TW202238132A - 多發性硬化症之診斷方法 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種透過檢測體液樣本中的無細胞核小體作為生物標記物來診斷具有多發性硬化症患者的方法。
Description
本發明關於在多發性硬化症患者的體液樣本中作為生物標記物的無細胞核小體。
多發性硬化症(MS)是一種大腦和脊髓的慢性神經退化性疾病，涉及環繞和保護神經的髓鞘(myelin sheath)的損失。症狀是非特異性的，但通常包含疲勞和視覺、活動性、感覺和平衡問題。在美國，超過300,000人被診斷出患有MSA。該疾病在女性中比男性更常見，且通常在20-30歲被診斷出來，儘管老年人也可能被診斷出來。
MS的根本原因仍然未知，但被認為包含遺傳和環境因素。該疾病的症狀是由髓鞘自體免疫損傷的斑塊(patch)所造成，其可能會變成發炎和中斷或阻止正常的神經訊號傳遞。隨著時間的推移發炎的斑塊可能會導致髓鞘形成疤痕或硬化，且反覆發作會導致對潛在神經的永久性損傷。
一旦確診，MS是一種可能造成殘疾但通常不是末期的終身疾病。患者分為3種主要群組。大多數MS患者具有復發-緩解型(relapsing-remitting)病程，其在幾天或幾週演變出新的症狀或復發的時期(有時稱為發作或急性病發(flare-up))，接著是疾病緩解的平靜時期，可持續數月或甚至數年。目前沒有可用的治癒方法，儘管有可用的治療可以控制症狀並提高復發的恢復。隨著病程的持續，患有復發-緩解型MS的患者可能會經歷殘疾更持續的增加，伴隨較少的或沒有復發，被稱為續發性進展型(secondary progressive)MS。一些10-15%的MS患者被診斷出為原發性進展型(primary progressive)MS，其中殘疾從一開始就增加且很少復發。殘疾的進展速度在不同患者間可能差異很大。
由於症狀的範圍，MS可能難以成功地診斷。目前的測試著重於調查神經損傷的證據，例如神經檢查(neurological examination)或核磁共振造影(MRI)掃描。也可以使用腰椎穿刺(lumbar puncture)來取得腦脊髓液(CSF)的樣本，並測試與自體免疫反應相關的免疫細胞或抗體的寡株帶(oligoclonal band)的存在。
MS簡單的血液檢查比腰椎穿刺的侵入性更小，且比MRI掃描和腰椎穿刺具有成本優勢。出於監測目的和疾病管控的重複腰椎穿刺顯然是不良的，且重複的MRI掃描是昂貴的。本領域仍需要提供簡單、非侵入式、具成本效益的方法來辨認患有多發性硬化症的患者，特別是對疾病的持續管控和檢測更具復發風險的患者。
根據第一態樣，提供一種診斷一主體多發性硬化症之方法，包含將從該主體中獲得的一體液樣本與一結合劑(binding agent)接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分(component)的含量。
根據另一態樣，提供一種檢測需要治療多發性硬化症之一主體的方法，包含：
(i) 將從該主體獲得的一體液樣本與一結合劑接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分的含量；以及
(ii) 使用該無細胞核小體的含量作為該主體需要進行多發性硬化症治療的一指標。
根據另一態樣，提供一種將包含組織蛋白H3.1的無細胞核小體作為用於診斷多發性硬化症的體液樣本中的生物標記物(biomarker)的用途。
根據另一態樣，提供一種治療患有多發性硬化症的一主體之方法，包含：
(i) 將從該主體中獲得的一體液樣本與一結合劑接觸，以測量無細胞核小體或其組分的含量；
(ii) 使用在步驟(i)中測量的該無細胞核小體或其組分的含量作為該主體中多發性硬化症存在和/或嚴重性的指標；以及
(iii) 對步驟(ii)中確定需要治療的該主體進行治療。
本發明利用升高含量的無細胞核小體來辨認患有多發性硬化症的主體。
因此，根據第一態樣，提供一種診斷一主體多發性硬化症之方法，包含將從該主體中獲得的一體液樣本與一結合劑接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分的含量。
核小體是染色質結構的基本單元，且是由八個高度保留的核心組織蛋白(包含各一對的組織蛋白H2A、H2B、H3和H4)的蛋白質複合物所組成。在這個複合物周圍包覆著大約146個鹼基對的DNA。另一種組織蛋白H1或H5作為連接子(linker)並且參與染色質的壓實。DNA被連續的核小體纏繞在一個所謂的「串珠」結構中，並且形成了開放或常染色質(euchromatin)的基本結構。在壓實或異染色質(heterochromatin)中，該串被螺旋且超螺旋成封閉且複雜的結構(Herranz and Esteller, Methods Mol. Biol.(2007) 361: 25-62)。
當在液體樣本中檢測到「核小體」時，可以指「無細胞核小體」。應當理解的是，貫穿本文的術語無細胞核小體是指含有任何無細胞染色質的片段，其包含一或多個核小體。
應當理解的是，無細胞核小體可以透過結合至其的組分來檢測。如本文所用，術語「其組分」是指核小體的一部分，即不需要檢測整個核小體。無細胞核小體的組分可選自由組織蛋白(即組織蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4)、組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白變體或同功異型體(isoform)、與核小體結合的蛋白質(即核小體-蛋白質加合物)、與核小體相關的DNA片段及/或與核小體相關的修飾核苷酸所組成的群組。例如，其組分可為組織蛋白(同功異型體)H3.1或DNA。
