KR20140109871A - 뉴클레오솜 부가물의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뉴클레오솜-단백질 부가물의 존재를 검출 및 측정하는 방법, 및 질환의 검출 및 진단을 위한 그와 같은 측정치의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환의 검출 및 진단을 위한 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법, 및 상기 방법에 의해 식별되는 바이오마커에 관한 것이다.

Description

뉴클레오솜 부가물의 검출 방법 {METHOD FOR DETECTING NUCLEOSOME ADDUCTS}
본 발명은 뉴클레오솜-단백질 부가물의 존재를 검출 및 측정하기 위한 방법, 및 질환의 검출 및 진단을 위한 그와 같은 측정치의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환의 검출 및 진단을 위한 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법, 및 상기 방법에 의해 식별되는 바이오마커에 관한 것이다.
인체는 수백 종의 세포 유형을 포함하고 있다. 이러한 세포 유형들 모두는 동일한 게놈을 포함하나, 광범위하게 상이한 표현형 및 상이한 신체에서의 기능들을 포함하고 있다. 이와 같은 표현형상의 다양성은 상이한 세포 유형에서의 상이한 게놈 발현에 기인한다. 상이한 유전자 발현의 조절에 대해 완전히 알려져 있는 것은 아니지만, 기본적인 메카니즘으로써 유염색질 또는 이질염색질으로서의 염색질 패킹(packing)의 조절, 뉴클레오솜 위치지정 및 뉴클레아제 접근가능 부위의 조절, DNA의 메틸화, 및 주위로 DNA가 권취되는 뉴클레오솜 구조의 변화를 포함하여, 유전자와 연관된 수많은 상호연결된 후성적 신호에 의한 유전자 조절이 포함된다.
뉴클레오솜은 염색질 구조의 기본 단위로써, 8개의 고도로 보존된 코어 히스톤들 (히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 각각의 쌍으로 이루어짐)의 단백질 복합체로 구성된다. 이와 같은 복합체 주위에 대략 146개 염기쌍의 DNA가 권취되어 있다. 또 다른 히스톤인 H1 또는 H5가 링커로 작용하며, 염색질 압축에 연관되어 있다. DNA는 종종 "비드 온 스트링(beads on a string)"과 유사한 것으로 언급되는 구조로 연속되는 뉴클레오솜 주위에 권취되어 있는데, 이는 개방형 또는 유염색질의 기본 구조를 형성한다. 압축형 또는 이질염색질에서는, 이와 같은 스트링이 폐쇄된 복합 구조로 나선화(coiled) 및 초나선화(super coiled)된다 (문헌 [Herranz and Esteller, 2007]).
성인 인간에서의 정상 세포 전환은 하루 1011개 정도 세포의 세포 분할에 의한 생성, 및 주로 아폽토시스에 의한 유사한 수의 사멸을 수반한다. 아폽토시스 과정에서, 염색질은 세포로부터 방출되는 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜으로 분해된다. 정상 상태에서는 이들이 제거되기 때문에, 건강한 대상체에서 발견되는 순환성 뉴클레오솜의 농도는 낮다. 농도 상승은 여러 암, 자가-면역 질환, 염증 상태, 졸중 및 심근 경색을 포함한 다양한 이상이 있는 대상체에서 발견된다 (문헌 [Holdenrieder & Stieber, 2009]).
모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜은 효소-연관 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 검출될 수 있는 바, 몇 가지 방법들이 보고되어 있다 (문헌 [Salgame et al, 1997]; [Holdenrieder et al, 2001]; [van Nieuwenhuijze et al, 2003]). 이들 검정은 통상적으로 항-히스톤 항체 (예를 들어 항-H2B, 항-H3 또는 항-H1, H2A, H2B, H3 및 H4)를 포획 항체로 사용하고, 항-DNA 또는 항-H2A-H2B-DNA 복합 항체를 검출 항체로 사용한다. 그러나, 이들 검정의 결과들이 서로 일치하지 않는다는 것이 발견되었다. 또한, 대부분의 혈청 또는 혈장 중 순환성 DNA가 모노-뉴클레오솜 및 올리고-뉴클레오솜으로 존재하는 것으로 보고되어 있지만 (문헌 [Holdenrieder et al, 2001]), 측정되는 혈청 또는 혈장 중 뉴클레오솜과 DNA의 농도는 잘 일치하지 않는다. 실시간 PCR (폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 측정되었을 때의 순환성 무세포 노클레오솜 농도와 순환성 DNA 농도 ELISA 결과 사이의 상관 계수는 혈청에서 r=0.531, 혈장에서 r=0.350인 것으로 보고된 바 있다 (문헌 [Holdenrieder et al, 2005]).
뉴클레오솜 ELISA 방법은 주로 아폽토시스를 검출하기 위한 방법으로서 세포 배양물에서 사용되며 (문헌 [Salgame et al, 1997]; [Holdenrieder et al, 2001]; [van Nieuwenhuijze et al, 2003]), 또한 혈청 및 혈장에서 순환성 무세포 뉴클레오솜의 측정을 위하여 사용된다 (문헌 [Holdenrieder et al, 2001]). 사멸 세포에 의해 순환계로 방출되는 무세포 혈청 및 혈장 뉴클레오솜 농도는 수많은 상이한 암의 연구에서 잠재적인 바이오마커로서의 그의 용도를 평가하기 위하여 ELISA 방법에 의해 측정되어 왔다 (문헌 [Holdenrieder et al, 2001]). 평균 순환성 뉴클레오솜 농도는 전체는 아니지만 대부분의 연구된 암에서 높은 것으로 보고되어 있다. 가장 높은 순환성 뉴클레오솜 농도는 폐암 대상체에서 관찰되었다. 최저 농도는 전립선암에서 관찰되었는데, 건강한 대상체의 정상 범위에 속하는 것이었다. 그러나, 악성 종양이 있는 대상체는 상당히 가변적인 혈청 뉴클레오솜 농도를 가지는 것으로 보고되어 있어서, 진행성 종양 질환이 있는 일부 대상체는 건강한 대상체에서 측정되는 범위 이내의 낮은 순환성 뉴클레오솜 농도를 가지고 있다는 것이 발견되었다 (문헌 [Holdenrieder et al, 2001]). 이것, 및 뉴클레오솜 농도 상승의 다양한 비-암성 원인으로 인하여, 순환성 뉴클레오솜 농도는 임상적으로는 암의 바이오마커로서 사용되지 않고 있다 (문헌 [Holdenrieder and Stieber, 2009]).
뉴클레오솜의 구조는 히스톤 단백질의 전사후 변형 (PTM), 및 변이 히스톤 단백질의 포함에 의해 달라질 수 있다. 히스톤 단백질의 PTM은 통상적으로 8종의 코어 히스톤 미부(tail)에서 이루어지며, 통상적인 변형에는 리신 잔기의 아세틸화, 메틸화 또는 유비퀴틴화는 물론, 아르기닌 잔기의 메틸화 및 세린 잔기의 인산화가 포함된다. 히스톤 변형은 유전자 발현의 후성적 조절에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Herranz and Esteller, 2007]). 뉴클레오솜의 구조는 또한 상이한 유전자 또는 스플라이스 생성물로써 상이한 아미노산 서열을 가지는 선택적인 히스톤 이소형 또는 변이체의 포함에 의해 달라질 수 있다. 히스톤 변이체들은 개별 유형들로 하위분할되는 수많은 계열로 분류될 수 있다. 수많은 히스톤 변이체들의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으며, 예를 들어 국립 인간 게놈 조사 연구소 NHGRI 히스톤 데이터베이스 (문헌 [Marino-Ramirez, L, Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D., and Landsman, D. The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011] (제출하였음) 및 [http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml]), 진뱅크(GenBank) (NIH 유전자 서열) 데이터베이스, EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 및 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ)에서 공개적으로 이용가능하다.
수많은 (대부분 면역조직화학) 연구에서, 건강한 세포와 질환 세포에 존재하는 히스톤 변이체 및 히스톤 변형 패턴이 상이한 것으로 나타난 바 있다 (문헌 [Herranz and Esteller, 2007]). 임상적 용도를 위한 면역조직화학 방법의 한 가지 단점은 조직 샘플 수집이 수술 또는 생검을 필요하는 침습성이라는 것이다.
뉴클레오솜 구조 및 위치에 의해 매개되는 후성적 신호전달 이외에, 세포에서의 유전자 발현의 조절은 DNA의 메틸화 상태에 의해서도 매개된다 (문헌 [Herranz and Esteller, 2007]). 어느 때인가부터, DNA가 시토신 뉴클레오티드의 5 위치에서 메틸화되어 5-메틸시토신을 형성할 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다.
암에서의 DNA 메틸화의 연관성은 일찌기 1983년에 보고되었다 (문헌 [Feinberg and Vogelstein, 1983]). 암 세포에서 관찰되는 DNA 메틸화 패턴은 건강한 세포의 것과 상이하다. 특히 동원체주변 영역 부근의 반복 요소가 암 세포에서는 건강한 세포에 비해 저메틸화되는 것으로 보고되어 있으나, 특정 유전자의 프로모터는 암 세포에서 과메틸화되는 것으로 보고되어 있다. 이러한 두 가지 효과의 균형은 암 세포에서의 전체적인 DNA 저메틸화를 초래하는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Rodriguez-Paredes & Esteller, 2011]).
