

Se apreciará por aquellos expertos en el ámbito que el método descrito de detección de nucleosoma asociados a variantes de histona en células o tejidos es más sencillo, más rápido, más barato, más cuantitativo y/o más reproducible que los métodos utilizados actualmente que incluyen IHC, transferencia Western p FACS. El nivel de concentración o cantidad de un nucleosoma particular asociado a variante de histona se puede expresar en términos absolutos o términos relativos, por ejemplo, como una proporción de los nucleosomas totales o del ADN total presente o como una relación al nivel de nucleosomas que contienen otra variante de histona o PTM o nucleótido.

Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que los términos anticuerpo, aglutinante o ligando con respecto a cualquier aspecto de la invención no son limitantes sino que se pretende que incluyen cualquier aglutinante capaz de unirse a moléculas o entidades específicas y que cualquier aglutinante adecuado se puede utilizar en el método de la invención. También será evidente que el término nucleosoma se pretende que incluya mononucleosomas y oligonucleosomas y cualquiera de tales fragmentos de cromatina que pueden ser analizados en medios fluidos.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un kit para detectar o medir nucleosomas el cual comprende un ligando o un aglutinante específico para la variante de histona a una parte componente del mismo, o un imitador estructural/conformacional del nucleosoma o parte componente del mismo, junto con instrucciones para uso del kit, de acuerdo con cualquiera de los métodos definidos en la presente.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un kit para detectar o medir nucleosomas que contienen una variante de histona particular el cual comprende un ligando o aglutinante especifico para la variante de histona particular o una parte componente del mismo, o un imitador estructural/conformacional del nucleosoma o parte componente del mismo, junto con instrucciones para uso del kit de acuerdo con cualquiera de los métodos definidos en la presente.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar un biomarcador variante de histona para detectar o diagnosticar estado de enfermedad en animales o humanos el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir el nivel de nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona en un fluido corporal de sujetos enfermos; (ii) detectar o medir el nivel de nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona en un fluido corporal de sujetos control; y (iii) utilizar la diferencia entre los niveles detectados y en sujetos enfermos y control para identificar si una variante de histona particular es útil como un biomarcador para esa enfermedad.

Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que los sujetos control se pueden seleccionar en una diversidad de bases las cuales pueden incluir, por ejemplo, sujetos que se sabe están libres de la enfermedad o pueden ser sujetos con una enfermedad diferente (por ejemplo; para la investigación de diagnóstico diferencial).

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar un biomarcador variantes de histona para determinar el pronóstico de un sujeto enfermo, animal o humano, el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir el nivel de nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona en un fluido corporal de sujetos enfermos; y (¡i) correlacionar el nivel de nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona detectado en un fluido corporal de sujetos enfermos con el resultado de enfermedad de los sujetos.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar un biomarcador variante de histona para ser utilizado para la selección de un régimen de tratamiento para un sujeto enfermo animal o humano en necesidad de tratamiento, el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir el nivel de nucleosomas libre de células que contiene una variante de histona en un fluido corporal de sujetos enfermos; y (ii) correlacionar el nivel de nucleosomas libre de células que contienen una variante de histona detectado en un fluido corporal de sujetos enfermos con la eficacia observada de un régimen de tratamiento en estos sujetos.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar un biomarcador variante de histona para ser utilizado para monitorear el tratamiento de un sujeto enfermo animal o humano, el cual comprende las etapas de: (i) detectar o medir el nivel de nucleosomas libres de células que contiene una variante de histona en un fluido corporal de un sujeto enfermo; (ii) repetir la detección o medición en una o más ocasiones durante el progreso de la enfermedad del sujeto; y (iii) correlacionar el nivel de nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona detectada en un fluido corporal de un sujeto enfermo con el progreso de enfermedad en el sujeto.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un biomarcador identificado por el método como se define en la presente.

Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que los nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona también se pueden detectar en un fluido biológico que incluye sangre, plasma, suero y orina por un procedimiento que involucra la extracción de la proteína variante de histona del complejo de nucleosoma seguido por un método para la detección o cuantificación de la proteína de variante de histona libre extraída. Los procedimientos de extracción adecuados incluyen procedimientos de extracción en ácido utilizados habitualmente para histonas los cuales utilizan la naturaleza básica de las proteínas histonas. La detección de la variante de histona se puede realizar, por ejemplo, por un inmunoanálisis para la porción de histona libre. Así, en una modalidad de la invención se extrae una variante de histona de un fluido biológico que incluye sangre, plasma, suero y orina y el extracto se prueba para la presencia de una variante de histona.

Se conoce en el ámbito que uno puede detectar la presencia de una proteína que está constituida como parte de un complejo que contiene otras porciones por métodos de inmunoanálisis. Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que los nucleosomas libres de células que contienen una variante de histona se pueden detectar en un fluido biológico que incluye sangre, plasma, suero y orina por un procedimiento que involucra el inmunoanálisis directo de las variantes de histona misma en el fluido. En este procedimiento, un inmunoanálisis de anticuerpo único, utilizando un anticuerpo dirigido a un epítopo presente en una variante de histona, o un inmunoanálisis de dos sitios, utilizando dos anticuerpos dirigidos a dos epítopos presentes en una variante de histona se utilizan para detectar la presencia de una variante de histona dentro de un nucleosoma. Así, en otra modalidad de la invención, una variante de histona contenida dentro de un nucleosoma se detecta directamente en un fluido biológico que incluye sangre, plasma, suero y orina mediante el uso de un método de inmunoanálisis para una variante de histona.

Asi, en una modalidad de la invención una variante de histona se extrae un fluido biológico que incluye sangre, plasma, suero y orina y el extracto se prueba para determinar la presencia de una variante de histona.

Un aspecto adicional de la invención proporciona ligandos o aglutinantes tales como compuestos como se encuentran de modo natural o sintetizados químicamente, capaces de unión específica al biomarcador. Un ligando o aglutinante de acuerdo con la invención puede comprender un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un ligando sintético tal como un anticuerpo plástico o un aptámero u oligonucleótido, capaz de unión específica al biomarcador. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo capaz de unión específica al biomarcador. Un ligando de acuerdo con la invención se puede marcar con un marcador detectable, tal como un marcador luminiscente, fluorescente, enzimático o radioactivo; de manera alternativa o adicional un ligando de acuerdo con la invención se puede marcar con una etiqueta de afinidad, por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina o una etiqueta His (por ejemplo, hexa-his). De manera alternativa, la unión de ligando se puede determinar utilizando tecnología libre de marca, por ejemplo, la de ForteBio Inc.

Un biosensor de acuerdo con la invención puede comprender el biomarcador o un imitador estructural/conformacional del mismo capaz de unión específica a un anticuerpo contra el biomarcador. También se proporciona un arreglo que comprende un ligando o imitador, como se describe en la presente.