本發明的方法和用途可以測量(無細胞)核小體本身的含量。「核小體本身」是指樣本中存在的總核小體的含量或濃度，與核小體可能包含或不包含的任何表觀遺傳特徵無關。總核小體的含量的檢測通常涉及檢測所有核小體共有的組織蛋白，例如組織蛋白H4。因此，可以透過檢測核心組織蛋白(例如組織蛋白H4)來測量核小體本身。如本文所述，組織蛋白形成被稱為核小體的結構單元，其用於在真核細胞中包裹DNA。
成年人的正常細胞更新涉及每天通過細胞分裂產生約10
11個細胞，以及相似數量的死亡，主要透過細胞凋亡。在細胞凋亡的過程中，染色質分解成單核小體和寡核小體(oligonucleosome)，其從細胞釋放出來。在正常情況下，在健康的主體中發現的循環核小體的含量較低。在患有多種疾病的主體中發現升高的含量，包含多種癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病、中風和心肌梗塞(Holdenreider & Stieber, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. (2009) 46(1): 1–24)。
以前的核小體ELISA方法主要用於細胞培養，通常作為檢測細胞凋亡的方法(Salgame et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25(3): 680-681; Holdenrieder et al. Clin. Chem. Lab. Med. (2001) 39(7): 596-605; van Nieuwenhuijze et al., Ann. Rheum. Dis. (2003) 62: 10–14)，但也用於測量血清和血漿中循環的無細胞核小體(Holdenrieder et al. (2001))。在許多不同癌症的研究中，已經透過ELISA方法測量了死亡細胞釋放到循環中的無細胞血清和血漿核小體含量，以評估他們作為潛在生物標記物的用途。
無細胞核小體可為單核小體、寡核小體、較大染色質片段的組成部分或NET的組成部分或其混合物。
可透過酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)檢測單核小體和寡核小體，並且已報導了幾種方法(例如，Salgame
et al.Nucleic Acids Research, 25(3), 680-681 (1997)；Holdenrieder
et al.Int. J. Cancer 95, 114–120 (2001)；van Nieuwenhuijze
et al.Ann Rheum Dis; 62: 10–14 (2003))。這些測定法通常使用作為捕獲抗體的抗-組織蛋白抗體(例如，抗-H2B、抗-H3或抗-H1、H2A、H2B、H3及H4)以及作為檢測抗體的抗-DNA或抗-H2A-H2B-DNA複合物抗體。
循環核小體不是蛋白質-核苷酸複合物的均質群。相反地，它們是染色質片段的異質群，該染色質片段起源於細胞死亡時對染色質的消化且含有大量表觀遺傳結構，該些表觀遺傳結構包含特定組織蛋白同功異型體(或變體)、轉譯後組織蛋白修飾、核苷酸或修飾的核苷酸和蛋白質加合物。本領域技術人員將清楚的是，核小體含量的升高將與某些循環核小體子群的升高相關，這些子群含有特定表觀遺傳訊號，其含有包含特定組織蛋白同功異型體(或變體)、包含特定轉譯後組織蛋白修飾、包含特定的核苷酸或修飾的核苷酸以及包含特定蛋白質加合物的核小體。這些類型的染色質片段的測定法為本領域眾所皆知的(例如，參見WO2005/019826、WO2013/030579、WO2013/030578、WO2013/084002，其透過引用併入本文)。
在一實施例中，無細胞核小體的組分包含無細胞核小體的表觀遺傳特徵。
本發明方法中使用的生物標記物可以是無細胞核小體本身和/或無細胞核小體的表觀遺傳特徵的含量。應當理解的是，術語「表觀遺傳訊號結構」和「表觀遺傳特徵」在本文可以互換使用。他們是指可以檢測到核小體的特定特徵。在一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵選自由：轉譯後組織蛋白修飾、組織蛋白同功異型體、修飾的核苷酸和/或與核小體-蛋白質加合物中的核小體結合的蛋白質組成的群組。
在一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包含一或多種組織蛋白變體或同功異型體。無細胞核小體的表觀遺傳特徵可為組織蛋白同功異型體，例如核心核小體的組織蛋白同功異型體，特別是組織蛋白H3同功異型體。術語「組織蛋白變體」和「組織蛋白同功異型體」在本文中可以互換使用。核小體的結構也可以藉由包含替代的組織蛋白同功異型體或變體而變化，所述組織蛋白同功異型體或變體是不同的基因或剪接產物並且具有不同的胺基酸序列。目前本領域已知許多組織蛋白同功異型體。組織蛋白變體可分為許多家族，其再被細分為個別的類型。數量龐大的組織蛋白變體的核苷酸序列為習知的且可公開獲得，例如在國家人類基因研究所NHGRI組織蛋白資料庫(
Mariño-Ramírez et al.The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins.