어떤 특정 유전자의 과메틸화는 암의 진단 바이오마커로 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈장으로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭에 의한 셉틴(Septin) 9 유전자의 과메틸화 검출과 관련하여 보고된 방법은 10%의 가양성률로 72%의 결장암을 검출한다고 보고되어 있다 (문헌 [Grutzmann et al, 2008]). 특정 유전자 또는 유전자좌의 DNA 메틸화 상태는 보통 일차 DNA 서열 변화로 이어지며 서열분석 또는 기타 수단에 의해 검출될 수 있는 5-메틸시토신이 아닌 시토신의 우라실로의 선택적 비술파이트 탈아미노화에 의해 검출된다 (문헌 [Allen et al, 2004]).
전체적인 DNA 저메틸화는 암 세포의 특질이다 (문헌 [Esteller 2007 and Hervouet et al, 2010]). 전체적인 DNA 메틸화는 면역조직화학 기술을 사용하여 세포에서 연구될 수 있다. 다르게는, 분석을 위하여 세포로부터 DNA가 추출된다.
핵산 및 히스톤 단백질 이외에도, 염색질은 그의 구성 DNA 및/또는 히스톤에 결합된 수많은 비-히스톤 단백질들을 포함하고 있다는 것이 여러 해 전부터 알려져 있었다 (문헌 [Yoshida and Shimura, 1972]). 이러한 염색질 결합 단백질들은 매우 다양한 유형을 가지며, 전사 인자, 전사 증강 인자, 전사 억제 인자, 히스톤 변형 효소, DNA 손상 복구 단백질 및 기타 많은 것들을 포함한 다양한 기능들을 가지고 있다. 염색질 결합 단백질에 대한 연구는 대부분 염색질 면역침전 (ChIP) 방법에 의해 수행되어 왔다. 이 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으나, 복잡하고, 어려우며, 고가이다.
통상적인 ChIP 방법에서는, 세포 염색질이 가교-결합됨으로써, 모든 단백질 및 핵산 성분들이 서로 공유 결합된다. 다음에, 염색질이 전단되어 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜의 제제를 형성한다. 대상 단백질에 대한 항체가 전단된 염색질에 첨가됨으로써, 단백질을 함유하는 해당 염색질 단편을 면역침전시킨다. 항체는 보통 대상 단백질을 함유하는 염색질 복합체의 단리를 용이하게 하기 위하여 고체 상 (예컨대 플라스틱 비드)에 결합되어 있다. 다음에, 가교-결합이 파기되고, 프로테이나제를 사용한 소화에 의해 단백질이 제거된다. 염색질 복합체와 결합되어 있는 DNA가 단리된 후, PCR에 이어지는 겔 전기영동, DNA 서열분석 (ChIP-Seq) 또는 DNA 마이크로어레이(microarray) (칩-상-ChIP)를 포함한 다양한 기술들 중 어느 것을 사용하여, 특정 단백질 결합과 연관되어 있는 DNA 서열, 유전자 또는 유전자좌를 확인하기 위하여 분석된다.
ChIP 방법은 염색질 결합 히스톤 단백질들과 결합되는 DNA 서열을 밝힌다. 예를 들어 히스톤 결합 분석 (문헌 [Ricke and Bielinsky, 2005])을 포함하여, 히스톤 및 뉴클레오솜과의 비-히스톤 단백질들의 결합에 대한 연구를 용이하게 하기 위한 ChIP 방법의 파생물들이 개발되었다. 염색질에 결합하는 많은 단백질들이 암 및 기타 질환 메카니즘에 연관되어 있으나, 순환계에서의 뉴클레오솜 부가물 형태로써의 그의 풍부도에 대해서는 이전에 조사된 바 없다. 그 예에는 고도 운동성 군 박스 단백질 1 (HMGB1), 제스트 상동체 2의 폴리콤(polycomb) 단백질 인핸서 (EZH2), 및 핵 수용체 군의 단백질이 포함된다.
고도 운동성 군의 단백질은 DNA 또는 히스톤 중량의 약 3%로 존재하는 염색질의 성분이다. 그것은 해당 DNA 서열에 대한 어떠한 알려져 있는 특이성도 없이 뉴클레오솜에 결합하는 구조 단백질이다 (문헌 [Gerlitz et al; 2009]). HMGB1은 구조적인 염색체 단백질이면서 전염증성 매개인자이다. 그것은 세포 사멸, 아폽토시스, 그리고 다양한 염증 및 자가면역 이상, 패혈증, 수막염 및 신경변성을 포함한 수많은 질환들에 연관되어 있다. HMGB1의 과발현은 암의 모든 모든 주요 특질들과 연관되어 있다 (문헌 [Tang et al; 2010]). HMGB1은 아폽토시스 세포의 염색질에 견고하게 결합된다. 뉴클레오솜-HMGB1 복합체의 연구는 이러한 부가물이 자가면역 질환인 전신성 홍반 루푸스 (SLE)에 걸린 대상체의 순환계에서 발견된다는 것, 그리고 상기 부가물이 SLE의 핵심 특징인 항-핵 항체의 발생에 연관되어 있다는 것을 밝혔다. HMGB1에 결합되지 않은 뉴클레오솜은 면역 반응을 도출하지 않는다. 이러한 부가물에서의 뉴클레오솜에 대한 HMGB1의 결합은 DNA 또는 히스톤에 대한 항체를 사용한 뉴클레오솜의 면역침전, 및 이어지는 면역침전된 뉴클레오솜에서의 HMGB1의 존재를 확인하기 위한 항-HMGB1 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 입증되어 있다 (문헌 [Urbonaviciute et al; 2008]).
HMGB 단백질은 염색질 기능에 영향을 준다고 알려져 있는 많은 다른 단백질들과 상호작용하는데, HMGB 단백질 더하기 추가적인 단백질들을 포함하는 염색질 복합체가 출현한다는 것이 밝혀진 바 있다 (문헌 [Gerlitz et al; 2009]). 따라서, 단순 뉴클레오솜-단백질 부가물 이외에도, 염색질에서는, 2종 또는 다중의 단백질들이 뉴클레오솜과 결합되어 있는 뉴클레오솜-단백질-복합체 부가물들이 출현한다.
EZH2는 유전자의 전사 억제 상태를 유지하는 것과 연관되어 있는 다중체 단백질 복합체를 형성하는 폴리콤-군 (PcG) 계열의 구성원이다. EZH2는 뉴클레오솜 히스톤 3의 리신 27 아미노산 잔기를 메틸화하는 히스톤 변형 효소 (히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제)이다. 이와 같은 히스톤 변형은 염색질 압축 및 유전자 침묵과 연관되어 있다 (문헌 [Cao et al; 2002]).
핵 수용체는 호르몬 또는 리간드의 조절하에서 유전자 발현을 조절하는 분자로써, 예를 들어 에스트로겐 수용체 (ER)는 에스트로겐 의존성 유전자들의 발현을 조절한다. 이러한 단백질들 중 많은 것이 질환 진행에 연관되어 있는데, 예를 들어 ER은 유방암의 진행에 연관되어 있어서, 많은 유방암 치료가 ER, 및/또는 그의 리간드인 에스트라디올과의 ER의 상호작용 방지를 표적으로 하고 있다.
세포에서 출현하는 뉴클레오솜-단백질 부가물 이외에도, 세포 사멸 후 세포로부터의 뉴클레오솜의 방출 이후 형성될 수 있는 다른 뉴클레오솜-단백질 부가물들이 존재한다. 그와 같은 뉴클레오솜 부가물에는 SLE의 핵심 특징인 뉴클레오솜-이뮤노글로불린 부가물이 포함된다.
본 발명자들은 생물학적 샘플에서의 단백질-뉴클레오솜 부가물의 직접적인 평가를 위한 간단한 면역검정 방법을 보고하는 바이다. 본 발명자들은 뉴클레오솜 결합 EZH2, HMGB1 및 수종의 핵 수용체의 간단한 검출 방법을 개발하고, 그와 같은 뉴클레오솜 부가물들이 혈청 샘플에서 검출될 수 있다는 것, 및 그것이 질환에서 바이오마커로서의 용도가 있다는 것을 보였다.
본 발명의 제1 측면에서는, 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단을 위한 혈중 바이오마커로서의 뉴클레오솜-단백질 부가물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제2 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 샘플 중 뉴클레오솜-단백질 부가물의 존재를 검출하는 방법이 제공된다:
(i) 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플 중 부가 단백질에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량하는 단계; 및
(iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계.
본 발명의 제3 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 샘플 중 뉴클레오솜 부가물의 존재를 검출하는 방법이 제공된다:
(i) 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플 중 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량하는 단계; 및
(iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 세포에서 뉴클레오솜 부가물을 검출하는 방법이 제공된다:
(i) 세포로부터 염색질을 단리하는 단계;
(ii) 염색질을 소화시키거나, 초음파처리하거나, 또는 다르게 분해하여, 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 형성시키는 단계; 및
(iii) 상기 제2 또는 제3 측면에서 기술된 본 발명의 ELISA 방법에 따라 뉴클레오솜 부가물의 존재를 검출 또는 측정하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출 또는 진단하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준을 대상체의 질환 상태를 식별하는 데에 사용하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 의학적 치료에 대한 적합성에 대하여 동물 또는 인간 대상체를 평가하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준을 대상체에 적합한 치료의 선택을 위한 파라미터로서 사용하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계;
(ii) 1회 이상의 횟수로 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물의 검출 또는 측정을 반복하는 단계; 및
(iii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준의 임의의 변화를 대상체 상태의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출 또는 진단하기 위한 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계;
(ii) 건강한 대상체 또는 대조 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
(iii) 질환에 걸린 대상체와 대조 대상체에서 검출된 수준 사이의 차이를 사용하여, 뉴클레오솜 부가물이 질환 상태에 대한 바이오마커로서 유용한지 여부를 식별하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 본원에서 정의되는 방법에 따라 식별되는 바이오마커가 제공된다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 뉴클레오솜 부가물 또는 그의 성분 부분에 특이적인 리간드 또는 결합제, 또는 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 이들의 성분 부분의 구조/형상 모방체, 및 이와 함께 키트의 사용 지침서를 포함하는, 뉴클레오솜 부가물 검출용 키트가 제공된다.