También se proporciona por la invención el uso de uno o más ligandos como se describen en la presente, los cuales pueden presentarse de manera natural o se pueden sintetizar químicamente, y es adecuadamente un péptido, anticuerpo o fragmento del mismo, aptámero u oligonucleótido o el uso de un biosensor de la invención, o un arreglo de la invención, o un kit de la invención para detectar y/o cuantificar el biomarcador. En estos usos, la detección y/o cuantificacion se puede llevar a cabo en una muestra biológica como se define en la presente.

Los kits de diagnóstico o monitoreo se proporcionan para realizar métodos de la invención. Estos kits de manera adecuada comprenderán un ligando de acuerdo con la invención, para detección y/o cuantificación del biomarcador y/o un biosensor y/o un arreglo como se describe en la presente, opcionalmente junto con instrucciones para uso del kit.

Un aspecto adicional de la invención es un kit para detectar la presencia de un estado de enfermedad, que comprende un biosensor capaz de detectar y/o cuantificar uno o más de los biomarcadores como se definen en la presente.

Los biomarcadores para detectar la presencia de una enfermedad son objetivos esenciales para el descubrimiento de objetivos novedosos y moléculas de fármacos que retardan o detienen el progreso del trastorno. Dado que el nivel del biomarcador es indicativo del trastorno y de la respuesta de al fármaco, el biomarcador es útil para identificación de compuestos terapéuticos novedosos en análisis in vitro y/o in vivo. Los biomarcadores de la invención se pueden utilizar en métodos para el cribado en búsqueda de compuestos que modulen la actividad del biomarcador.

De este modo, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un aglutinante o ligando, como se describe, el cual puede ser un péptido, anticuerpo o fragmento del mismo o aptámero u oligonucleótido de acuerdo con la invención; o el uso de un biosensor de acuerdo con la invención, o un arreglo de acuerdo con la invención; o un kit de acuerdo con la invención, para identificar una sustancia capaz de promover y/o suprimir la generación del biomarcador.

Además, se proporciona un método para identificar una sustancia capaz de promover o suprimir la generación del biomarcador en un sujeto, que comprende administrar una sustancia de prueba a un animal sujeto y detectar y/o cuantificar el nivel del biomarcador presente en la muestra de prueba del sujeto.

El término "biomarcador" significa un indicador biológico distintivo o derivado biológicamente de un proceso, evento o condición. Los biomarcadores pueden ser utilizados en métodos de diagnóstico, por ejemplo, en cribado clínico y determinación de pronóstico y en el monitoreo de los resultados del tratamiento, identificación de pacientes que más probablemente responderán a un tratamiento terapéutico particular, análisis sistemático y desarrollo de fármacos. Los biomarcadores y usos de los mismos son valiosos para identificación de tratamientos nuevos con fármacos y para el descubrimiento de objetivos nuevos para el tratamiento de fármacos.

Los términos "detectar" y "diagnosticar", como se utilizan en la presente abarcan identificación, confirmación y/o caracterización de un estado de enfermedad. Los métodos de detección, monitoreo y de diagnóstico de acuerdo con la invención son útiles para confirmar la existencia de una enfermedad, para monitorear el desarrollo de la enfermedad al determinar el inicio y progreso o para determinar disminución o regresión de la enfermedad.

Los métodos de detección, monitoreo y de diagnóstico también son útiles en método para determinación de un análisis clínico, pronóstico, selección de tratamiento, evaluación de beneficio terapéutico, es decir, para análisis sistémico de fármacos y desarrollo de fármacos.

Los métodos eficientes de diagnóstico y monitoreo proporcionan "soluciones para el paciente" muy poderosas con el potencial de pronóstico mejorado, al establecer el diagnóstico correcto, permitir identificación rápida del tratamiento más apropiado (y de esta manera se reduce la exposición innecesaria a efectos secundarios de fármacos de dañinos) y se reducen las tasas de recaída.

En una modalidad, el biomarcador es liberado de las células de un tumor. Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la detección del crecimiento de un tumor el cual comprende las etapas de (i) medir un biomarcador en una muestra biológica que se asocia con o que se libera de las células de un tumor, y (ii) demostrar que el nivel del biomarcador se asocia con el tamaño, etapa, agresividad o diseminación del tumor.

Se sabe que recambio celular aumentado, la muerte celular y apoptosis llevan a niveles circulatorios aumentados de nucleosomas libres de célula (Holdenrieder et al, 2001). El nivel de nucleosomas libres de células circulantes es un indicador no específico y se presenta en una diversidad de condiciones que incluyen enfermedades inflamatorias, una gran variedad de condiciones benignas y cancerosas, enfermedades autoinmunes así como después de traumatismo o isquemia (Holdenrieder et al, 2001). Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que la invención tendrá aplicación en una diversidad de áreas de enfermedad cuando los nucleosomas circulantes han sido encontrados en los sujetos. Estos incluyen, sin limitación, traumatismo (por ejemplo, daño grave o cirugía), ejercicio extremo (por ejemplo, al correr un maratón), apoplejía y ataque cardíaco, septicemia u otras infecciones graves. Hemos utilizado el método de inmunoanálisis de la invención para medir los niveles nucleosoma e investigar su variabilidad en estructura de histonas y nucleotídica en una variedad de enfermedades que incluyen cardiomiopatía, lupus eritematoso sístémico, colitis ulcerativa, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide y se han comparado estos con los resultados de sujetos sanos. Podemos detectar nucleosomas y determinar sus estructuras relativas (en términos de composición de histona y nucleótidos) en todas estas enfermedades. Dado que los métodos de la presente invención son capaces de detección de una amplia gama de nucleosomas en comparación con los métodos de ELISA para nucleosomas, los métodos de la invención tienen aplicaciones en una amplia gama de áreas de enfermedades cancerosas y no cancerosas.

Los inmunoanálisis de la invención incluyen análisis inmunométricos que utilizan métodos de detección de enzimas (por ejemplo, ELISA), análisis inmunométricos marcados por fluorescencia, análisis inmunométricos marcados por fluorescencia resueltos en tiempo, análisis inmunométricos, análisis inmunométricos quimioluminiscentes, análisis inmunoturbidimétricos, análisis inmuno-métricos marcados con material particulado y análisis inmunorradiométricos así como métodos de inmunoanálisis competitivo que incluye antígeno marcado y métodos de inmunoanálisis competitivo de anticuerpo marcado con una diversidad de tipos de marcas que incluyen marcas radiactivas, enzimáticas, fluorescentes, fluorescentes resueltas en tiempo y materiales particulados. La totalidad de estos métodos de inmunoanálisis son bien conocidos en el ámbito, véase, por ejemplo, Sálgame et al, 1997 y van Nieuwenhuijze et al, 2003.

En una modalidad, la muestra biológica comprende un fluido corporal. Por ejemplo, las muestras biológicas que se pueden probar en un método de la invención incluyen líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre completa, suero sanguíneo, plasma, sangre menstrual, fluido endometrial, orina, saliva u otro fluido corporal (heces, fluido e lagrimas, fluido sinovial, esputo), aliento, etc. tal como aliento condensado o un extracto o purificación del mismo o una dilución el mismo. Las muestras biológicas también incluyen especímenes de un sujeto vivo o tomadas post-mortem. Las muestras se pueden preparar, por ejemplo, cuando sea apropiado diluidas o concentradas y se pueden almacenar de la manera habitual.