Database Vol.2011. 和http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank (NIH基因序列)資料庫、EMBL核苷酸序列資料庫、和日本DNA資料庫(DDBJ)。例如，組織蛋白H2的變體包括H2A1、H2A2、mH2A1、mH2A2、H2AX和H2AZ。在另一個例子中，H3的組織蛋白同功異型體包含H3.1、H3.2和H3t。
在一實施例中，組織蛋白同功異型體為H3.1。如本文實施例所示，H3.1的含量在多發性硬化症患者中出乎意料地升高。因此，根據本發明的另一態樣，提供一種將包含組織蛋白H3.1的無細胞核小體作為用於診斷多發性硬化症的體液樣本中的生物標記物的用途。
核小體的結構可以藉由組織蛋白的轉譯後修飾(PTM)來改變。組織蛋白的PTM通常發生在核心組織蛋白的尾部，而常見的修飾包含離胺酸殘基的乙醯化、甲基化或泛素化以及精胺酸殘基的甲基化及絲胺酸殘基的磷酸化等。本領域已知許多組織蛋白修飾，並且隨著識別出新的修飾而增加(Zhao和Garcia, 2015 Cold Spring Harb Perspect Biol, 7: a025064)。因此，在一實施例中，無細胞核小體的表觀遺傳特徵可為組織蛋白轉譯後修飾(PTM)。組織蛋白PTM可為核心核小體的組織蛋白PTM，例如H3、H2A、H2B或H4，特別是H3、H2A或H2B。特別地，組織蛋白PTM是組織蛋白H3 PTM。在WO 2005/019826中記載了這種PTM的示例。
例如，轉譯後修飾可包括乙醯化、甲基化(可為單甲基、二甲基或三甲基化)、磷酸化、核糖苷化(ribosylation)、瓜胺酸化(citrullination)、泛素化、羥基化、糖基化、亞硝化、麩醯胺化和/或異構化(參見Ausio(2001)Biochem Cell Bio 79: 693)。在一實施例中，組織蛋白PTM係選自瓜胺酸化或甲基化。在另一實施例中，組織蛋白PTM是H3瓜胺酸(H3cit)或H4瓜胺酸(H4cit)。在另一實施例中，組織蛋白PTM是H3R2,R8,R17Cit。在另一實施例中，組織蛋白PTM是H3甲基化，例如H3K27Me3。
也可以檢測到一組或一類相關的組織蛋白轉譯後修飾(而不是單一修飾)。一個典型的例子，但不限於，涉及使用2位點免疫測定，該2位點免疫測定是採用直接結合至核小體的一抗體或其他選擇性結合劑、和直接結合至待測組織蛋白修飾群組的一抗體或其他選擇性結合劑。旨在結合一組組織蛋白修飾的此類抗體的例子包含，出於說明性目的，但不限於，抗-泛-乙醯化抗體、抗-泛-瓜胺酸化抗體(例如，泛-瓜胺酸化H3抗體，例如H3R2,R8,R17Cit抗體])或抗-泛素抗體。
在一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包含一或多種DNA修飾。除了由核小體組織蛋白同功異型體和PTM組成物介導的表觀遺傳訊號外，核小體的核苷酸和修飾的核苷酸的組成也不同。一些核小體可比其他核小體包含更多的5-甲基胞嘧啶殘基(或5-羥甲基胞嘧啶殘基或其他核苷酸或修飾的核苷酸)。在一實施例中，DNA修飾選自5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。
在一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包含一或多種蛋白質-核小體加合物或複合物。另一類的循環核小體子集是核小體蛋白質加合物。多年來已知的是，染色質包含大量的與其組成DNA及/或組織蛋白結合的非組織蛋白蛋白質。這些染色質相關蛋白種類繁多，且具有多種功能，包括轉錄因子、轉錄增強因子、轉錄抑制因子、組織蛋白修飾酵素、DNA損傷修復蛋白以及其他。這些染色質片段包含核小體和其他非組織蛋白染色質蛋白或DNA，並且在本領域中對於其他非組織蛋白染色質蛋白已有所描述。
在一實施例中，加合到核小體的蛋白質(因此可作為生物標記物)選自：轉錄因子、高遷移率族蛋白質或染色質修飾酵素。「轉錄因子」是指與DNA結合且透過促進(即活化劑)或抑制(即抑制劑)轉錄以調節基因表現的蛋白質。轉錄因子含有一或多個DNA結合域(DNA-binding domain, DBD)，其附著於與其調控的基因相鄰的特定DNA序列。本文所述的所有循環核小體和核小體部分、類型或亞組均可用於本發明。
應當理解的是，在本發明的方法和用途中可以檢測到多於一種的無細胞核小體的表觀遺傳特徵。多種生物標記物可用於作為組合生物標記物。因此，在一實施例中，用途包含多於一種的無細胞核小體的表觀遺傳特徵作為組合生物標記物。表觀遺傳特徵可為相同類型(例如PTMs、組織蛋白同功異型體、核苷酸或蛋白質加合物)或不同類型(例如PTM與組織蛋白同功異型體組合)。例如，可以檢測到轉譯後組織蛋白修飾和組織蛋白變體(即檢測到多於一種類型的表觀遺傳特徵)。或者，或另外，檢測到多於一種類型的轉譯後組織蛋白修飾，或檢測到多於一種型的組織蛋白同功異型體。在一態樣中，用途包含轉譯後組織蛋白修飾和組織蛋白同功異型體作為在樣本中的組合生物標記物，用於診斷或檢測多發性硬化症。在一實施例中，組合生物標記物為H3.1、瓜胺酸化H3(例如H3R2,R8,R17Cit)和/或甲基化H3(例如H3K27Me)。
術語「生物標記物」是指過程、事件、或狀況的特殊生物學或生物學所衍生的指標。生物標記物可用於診斷方法，例如臨床篩檢、預後評估及監測治療結果、辨別最有可能對特定治療方法產生反應的患者、藥物篩選及開發。生物標記物和其用途對辨別新的藥物治療和發現藥物治療的新標靶是重要的。
本文所述的方法和用途可以在體液樣本中進行測試，特別是CSF、血液、血清或血漿樣本。較佳地，使用血漿樣本。血漿樣本可以收集在含有一或多種抗凝劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素(heparin)或檸檬酸鈉，特別是EDTA)的收集管中。