도 1: 말 혈청에 희석된 헬라 세포로부터 추출된 소화 염색질 중 뉴클레오솜 EZH2 부가물 수준의 검출에 있어서의 ELISA 투여량 반응 곡선.
도 2: 5명의 건강한 대상체 및 11명의 종양에 걸린 대상체로부터 채취된 혈청 샘플 중 뉴클레오솜-EZH2 부가물 ELISA 결과.
도 3: 말 혈청에 희석된 헬라 세포로부터 추출된 소화 염색질 중 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 수준의 검출에 있어서의 ELISA 투여량 반응 곡선.
도 4: 5명의 건강한 대상체 및 11명의 종양에 걸린 대상체로부터 채취된 혈청 샘플 중 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 ELISA 결과.
도 5: 31명의 건강한 대상체, 및 (A) 결장암; (B) 유방암 또는 (C) 폐암에 걸린 74명의 대상체로부터 채취된 혈청 샘플 중 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 ELISA 결과.
도 6: *문헌 [Holdenrieder et al; 2001]의 방법에 의해 제조된 무세포 뉴클레오솜 중 뉴클레오솜-프로게스테론 수용체 부가물 수준의 검출에 있어서의 ELISA 투여량 반응 곡선.
도 7: *문헌 [Holdenrieder et al; 2001]의 방법에 의해 제조된 2명의 전립선암 사례 및 무세포 뉴클레오솜 샘플 중 뉴클레오솜-안드로겐 수용체 부가물 수준의 검출에 있어서의 ELISA 결과.
도 8: *문헌 [Holdenrieder et al; 2001]의 방법에 의해 제조된 무세포 뉴클레오솜 중 뉴클레오솜-에스트로겐 수용체 알파 (ERα) 부가물 수준의 검출에 있어서의 ELISA 투여량 반응 곡선.
도 9: 소화된 MCF7 염색질 중 뉴클레오솜-ERβ 부가물 수준의 검출에 있어서의 ELISA 결과. 검정은 2종의 상이한 포맷으로 수행되었음. 첫 번째 포맷에서는, 항-뉴클레오솜 항체를 웰 상에 코팅하고, 항-ERβ 항체를 비오티닐화하였음. 두 번째 포맷에서는, 항-ERβ 항체를 웰 상에 코팅하고, 항-뉴클레오솜 항체를 비오티닐화하였음.
도 10: 뉴클레오솜 H2AZ-ERβ 부가물 ELISA 결과.
도 11: 12명의 건강한 대상체 및 16명의 종양에 걸린 대상체로부터 채취된 혈청 샘플 중 뉴클레오솜-ERβ 부가물 ELISA 결과.
본 발명의 제1 측면에서는, 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단을 위한 혈중 바이오마커로서의 뉴클레오솜-단백질 부가물의 용도가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 바이오마커는 암의 진단에 사용된다. HMGB1 및 EZH2를 함유하는 2종의 그와 같은 부가물이 암에 걸린 대상체의 순환계에는 존재하나, 건강한 대상체의 순환계에서는 검출되지 않는다는 것이 밝혀졌다.
암이 호르몬 의존성이며 성장에 호르몬의 존재를 필요로 할 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 핵 호르몬이 수용체 결합 호르몬 복합체의 핵 국소화, 및 게놈 중 특이적 호르몬 반응 요소에의 결합에 의해 기능한다는 것 역시 잘 알려져 있다. 상기 요소와 연관되어 있는 유전자의 발현은 게놈상 반응 요소에 대한 수용체 결합 호르몬 복합체의 결합에 의해 조절된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 종양 상태를 특성화하기 위한 호르몬 수용체-뉴클레오솜 부가물 및 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물 바이오마커를 제공한다. 이러한 부가물은 혈액 또는 또 다른 체액 중에 존재하는 순환성 부가물일 수 있거나, 또는 종양 조직 샘플로부터 염색질의 소화에 의해 생성될 수 있다.
핵 호르몬 수용체가 호르몬 또는 리간드 조절하에서 유전자 발현을 조절한다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 에스트로겐 수용체는 세포 표면 막에서의 그의 기질 (스테로이드 호르몬인 에스트로겐)의 결합에 의해 기능한다. 결합 후에는, 호르몬-수용체 복합체의 내재화, 및 핵내 국소화가 이어지며, 거기에서 수용체는 게놈 중의 특정 호르몬 반응 요소에 결합한다. 에스트로겐 수용체가 결합하는 특정 유전자 서열은 에스트로겐 반응 요소 (ERE)로 알려져 있다. ERE와 연관되어 있는 유전자의 발현은 수용체, 그리고 그에 따라 대상체 순환계에서의 에스트로겐의 존재 또는 수준에 의해 조절될 수 있다. 유방암의 성장이 종종 에스트로겐 조절하에 있으며, 그와 같은 암이 종종 에스트로겐 의존성인 것으로 지칭된다는 것 역시 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 종양은 에스트로겐 수용체 (ER)를 과발현하기 때문에, 그들은 종종 ER+ 종양으로 지칭된다. 에스트로겐 의존성 종양의 성장은 에스트로겐 수용체에 대한 에스트로겐 결합의 방지를 목표로 하는 치료적 개재에 의해 저속화 또는 방지될 수 있으며, 이는 통상적인 유방암 치료 방법이다. 그와 같은 치료의 예에는 에스트로겐 의존성 유방암에서 에스트로겐의 길항제로 작용하는 약물 타목시펜, 및 에스트로겐 생성을 저속화 또는 방지하는 아로마타제 억제제가 포함된다. 그러나, 시간이 지나면서, 암은 에스트로겐 자극의 부재하에서도 성장하며 다른 치료를 필요로 하게 되는 에스트로겐 비의존성 종양으로 발달한다. 에스트로겐 의존성 및 비의존성 종양의 진단은 현재 종양 세포에서의 에스트로겐 수용체의 풍부도 등을 측정하기 위한 종양 생검 조직의 면역염색에 의해 일상적으로 수행되고 있다. 임상의는 종양 치료 과정에서 추가적인 에스트로겐 의존성 치료가 적절한지 아닌지, 또는 질환이 진행함에 따라 변화하는 종양의 특성을 반영하여 대상체의 치료 요법이 변경되어야 하는지를 결정하기 위하여, 반복적으로 종양의 에스트로겐 의존성을 재시험할 필요가 있을 수 있다. 불행하게도, 현재의 시험은 차선으로써, 시험이 수행될 때마다 반복되는 고통스러운 생검을 필요로 한다. 본 발명의 한 실시양태에서는, 유방암 환자의 순환계에서의 에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 부가물의 검출이 적절한 치료의 선택을 돕는 종양의 에스트로겐 의존성, 그리고 예상되는 예후 정보에 대한 지표로서의 종양 세포 핵에서의 ERE에 대한 에스트로겐 수용체 결합의 지표로서 사용된다. 이와 같은 방법은 그것이 단순한 에스트로겐 수용체 존재 또는 풍부도의 지표 대신 종양에서의 ERE-에스트로겐 수용체 결합을 표시해주며, 그것이 생검에 대한 필요성 없이 간단한 혈액 시험에 의해 원하는 만큼 빈번하게 반복될 수 있다는 장점을 가진다. 본 발명자들은 수용체의 ERα 및 ERβ 형태 모두를 함유하는 뉴클레오솜-ER 부가물의 검출 및 정량을 위한 간단한 ELISA 방법을 개발하였다. 놀랍게도, 이러한 부가물들은 암 환자의 순환계에 존재한다.
당업자라면, 동일한 원리가 종양 조직 자체로부터 생성되는 세포 염색질 소화물에서의 에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 부가물의 검출에 적용될 수 있다는 것을 분명히 알고 있을 것이다. 이와 같은 종양 에스트로겐 의존성의 평가 방법은 그것이 단순한 에스트로겐 수용체 존재 또는 풍부도의 지표 대신 종양에서의 ERE-에스트로겐 수용체 결합을 표시해주기 때문에, 현행 방법에 비해 뛰어나다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 순환계 또는 또 다른 체액 중 어느 하나에서의 에스트로겐-에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물 중, 또는 종양 조직으로부터 염색질의 소화물로서 생성되는 뉴클레오솜 중 스테로이드 에스트겐 자체의 존재 검출이 종양의 에스트로겐 의존성 상태의 지표로서 사용된다.
순환성 뉴클레오솜이 자궁내막증에서 상승되며 (문헌 [Holdenrieder et al; 2001]), 자궁내막증 조직이 에스트로겐 반응성이기 때문에, 자궁내막증 세포 염색질에서의 에스트로겐 수용체의 결합이 순환계 중 에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 부가물 또는 에스트로겐-에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물로 이어질 수 있다는 것이 보고되어 있다. 본 발명의 추가적인 실시양태에서는, 에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 부가물 또는 에스트로겐-에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물이 예를 들어 자궁내막증을 포함한 에스트로겐 의존성 부인과 이상의 존재에 대한 바이오마커로서 체액에서 검출된다.