En una modalidad, el método de la invención se repite múltiples ocasiones. Esta modalidad proporciona la ventaja de permitir que los resultados de detección sean monitoreados durante un período de tiempo. Tal distribución proporcionará el beneficio de monitorear o determinar la eficacia de tratamiento de un estado de enfermedad. Tales métodos de monitoreo de la invención se pueden utilizar para monitorear el inicio, progreso, estabilización, disminución, recaída y/o remisión.

De esta manera, la invención también proporciona un método para monitorear la eficacia de un tratamiento para un estado de enfermedad en un sujeto, sospechoso de tener la enfermedad, que comprende detectar y/o cuantificar el biomarcador presente en una muestra biológica del sujeto. En métodos de monitoreo, las muestras de prueba se pueden tomar en dos o más ocasiones. El método puede comprender además comparar el nivel de uno o varios biomarcadores presentes en la muestra de prueba con uno o más controles y/o con uno o más muestras de prueba previas tomadas anteriormente del mismo sujeto de prueba, por ejemplo, antes del inicio del tratamiento y/o del mismo sujeto de prueba en una etapa previa del tratamiento. El método puede comprender detectar un cambio en la naturaleza o cantidad de uno o varios de los biomarcadores en las muestras de prueba tomadas en ocasiones diferentes.

Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para monitorear la eficacia del tratamiento para un estado de enfermedad en un sujeto humano o animal, que comprende: (i) cuantificar la cantidad del biomarcador como se define en la presente; y (ii) comparar la cantidad del biomarcador en una muestra de prueba con la cantidad presente en uno o más controles y/o una o más muestras de prueba previas tomadas en un momento anterior del mismo sujeto de prueba.

Un cambio en el nivel del biomarcador en la muestra de prueba en relación al nivel en una muestra de prueba previa tomada anteriormente del mismo sujeto de prueba puede ser indicativo de un efecto benéfico, por ejemplo, estabilización o mejoría del tratamiento respecto al trastorno o desorden del que se sospecha. Además, una vez que se ha completado el tratamiento, el método de la invención se puede repetir periódicamente con el fin de monitorear en búsqueda de recurrencia de una enfermedad.

Los métodos para monitorear la eficacia de un tratamiento se pueden utilizar para monitorear la eficacia terapéutica de tratamientos existentes y terapias nuevas en sujetos humanos y en animales no humanos (por ejemplo, en modelos en animales). Estos métodos de monitoreo se pueden incorporar en análisis sistemáticos en búsquedas de sustancias de fármacos nuevos y combinaciones de sustancias.

En una modalidad adicional, el monitoreo de los cambios más rápidos debido a tratamientos de acción rápida se puede llevar a cabo en intervalos más cortos, de horas o días.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para identificar un biomarcador para detectar la presencia de un estado de enfermedad. El término "identificar", como se utiliza en la presente significa confirmar la presencia del biomarcador presente en la muestra biológica. La cuantificación de la cantidad del biomarcador presente en una muestra puede incluir determinar la concentración del biomarcador presente en la muestra. La identificación y/o cuantificación se puede realizar directamente en la muestra, o indirectamente en un extracto de la misma, o en una dilución de la misma.

En aspectos alternativos de la invención, la presencia del biomarcador se determina al detectar y/o cuantificar el anticuerpo o fragmentos del mismo capaces de especificar la unión al biomarcador que se generan por el cuerpo del sujeto en respuesta al biomarcador y por lo tanto están presentes en una muestra biológica de un sujeto que tiene un estado de enfermedad.

La identificación y/o cuantificación se puede realizar por cualquier método adecuado para identificar la presencia y/o cantidad de una proteína específica en una muestra biológica de un paciente o una purificación o extracto de una muestra biológica o una dilución de la misma. En métodos de la invención, la cuantificación se puede llevar a cabo al medir la concentración del biomarcador en la muestra o en muestras. Las muestras biológicas que se pueden probar en un método de la invención incluyen aquellas como se define en lo anterior. Las muestras se pueden preparar, por ejemplo, cuando se diluyen o concentran apropiadamente y se almacenan de la manera habitual.

La identificación y/o cuantificación de biomarcadores se puede realizar por detección del biomarcador o de un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento con un corte en la parte C-terminal o con un corte en la parte N-terminal. Los fragmentos adecuadamente son mayores de 4 aminoácidos de longitud, por ejemplo, de una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos. Se hace notar en particular que los péptidos de una secuencia igual o relacionada con la de las colas de histona son fragmentos particularmente útiles de proteínas de histona.

El biomarcador se puede detectar directamente, por ejemplo, por SELDI o MALDI-TOF. De manera alternativa, el biomarcador se puede detectar directa o indirectamente por medio de interacción con un ligando o ligandos tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo que une biomarcador, u otro péptido o ligando, por ejemplo, aptámero u oligonucleótido, capaz de unir específicamente el biomarcador. El ligando o aglutinante puede poseer una marca detectable, tal como una marca luminiscente, fluorescente o radioactiva y/o una etiqueta de afinidad.

Por ejemplo, la detección y/o cuantificación se puede llevar a cabo por uno o más métodos que se seleccionan del grupo que consiste de SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), un análisis basado en gel 1-D, un análisis basado en gel 2-D, espectroscopia de masas (EM), CL en fase inversa (RP), permeación de tamaño (filtración en gel), intercambio iónico, afinidad, CLAP, UPLC y otras técnicas basadas en CL o CL EM. Las técnicas CL EM apropiadas incluyen ICAT R (Applied Biosystems, CA, USA) o iTRAQ R (Applied Biosystems, CA, USA). La cromatografía líquida (por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión (CLAP) o cromatografía líquida de baja presión (CLBP), cromatografía en capa delgada, espectroscopia RMN (resonancia magnética nuclear) también pueden utilizarse.

Los métodos de diagnostico o monitoreo de acuerdo con la invención también pueden comprender analizar una muestra por SELDI TOF o MALDI TOF para detectar la presencia o nivel del biomarcador. Estos métodos también son adecuados para análisis sistemático clínico, pronóstico, monitoreo de los resultados del tratamiento, identificación de pacientes que más probablemente respondan a un tratamiento terapéutico particular, para el análisis sistemático de fármacos y el desarrollo y la identificación de objetivos nuevos para el tratamiento de fármacos.