診斷和監測方法
根據另一態樣，提供一種監測一主體中多發性硬化症的方法，包含：
(i) 將從該主體中獲得的一體液樣本與一結合劑接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分的含量；
(ii) 在一或多個時點重複檢測或測量從該主體中獲得的一體液中的無細胞核小體或其組分的含量；
(iii) 使用無細胞核小體或其組分的含量的任何變化來監測該主體中多發性硬化症。
這種方法可以用於監測主體中疾病的進展或發展，以確定是否需要醫療介入。例如，如果確定主體具有輕度階段的疾病或處於緩解期(remission)，則本發明可以用於監測疾病進展，以用於未來復發的發展。例如，如果該方法包含來自確定患有輕度階段疾病的主體中的樣本，則可以在另一時間點重複生物標記物含量的測量，以確定生物標記物含量是否改變。
檢測和/或定量可以直接在體液核小體樣本上進行，或在純化的或濃縮的(enriched)核小體樣本上進行，或間接在其萃取物上進行，或在其稀釋液上進行。定量樣本中存在的生物標記物的含量可包含檢測樣本中存在的生物標記物的濃度。根據本文所述之本發明的檢測、監測和診斷的用途以及方法可用於確認疾病的存在、透過評估發病和進展來監測疾病的發展、或評估疾病的改善或消退。檢測、監測和診斷的用途以及方法也可以用於評估臨床篩檢、預後、治療選擇、治療益處評估的方法，即用於藥物篩選和藥物開發。
檢測或測量可以包含免疫測定、免疫化學、質譜、色譜、染色質免疫沉澱或生物感測器方法。特別是，檢測和/或測量可包含用於核小體部分的2位點免疫測定法。這種方法較佳用於核小體或含有表觀遺傳特徵的核小體的原位測量，其是使用兩種抗-核小體結合劑或一種抗-核小體結合劑和抗-組織蛋白修飾或抗-組織蛋白變體或抗-DNA修飾或抗-加合蛋白檢測結合劑。或者，免疫測定法可採用兩種抗-核小體結合劑他們皆直接與核小體的表觀遺傳特徵結合。此外，檢測和/或測量可包含2位點免疫測定，例如採用標記的或固定的組合：抗-核小體、抗-組織蛋白修飾、抗-組織蛋白變體/同功異型體、抗-DNA修飾或抗-加成蛋白結合劑。
在一實施例中，檢測或測量方法包含將體液樣本與一固相接觸，該固相包含用於檢測無細胞核小體或其組分的一結合劑，以及檢測所述結合劑的結合。
在一實施例中，檢測或測量方法包含：(i) 將樣本與結合至一無細胞核小體的一表觀遺傳特徵的一第一結合劑接觸；(ii) 將步驟(i)中由第一結合劑結合的樣本與結合至無細胞核小體的一第二結合劑接觸；以及(iii) 檢測或定量在樣本中第二結合劑的結合。
在另一實施例中，檢測或測量方法包含：(i) 將樣本與結合至無細胞核小體的一第一結合劑接觸；(ii) 將步驟(i)中由第一結合劑結合的樣本與結合至一無細胞核小體的一表觀遺傳特徵的一第二結合劑接觸；以及(iii) 檢測或定量在樣本中第二結合劑的結合。
可以使用一或多種試劑(例如合適的結合劑)來檢測或測量生物標記物的含量。例如，一或多種結合劑可包含對目標生物標記物具有特異性的配體或結合劑，該目標生物標記物諸如核小體或其組成部分、核小體的表觀遺傳特徵、核小體的結構/形狀模擬物或其組成部分，可選地與一或多種介白素組合。
對於本領域技術人員將清楚的是，本文所使用的術語「抗體」、「結合劑」或「配體」不限於但旨在包含能夠與特定分子或實體結合的任何結合劑，並且可以在本發明的方法中使用任何適合的結合劑。還將清楚的是，術語「核小體」旨在包含單核小體、寡核小體和任何可在流體介質中分析的蛋白質-DNA染色質片段。
檢測生物標記的方法是本領域眾所皆知的。試劑可包括一或多種配體或結合劑，例如，天然存在或化學合成的化合物，其能夠與所需的標靶特異性結合。配體或結合劑可包含能夠與所需標靶特異性結合的胜肽、抗體或其片段、或合成的配體(例如，塑性抗體)、或適體或寡核苷酸。該抗體可為單株抗體或其片段。應理解的是，如果使用抗體片段，則其保留結合生物標記物的能力，使生物標記物可被測得(根據本發明)。配體/結合劑可以用可檢測的標記物來標記，例如發光、螢光、酵素或放射性標記物；替代性地或額外地，可用親和標幟來標記本發明的配體，該親和標籤諸如生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素或His(例如hexa-His)標籤。或者，可以使用無標記技術(例如ForteBio Inc.)確定配體結合。
如本文所述，術語「檢測」或「診斷」包含對疾病狀態的識別、確認和/或表徵，且用作診斷的輔助，其中檢測或診斷方法與其他方法一起使用以對患者的狀況進行更完整的評估。根據本發明的檢測、監測和診斷方法可用於確認疾病的存在、透過評估發病和進展來監測疾病的發展、預測疾病的預後、預測和/或監測和/或管理疾病復發、或評估疾病的改善或消退。檢測、監測和診斷方法也可用於評估臨床篩檢、預後、治療選擇、治療益處評估的方法，即用於藥物篩選和藥物開發。
本發明的方法可涉及標誌物含量的標準化。例如可以將含有特定表觀遺傳特徵的無細胞核小體的含量相對於核小體本身(或一些其他類型的核小體或參數)的含量標準化，以將含量表達為包含該特徵的核小體的比例。例如，將瓜胺酸化核小體的含量表示為瓜胺酸化的核小體的比例。
在一實施例中，本文所述的方法在多個時點(occasion)被重複。此實施例提供允許在一段時間監測檢測結果的優點。這樣的安排將提供監測或評估疾病狀態的治療效果的益處。本發明的這些監測方法可用於監測發病、進展、穩定性、改善、復發和/或緩解。因此，在一實施例中，在一或多個時點重複該方法，且使用無細胞核小體或其組分的含量的任何變化來監測主體中多發性硬化症的進展。
