NL1014106C2 - Werkwijze voor het detecteren van een pathologische afwijking bij een cel, een antistof en een assay kit. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het detecteren van een pathologische afwijking bij een cel, een antistof en een assay kit

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detecteren van een pathologische afwijking bij een cel van een bepaald type, waarbij de cel in contact wordt gebracht met een antistof, en de binding van de anti-5 stof aan een niet-buitenmembraaneiwit van de cel wordt gedetecteerd.

Voor het detecteren van pathologische afwijkingen bij cellen wordt veelvuldig gebruik gemaakt van antistoffen die specifiek een determinant herkennen die bij normale 10 cellen van dat type niet of in significant mindere mate danwel juist in grotere mate aanwezig is. Voor leukemie wordt daarbij veelal gebruik gemaakt van antigene determinanten op het celoppervlak (buitenmembraaneiwitten, daaronder begrepen antigene determinanten van gemodificeerde buitenmembraanei-15 witten). Ook is het bekend om een cel te prepareren teneinde binnen de celmembraan aanwezige delen voor een antistof bereikbaar te maken en de aldus geprepareerde cel in contact te brengen met een antistof teneinde pathologische afwijkingen bij een cel te detecteren. Detectie van een pathologische 20 afwijking kan niet alleen dienen voor het stellen van een diagnose, maar ook voor het volgen van een therapeutische behandeling.

Er bestaat een voortdurende behoefte aan detectie-wijzen waarmee pathologische afwijkingen bij een cel kunnen 25 worden gedetecteerd, bij voorkeur in een vroeg stadium, met een grote specificiteit en met grote gevoeligheid.

De onderhavige uitvinding beoogt één of meer van de hierboven genoemde doelen te bereiken.

Hiertoe verschaft de onderhavige uitvinding een 30 werkwijze volgens de aanhef die hierdoor wordt gekenmerkt dat als de antistof een antistof wordt gebruikt die specifiek is voor een eiwit gekozen uit de groep bestaande uit i) een eiwit van een Polycombgroepcomplex; ii) een co-repressor of een co-activator van een Polycombgroepcomplex; en iii) een 35 Boundary element-bindend eiwit, en de mate van binding van de 1014106 2 antistof wordt vergeleken met een voor een normale cel van dat type bepaalde referentiewaarde.

Gevonden is dat bij eiwitten zoals hier gedefinieerd een afwijkende concentratie ervan een zeer goede indicator is 5 voor het detecteren van een pathologische afwijking.

In de onderhavige aanvrage wordt onder een antistof verstaan elk selectief het gedefinieerde eiwit bindend eiwit, zoals een polyklonaal of monoklonaal antilichaam of een door middel van proteolyse verkregen selectief bindend fragment 10 daarvan, een peptide of peptoïde dat codeert voor het bindende deel van een antistof, een door middel van faag-display-techniek tot expressie gebracht specifiek herkennend peptide enz.

Wanneer in de onderhavige aanvrage wordt gesproken 15 over een cel wordt hieronder een cel van een zoogdier verstaan, in het bijzonder een mens, waarbij de cel die wordt onderzocht op een afwijking en de normale cel beide van hetzelfde celtype zijn.

Wanneer in de onderhavige aanvrage wordt gesproken 20 over een referentiewaarde van een normale cel wordt hieronder verstaan een referentiewaarde van een cel die zich in hetzelfde of een overeenkomstig differentiatiestadium bevindt of overeenkomstig is gestimuleerd als de op een pathologische afwijking te onderzoeken cel, die zoals hierboven uiteengezet 25 van hetzelfde celtype is. Dat wil zeggen, afhankelijk van het differentiatiestadium of een stimulatie kunnen normale cellen een wisselende referentiewaarde vertonen. De referentiewaarde is bijvoorbeeld een waarde van een met de concentratie van een eiwit zoals gedefinieerd evenredige parameter (daaronder 30 begrepen de concentratie zelf), zoals fluorescentie-intensi-teit. De referentiewaarde kan ook een verhouding zijn van waarden voor de mate van binding (d.w.z. de concentratie).