La identificación y/o cuantificación de los biomarcadores analitos se puede realizar utilizando un método inmunológico que involucra un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unión específica al biomarcador. Los métodos inmunológicos adecuados incluyen inmunoanálisis tipo emparedado, tal como una prueba de ELISA tipo emparedado, en la cual la detección de los biomarcadores de analito se realiza utilizando dos anticuerpos los cuales reconocen epítopos diferentes en un biomarcador analito; radioinmunoanálisis (RIA), análisis inmunosolvente unido a enzima directo, indirecto o competitivo (ELISA); inmunoanálisis enzimático (EIA), inmunoanálisis de fluorescencia (FIA), transferencia Western, inmunoprecipitación y cualquier inmunoanálisis basado en partículas (por ejemplo, utilizando oro, plata o partículas de látex, partículas magnéticas o puntos Q). Los métodos inmunológicos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, en placa de microtitulación o en formato de tira.

En una modalidad, uno o más de los biomarcadores se pueden sustituir por una molécula o un fragmento mensurable de la molécula encontrado corriente arriba o corriente abajo del biomarcador en una vía biológica.

La identificación de los biomarcadores clave específicos para una enfermedad es central a la integración de los procedimientos de diagnóstico y regímenes terapéuticos. Utilizando biomarcadores predictivos se pueden desarrollar herramientas de diagnóstico apropiadas tales como biosensores; en consecuencia, en los métodos y usos de la invención, la identificación y cuantificación se puede llevar a cabo utilizando un biosensor, un sistema microanalítico, un sistema de micromanipulación, un sistema de microseparación, un sistema de inmunocromatografía u otros dispositivos analíticos adecuados. El biosensor puede incorporar un método inmunológico para detección de uno o varios de los biomarcadores, tecnologías eléctricas, térmicas, magnéticas, ópticas (por ejemplo, un holograma) o acústicas. El uso de estos biosensores, es posible para detectar uno o varios biomarcadores objetivo en las concentraciones anticipadas encontradas en muestras biológicas.

Como se utiliza en la presente, el término "biosensor" significa cualquier cosa capaz de detectar la presencia del biomarcador. Los ejemplos de biosensores se describen en la presente.

Los biosensores de acuerdo con la invención pueden comprender un aglutinante de ligando o ligandos, como se describe en la presente, capaces de unión específica al biomarcador. Estos biosensores son útiles para detectar y/o cuantificar un biomarcador de la invención.

Uno o varios de los biomarcadores de la invención se pueden detectar utilizando un biosensor que incorpora tecnologías basadas en hologramas "inteligentes" o sistemas acústicos de alta frecuencia, estos sistemas son particularmente susceptibles de configuraciones de tipo de "código de barra" o de arreglo.

En los sensores de holograma inteligente (Smart Holograms Ltd, Cambridge, Reino Unido), se almacena una imagen holográfica sobre una película de polímero delgada que está sensibilizada para reaccionar específicamente con el biomarcador. Ante la exposición, el biomarcador reacciona con el polímero lo que genera una alteración en la imagen presentada por el holograma. La lectura del resultado de la prueba puede ser un cambio en la brillantez óptica, imagen, color y/o posición de la imagen. Para aplicaciones cualitativas y semicuantitativas un holograma de sensor puede ser leído a simple vista, y por lo tanto se elimina la necesidad de equipo de detección. Se puede utilizar un sensor de color sencillo para leer la señal cuando se requieren mediciones cuantitativas. La opacidad o el color de la muestra no interfieren con la operación del sensor. El formato del sensor permite el multiplexado para detección simultánea de varias sustancias. Se pueden diseñar sensores reversibles e irreversibles para satisfacer diferentes requerimientos, y es factible el monitoreo continuo de un biomarcador particular de interés.

De manera adecuada, los biosensores para detección de uno o más biomarcadores de la invención combinan reconocimiento biomolecular con medios apropiados para convertir la detección de la presencia o la cuantificación del biomarcador en la muestra en una señal. Los biosensores se pueden adaptar para pruebas de diagnóstico de "sitio alternativo", por ejemplo, en la sala de espera, en el departamento de pacientes externos, en el quirófano, en la casa, en el campo y en el lugar de trabajo.

Los biosensores para detectar uno o más biomarcadores de la invención incluyen sensores acústico, de resonancia de plasmón, holográfico, de interferometría de biocapa (BLI) y micromanipulados. Los elementos de reconocimiento impresos, la tecnología de transistores de película delgada, los dispositivos resonadores acústicos magnéticos y otros sistemas electroacústicos novedosos se pueden utilizar en los biosensores para detección de uno o más biomarcadores de la invención.

Los métodos que involucran identificación y/o cuantificación de uno o más biomarcadores de la invención se pueden realizar en instrumentos sobre el gabinete o se pueden incorporar en plataformas desechables, de diagnóstico o monitoreo que se pueden utilizar en un ambiente diferente de laboratorio, por ejemplo, en el consultorio del médico o un lado de la cama del paciente. Los biosensores adecuados para realizar los métodos de la invención incluyen tarjetas de "crédito" con lectores ópticos o acústicos. Los biosensores se pueden configurar para permitir que los datos recolectados sean transmitidos electrónicamente al médico para interpretación y de esta manera pueden formar base para medicina electrónica (e-medicina).

Los kits de diagnóstico y monitoreo de la presencia de un estado de enfermedad se describen en la presente. En una modalidad, los kits adicionalmente contienen un biosensor capaz de identificar y/o cuantificar un biomarcador. De manera adecuada, un kit de acuerdo con la invención puede contener uno o más componentes que se seleccionan del grupo de: un aglutinante de ligando o ligandos, específicos para el biomarcador o un imitador de estructura/conformación del biomarcador, uno o más controles, uno o más reactivos y uno o más consumibles; opcionalmente junto con instrucciones para uso del kit de acuerdo con cualquiera de los métodos que se definen en la presente.

La identificación de biomarcadores para un estado de enfermedad permite la integración de procedimientos de diagnóstico y regímenes terapéuticos. La detección de un biomarcador de la invención se puede utilizar para el cribado de sujetos antes de su participación en ensayos clínicos. Los biomarcadores proporcionan el medio para indicar la respuesta terapéutica, incapacidad para responder, perfil de efectos secundarios desfavorables, grado de cumplimiento del medicamento y obtención de niveles adecuados del fármaco en suero. Los biomarcadores se pueden utilizar para proporcionar advertencia de una respuesta adversa al fármaco. Los biomarcadores son útiles en el desarrollo de tratamientos personalizados, dado que la determinación de la respuesta se puede utilizar para un ajuste fino de la dosificación, minimizar el número de medicaciones prescritas, reducir el retraso en la obtención de un tratamiento eficaz y evitar reacciones adversas a los fármacos. De esta manera, al monitorear un biomarcador de la invención, el cuidado del paciente se puede personalizar con precisión para que satisfaga las necesidades determinadas por el trastorno y el perfil fármaco genómico del paciente, el biomarcador de esta manera se puede utilizar para titular la dosis óptima, predecir una respuesta terapéutica positiva e identificar a aquellos pacientes que presentan un riesgo alto de efectos secundarios graves.

Las pruebas basadas en biomarcador proporcionan una determinación de primera línea de pacientes "nuevos" y proporciona medidas objetivas para diagnóstico preciso y rápido, no asequible utilizando las medidas actuales.