在監測方法中，可能會在二或多個時點提取測試樣本。該方法可進一步包含將存在於測試樣本中的生物標記物的含量與一或多個對照和/或與一或多個從相同測試主體中較早取出的先前測試樣本進行比較，例如治療開始前和/或來自較早治療階段的相同測試主體。該方法可包含檢測在不同時點取出的測試樣本中生物標記物的性質或含量的變化。
測試樣本中的生物標記物的含量相對於從相同測試主體中較早取出的先前測試樣本中的含量的變化可以指示有益效果。例如，所述治療對病症或疑似病症的穩定或改善。此外，一旦完成治療，可以定期的重複本發明的方法以監測疾病的重現或復發。
監測治療功效的方法可用於監測在人類主體和非人類動物(例如在動物模型)中現有療法和新療法的治療效果。這些監測方法可以合併至新原料藥和物質組合的篩選中。
在另一實施例中，可以更短的數小時或數天的間隔進行由於快速作用療法而產生的更快速變化的監測。
提供了用於執行本發明方法的診斷或監測試劑套組(kit)(或組(panel))。這類套組合適地包含一或多種用於檢測和/或定量根據本發明的生物標記物的配體，和/或生物感測器、和/或本文所述的陣列，可選地連同試劑套組的使用說明。
本發明的另一態樣為用於診斷或監測多發性硬化症進展的套組，包含能夠檢測和/或定量如本文所定義之一或多種生物標記物的一生物感測器。如本文所使用，術語「生物感測器」是指能夠檢測生物標記物存在的任何事物。本文描述了生物感測器的例子。生物感測器可包含如本文所述的配體結合劑或配體，其能夠特異性結合至生物標記物。這種生物感測器可用於檢測和/或定量本發明的生物標記物。
合適地，用於檢測一或多種生物標記物的生物感測器將生物分子辨識與適當的方法相結合，以將樣本中生物標記物的存在或定量的檢測轉換為訊號。生物感測器可適用於「替代場所」診斷測試，例如在病房裡、門診部、手術室、家庭、田野及工作場所。用於檢測本發明的一或多種生物標記物的生物感測器包含橫向流動(lateral flow)、聲學、電漿共振、全像攝影、生物層干涉法(BLI)及微工程感測器。印記辨識元件、薄膜電晶體技術、磁聲諧振器裝置及其他新穎的聲電系統可用於生物感測器中，以檢測一或多種生物標記物。
用於檢測疾病存在的生物標記物是發現新標靶和藥物分子的重要標靶，其可減緩或停止疾病的進展。由於生物標記物的含量是表示疾病和藥物反應的，因此生物標記物可用於在體外和/或在體內測定中鑑別新的治療化合物。本文所述的生物標記物可用於篩選調節生物標記物活性的化合物的方法中。
因此，在本發明的另一態樣中，提供如所述之結合劑或配體的用途，其可為針對根據本發明之生物標記物的胜肽、抗體或其片段、或適體或寡核苷酸；或根據本發明之生物感測器、或陣列、或套組的用途，以辨別能夠促進和/或抑制生物標記物產生的物質。
本文所述之免疫測定法包含使用與本文所定義之生物標記物結合之一或多種抗體或其他特異性結合劑的任何方法。免疫測定法包含2位點免疫測定法或採用酶檢測方法的免疫測定法(例如，ELISA)、螢光標記免疫測定法、時差性螢光標記免疫測定、化學發光免疫測定法、免疫比濁測定法、微粒標記免疫測定法和免疫放射測定法以及單位點免疫測定法、試劑限制免疫測定、競爭性免疫測定方法，該競爭性免疫測定方法包含標記抗原及標記抗體單抗體免疫測定方法，其具有多種標記類型，包含放射性標記、酶標記、螢光標記、時差性螢光標記及微粒標記。所有所述免疫測定方法都是本領域所熟知的，參見諸如Salgame等人(1997)和van Nieuwenhuijze等人(2003年)。
辨別、檢測及/或定量可以在任何適用於檢測來自主體的生物樣品、或生物樣品或其稀釋液之純化物或萃取物中特定蛋白質的存在及/或量的方法中進行。特別是，可以透過測量一或多個樣本中目標的濃度來進行定量。可以在本發明的方法中測試的生物樣本包括如上文所定義的那些。樣本舉例可在適當稀釋或濃縮的情況下製備，且以常見方式儲存。本發明發現了血漿樣本中的特殊用途，該血漿樣品可從主體獲得。
生物標記物的辨別、檢測和/或定量可透過檢測生物標記物或其片段來進行，例如，具有C端截短或具有N端截短的片段。片段長度較佳為大於4個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。特別注意的是，與組織蛋白末端胜肽相同或相關序列的胜肽是組織蛋白特別有用的片段。
例如，檢測和/或定量可通過一或多種選自由：免疫測定法、免疫層析法(immunochromatography)、表面增強雷射脫附游離/飛行時間質譜儀(SELDI (-TOF))、基質輔助雷射脫附/游離飛行時間(MALDI (-TOF))、一維電泳分析(1-D gel-based analysis)、二維電泳分析(2-D gel-based analysis)、質譜(MS)、逆相(RP)液相層析(LC)、尺寸滲透(凝膠過濾)、離子交換、親和力、高壓液相層析法(HPLC)、超高效液相層析法(UPLC)和其他LC或基於LC MS的技術所組成的群組的方法來進行。合適的LC MS的技術包含ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA)或iTRAQ® (Applied Biosystems, CA, USA)。也可以使用液相層析法(例如高壓液相層析法(HPLC)或低壓液相層析法(LPLC))、薄膜層析法、NMR(核磁共振)光譜法。
涉及本發明的一或多種生物標記物的檢測及/或定量的方法可以在實驗臺儀器上進行，或可以結合到可在非實驗室環境(例如，在醫師的辦公室或主體床邊)中使用的一次性、診斷或監測平台上。用於進行本發明的方法的適合的生物感測器包含具有光學或聲學讀取器的「信用」卡。生物感測器可被設計為將收集到的數據以電子方式傳輸給醫師以進行解讀，並因此可以形成電子醫學的基礎。