Het spreekt voor zich dat bij de keuze van het te detecteren eiwit (of de te detecteren eiwitten) met voordeel 35 kan worden gekozen voor die referentiewaarden welke onafhankelijk zijn van het differentiatiestadium of bij de stimulering van een normale cel niet worden bereikt. Bij het aantonen van een afwijkende cel temidden van een grote populatie normale cellen kunnen die normale cellen een wisselende 1014106 3 concentratie van een gedefinieerd eiwit, bijv. ring 1, vertonen. Dit bijvoorbeeld afhankelijk van de leeftijd van de cel, evt. stimulatie, nutriënten, eerder contact met andere cellen waarbij stoffen zijn uitgewisseld etc. Het kan dan heel goed 5 zijn dat een kwaadaardige cel een verhoogde concentratie van een zoals hierin gedefinieerd eiwit bevat in vergelijking met cellen die dezelfde 'voorgeschiedenis' hebben/zelfde omstandigheden enz. terwij1 die concentratie nog beneden de concentratie ligt van een niet-kwaadaardige cel met een andere 10 voorgeschiedenis (en dus beneden die referentiewaarde). Door te normaliseren met een ander gedefinieerd eiwit, kan een referentiewaarde worden gevonden die niet of in mindere mate afhankelijk van de omstandigheden varieert en in geval van een pathologische afwijking de gemeten waarde wél significant 15 is.

In de onderhavige aanvrage worden onder Boundary elementen DNA-eiwitcomplexen verstaan die de grenzen van chromatinedomeinen definiëren én die in staat zijn de repressie van genexpressie door chromatine-geassocieerde represso-20 ren tegen te gaan.

Volgens een belangrijke uitvoeringsvorm is voor het detecteren van een pathologische afwijking de cel een kankercel .

Er bestaan zeer veel soorten kanker, elk weer onder-25 verdeeld in verschillende subtypen. Het is voor het stellen van de diagnose, het bepalen van de prognose, en in het bijzonder ook het bepalen en volgen van een therapeutische behandeling belangrijk te weten met welke variant men te maken heeft en wat voor een bepaalde variant de bij een 30 individu gemeten waarde is in vergelijking met de referentiewaarde. Het vervaardigen van antistoffen tegen de diverse (sub)typen van kanker is een zeer moeizaam karwei. Daarentegen laat de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding de mogelijkheid open om voor zeer sterk uiteenlopende soorten 35 kanker en/of varianten te volstaan met één of slechts enkele antistoffen tegen even zoveel van de gedefinieerde eiwitten.

Volgens een eerste uitvoeringsvorm is het eiwit van een Polycombcomplex een eiwit gekozen uit de groep bestaande uit HPH, BMI1, RING 1, HPC, EZH, EED, en YY1.

1014100 4

Volgens een alternatieve uitvoeringsvorm is de co-repressor een eiwit gekozen uit CtBP en HDAC.

Volgens een voorkeursuitvoering wordt een tweede antistof gebruikt die specifiek is voor een tweede eiwit 5 gekozen uit i) een eiwit van een Polycombgroepcomplex; ii) een co-repressor of co-activator van een Polycombgroepcomplex; en iii) een Boundary element-bindend eiwit, de verhouding van de mate van binding van de antistof en de tweede antistof wordt bepaald en de aldus verkregen verhoudingswaar-10 de wordt vergeleken met een voor de normale cel bepaalde referentiewaarde.

Deze werkwijze kan worden gebruikt voor het vergroten van de nauwkeurigheid van de detectie. Zo zal, bijvoorbeeld, voor een pathologische afwijking waarbij de concentra-15 tie van één zoals hierin gedefinieerd eiwit licht daalt en de concentratie van een ander zoals hierin gedefinieerd eiwit licht stijgt, een meer betrouwbare detectie kunnen worden bereikt met minder vals-positieve cellen wanneer de verhouding van de gemeten waarden als referentiewaarde wordt ge-20 bruikt. Deze uitvoeringsvorm is ook geschikt in die gevallen waarin voor het betreffende normale celtype de concentratie sterk varieert afhankelijk van het differentiatiestadium en/of een stimulatie en het detecteren van de mate van binding van het tweede eiwit wordt gebruikt voor het uitvoeren 25 van een normalisatie.