에스트로겐 의존성 유방암과 유사한 방식으로, 안드로겐 의존성 전립선암의 성장은 안드로겐을 필요로 하거나, 그에 의해 촉진된다. 안드로겐 의존성 전립선 종양은 안드로겐 수용체 (AR)에 대한 안드로겐 결합을 방지하는 방법에 의해 간단하게 치료된다. 안드로겐 의존성 전립선 종양 역시 안드로겐 비의존성이 됨으로써 물리적, 또는 그의 수용체에 대한 안드로겐 결합을 방지하는 약물에 의한 화학적 거세를 포함한 치료에 대하여 내성이 되도록 발달할 수 있다. 종양의 안드로겐 의존성 상태는 게놈 중 안드로겐 반응 요소 (ARE)에 결합하는 안드로겐 수용체의 농도에 의해 측정될 수 있는데, 이는 대상체의 순환계 또는 전립선 조직으로부터의 염색질 소화물에 존재하는 안드로겐 수용체-뉴클레오솜 부가물 수준의 분석에 의해 측정될 수 있다. 이와 같은 목적을 위한 본 발명의 실시양태는 대상체의 순환계 또는 체액, 또는 대상체의 종양 조직으로부터 염색질 소화에 의해 생성되는 뉴클레오솜에서의 안드로겐 수용체-뉴클레오솜 부가물 또는 안드로겐-안드로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물의 검출을 포함한다. 본 발명자들은 드디어 뉴클레오솜-AR 부가물의 검출 및 정량을 위한 간단한 ELISA 방법을 개발하고, 그의 효용을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 뉴클레오솜-프로게스테론 수용체 부가물의 검출 및 정량을 위한 간단한 ELISA 방법도 개발하였다. 다른 호르몬 의존성 질환들은 본 발명 방법의 유사한 실시양태들을 사용하여 처리될 수 있다. 그와 같은 실시양태들은 예를 들어 레티노산 수용체를 수반하는 다양한 유형의 백혈병을 포함한 종양의 검출을 위한 예컨대 글루코코르티코이드 수용체, 갑상선 호르몬 수용체 및 레티노산 수용체-뉴클레오솜 부가물을 포함한 다른 수용체-뉴클레오솜 부가물들의 검출을 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면에 따라, 앞서 기술된 방법들은 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물을 검출하는 데에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물은 티록신-갑상선 호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물, 트리아이오도티로닌-갑상선 호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물, 레티노산-레티노산 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물, 안드로겐-안드로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물 또는 에스트로겐-에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물을 포함한다. 이와 같은 본 발명의 측면은 호르몬 활성화된 부가물은 물론, 야생형 또는 정상 호르몬 수용체를 함유하는 부가물을 예를 들어 (예컨대 에스트로겐 비의존성 유방암에서) 질환 진행 과정에서의 돌연변이로 인하여 그의 리간드에 결합하지 않는 호르몬 수용체로부터 구별한다는 장점을 가진다. 이와 같은 본 발명의 측면은 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 한 실시양태에서는, 호르몬 수용체에 결합하도록 유도된 항체 대신, 호르몬 자체에 결합하도록 유도된 항체 또는 다른 결합제가 사용된다. 대안적인 실시양태에서는, 항체 포획된 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물로부터 호르몬이 추출된 후, 확립되어 있는 방법, 예를 들어 면역검정 방법, 분광촬영 방법, 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피에 이어지는 질량 분광법 (LC/MS) 또는 기체 크로마토그래피에 이어지는 질량 분광법 (GC/MS)을 포함한 크로마토그래피 방법에 의해 정량된다. 예를 들어, 안드로겐-안드로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물은 부가물 상 (예를 들어 안드로겐 수용체 또는 뉴클레오솜 상)에 존재하는 에피토프에 결합하도록 유도된 고정된 항체에 의해 포획된다. 다음에, 호르몬은 고체 상 결합 부가물로부터 유기 용매 (예를 들어 디에틸 에테르)로 추출된다. 용매가 옮겨져 건조되고, 안드로겐이 검정 완충제 중에 재용해된 후, 그 농도가 측정된다 (예를 들어 경쟁적 면역검정에 의함). 당업자라면, 이와 같은 실시양태가 스테로이드 및 갑상선 호르몬과 같은 소형 분자 호르몬에 대하여 특별한 적용성을 가질 것임을 분명히 알고 있을 것이다.
본 발명은 뉴클레오솜에 결합되어 있는 단백질의 검출을 목표로 한다. 이는 1종의 항체는 뉴클레오솜에 결합하도록 유도되고 다른 1종은 뉴클레오솜에 결합된 단백질에 결합하도록 유도되는 이중 항체 ELISA 시험에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 뉴클레오솜에 결합하도록 유도되는 항체가 전체 뉴클로오솜 복합체에 대하여 유도될 필요는 없으며, 오히려 뉴클레오솜의 단백질 또는 핵산 성분 부분에 대하여 유도될 수 있다. 이와 같은 본 발명의 실시양태에서, 뉴클레오솜에 결합하는 데에 사용되는 항체는 예를 들어 특정 히스톤, 히스톤 변형체, 히스톤 변이체 또는 이소형, 또는 특정 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한 뉴클레오솜의 소정 성분 부분에 결합하도록 유도될 수 있다. 이와 같은 검정 설계는 뉴클레오솜의 결합제로서의 히스톤 변이체 H2AZ에 결합하도록 유도된 항체를 사용하는 예를 사용할 경우 주효한 것으로 나타났다. 당업자라면, 이와 같은 방법이 부가물 중 대상 단백질 및 H2AZ 모두를 함유하는 뉴클레오솜에만 선택적으로 결합한다는 추가적인 장점을 가진다는 것을 분명히 알고 있을 것이다. 이와 같은 설계는 소정의 특정 히스톤, 히스톤 변형체, 히스톤 변이체, 뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 기타 뉴클레오솜 구조와의 부가물 단백질의 소정 조합을 시험하기 위한 검정 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 샘플 중 뉴클레오솜-단백질 부가물의 존재를 검출하는 방법이 제공된다:
(i) 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플 중 부가 단백질에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량하는 단계; 및
(iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계.
당업자라면, 검출될 결합제가 부가된 단백질 또는 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜의 성분 부분에 대하여 유도된 항체들 중 어느 하나가 되도록 선택될 수 있다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다.
본 발명의 제3 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 샘플 중 뉴클레오솜 부가물의 존재를 검출하는 방법이 제공된다:
(i) 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플 중 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량하는 단계; 및
(iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 뉴클레오솜 부가물은 전염증성 단백질, 고도 운동성 군 단백질, 폴리콤 단백질, 염색질 변형 효소, 핵 수용체 또는 호르몬을 포함한다. 대안적인 실시양태에서, 뉴클레오솜 부가물은 고도 운동성 군 단백질, 폴리콤 단백질, 염색질 변형 효소, 호르몬 수용체 또는 호르몬을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 뉴클레오솜 부가물은 염색질 변형 효소, 핵 수용체 또는 호르몬을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 상기 고도 운동성 군 단백질은 HMGB1이다. 한 실시양태에서, 바이오마커가 암의 진단에 사용되는 경우, 뉴클레오솜-단백질 부가물은 고도 운동성 군 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 염색질 변형 효소는 히스톤 아세틸화, 탈아세틸화, 메틸화, 탈메틸화, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화, 수모일화, 탈수모일화 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제 효소이다. 대안적인 실시양태에서, 염색질 변형 효소는 EZH2이다.
한 실시양태에서, 뉴클레오솜-단백질 부가물이 핵 수용체를 포함하는 경우, 상기 핵 수용체는 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 글루코코르티코이드 수용체 또는 레티노산 수용체이다. 대안적인 실시양태에서, 뉴클레오솜-단백질 부가물이 핵 수용체를 포함하는 경우, 상기 핵 수용체는 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체 또는 레티노산 수용체이다.
한 실시양태에서, 뉴클레오솜-단백질 부가물이 호르몬을 포함하는 경우, 상기 호르몬은 갑상선 호르몬, 글루코코르티코이드 호르몬, 또는 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스토겐, 코르티코스테로이드 또는 레티노산을 포함한 스테로이드 호르몬이다. 대안적인 실시양태에서, 뉴클레오솜-단백질 부가물이 호르몬을 포함하는 경우, 상기 호르몬은 에스트로겐, 안드로겐, 코르티코스테로이드 또는 레티노산을 포함한 스테로이드 호르몬이다.
한 실시양태에서, 뉴클레오솜-단백질 부가물이 호르몬 수용체를 포함하는 경우, 상기 호르몬 수용체는 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 갑상선 호르몬 수용체 또는 레티노산 수용체이다.
상기 방법은 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하도록 유도된 항체와의 조합으로써 뉴클레오솜 자체에 대하여 유도된 항체를 사용하여, 또는 역시 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하도록 유도된 항체와의 조합으로써 뉴클레오솜 성분에 대하여 유도된 항체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 한 실시양태에서, 상기 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜 성분 항체 또는 결합제는 특정 후성적 뉴클레오솜 에피토프; 예를 들어 소정 히스톤 변이체 (예컨대 H2AZ), 소정 히스톤 변형체 (예컨대 트리메틸 H3K9) 또는 소정 뉴클레오티드 또는 변형 뉴클레오티드 (예컨대 5-메틸시토신)에 결합하도록 유도된다. 대안적인 실시양태에서는, 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜 성분 결합제가 특정 후성적 신호 구조에 결합하도록 유도됨으로써, 상기 후성적 신호 구조를 함유하는 특정 뉴클레오솜 부가물 하위세트만이 검출된다.