用於疾病狀態的生物標記物的鑑別允許整合診斷程序和治療法。生物標記物提供了指示治療反應、無反應、不利的副作用概況、藥物順從性(medication compliance)的程度和達成足夠的血清藥物含量的方法。生物標記物可用於提供不良藥物反應的警告。生物標記物可用於個人化治療的發展，由於反應評估可用於微調(fine-tune)劑量、最小化處方藥的數量、減少達到有效治療的延遲和避免不良藥物反應。因此，透過監測本發明的生物標記物，可以精確地定製使主體照護以匹配疾病和主體的藥物基因輪廓確定的需求，生物標記物可因此用於滴定最佳劑量、預測陽性治療反應和識別那些嚴重副作用高風險的主體。
基於生物標記物的測試為「新」主體提供了第一線評估，並為準確和快速診斷提供了客觀方法，這是使用現行方法無法實現的。
生物標記物監測方法、生物感測器和套組作為主體監測工具也是極為重要的，以使醫生能夠判定復發是否是因為病情的惡化。如果評估藥物治療不足，則可以恢復或增加治療；如果合適可以改變治療方法。由於生物標記物對疾病的狀態是敏感的，它們提供了藥物治療影響的指示。
本文提及到的「主體」或「患者」可互換地使用。主體可為人類主體或動物主體。在一實施例中，主體為人類。在一實施例中，主體為(非人類)動物。本文所述的組和方法可在體外、體內或離體進行。
可以將檢測和/或定量與臨界量(cut-off level)進行比較。可透過分析來自多個患者和對照的結果並決定用於將主體分為患有或不患有該疾病的合適數值來預先決定臨界值(cut-off value)。例如，對於患有該疾病的患者中生物標記物含量為較高的疾病，如果檢測到的含量高於臨界值，則表示該患者患有該疾病。或者，對於患有該疾病的患者中生物標記物含量為較低的疾病，如果檢測到的含量低於臨界值，則表示該患者患有該疾病。使用簡單的臨界值的優點包括臨床醫生能夠輕鬆理解測試內容，並且不需任何軟體或其他輔助手段即可解釋測試結果。可使用本領域的方法確定臨界量。
也可以將檢測和/或定量與對照進行比較。本領域技術人員將清楚的是，可以在多種基礎上選擇對照主體，例如其可以包含已知為沒有疾病的主體或可以是患有不同疾病的主體(例如，用於鑑別診斷調查)。「對照(control)」可包括健康主體、未患病主體和/或處於緩解期的主體。對照也可以是沒有症狀或症狀輕度的多發性硬化症的主體。輕度症狀可包含不需要醫院干預和/或侵入性醫療的可控制的症狀。
與對照的比較在診斷領域是已知的。在對照組中發現的值的範圍可以用作正常或健康或參考範圍，可將測試主體發現的值與其進行比較。例如，如果參考範圍小於10(＜10)單位，則5單位的測試值將被視為正常或不需要治療，但11單位的值將被視為異常且指示為需要治療。
因此，在一實施例中，該方法另外包含將主體的體液樣本中的無細胞核小體或其組分的含量與一或多個對照進行比較。例如該方法可包含將從主體獲得的樣本中的無細胞核小體存在的含量與從正常主體獲得的樣本中的無細胞核小體存在的含量進行比較。對照可以是健康主體。
在一實施例中，與對照相比，無細胞核小體或其組分的含量為升高。
可以理解的是，沒有必要在每次都因為要比較所以測量對照組含量。例如，針對健康/非疾病對照，一旦確定了「正常範圍」，就可以將其用作所有後續測試的基準。可以透過從多個沒有感染的對照主體身上獲取樣品並測試生物標記物含量來確定正常範圍。然後可以檢查懷疑受感染的主體的結果(即生物標記物含量)，看他們是否在各自的正常範圍內或之外。使用「正常範圍」是檢測疾病的標準做法。
在一實施例中，該方法還包含確定該患者之至少一臨床參數。此參數可用於結果的解讀。臨床參數可以包含任何相關的臨床訊息，例如但不限於體溫、性別、體重、身體質量指數(BMI)、吸煙狀況和飲食習慣。因此，於一實施例中，臨床參數係選自由：體溫、年齡、性別以及身體質量指數(BMI)所組成的群組。
根據本發明的另一態樣，提供了結合劑在製造用於診斷或監測多發性硬化症的方法中的套組的用途，包含：
(i) 將從主體中獲得的一體液樣本與結合劑接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分的含量；以及
(ii) 使用檢測到的無細胞核小體的含量來診斷或監測主體。
根據本發明的另一態樣，提供了一種檢測需要對多發性硬化症進行醫療的主體的方法，包含：
(i) 將從主體中獲得的一體液樣本與結合劑接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分的含量；以及
(ii) 使用該無細胞核小體的含量作為主體需要對多發性硬化症進行醫療的指示。
其他生物標記物
可以檢測或測量無細胞核小體的含量作為一組測量之一。該組可包含如上文所述的核小體的不同表觀遺傳特徵(例如組織蛋白同功異型體和PTM)。用於檢測多發性硬化症的組合測試中的生物標記物包含但不限於寡株免疫球蛋白G (IgG)或免疫球蛋白M (IgM)蛋白、細胞因子部分(特別是介白素)、C-反應蛋白(C-reactive protein)、D-二聚體(D-Dimer)、因子VII活化蛋白酶(FSAP)、纖維蛋白原和纖維蛋白/纖維蛋白原分解產物。在一實施例中，該組包含一或多種細胞因子，例如一或多種介白素。在較佳實施例中，組測量是在CSF、血液、血漿或血清樣本中進行。
介白素(interleukin，IL)是一組通常由白血球分泌的細胞因子，其是作為訊號分子。它們在刺激免疫反應和發炎中扮演重要角色。它們在1970年代首次被發現，並由於發現了更多類型的介白素而被編號。介白素的例子包含但不限於：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15。
在一實施例中，一或多種介白素選自由：介白素-6(IL-6)和介白素-12(IL-12)所組成的群組。
介白素可為IL-6。介白素-6(IL-6)是一種具有多種生物學功能的細胞因子。它是發燒和急性期反應的有效誘導物。人類IL-6的序列是本領域已知的，並且在UniProt登錄號P05231中記載。在一特定實施例中，介白素可為IL-6。