Met voordeel geschiedt de bepaling van de mate van binding door het meten van fluorescentie of lichtabsorptie. Het laatste kan bijvoorbeeld geschieden door middel van een histochemische kleuring, een in het vak welbekende techniek. 30 De werkwijze volgens de uitvinding is geschikt voor het detecteren van een pathologische afwijkende cel in een biopt. De cel is met voordeel een in een uitstrijkje aanwezige cel, zoals een baarmoederhalscel. Volgens een alternatieve gunstige uitvoeringsvorm is de cel een in een cytospin-35 preparaat aanwezige cel. Voor beide gunstige uitvoeringsvormen geldt dat het verkrijgen van materiaal snel en op voor een patiënt weinig belastende wijze kan geschieden.

In alle gevallen geldt dat het zeer eenvoudig is de cel te verkrijgen en preparatietechnieken voor het in contact 1014106 5 brengen met een antistof snel kunnen worden uitgevoerd en aldus een grootschalige screening mogelijk maken. Het gebruik van een op een cytospin gebaseerde techniek heeft verder het voordeel dat eventueel los geraakte kankercellen die in de 5 bloedstroom terecht zijn gekomen dankzij de zeer gevoelige techniek volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gedetecteerd, zelfs als zij in zeer kleine aantallen (in vergelijking met bloedcellen) aanwezig zijn.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een anti-10 stof gericht tegen een Boundary element-bindend eiwit van een zoogdier.

Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een assay kit welke kit voor het detecteren van een pathologische afwijking bij een cel een antistof bevat gericht tegen een 15 eiwit gekozen uit de groep bestaande uit i) een eiwit van een Polycombgroepcomplex; ii) een co-repressor of een co-activa-tor van een Polycombgroepcomplex; en iii) een Boundary element -bindend eiwit, en de mate van binding van de antistof wordt vergeleken met een voor een normale cel van dat type 20 bepaalde referentiewaarde.

1014106

Claims (11)

1. Werkwijze voor het detecteren van een pathologische afwijking bij een cel van een bepaald type, waarbij de cel in contact wordt gebracht met een antistof, en de binding van de antistof aan een niet-buitenmembraaneiwit van de cel 5 wordt gedetecteerd, met het kenmerk, dat als de antistof een antistof wordt gebruikt die specifiek is voor een eiwit gekozen uit de groep bestaande uit i) een eiwit van een Poly-combgroepcomplex; ii) een co-repressor of een co-activator van een Polycombgroepcomplex; en iii) een Boundary element- 10 bindend eiwit, en de mate van binding van de antistof wordt vergeleken met een voor een normale cel van dat type bepaalde referentiewaarde.

2. Werkwijze voor het detecteren van een pathologische afwijking bij een cel volgens conclusie l, met het 15 kenmerk, dat de cel een kankercel is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het eiwit van een Polycombcomplex een eiwit is gekozen uit de groep bestaande uit HPH, BMI1, RING 1, HPC, EZH, EED, en YY1.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de co-repressor een eiwit is gekozen uit CtBP en HDAC.

5. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat een tweede antistof wordt gebruikt die 25 specifiek is voor een tweede eiwit gekozen uit i) een eiwit van een Polycombgroepcomplex,· ii) een co-repressor of een co-activator van een Polycombgroepcomplex; en iii) een Boundary element-bindend eiwit, de verhouding van de mate van binding van de antistof en de tweede antistof wordt bepaald en de 30 aldus verkregen verhoudingswaarde wordt vergeleken met een voor de normale cel bepaalde referentiewaarde.

6. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de bepaling van de mate van binding geschiedt door het meten van fluorescentie of lichtabsorptie.

7. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de cel een van een uitstrijkje aanwezige 1014106 » * cel is.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de van een uitstrijkje afkomstige cel een baarmoederhals-cel is.

9. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 6, met het kenmerk, dat de cel een in een cytospinpreparaat aanwezige cel is.

10. Antistof gericht tegen een Boundazy element-bindend eiwit van een zoogdier.

11. Assay kit voor het detecteren van een pathologi sche afwijking bij een cel, welke kit een antistof bevat gericht tegen een eiwit gekozen uit de groep bestaande uit i) een eiwit van een Polycombgroepcomplex; ii) een co-repressor of een co-activator van een Polycombgroepcomplex; en iii) een 15 Boundary element-bindend eiwit, en de mate van binding van de antistof wordt vergeleken met een voor een normale cel van dat type bepaalde referentiewaarde. 1014106