한 실시양태에서, 사용되는 결합제는 항체, 항체 단편 또는 압타머(aptamer)이다. 추가적인 실시양태에서, 사용되는 결합제는 항체이다.
한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 유체이다. 추가적인 실시양태에서, 샘플은 혈액 또는 혈청 또는 혈장이다. 당업자라면, 체액에서의 뉴클레오솜 부가물의 검출이 생검을 필요로 하지 않는 최소한으로 침습성인 방법이라는 장점을 가진다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다.
그러나, 일부 경우에서는, 해당 세포로부터 뉴클레오솜을 생성시킨 후 특정 뉴클레오솜 부가물의 존재에 대하여 뉴클레오솜을 분석함으로써 직접적으로 세포의 뉴클레오솜 부가물 상태를 평가하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 세포에서 뉴클레오솜 부가물을 검출하는 방법이 제공된다:
(i) 세포로부터 염색질을 단리하는 단계;
(ii) 염색질을 소화시키거나, 초음파처리하거나, 또는 다르게 분해하여, 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 형성시키는 단계; 및
(iii) 상기 제2 내지 제6 측면들 중 어느 하나에서 기술된 본 발명의 ELISA 방법에 따라 뉴클레오솜 부가물의 존재를 검출 또는 측정하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출 또는 진단하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준을 대상체의 질환 상태를 식별하는 데에 사용하는 단계.
본 발명의 한 실시양태에서, 샘플 중 뉴클레오솜 부가물의 존재는 해당 치료를 필요로 하는 대상체를 위한 최적 치료 요법을 결정하는 데에 사용된다. 그와 같은 실시양태의 한 예는 종양의 호르몬 의존성 평가를 위한 핵 호르몬 수용체-뉴클레오솜 부가물 또는 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물의 검출이다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 의학적 치료에 대한 적합성에 대하여 동물 또는 인간 대상체를 평가하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준을 대상체에 적합한 치료의 선택을 위한 파라미터로서 사용하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계;
(ii) 1회 이상의 횟수로 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물의 검출 또는 측정을 반복하는 단계; 및
(iii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준의 임의의 변화를 대상체 상태의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계.
한 실시양태에서, 뉴클레오솜 부가물은 측정 패널들 중 하나로서 검출 또는 측정된다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 암, 양성 종양, 염증성 질환, 자가면역 질환, 자궁내막증, 감염성 질환, 패혈증, 졸중 또는 심근 경색에 실제로 걸려 있거나 그것이 의심되는 대상체에서 사용하기 위한 것으로써, 질환 상태의 검출 또는 진단, 또는 의학적 치료에 대한 적합성에 대한 동물 또는 인간 대상체의 평가, 또는 동물 또는 인간 대상체 치료의 모니터링을 목적으로 하는, 단독 또는 측정 패널들의 일부 중 어느 하나로서의 뉴클레오솜 부가물의 검출 또는 측정 방법이 제공된다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출 또는 진단하기 위한 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계;
(ii) 건강한 대상체 또는 대조 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
(iii) 질환에 걸린 대상체와 대조 대상체에서 검출된 수준 사이의 차이를 사용하여, 뉴클레오솜 부가물이 질환 상태에 대한 바이오마커로서 유용한지 여부를 식별하는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 뉴클레오솜 부가물 또는 그의 성분 부분에 특이적인 리간드 또는 결합제, 또는 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 이들의 성분 부분의 구조/형상 모방체, 및 이와 함께 키트의 사용 지침서를 포함하는, 뉴클레오솜 부가물 검출용 키트가 제공된다.
히스톤 및 핵산 성분 외에에, 염색질은 광범위한 기능들을 수행하는 매우 다양한 단백질들을 함유하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 이러한 단백질의 예로서 HMGB1, EZH2 및 수종의 핵 수용체를 선택하고, 해당 단백질의 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜 부가물 검출을 위한 간단한 ELISA 방법을 개발하였다. 본 발명자들은 건강한 대상체 및 질환에 걸린 대상체로부터 채취된 혈청 샘플에서 직접적으로 이러한 ELISA 방법을 수행한 바, 상기 방법은 샘플 추출 또는 기타 샘플 사전-처리를 필요로 하지 않는다. 놀랍게도, 해당 뉴클레오솜 부가물들이 암 대상체의 혈청에서 검출될 수 있다는 것, 그리고 뉴클레오솜 부가물 ELISA 검정이 질환 상태의 검출 및 진단에 유용하다는 것이 밝혀졌다.
HMGB1은 세포 사멸, 아폽토시스, 그리고 다양한 염증성 및 자가면역 이상, 패혈증, 수막염, 신경변성, SLE 및 암을 포함한 수많은 질환과 연관되어 있는 손상 연관 분자 패턴 (DAMP) 단백질이다 (문헌 [Tang et al; 2010]). 많은 암에서 상승된 HMGB1의 발현이 발생하며, 침습 및 전이와 연관되어 있는 것으로 생각되고 있다 (문헌 [Sims et al, 2010]). HMGB1 농도의 상승은 또한 암 환자의 혈액은 물론, 다양한 기타 이상에서 발생한다 (문헌 [Stoetzer et al, 2012]). 순환성 HMGB1은 ELISA에 의해 측정될 수는 있으나 그와 같은 측정이 일상적인 임상 업무에서 사용되지는 않는데, 순환성 HMGB1이 결합 형태와 유리 형태로 출현하며 이들을 구별하는 데에 현재 이용가능한 웨스턴 면역블롯 방법은 일상적인 사용에는 적합하지 않기 때문이다. 따라서, 유리 HMGB1과 HMGB1 복합체 사이를 구별하기 위한 신뢰성 있는 방법에 대한 필요성이 존재한다 (문헌 [Urbonaviciute and Voll, 2011]). 중요한 종류의 순환성 HMGB1 복합체는 HMGB1-뉴클레오솜 부가물로써, 본 발명의 한 실시양태는 HMGB1-뉴클레오솜 부가물 및 기타 HMG-뉴클레오솜 부가물의 검출에 관한 것이다. HMG-뉴클레오솜 부가물은 빠르고 간단한 ELISA 방법을 사용하여 암 환자의 혈액에서 측정될 수 있는 것으로 나타났다.
HMGB1은 아폽토시스 세포의 염색질에 견고하게 결합되어 있다. 뉴클레오솜-HMGB1 복합체의 연구는 이러한 부가물이 자가면역 질환인 SLE에 걸린 대상체의 순환계에서 발견된다는 것, 그리고 상기 부가물이 SLE의 핵심 특징인 항-핵 항체의 발생에 연관되어 있다는 것을 나타내고 있다. 순환계에서의 이러한 부가물의 존재가 임상 진단 목적으로 사용된 바는 없는데, 그의 검출에 사용되는 웨스턴 블롯 방법이 고가이며 느리고 어려워서, 일상적인 임상 용도에는 적합하지 않기 때문이다. 본 발명은 이러한 단점을 극복한다.
EZH2는 뉴클레오솜 히스톤 3의 리신 27 아미노산 잔기를 메틸화함으로써 염색질 압축 및 유전자 침묵으로 이끄는 염색질 변형 효소 (히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제)이다 (문헌 [Cao et al; 2002]). 이 단백질은 살아 있는 세포의 핵에서 염색질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 놀랍게도, EZH2가 세포 사멸 후 뉴클레오솜에 결합되어 유지되며, 본 발명의 신규 ELISA 방법을 사용하면 암 대상체의 혈청에서 모노뉴클레오솜-EZH2 및 올리고뉴클레오솜-EZH2 부가물이 검출될 수 있는 것으로 나타났다.
염색질 변형 효소가 암에 연관되어 있으며 (문헌 [Fullgrabe et al, 2011]), 표적화된 약물의 사용을 통한 이러한 효소의 활성 억제가 암 요법의 주요 형태라는 것은 알려져 있다. 이러한 약물에는 예를 들어 비제한적으로 히스톤 탈아세틸화 복합체 억제제 (HDACi), 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 억제제 (HMTi) 및 DNA 메틸 트랜스퍼라제 억제제 (DNMTi)가 포함된다. 순환계에서의 HMGB1 부가물의 존재가 병리적이며 항-핵 항체와 연관되어 있다고 알려져 있기는 하지만, 염색질 변형 효소-뉴클레오솜 부가물이 순환계에 존재한다는 발견은 이전에 보고된 바 없다. 염색질 변형 효소-뉴클레오솜 부가물에 대한 검정은 예를 들어 암 질환 상태의 평가, 및 염색질 변형 효소 억제제 약물의 효능 측정, 예를 들어 순환성 염색질 변형 효소-뉴클레오솜 부가물의 농도가 특정 약물을 사용한 치료에 의해 변경되는지를 측정하는 것을 포함한 다중적인 암에서의 용도를 가진다. 본 발명의 방법은 질환 검출, 모니터링, 예후, 감별 진단 및 치료 요법의 선택을 포함한 매우 다양한 질환 진단상의 목적으로 순환성 염색질 변형 효소-뉴클레오솜 부가물 수준을 측정하는 데에 사용될 수 있다. HMT 효소 EZH2를 함유하는 뉴클레오솜 부가물이 암 환자의 순환계에서 검출될 수 있는 것으로 나타났다. 당업자라면, 본 발명의 방법이 이전에 언급된 HDAC 및 DNMT 효소는 물론, 예를 들어 히스톤 아세틸화, 탈메틸화, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화, 수모일화 및 탈수모일화 효소를 포함한 많은 다른 효소들을 포함하여, 기타 염색질 변형 효소들에도 적용될 수 있다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다.