或者，或另外，介白素可以是IL-12。介白素-12(IL-12)是一種T細胞刺激因子，因為其可以刺激T細胞的生長和功能。其是由IL-12A和IL-12B組成的異二聚體細胞因子。人類IL-12A的序列是本領域已知的並在UniProt登錄號P29459中記載，且人類IL-12B的序列也是已知的並在UniProt登錄號P29460中記載。在一特定實施例中，介白素可為IL-12。
在一實施例中，該套組(panel)包含無細胞核小體或其表觀遺傳特徵和介白素。在另一實施例中，該套組包含無細胞核小體的表觀遺傳特徵和兩種介白素。例如，無細胞核小體測量可以與一種以上的介白素測量相結合，例如IL-6和IL-12。在另一實施例中，無細胞核小體的表觀遺傳特徵選自組織蛋白同功異型體(例如H3.1)、和轉譯後修飾的組織蛋白(例如瓜胺酸化H3和/或甲基化H3)。在又一實施例中，測量套組為H3.1、H3R2,R8,R17Cit和H3K27Me3。
可以使用本發明的生物標記物得到模型。用於得到模型或演算法的方法是本領域已知的且合適的套裝軟體是可買到的。用於此目的的典型軟體工具包含SPSS(社會科學統計軟體)和”R”。這些套裝軟體提供臨床數據的線性和非線性數據建模。
本領域技術人員將清楚的是，本文揭露的生物標記物的任何組合可用於檢測多發性硬化症的套組和演算法中，且可將另外的標記物添加到包含這些標記物的套組中。
根據本發明的一態樣，提供套組測試的用途，以檢測患有多發性硬化症患者，其中套組測試包含用於檢測從患者獲得的樣本中的核小體或其組分和一或多種介白素的測量的試劑。
治療方法
根據另一態樣，提供一種治療患有多發性硬化症的一主體的方法，包含：
(i) 將從該主體中獲得的一體液樣本與一結合劑接觸，以測量無細胞核小體或其組分的含量；
(ii) 使用在步驟(i)中測量的該無細胞核小體或其組分的含量作為該主體中多發性硬化症存在和/或嚴重性的指標；以及
(iii) 對步驟(ii)中確定需要治療的該主體進行治療。
根據另一態樣，提供一種在需要的一主體中治療多發性硬化症的方法，該方法包含將治療劑施用於當與從對照主體獲得的樣本中的無細胞核小體的含量相比，從所述主體獲得的樣本中被識別為 具有不同含量的無細胞核小體的主體的步驟。
步驟(iii)可包含施用治療劑。治療可集中於治療MS症狀的復發(例如使用類固醇藥物)、治療特定的MS症狀和/或減少復發次數的治療(即疾病改善療法(disease-modifying therapy)。在一實施例中，該治療選自一或多種：類固醇(例如皮質類固醇，例如普賴鬆(prednisone)和甲基普立朗(methylprednisolone)、干擾素β藥物(例如Avonex、Betaferon、Extavia、Plegridy和Rebif)、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)、芬戈莫德(fingolimod)、反丁烯二酸二甲酯(dimethyl fumarate)、反丁烯二酸地羅西美(diroximel fumarate)、特立氟胺(teriflunomide)、西普尼莫德(siponimod)、克拉屈濱(cladribine)、單株抗體治療(例如奧瑞珠單抗(Ocrelizumab)、那他珠單抗(Natalizumab)和阿侖單抗(Alemtuzumab))或造血幹細胞移植(haematopoietic stem cell transplantation, HSCT)。
根據本發明的另一態樣，提供一種治療多發性硬化症的方法，包含使用套組測試識別需要治療多發性硬化症的患者並提供所述治療，其中套組測試包含檢測核小體或其組分的測量的試劑。與對照相比，預期患有多發性硬化症的患者具有更高含量的無細胞核小體。
應當理解的是，本文所述的實施例可以應用於本發明的所有態樣，即針對用途描述的實施例可以同樣地應用於請求保護的方法等。
現在將參考以下非限制性實施例說明本發明。
實施例
1
從24名被診斷患有MS的患者和19名健康主體中收集血漿樣本進行核小體測定。將全血樣本收集到血漿採血管中，並在靜脈穿刺後2小時內離心。將血漿轉移到冷凍管中並冷凍保存直到進行分析。在測定前，將保存的血漿樣本解凍並以14000 g離心2分鐘。
對樣本進行3種不同核小體類型的測量。這些是含有組織蛋白變體H3.1的核小體(H3.1-核小體)、含有組織蛋白PTM H3K27Me3的核小體(組織蛋白H3在離胺酸殘基27處甲基化)和含有組織蛋白PTM H3R2,R8,R17Cit的核小體(組織蛋白H3在精胺酸殘基2、8和17處瓜胺酸化)。使用自動免疫分析儀透過免疫測定進行核小體的測量。簡單來說，將校準物或樣本(50µl)與吖啶酯(acridinium ester)標記的抗-核小體抗體(50µl)和測定緩衝液(100µl)在37℃下培養1800秒。加入塗覆有抗-H3.1、抗-H3K27Me3或抗-H3R2,R8,R17Cit抗體(20µl)的磁珠，並將混合物再培養900秒。接著分離磁珠，洗滌3次，並通過超過7000毫秒的發光輸出來測定磁性結合的吖啶酯。從標準曲線內插獲得結果。
結果顯示，儘管具有不同的模型，MS患者的3種核小體類型的血漿含量升高。在MS中H3.1-核小體含量升高，結果產生的ROC曲線具有曲線下面積(AUC)為87%以及在100%特異性下的靈敏度為54%(圖1)。在MS中H3K27Me3-核小體含量升高，結果產生的ROC曲線具有曲線下面積(AUC)為89%以及在100%特異性下的靈敏度為58%(圖2)。在MS中H3R2,R8,R17Cit-核小體含量升高，結果產生的ROC曲線具有曲線下面積(AUC)為78%以及在100%特異性下的靈敏度為33%(圖3)。
我們推斷，在MS患者體液中的核小體含量升高，且核小體測量值是疾病的存在和嚴重性的有效指標，且可提供復發或發作的可能性和/或可能嚴重性的指標，以及症狀改善或發作的指標。