Además, las pruebas de biomarcador de diagnóstico son útiles para identificar a miembros de la familia o pacientes con enfermedad ligera o asintomática o quienes pueden encontrarse en alto riesgo de desarrollar la enfermedad sintomática. Esto permite el inicio de un tratamiento apropiado o de medidas preventivas, por ejemplo, manejo de los factores de riesgo. Estos enfoques se reconocen que mejoran el resultado y pueden evitar un inicio abierto del trastorno.

Los métodos de monitoreo de biomarcador, los biosensores y los kits también son vitales como herramientas de monitoreo del paciente para permitir al médico determinar si la recaída se debe a un empeoramiento del trastorno. Si el tratamiento farmacológico se determina que es inadecuado, entonces el tratamiento puede reiniciarse o incrementarse; se puede proporcionar, si es apropiado, un cambio en el tratamiento. Dado que los biomarcadores son sensibles al estado del trastorno, proporcionan una indicación del impacto del tratamiento con el fármaco.

La invención ahora se ilustrará con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Una muestra de sangre humana que contiene nucleosomas libres de células de sujetos sanos preparada de acuerdo con el método descrito por Hodenrieder (*Hodenrieder et al., 2001) se probó utilizando una prueba de ELISA para el nucleosoma asociado a la variante de histona mcroH2A1.1 utilizando el anticuerpo de captación anti-histona en fase sólida que une nucleosomas intactos y un anticuerpo de detección policlonal anti-variante de histona macroH2A1.1 purificado por afinidad y biotinado. La muestra humana se diluye de manera seriada en suero bovino fetal y se prueba por duplicado en la prueba de ELISAno diluida y en diluciones 1 :2, 1:4 y 1 :8. El suero bovino fetal puro también se corre en la ELISA como una muestra de control que no contiene nucleosomas libres de células. El método de análisis es el siguiente: una solución del anticuerpo anti-histona en amortiguador fosfato 0.1 M, pH 7.4 se agrega a los poros de microtitulación (100 µ?/????) y se incuba durante la noche a 4°C para recubrir los pozos con el anticuerpo de captación. El exceso de anticuerpo anti-histona se decanta. Se agrega una solución de albúmina sérica bobina (20g/l) a los pozos (150 µ?/????) y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente para bloquear el exceso de sitios de unión a proteína en los pozos. El exceso de la solución de albúmina sérica bovina se decanta y los pozos se lavan dos veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????, amortiguador 0.05 TRIS/HCI, pH 7.5 que contiene Tween 20 1 %). Se agregan a los pozos la muestra (10 µ?/????) y el amortiguador de análisis (50 µ?/????, 0.05M de TRIS/HCI, pH 7.5 que contiene NaCI 0.9%, 0.05% de desoxicolato de sodio y Nonidet P40 1 % sustituto) y se incuban durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. La muestra y la mezcla del amortiguador de análisis se decantan y los pozos se lavan tres veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????). Una solución del anticuerpo de detección anti-variante de histona purificado por afinidad y biotinado se agrega (50 µ?/????) y se incuba a 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. El exceso del anticuerpo de detección se decanta y los pozos nuevamente se lavan tres veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????). Una solución que contiene conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano se agrega (50 µ?/????) y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. El exceso de conjugado se decanta y los pozos se lavan nuevamente tres veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????). Se agrega una solución de sustrato colorido (100 µ?/???? de, sal de diamonio de 2,2'-azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico]) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. Se agrega una solución STOP (100 µ?/????) que contiene dodecilsulfato de sodio 1 % y la densidad óptica (DO) de los pozos se mide a una longitud de onda de 405 nm utilizando un lector de placa de microtitulación estándar. Una curva dosis-respuesta reproducible de color en aumento con incremento en la concentración de nucleosoma asociado con histona variante macroH2A1.1 se observa con una señal de fondo bajo observada en ausencia de nucleosoma asociado a histona variante macroH2A1.1 (suero bovino fetal). La señal de ELISA positiva indica que la histona variante macroH2A1.1 detectada por la prueba de ELISA se incorpora dentro de un nucleosoma como un anticuerpo de captación utilizado se une a histonas dentro de nucleosomas intactos y no se une a histona H2. Los resultados se muestran en la figura 1.

EJEMPLO 2 Una preparación de nucleosoma disponible comercialmente producida por digestión de cromatina extraída de células MCF7 en la cual el ADN y las proteínas en el club nucleosoma se reticulan para estabilidad (asegurando que todas las histonas presentes en la preparación se incorporan en nucleosomas intactos) se analiza utilizando un método de ELISA para el nucleosoma asociado a histona variante macroH2A2 utilizando un anticuerpo de captación anti-histona en fase sólida que une nucleosomas intactos y un anticuerpo de detección policlonal anti-histona variante macroH2A2 purificado por afinidad en biotinado. La muestra de nucleosoma se diluye de manera seriada en suero bovino fetal y se prueba por duplicado en la ELISA. El suero bovino fetal puro después se corre también en la prueba de ELISA como una muestra control que no contiene nucleosomas libres de células. El método de análisis es el siguiente: una solución de anticuerpo anti-histona en amortiguador fosfato 0.1 M, pH 7.4, se agrega a pozos de microtitulación (100 µ?/????) y se incuba durante la noche a 4°C para recubrir los pozos con anticuerpo de captación. El exceso de anticuerpo anti-histona se decanta. Se agrega a los pozos 20 g/l de una solución de albúmina sérica bovina (200 µ?/????) y se incuba a 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear el exceso de sitios de unión de proteína en los pozos. El exceso de solución de albúmina sérica bovina se decanta y los pozos se lavan tres veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????), amortiguador Tris 0.05 M/HCI, pH 7.5, que contiene Twenn 20 1 %). Se agregan a los pozos una muestra (10 µ?/????) y amortiguador de análisis (50 µ?/????, TRIS 0.05 M/HCI, pH 7.5 que contiene NaCI 0.9%, desoxicolato de sodio 0.05% y Nonidet P40 1 % sustituto) a los pozos y se incuba durante la noche a 4°C. La mezcla de la muestra y análisis se decanta y los pozos se lavan tres veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????). Una solución de anticuerpo de detección policlonal anti-histona variante macroH2A1.1 purificada por afinidad y biotinada se agrega (50 µ?/????) y se incuba 90 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. El exceso de anticuerpo de detección se decanta y los pozos se lavan nuevamente tres veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????). Una solución que contiene conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano se agrega (50 µ?/????) y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. El exceso de conjugado se decanta y los pozos nuevamente se lavan tres veces con amortiguador de lavado (200 µ?/????). Se agrega una solución de sustrato colorido (100 µ?/???? de sal diamonio 2,2'-azinobis[ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico]) y se incuba 20 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. La densidad óptica (DO) de los pozos se mide a una longitud de onda de 405 nm utilizando un lector de placa de microtitulación estándar. Una curva dosis-respuesta de color con aumento al aumentar la concentración de nucleosoma asociado a histona variante macroH2A2 se observa con una señal de fondo bajo, observada en ausencia de histona variante macroH2A2 (suero bovino fetal). La señal de ELISA positiva indica que la variante de histona macroH2A2 detectada por la prueba de ELISA se incorpora dentro de un nucleosoma dado que (i) no están presentes libres en la muestra y (ii) el anticuerpo de captación utilizado se une a histonas dentro de nucleosomas intactos y no se une a histona H2. Los resultados se muestran en la figura 2.