핵 수용체는 리간드 호르몬 조절하에 핵에서의 그의 유전자 조절 효과를 발휘한다. 예로는 스테로이드 호르몬 수용체, 갑상선 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 및 레티노산 및 비타민 D 수용체가 포함된다. 이들 수용체는 다양한 암 및 기타 질환 메카니즘에 연관되어 있다. 일부 예에는 백혈병에서의 레티노산 수용체 (RAR), 유방암 및 자궁내막증에서의 에스트로겐 수용체 (ER), 전립선암에서의 안드로겐 수용체 (AR), 및 갑상선 질환 및 암에서의 갑상선 호르몬 수용체의 연관성이 포함된다.
놀랍게도, 핵 수용체-뉴클레오솜 부가물이 암 환자의 순환계에서 검출될 수 있는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명자들이 연구를 위해 선택한 모든 세포-내 염색질 결합 단백질들이 뉴클레오솜 부가물의 형태로 암 환자의 혈청에서 발견될 수 있다. 이러한 발견은 해당 부가물들이 비일상적인 것이 아닐 수 있다는 것, 그리고 많은 상이한 염색질 결합 단백질들을 포함하는 많은 그와 같은 세포-내 뉴클레오솜 단백질 부가물들이 세포 사멸 후 그의 완전성을 유지함으로써 본 발명의 방법에 의한 암, 자가-면역 및 염증성 질환 환자 혈청에서의 검출에 적합할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 적절한 특정 항-염색질 단백질 (항-HMGB1, 항-EZH2 또는 항-핵 수용체) 항체와의 조합으로써, 항-히스톤 항체를 이러한 검정을 위한 포획 항체로 사용하였다. 본 발명자들은 상기 검정을 사용하여, 특정 단백질을 함유하는 뉴클레오솜 부가물이 암에 걸린 대상체로부터 채취된 혈액 샘플에서 측정될 수 있으며, 비-침습성이거나 최소한으로 침습성인 바이오마커로서 사용하기에 탁월하다는 것을 나타내었다. 질환에 걸린 대상체로부터 채취된 혈청 샘플에서 검출되는 뉴클레오솜-부가물 수준은 건강한 대상체로부터의 혈청 샘플에서 검출되는 것과 상이하였다.
본 발명자들은 결장암에 걸린 3명의 대상체, 폐암에 걸린 6명의 대상체 및 췌장암에 걸린 2명의 대상체로부터 채취된 혈액 샘플에서 순환성 무세포 뉴클레오솜-HMGB1 및 뉴클레오솜-EZH2 부가물의 농도를 측정하고, 그것을 5명의 건강한 대상로부터의 혈액 샘플에 존재하는 농도는 물론, 문헌 (*문헌 [Holdenrieder et al, 2001])에 기술되어 있는 바와 같이 제조된 건강한 대상체로부터의 혈청 뉴클레오솜의 인공적으로 생성된 제제, 그리고 헬라(Hela) 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 제조된 시중에서 구입가능한 뉴클레오솜 제제과 비교하였다.
5명의 건강한 대상체에서의 결과 (평균 결과 ± 2 평균의 표준 편차)로부터 뉴클레오솜-HMGB1 및 뉴클레오솜-EZH2 부가물에 대하여 정상 범위를 계산하고, 암 대상체에서의 결과를 조사하여 그것이 각 정상 범위에 속하는지 또는 그것을 벗어나는지를 알아보았다. 데이터는 3개 결장암 샘플 중 2개, 6개 폐암 샘플 중 4개, 및 2개 췌장암 샘플 중 1개가 상승된 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 수준을 가졌다는 것, 그리고 유사하게 3개 결장암 샘플 중 2개, 6개 폐암 샘플 중 4개, 및 2개 췌장암 샘플 중 1개가 상승된 뉴클레오솜-EZH2 부가물 수준 (정상 범위의 상단보다 더 높은 광학 밀도 결과)를 가졌다는 것을 보여준다.
마찬가지로, 건강한 사람 및 질환에 걸린 환자에서 핵 수용체-뉴클레오솜 부가물의 농도를 측정하였는데, 암 환자의 혈청에 그것이 존재한다는 것을 나타내었다.
염색질에 결합하는 단백질에는 비제한적으로 핵 수용체, 고도 운동성 군 단백질 (예컨대 HMGB1), 폴리콤 단백질, 염색질 변형 효소 (예컨대 EZH2), DNA 변형 효소, 핵 수용체, 전사 인자, 구성 또는 구조 단백질, 전사 증강 인자, 전사 억제 인자, 복제 단백질, DNA 손상 복구 단백질, 그리고 유전자 발현, 염색질 패킹 또는 복제의 조절에 연관되어 있는 소정의 기타 단백질들이 포함된다.
뉴클레오솜 부가물은 세포 사멸 후 생물학적 유체에 존재하는 뉴클레오솜의 결합으로 인하여 발생할 수도 있다. 그와 같은 부가물의 예는 SLE와 같은 자가면역 질환에서 형성되는 뉴클레오솜-항체 부가물일 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서는, 뉴클레오솜-단백질 복합체 또는 부가물의 존재를 검출 또는 측정하는 방법이 제공된다. 측정될 뉴클레오솜 부가물은 비제한적으로 건강 상태 또는 질환 상태의 결과로서 생물학적 유체에 존재하는 자연 발생 뉴클레오솜 부가물을 포함한 소정 기원의 것일 수 있거나, 또는 뉴클레오솜 부가물은 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 생성될 수 있거나, 또는 유도된 아폽토시스 또는 세포의 괴사에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어 *문헌 [Holdenrieder et al; 2001]의 방법에 의함). 놀랍게도, 이들 모두의 상황에서 뉴클레오솜 부가물이 출현하며, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 생물학적 유체에서 뉴클레오솜-단백질 부가물의 존재를 검출 또는 측정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가적인 실시양태에서는, 1종 이상 뉴클레오솜-단백질 복합체 또는 부가물의 존재 또는 농도에 대하여 대상체 샘플을 시험하는 것에 의한, 질환 존재, 유형, 재발 또는 중증도의 검출 또는 진단 방법, 또는 최적 약물 또는 기타 치료 선택사항의 평가 방법이 제공된다.
본 발명의 추가적인 실시양태에서는, 시험 패널의 일부로서 뉴클레오솜-단백질 복합체 또는 부가물의 존재 또는 농도에 대하여 대상체로부터 채취된 샘플을 시험하는 것에 의한, 질환 존재, 유형, 재발 또는 중증도의 검출 또는 진단 방법, 또는 최적 약물 또는 기타 치료 선택사항의 평가 방법이 제공된다. 상이한 히스톤 변형을 함유하는 무세포 뉴클레오솜들의 검출을 위한 ELISA 방법에 대해서는 보고되어 있다 (문헌 [Bawden et al; 2005]).
예컨대, 상기 시험 패널들은 예를 들어 비제한적으로 대상체의 건강 상태 또는 질환 상태 지표로서의 상이한 부가물 및/또는 히스톤 변형체 및/또는 히스톤 변이체 및/또는 변형 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오솜 자체의 측정치, 또는 이들 중 어느 것과 임의의 다른 뉴클레오솜 에피토프의 소정 조합 또는 비를 포함한 상이한 뉴클레오솜 에피토프들을 함유하는 뉴클레오솜의 2종 이상 측정치로 구성될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 방법이 특정 단백질을 함유하는 뉴클레오솜 부가물의 검출 및 측정에 있어서 성공적인 방법이며, 이와 같은 방법이 현행 기술의 방법보다 뛰어난 뉴클레오솜 부가물 검출 방법이라는 결론을 내렸다. 본 방법은 빠르고, 저비용이며, 혈액 및 그의 유도체들을 포함한 복잡한 생물학적 매체 및 유체에서 사용하기에 적합하다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 혈액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출하는 데에 사용될 수 있다는 것, 그리고 그것이 암의 바이오마커로서 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 당업자라면, 혈액에 존재하는 바이오마커가 순환성 뉴클레오솜의 상승과 연관되어 있는 암 및 기타 질환의 광범위한 진단 및 질환 스크리닝 목적에 있어서 가치가 있다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다 (문헌 [Holdenrieder et al, 2001]).
본 발명의 한 측면에서는, 샘플에서 무세포 뉴클레오솜 부가물을 검출 및 측정하기 위한 이중 항체의 면역측정 또는 샌드위치 면역검정 방법이 제공된다. 이와 같은 측면의 한 실시양태는 하기의 단계들을 포함하는 면역검정이다:
(i) 뉴클레오솜 부가물을 함유할 수 있는 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제1 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜-단백질 부가물로서 존재할 수 있는 단백질에 결합하는 제2 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플 중 뉴클레오솜-단백질 부가물에 대한 상기 제2 항체 또는 다른 결합제의 결합을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및
(iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜-단백질 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 면역측정 면역검정에 의한 샘플 중 무세포 뉴클레오솜 부가물의 검출 및 측정 방법이 제공된다:
(i) 특정 단백질을 함유하는 뉴클레오솜 부가물을 함유할 수 있는 샘플을 대상 단백질에 결합하는 제1 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제2 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플 중 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제2 항체 또는 다른 결합제를 사용하여, 뉴클레오솜 샘플에 대한 상기 제2 항체 또는 다른 결합제의 결합을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및
(iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계.