無
圖1. 在診斷出患有MS的主體和健康的主體中測量含有組織蛋白H3.1的核小體的含量的盒形圖(box plot)和ROC曲線(receiver operating characteristic curve (接收器操作特性曲線))。
圖2. 在診斷出患有MS的主體和健康的主體中測量含有組織蛋白PTM H3K27Me3的核小體的含量的盒形圖和ROC曲線。
圖3. 在診斷出患有MS的主體和健康的主體中測量含有組織蛋白PTM H3R2,R8,R17Cit的核小體的含量的盒形圖和ROC曲線。
無。
Claims (26)
- 一種診斷一主體多發性硬化症之方法，包含將從該主體中獲得的一體液樣本與一結合劑(binding agent)接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分(component)的含量。
- 如請求項1所述之方法，其中，該體液樣本為血液、血清或血漿樣本。
- 如請求項1所述之方法，其中，該體液樣本為腦脊髓液(cerebrospinal fluid)樣本。
- 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中，該無細胞核小體之組分包含該無細胞核小體的一表觀遺傳特徵(epigenetic feature)。
- 如請求項4所述之方法，其中，該表觀遺傳特徵為組織蛋白(histone)同功異型體(isoform)，例如核心核小體的組織蛋白同功異型體，特別是組織蛋白H3同功異型體。
- 如請求項5所述之方法，其中，該組織蛋白同功異型體為H3.1。
- 如請求項4所述之方法，其中，該表觀遺傳特徵為組織蛋白轉譯後修飾(post translational modification (PTM))，例如核心核小體的組織蛋白PTM，特別是組織蛋白H3 PTM。
- 如請求項7所述之方法，其中，該組織蛋白PTM選自瓜胺酸化或甲基化。
- 如請求項1至8中任一項所述之方法，其中，使用免疫測定、免疫化學、質譜、色譜、染色質免疫沉澱或生物感測器方法來檢測或測量該無細胞核小體或其組分的含量。
- 如請求項1至9中任一項所述之方法，其中，該檢測或測量方法包含將該體液樣本與一固相接觸，該固相包含用於檢測無細胞核小體或其組分的一結合劑，以及檢測所述結合劑的結合。
- 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中，該檢測或測量方法包含： (i) 將該樣本與結合至一無細胞核小體的一表觀遺傳特徵的一第一結合劑接觸； (ii) 將步驟(i)中由該第一結合劑結合的該樣本與結合至無細胞核小體的一第二結合劑接觸；以及 (iii) 檢測或定量在該樣本中該第二結合劑的結合。
- 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中，該檢測或測量方法包含： (i) 將該樣本與結合至無細胞核小體的一第一結合劑接觸； (ii) 將步驟(i)中由該第一結合劑結合的該樣本與結合至一無細胞核小體的一表觀遺傳特徵的一第二結合劑接觸；以及 (iii) 檢測或定量在該樣本中該第二結合劑的結合。
- 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中，該主體為人類或動物主體。
- 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中，該方法在一或多個時點(occasion)重複，且使用無細胞核小體或其組分的含量的任何變化來監測該主體中多發性硬化症的進展。
- 如請求項1至14中任一項所述之方法，還包含將該主體的該體液樣本中的該無細胞核小體或其組分的含量與一或多個對照進行比較。
- 如請求項15所述之方法，其中，該對照為一健康主體。
- 如請求項1至16中任一項所述之方法，其中，與一對照相比，該無細胞核小體或其組分的含量升高。
- 如請求項1至17中任一項所述之方法，其中，檢測或測量該無細胞核小體的含量作為一套組測量之一。
- 如請求項18所述之方法，其中，該套組包含測量一或多種介白素(interleukin)的含量。
- 如請求項18或19所述之方法，其中，該套組包含測量C反應蛋白(C reactive protein (CRP))、D-二聚體(D-Dimer)和/或因子VII-活化蛋白酶(VII-activating protease (FSAP))的含量。
- 如請求項18至20中任一項所述之方法，其中，該套組包含測量寡株(oligoclonal)IgG或IgM蛋白的含量。
- 一種檢測需要治療多發性硬化症之一主體之方法，包含： (i) 將從該主體獲得的一體液樣本與一結合劑接觸，以檢測或測量無細胞核小體或其組分的含量；以及 (ii) 使用該無細胞核小體的含量作為該主體需要進行多發性硬化症治療的一指標。
- 一種將包含組織蛋白H3.1的無細胞核小體作為用於診斷多發性硬化症的一體液樣本中的一生物標記物(biomarker)的用途。
- 一種將包含組織蛋白H3K27Me的無細胞核小體作為用於診斷多發性硬化症的一液體樣本中的一生物標記物的用途。
- 一種將包含組織蛋白H3R2,R8,R17Cit的無細胞核小體作為用於診斷多發性硬化症的一液體樣本中的一生物標記物的用途。
- 一種治療患有多發性硬化症的一主體之方法，包含： (i) 將從該主體中獲得的一體液樣本與一結合劑接觸，以測量無細胞核小體或其組分的含量； (ii) 使用在步驟(i)中測量的該無細胞核小體或其組分的含量作為該主體中多發性硬化症存在和/或嚴重性的指標；以及 (iii) 對步驟(ii)中確定需要治療的該主體進行治療。
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