EJEMPLO 3 Una preparación de nucleosoma disponible comercia Imente producida por digestión de cromatina extraída de células CF7 en la cual el ADN y las proteínas se reticulan para estabilidad (asegurando que todas las histonas presentes están incorporadas en nucleosomas intactos) se prueban utilizando un método de ELISA para nucleosoma asociado a histona variante H2AZ utilizando el anticuerpo de captación anti-histona en fase sólida que se une a nucleosomas intactos y que no se une a histona H2 y un anticuerpo de detección policlonal anti-histona variante H2AZ purificado por afinidad y biotinado. Los detalles de procedimiento de análisis son similares a los descritos en el ejemplo 2 anterior. Una curva dosis-respuesta reproducible de color en aumento a incrementando la concentración de histona de variante H2AZ asociado a nucleosoma se observa con una señal de fondo bajo, observada en ausencia de nucleosoma asociado a histona variante H2AZ (suero bovino fecal). La señal de ELISA positiva indica que la variante de histona macroH2A2 detectada se incorpora dentro de un nucleosoma dado que (i) no están presentes histonas libres en la muestra y (ii) en anticuerpo de captación utilizado se une a histonas dentro de nucleosomas intactos y no se une a histona H2. Los resultados se muestran en la figura 3.

EJEMPLO 4 Utilizamos los métodos de ELISA para nucleosoma de la técnica actual para medir el contenido de nucleosoma libre de célula circulante de muestras sanguíneas de células tomadas de 20 sujetos sanos. El primer método de ELISA actual (ELISA 1) es Roche Cell Death ELISA y el otro (ELISA 2) es una prueba de ELISA que utiliza un anticuerpo de captación anti-histona y un anticuerpo de detección de complejo anti-histona-ADN. Los niveles de nucleosoma detectados por ambos métodos de ELISA para nucleosoma son ambos menores en plasma normal que en suero normal. El intervalo normal (la expresión en unidades de densidad óptica) para el nivel de suero de nucleosoma se calculó (media + 2 desviaciones estándar de la media de 20 resultados de suero de sujetos sanos) que es 0-4.3 unidades DO para ELISA 1 y 0 - 1.4 para ELISA 2. Los intervalos respectivos para plasma son de 0.095 y 0.096. Los resultados se muestran en la figura 4.

También medimos los niveles de nucleosomas que contienen una PTM de histona y dos nucleótidos así como las tres variantes de histona asociadas a nucleosoma mH2A1.1 , mH2A2 y H2AZ en las mismas muestras. Los resultados muestran que las muestras de suero tomadas de sujetos sanos presentan niveles uniformemente bajos de nucleosomas que contienen variantes de histona de PTM o nucleótidos. Los intervalos normales (expresados como densidad óptica) para el nivel de suero de nucleosomas que contienen variantes de histona, PTM o nucleótidos: (a) 0-0.36 para mH2A1.1 , (b) 0.05 - 0.78 para mH2A2, (c) 0.11 - 0.58 para H2AZ, (d) 0.06 - 0.61 para P-H2AX (Ser139), (e) 0.06 - 0.36 para 5-metilcitosina y (f) 0.03 - 0.36 para 5-hidroximetilcitosína. Los resultados en plasma tratado con EDTA medido fueron mayores para la totalidad de los 20 sujetos sanos. Los resultados se muestran en la figura 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

EJEMPLO 5 Medimos los nucleosomas libres de células en plasma tratado con EDTA tomado de 13 sujetos sanos y 55 sujetos con cáncer de estómago, intestino grueso, recto, pulmón (carcinoma microcítico y diversos carcinomas amicrocíticos), mama, ovario, próstata, riñon y diversos cánceres bucales (cavidad bucal, paladar, faringe y laringe). La totalidad de las muestras de sujetos sanos en pacientes con cáncer fueron positivas para nucleosomas libres de células. No obstante, los niveles detectados en muestras tomadas de sujetos con cáncer fueron mayores que los encontrados en muestras de sujetos sanos y los resultados muestran que los sujetos sanos y con cáncer se pueden diferenciar. Por ejemplo, el intervalo normal calculado en términos DO, como la media + 2 desviaciones estándar en la media, para el análisis de nucleosoma de H2AZ es de 0 - 0.95. Utilizando el nivel limite de 0.95; la totalidad de los 13 sujetos sanos fueron negativos para los niveles de nucleosoma H2AZ elevados. En contraste, se obtuvo un resultado positivo para niveles de nucleosomas H2AZ elevados para 46 de 55 muestras de cáncer (una sensibilidad clínica general de 84%) que incluye 100% (8 de 8) de estomago, 100% (5 de 5) de intestino grueso, 67% (2 de 3) de rectal, 83% (5 de 6) de pulmón microcítico, 79% de pulmón amicrocítico, 50% (3 de 6) de mama, 100% (1 de 1) de ovario, 100% (1 de 1) de páncreas, 80% (4 de 5) de próstata, 100% (1 de 1 ) de riñon y 100% (5 de 5) de muestras de cáncer bucal. Los resultados se muestran en la figura 19.

De manera similar para el análisis de nucleosoma asociado a I71H2A1.1 , el intervalo normal es de 0-0.91. Utilizando este valor límite la totalidad de las 13 muestras sanes son negativas y 64% (35 de 55) de las muestras con cáncer fueron positivas. Para el análisis de nucleosoma asociado a P-H2AX (Ser139), el intervalo normal fue de 0-1.08. Utilizando este valor límite, la totalidad de las 13 muestras sanas fueron negativas y 60% (33 de 55) de las muestras con cáncer fueron positivas. También se midió el nucleosoma asociado a 5-metilcitosina y el análisis en el intervalo normal fue de 0 - 1.41. Utilizando este valor límite la totalidad de las 13 muestras sanas fueron negativas y 55% (30 de 55) de las muestras de cáncer fueron positivas.

También utilizamos los métodos de la invención para medir una diversidad de otras estructuras asociadas con nucleosoma en las mismas muestras. Los resultados de estos inmunoanálisis se compilaron para proporcionar un perfil de estructuras de nucleosoma en muestras tomadas de pacientes con cáncer normalizadas en relación a los niveles detectados de nucleosomas que contienen 5-metilcitosina. Comparamos los perfiles resultantes de la estructura de nucleosoma de las muestras tomadas de sujetos sanos. El perfil de estructura de nucleosoma de nucleosomas libres de células se encuentra que es diferente al de los sujetos sanos. Los resultados se muestran en la figura 23. De igual manera compilamos los perfiles de estructura de nucleosoma para muestras tomadas de una diversidad de enfermedades diferentes a cáncer y se compararon estas con los perfiles de nucleosomas en muestras tomadas de pacientes con cáncer y de sujetos sanos. Los resultados se muestran en la figura 24.