당업자라면, 상기 제1 측면의 단계 (i) 및 상기 제2 측면의 단계 (ii)에서 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 데에 사용되는 항체 또는 다른 결합제가 무손상 뉴클레오솜, 또는 비제한적으로 히스톤, 히스톤 변이체, 히스톤 변형체, 뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 뉴클레오솜 DNA 성분의 다른 부분을 포함한 뉴클레오솜의 소정 성분 부분에 대하여 유도된 항체 (또는 다른 결합제)일 수 있다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 추가적인 측면에서는, 비제한적으로 특정 히스톤 변형체, 히스톤 변이체 또는 뉴클레오티드를 포함하여, 해당 결합제가 유도되는 또 다른 특징을 추가적으로 포함하는 뉴클레오솜-단백질 부가물(만)의 검출 방법이 제공된다. 이와 같은 설계의 장점은 검정의 뉴클레오솜 성분 에피토프 및 부가된 단백질 에피토프가 건강한 사람 또는 질환에 걸린 환자, 또는 조사중인 다른 환자 상태에서 그 농도가 모두 크게 다른 에피토프들이 되도록 선택될 수 있다는 것이다. 따라서, 검정에 의해 검출되는 뉴클레오솜의 비율은 감소되나, 검정의 임상적 선택성 또는 특이성은 증가될 가능성이 있다.
본 발명자들은 항-EZH2 항체와 함께 항-뉴클레오솜 항체로서 뉴클레오솜 성분 H2AZ에 대하여 유도된 항체를 사용하여 이와 같은 검정 설계를 수행하고, H2AZ와 특이적으로 결합된 뉴클레오솜-EZH2 부가물이 그와 같은 검정에 의해 검출될 수 있다는 것, 그리고 이러한 검정이 건강한 사람과 질환에 걸린 대상체로부터 채취된 샘플 사이를 구별하는 데에 사용될 수 있다는 것을 밝혔다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 검출될 뉴클레오솜 부가물은 1종을 초과하는 단백질을 함유할 수 있다. 추가적인 부가물 중 단백질은 뉴클레오솜에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오솜은 HMGB 단백질에, 그리고 추가적으로 추가적인 단백질 또는 단백질들에 결합될 수 있다. 상기 추가적인 단백질(들)은 직접적으로 뉴클레오솜에 결합될 수 있거나, 또는 HMGB 단백질에 결합됨으로써 간접적으로 뉴클레오솜에 결합될 수 있다. 뉴클레오솜 부가물은 다수의 단백질 성분으로 구성되는 대형 단백질 복합체를 함유할 수 있는데, 이 경우 뉴클레오솜에 대한 복합체 부가물 중 특정 단백질의 결합은 다수의 중간 결합 연결을 통할 수 있다. 당업자라면, 직접적으로 또는 간접적으로 뉴클레오솜 부가물에서 뉴클레오솜에 결합되어 있는 단백질이 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다.
당업자라면, 기술되는 본 발명의 방법이 예를 들어 미국 포르테바이오 인코포레이티드(ForteBio Incorporated)에 의해 시판되고 있는 유형의 바이오센서 유형 검정 및 무-표지 검정을 포함한 다양한 실시양태들을 포함한다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 샘플에서 특정 뉴클레오솜 부가물을 포함하는 뉴클레오솜의 비율을 검출하는 방법이 제공된다:
(i) 샘플에서 뉴클레오솜의 농도를 검출 또는 측정하는 단계;
(ii) 본 발명의 방법에 따라 뉴클레오솜 부가물의 농도를 검출 또는 측정하는 단계; 및
(iii) 상기 2개의 측정치를 사용하여 뉴클레오티드 부가물을 포함하는 뉴클레오솜의 비율을 측정하는 단계.
대상체로부터 채취된 혈액에서의 뉴클레오솜 부가물의 검출 및 측정은 암에 걸린 대상체를 식별하여 건강한 대상체로부터 그들을 구별하는 진단 방법으로 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명의 추가적인 측면에서는, 체액에서 무세포 뉴클레오솜 부가물의 존재 및/또는 수준 또는 농도를 측정 또는 검출하고, 검출된 수준을 비제한적으로 임상적 질환 진단, 질환 유형 또는 아형의 감별 진단, 또는 질환 예후, 또는 질환 재발, 또는 치료 요법에 대한 대상체 민감성의 진단을 포함한 대상체 질환 상태의 바이오마커로서 사용하는 것에 의한, 질환 존재의 검출 또는 진단 방법이 제공된다. 당업자라면, 진단용 시험에 사용되는 체액에 비제한적으로 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액 및 기타 유체가 포함된다는 것을 알고 있을 것이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플로 선택되는 체액은 혈액, 혈청 또는 혈장이다. 체액에서의 뉴클레오솜 부가물의 검정 반응, 수준, 농도 또는 양은 절대적인 용어 또는 상대적인 용어로, 예를 들어 비제한적으로 존재하는 총 뉴클레오솜 농도의 비율로, 또는 히스톤 변형과 같은 또 다른 뉴클레오솜 구조를 함유하는 뉴클레오솜의 농도, 또는 총 DNA의 농도에 대한 비로 표현될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 뉴클레오솜 부가물 측정은 비제한적으로 임상적 질환 진단, 질환 유형 또는 아형의 감별 진단, 또는 질환 예후, 또는 질환 재발, 또는 치료 요법에 대한 대상체 민감성의 진단을 포함한 대상체 질환 상태의 검출 또는 진단을 위한 진단용 시험 또는 측정 패널의 구성원으로 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 세포에서 단백질의 염색질 결합의 존재 및/또는 농도를 검출 또는 측정하는 방법이 제공된다:
(i) 세포로부터 염색질을 단리하는 단계;
(ii) 상기 염색질을 분해하여 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 형성시키는 단계; 및
(iii) 본 발명의 면역검정 방법에 의해 상기 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜에서의 뉴클레오솜 부가물의 존재를 검출 또는 측정하는 단계.
염색질으로부터 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 생성시키는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있는데, 효소 소화 및 초음파처리가 포함된다 (문헌 [Dai et al, 2011]). 본 발명자들은 헬라 및 MCF7 세포로부터 생성되는 뉴클레오솜에 대하여 이와 같은 측면을 입증하였다.
당업자라면, 본 발명의 소정 측면과 관련한 항체, 결합제 또는 리간드라는 용어가 제한적인 것이 아니라, 오히려 특정 분자 또는 실재물에 결합할 수 있는 항체 단편, 압타머 또는 소정 결합제를 포함하고자 하는 것이라는 것, 그리고 어떠한 적합한 결합제도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다. 뉴클레오솜이라는 용어가 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜, 그리고 유체 매체에서 분석될 수 있는 소정의 그와 같은 염색질 단편들을 포함하고자 하는 것이라는 것 역시 분명하게 알고 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 뉴클레오솜 부가물 또는 그의 성분 부분에 특이적인 리간드 또는 결합제, 또는 뉴클레오솜 부가물 또는 그의 성분 부분의 구조/형상 모방체, 및 이와 함께 본원에서 정의되는 방법들 중 어느 것에 따른 키트의 사용 지침서를 포함하는, 뉴클레오솜 부가물 검출 또는 측정용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 동물 또는 인간에서 질환 상태를 검출 또는 진단하기 위한 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 검출 또는 측정하는 단계;
(ii) 대조 대상체의 체액에서 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 검출 또는 측정하는 단계; 및
(iii) 질환에 걸린 대상체와 대조 대상체에서 검출된 수준 사이의 차이를 사용하여, 뉴클레오솜 부가물이 해당 질환에 대한 바이오마커로서 유용한지 여부를 식별하는 단계.
당업자라면, 상기 대조 대상체가 다양한 기준으로 선택될 수 있으며, 거기에는 예를 들어 질환이 없는 것으로 알려져 있는 대상체가 포함될 수 있거나, 또는 다른 질환에 걸린 대상체 (예를 들어 감별 진단의 조사를 위한 것임)가 있을 수 있다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 질환에 걸린 동물 또는 인간 대상체의 예후를 평가하기 위한 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 검출 또는 측정하는 단계; 및
(ii) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 검출된 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 대상체의 질환 결과와 상관시키는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 치료를 필요로 하는 질환에 걸린 동물 또는 인간 대상체를 위한 치료 요법의 선택에 사용될 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 검출 또는 측정하는 단계; 및
(ii) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 검출된 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 해당 대상체에서의 치료 요법의 관찰된 효능과 상관시키는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 질환에 걸린 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 데에 사용될 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법이 제공된다:
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 검출 또는 측정하는 단계;
(ii) 대상체의 질환 진행 동안, 1회 이상의 횟수로 상기 검출 또는 측정을 반복하는 단계; 및
(iii) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 검출된 무세포 뉴클레오솜 부가물의 농도를 대상체에서의 질환 진행과 상관시키는 단계.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 본원에서 정의되는 바와 같은 방법에 의해 식별되는 바이오마커가 제공된다.
본 발명의 추가적인 측면은 상기 바이오마커에 특이적인 결합을 할 수 있는 리간드 또는 결합제, 예컨대 자연 발생 화합물 또는 화학적 합성 화합물을 제공한다. 본 발명에 따른 리간드 또는 결합제에는 바이오마커에 특이적인 결합을 할 수 있는 펩티드, 항체 또는 그의 단편, 또는 합성 리간드 예컨대 플라스틱 항체(plastic antibody), 또는 압타머 또는 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 상기 항체는 바이오마커에 특이적인 결합을 할 수 있는 모노클로날 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 리간드는 검출가능한 마커, 예컨대 발광, 형광, 효소 또는 방사성 마커를 사용하여 표지될 수 있거나; 또는 다르게는 또는 더하여 본 발명에 따른 리간드는 친화성 태그, 예컨대 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 His (예컨대 헥사-His) 태그를 사용하여 표지될 수 있다. 다르게는, 리간드 결합은 무표지 기술 예컨대 포르테바이오 인코포레이티드의 것을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 바이오센서는 바이오마커에 대한 항체에 특이적인 결합을 할 수 있는 바이오마커 또는 그의 구조/형상 모방체를 포함할 수 있다. 역시 제공되는 것은 본원에서 기술되는 바와 같은 리간드 또는 모방체를 포함하는 어레이이다.