Después realizamos otro experimento similar que incluye muestras de 10 sujetos sanos y 62 pacientes adicionales con cáncer de diversos tipos. Los resultados fueron similares a los del primer experimento. Por ejemplo, utilizando los resultados para nucleosoma asociados a la variante de histona H2AZ y un límite de media + 2 desviaciones estándar de la media de los resultados para sujetos sanos, se obtuvieron resultados negativos para la totalidad de los 10 sujetos sanos y resultados positivos se obtuvieron para 95% (59 de 62) de pacientes con cáncer que incluyen 9 de 9 pacientes con cáncer de próstata, 5 de 5 pacientes con cáncer de piel, 6 de 8 pacientes con cáncer de esófago, 12 de 13 pacientes con cáncer de vejiga, 2 de 2 pacientes con cáncer en el cuello uterino y 1 de 1 paciente con cáncer de colon, 4 de 4 pacientes con cáncer de mama, 7 de 7 pacientes con cáncer de ovario, 7 de 7 pacientes con cáncer de laringe, 3 de 3 pacientes con cáncer de pulmón y 3 de 3 pacientes con cáncer renal. Los resultados se muestran en la figura 18. Este resultado indica que el nucleosoma asociado a las variantes de histona son biomarcadores clínicamente sensibles para cáncer.

Los resultados se muestran en la figura 20.

EJEMPLO 6 Utilizamos dos métodos de ELISA para nucleosoma de la técnica actual para medir el contenido de nucleosoma libre de células circulantes de muestras tratadas con EDTA tomadas de 3 sujetos con cáncer de colon, 13 sujetos con cáncer de pulmón, 2 sujetos con cáncer pancreático, 1 sujeto con cáncer bucal y una muestra de nucleosoma producida a partir del sujeto sano de acuerdo con el método de Holdenrieder (*Holdenrieder et al, 2001). El primer método de ELISA actual (ELISA 1 ) es la prueba de ELISA Roche Cell Death y la otra (ELISA 2) es una prueba de ELISA que utiliza un anticuerpo de captación anti-histona y un anticuerpo de detección de complejo anti-histona-ADN.

También medimos los niveles de nucleosomas que contienen tres histonas variantes, un PTM de histona y dos nucleotidos. Los resultados muestran que aunque se detectaron para la mayor parte de los sujetos resultados de nucleosomas bajos para los métodos de ELISA de la técnica actual, particularmente para pacientes con cáncer pancreático y bucal, la mayor parte de estas muestras tienen niveles detectables superiores de nucleosomas que los que contienen uno o más nucleosomas asociados a variantes de histonas. Los resultados para muestras tomadas de tres sujetos con cáncer de colon, 13 sujetos con cáncer de pulmón, 2 sujetos con cáncer pancreático y un sujeto con cáncer bucal se muestran en la figura 1 1 , la figura 12, la figura 13 y la figura 14, respectivamente. Se detectaron niveles significativos de nucleosoma asociados a variante de histona en 16 de los 19 muestras de cáncer (todas excepto tres muestras de cáncer de pulmón). Además, el nucleosoma asociado con 5-hidroximetilcitosina se detectó en 12 de las 19 muestras de cáncer y el nucleosoma asociado a 5-metilcitosina se detectó en la totalidad de las 19 muestras de cáncer.

Además, el patrón de los niveles de nucleosoma que contienen niveles diferentes de variantes de histona no son uniformes para todos los sujetos, sino que muestra patrones diferentes para los diferentes cánceres probados. Para facilitar la comparación entre resultados para sujetos con cánceres iguales o diferentes los resultados para las pruebas de nucleosoma (para nucleosomas que contienen macroH2A1.1 , macroH2A2, H2AZ, P-H2AX(Ser139), 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina) se normalizaron como una proporción de la señal DO observada para nucleosomas que contienen 5-metilcitosina. Los resultados normalizados (con barras de error que muestran la desviación estándar en resultados en donde las muestras de más de un sujeto se aprobaron) se muestran para cada cáncer en la figura 15 así como los mismos resultados para la muestra de nucleosoma producida de sujetos sanos (mH2A2 y 5-hidroximetilcitosina no se midieron para esta muestra). La figura 15 muestra que el patrón de distribución de nucleosomas que contienen los diferentes variantes de histonas normalizadas, nucleótidos o PTM en la totalidad de los cuatro cánceres investigados difiere de manera muy notoria en la distribución de nucleosomas en la muestra preparada a partir de sujetos sanos. De esta manera, la presente invención se puede utilizar como un método para la detección de cáncer en una prueba de cribado basada en sangre simple. Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que la invención incluye la prueba de nucleosomas que contienen otras variantes de histona, nucleótidos y/o modificaciones de histona para diferenciar adicionalmente o de mejor manera entre nucleosomas libres de células circulantes o de origen tumoral o de otra enfermedad.

Además, el patrón de tipos de nucleosoma observados difiere para diferentes tipos de cáncer. Por ejemplo, la muestra tomada de un sujeto con cáncer bucal presenta niveles normalizados menores de ambos nucleosomas que contienen mH2A2 o P-H2AX(Ser139) en comparación con cualquiera de los otros tres tipos de cáncer. De manera similar, las muestras de sujetos con cáncer pancreático pueden ser distinguidas de muestras de sujetos con cáncer de colon en base en un nivel normalizado diferente de nucleosomas que contienen la variante macroH2A1.1. De esta manera, la presente invención se puede utilizar como un método de diagnóstico de cáncer de modo general y para distinguir un tipo de cáncer particular. Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que la invención incluye las pruebas de nucleosomas que contienen otras variantes de histona adicionales y/o modificaciones de histona y/o nucleótidos para diferenciar adicionalmente o de mejor manera entre nucleosomas libres de células circulantes de origen de tumor específico diferente u otro origen de enfermedad.

EJEMPLO 7 Medimos los niveles de nucleosoma asociado a variante de histona en muestras de suero tomadas de 4 sujetos sanos y 20 muestras de suero tomadas de sujetos con cáncer pancreático utilizando el método de la invención como se describe en lo anterior. Utilizando un nivel de límite de 0.27 (media + 2 desviaciones estándar de los niveles encontrados en pacientes sanos), los niveles de nucleosoma asociado a H2AZ están elevados en 80% (16 de 20) de las muestras tomadas de pacientes con cáncer pancreático y ninguno de los sujetos sanos. Los resultados se muestran en la figura 21.

EJEMPLO 8 Medimos los niveles de nucleosoma asociados a la histona H2AZ de algunas muestras humanas tomadas de pacientes con cáncer utilizando un anticuerpo de detección anti-H2AZ biotinado como se describe en el ejemplo 3. El método se realizó dos veces utilizando dos anticuerpos de captación monoclonales clónales anti-histona diferentes para determinar si los resultados de H2AZ son repetibles para diferentes anticuerpos de captación. Los resultados en la figura 16 muestran que los niveles de nucleosoma asociados a la histona H2AZ de los dos análisis se relacionan linealmente con una línea del mejor ajuste que intercepta aproximadamente en cero. Las unidades son lecturas de densidad óptica simple.

EJEMPLO 9 Medimos los niveles de nucleosoma asociados a la histona H2AZ de muestras de plasma humanas tratadas con EDTA tomadas de pacientes con cáncer de pulmón como se describe en el ejemplo 3. Los niveles detectados se correlacionaron con el progreso de la enfermedad de los pacientes. Los resultados mostrados en la figura 22 indican que los niveles del nucleosoma asociados con histona H2AZ aumentan con la gravedad de la enfermedad en términos de tamaño, etapa, diseminación nodal y diseminación metastásica distante y los niveles de nucleosoma asociados a histona H2AZ se pueden utilizar, solos o como parte de un panel de diagnóstico, como indicadores de enfermedad nodal, tamaño, etapa o progreso metastásico.

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Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 - Un nucleosoma libre de células que comprende una variante de histona o isoforma de histona para usarse como un biomarcador para el diagnóstico de cáncer, cardiomiopatía, lupus eritematoso sistémico, colitis, trastorno pulmonar obstructivo crónico, enfermedad de Crohn y artritis reumatoide.

2 - El nucleosoma para usarse según la reivindicación 1 , en donde el nucleosoma es un mononucleosoma o un oligonucleosoma.

3. - El nucleosoma para usarse según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el nucleosoma libre de células que comprende una variante de histona o isoforma de histona se mide en una muestra de sangre.

4. - El nucleosoma para usarse según las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cáncer es un cáncer de vejiga, mama, colon, cuello uterino, esófago, riñon, intestino grueso, pulmón, cavidad bucal, ovario, páncreas, próstata, recto, piel o estómago.

5. - El nucleosoma para usarse según la reivindicación 4, en donde el cáncer es un cáncer de colon, pulmón, cavidad bucal o páncreas.

6. - Un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o una isoforma de histona en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un agente de unión el cual se une a la variante de histona o isoforma de histona; (ii) detectar o cuantificar la unión del agente de unión a la variante de histona o isoforma de histona en la muestra; y (iii) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de la variante de histona o isoforma de histona o nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en la muestra.

7. - Un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o una isoforma de histona en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un primer agente de unión el cual se une a los nucleosomas; (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión el cual se une a una variante de histona o una isoforma de histona; (iii) detectar o cuantificar la unión del segundo agente de unión a una variante de histona o isoforma de histona en la muestra; y (iv) utilizar la presencia o grado de tal unión como una medida de la presencia de los nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en la muestra.

8. - Un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o isoforma de histona en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto la muestra con un primer agente de unión el cual se une a la variante de histona o isoforma de histona; (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión el cual se une a los nucleosomas; (iii) detectar o cuantificar la unión del segundo agente de unión a los nucleosomas en la muestra; y (¡v) utilizar la presencia o grado de unión como una medida de la presencia de nucleosomas que contienen la variante de histona o la isoforma de histona en la muestra.

9 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado además porque la isoforma de histona es una isoforma de histona común que se presenta en la totalidad o la mayor parte de los nucleosomas para prueba para nucleosomas por si mismos.

10. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado además porque el agente de unión utilizado para unir una histona está dirigido para unir una región de la histona que es común a la totalidad o la mayor parte de las variantes de histona o isoformas de la porción de histona y se presenta en la totalidad o la mayor parte de los nucleosomas para probar los nucleosomas por si mismos.

11. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado además porque el agente de unión es un anticuerpo.

12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 , caracterizado además porque la muestra es un fluido biológico.

13.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado además porque la muestra es sangre, suero o plasma.

14.- Un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o una isoforma de histona de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 en una célula, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) aislar cromatina de una célula; (ii) digerir, someter a sonicado o descomponer de alguna otra manera la cromatina para formar mono-nucleosomas y/u oligo-nucleosomas; y (iii) detectar o medir la presencia de la variante de histona o isoforma de histona en los nucleosomas de conformidad con un método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.

15 - Un método para detectar la presencia de un nucleosoma que contiene una variante de histona o isoforma de histona en una muestra de sangre, suero o plasma, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) remover, liberar o extraer la variante o isoforma de histona del complejo de nucleosoma para producir una porción de variante o isoforma de histona libre; (ii) detectar o cuantificar la variante o isoforma de histona libre en la muestra; y (iii) utilizar la presencia o cantidad de la variante o isoforma de histona libre como una medida de la presencia de nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en la muestra.

16.- Un método para detectar o diagnosticar un estado de enfermedad en un animal o un sujeto humano, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contengan variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal de un sujeto; y (ii) utilizar el nivel detectado de nucleosoma asociado de la variante de histona o isoforma de histona para identificar el estado de enfermedad del sujeto.

17-. Un método para determinar en un mamífero o un sujeto humano lo adecuado de un tratamiento médico, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contienen una variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto; y (i¡) utilizar el nivel asociado a nucleosoma de la variante de histona o isoforma de histona como un parámetro para selección de un tratamiento adecuado para el sujeto.

18 - Un método para monitorear un tratamiento de un animal o un sujeto humano, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contienen variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto; (ii) repetir la detección o medición de nucleosomas que contienen una variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto en una o más ocasiones; y (iii) utilizar cualquier cambio en el nivel de nucleosoma asociado variante de histona o isoforma de histona detectado, como un parámetro para cualquiera de los cambios en la condición del sujeto.

19. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado además porque el nucleosoma asociado a la variante de histona o isoforma de histona se detecta o se mide como uno de un panel de mediciones.

20. - Un método para identificar un biomarcador de variante de histona o isoforma de histona para detectar o diagnosticar un estado de enfermedad en un animal o en sujeto humano, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) detectar o medir nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal del sujeto; (ii) detectar o medir nucleosomas que contienen la variante de histona o isoforma de histona en un fluido corporal de un sujeto sano o un sujeto control; y (iii) utilizar la diferencia entre los niveles detectados en sujetos enfermos y control para identificar si una variante de histona o isoforma de histona es útil como un biomarcador para el estado de enfermedad.

21.- Un biomarcador identificado por el método de conformidad con la reivindicación 20.

22.- Un kit para la detección de un nucleosoma asociado a variante de histona o isoforma de histona, caracterizado porque comprende un ligando o aglutinante especifico para la variante de histona o isoforma de histona o con parte o componente del mismo o un imitador estructural/conformacional de la variante de histona o isoforma de histona o parte o componente de la misma, junto con instrucciones para uso del kit, de acuerdo con cualquiera de los métodos definidos en las reivindicaciones 6 a 20.