역시 본 발명에 의해 제공되는 것은 자연 발생 또는 화학적 합성의 것일 수 있으며 적합하게는 펩티드, 항체 또는 그의 단편, 압타머 또는 올리고뉴클레오티드인 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상 리간드, 또는 본 발명 바이오센서, 또는 본 발명 어레이, 또는 본 발명 키트의, 바이오마커를 검출 및/또는 정량하기 위한 용도이다. 이러한 용도에서, 검출 및/또는 정량은 본원에서 정의되는 바와 같은 생물학적 샘플에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위한 진단 또는 모니터링용 키트가 제공된다. 그와 같은 키트는 적합하게는 임의로 키트의 사용 지침서와 함께, 바이오마커의 검출 및/또는 정량을 위한 본 발명에 따른 리간드, 및/또는 바이오 센서, 및/또는 본원에서 기술되는 바와 같은 어레이를 포함하게 된다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 정의되는 바와 같은 1종 이상의 바이오마커를 검출 및/또는 정량할 수 있는 바이오센서를 포함하는 질환 상태 존재 검출용 키트이다.
질환의 존재를 검출하기 위한 바이오마커는 장애의 진행을 지연 또는 중지시키는 새로운 표적 및 약물 분자의 발견을 위한 본질적 표적이다. 바이오마커의 농도가 장애 및 약물 반응을 표시해주기 때문에, 바이오마커는 시험관내 및/또는 생체내 검정에서의 새로운 치료 화합물의 식별에 유용하다. 본 발명의 바이오마커는 바이오마커의 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 측면에서는, 본 발명에 따른 펩티드, 항체 또는 그의 단편 또는 압타머 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있는 기술된 바와 같은 결합제 또는 리간드; 또는 본 발명에 따른 바이오센서, 본 발명에 따른 어레이; 또는 본 발명에 따른 키트의, 바이오마커의 생성을 촉진 및/또는 억제할 수 있는 물질을 식별하기 위한 용도가 제공된다.
또한, 시험 물질을 대상체 동물에게 투여하는 것, 및 대상체로부터의 시험 샘플에 존재하는 바이오마커의 농도를 검출 및/또는 정량하는 것을 포함하는, 대상체에서 바이오마커의 생성을 촉진 또는 억제할 수 있는 물질을 식별하는 방법이 제공된다.
"바이오마커"라는 용어는 과정, 사례 또는 이상의 고유한 생물학적 또는 생물학적으로 유도된 지표를 의미한다. 바이오마커는 진단 방법들, 예를 들어 임상 스크리닝, 및 예후 평가, 및 요법의 결과 모니터링, 특정 치료적 치료에 반응할 가능성이 가장 큰 대상체의 식별, 약물 스크리닝 및 개발에 사용될 수 있다. 바이오마커 및 그의 용도는 새로운 약물 치료의 식별, 및 약물 치료를 위한 새로운 표적의 발견에 중요하다.
본원에서 사용될 때의 "검출하는 것" 및 "진단하는 것"이라는 용어는 질환 상태의 식별, 확인 및/또는 특성화를 포괄한다. 본 발명에 따른 검출, 모니터링 및 진단 방법은 질환의 존재를 확인하거나, 발병 및 진행을 평가하는 것에 의해 질환의 발달을 모니터링하거나, 또는 질환의 개선 또는 감퇴를 평가하는 데에 유용하다. 검출, 모니터링 및 진단 방법은 또한 임상 스크리닝의 평가, 예후, 요법의 선택, 치료 이익의 평가, 즉 약물 스크리닝 및 약물 개발을 위한 방법에 유용하다.
효율적인 진단 및 모니터링 방법은 올바른 진단을 확립함으로써 가장 적절한 치료의 빠른 식별을 가능케 하는 것 (그에 따라 유해한 약물 부작용에 대한 불필요한 노출을 감소시키는 것), 및 재발률을 감소시키는 것에 의해, 개선된 예후의 잠재력을 가지는 매우 강력한 "대상체 해법"을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 바이오마커는 종양의 세포로부터 방출된다. 따라서, 본 발명의 추가적인 측면에서는, (i) 종양 세포와 연관되어 있거나 그로부터 방출된 생물학적 샘플에서 바이오마커를 측정하는 단계, 및 (ii) 상기 바이오마커의 농도가 종양의 크기, 단계, 공격성 또는 전파성과 연관되어 있음을 입증하는 단계를 포함하는, 종양 성장의 검출 방법이 제공된다.
세포 전환, 세포 사멸 및 아폽토시스의 증가는 무세포 뉴클레오솜 순환 농도의 증가로 이어지는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Holdenrieder et al, 2001]). 순환성 무세포 뉴클레오솜 농도는 비-특이적인 지표로써, 염증성 질환, 매우 다양한 양성 및 악성 이상, 자가면역 질환은 물론, 외상 또는 허혈 후를 포함한 다양한 조건에서 발생한다 (문헌 [Holdenrieder et al 2001]). 당업자라면, 대상체에서 순환성 뉴클레오솜이 발견된 바 있는 다양한 질환 영역에서 본 발명이 적용성을 가지게 된다는 것을 분명하게 알고 있을 것이다. 여기에는 비제한적으로 외상 (예를 들어 중증의 손상 또는 수술), 극한 운동 (예를 들어 달리기 마라톤), 졸중 및 심장마비, 패혈증 또는 기타 심각한 감염 및 자궁내막증이 포함된다.
본 발명의 면역검정에는 효소 검출 방법 (예컨대 ELISA), 형광 표지 면역측정 검정, 시간-분해 형광 표지 면역측정 검정, 화학발광 면역측정 검정, 면역탁도측정 검정, 미립자 표지 면역측정 검정 및 면역방사선측정 검정을 사용하는 면역측정 검정들, 그리고 방사성, 효소, 형광, 시간-분해 형광 및 미립자 표지를 포함한 다양한 표지 유형을 사용하는 표지 항원 및 표지 항체 경쟁적 면역검정 방법을 포함한 경쟁적 면역검정 방법이 포함된다. 상기 모든 면역검정 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어 문헌 [Salgame et al, 1997] 및 [van Nieuwenhuijze et al, 2003]을 참조한다.
한 실시양태에서, 상기 생물학적 샘플은 체액을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 시험될 수 있는 생물학적 샘플에는 뇌척수액 (CSF), 전혈, 혈액 혈청, 혈장, 월경액, 자궁내막액, 소변, 타액, 또는 기타 체액 (대변, 눈물액, 윤활막액, 가래), 예컨대 압축된 호흡으로서의 호흡, 또는 이들로부터의 추출물 또는 정제물, 또는 이들의 희석물이 포함된다. 생물학적 샘플에는 또한 살아 있는 대상체에서 유래하거나 사후에 채취된 시편이 포함된다. 샘플은 예를 들어 적절하게 희석 또는 농축된 후 일상적인 방식으로 저장되는 경우에 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다수의 횟수로 반복된다. 이와 같은 실시양태는 검출 결과가 장기간에 걸쳐 모니터링되는 것을 가능케 하는 장점을 제공한다. 그와 같은 설계는 질환 상태 치료의 효능을 모니터링 또는 평가하는 이익을 제공하게 된다. 그와 같은 본 발명의 모니터링 방법은 발병, 진행, 안정화, 개선, 재발 및/또는 경감을 모니터링하는 데에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 해당 대상체로부터의 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커를 검출 및/또는 정량하는 것을 포함하는, 해당 질환을 가지고 있는 것으로 의심되는 대상체에서의 질환 상태에 대한 요법의 효능을 모니터링하는 방법도 제공한다. 모니터링 방법에서, 시험 샘플은 2회 이상의 횟수로 채취될 수 있다. 상기 방법은 추가적으로 시험 샘플에 존재하는 바이오마커(들)의 농도를 1종 이상의 대조(들), 및/또는 예컨대 요법의 시작 전에 동일한 시험 대상체로부터 및/또는 요법의 초기 단계에 동일한 시험 대상체로부터 초기에 채취된 1종 이상의 이전 시험 샘플(들)과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 상이한 시점에 채취된 시험 샘플에서의 바이오마커(들)의 특성 또는 양의 변화를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 측면에서는, 하기를 포함하는, 인간 또는 동물 대상체에서의 질환 상태에 대한 요법의 효능을 모니터링하는 방법이 제공된다:
(a) 본원에서 정의되는 바와 같은 바이오마커의 양을 정량하는 단계; 및
(b) 시험 샘플에서의 상기 바이오마커의 양을 1종 이상의 대조(들), 및/또는 동일한 시험 대상체로부터 초기 시점에 채취된 1종 이상의 이전 시험 샘플(들)에 존재하는 양과 비교하는 단계.
동일한 시험 대상체로부터 초기에 채취된 이전 시험 샘플에서의 농도에 대비한 시험 샘플에서의 바이오마커 농도의 변화는 장애 또는 장애 의증에 대한 해당 요법의 유익한 효과, 예컨대 안정화 또는 개선을 표시하는 것일 수 있다. 또한, 치료가 완료되고 나면, 본 발명의 방법은 질환의 재발을 모니터링하기 위하여 주기적으로 반복될 수 있다.
요법의 효능을 모니터링하는 방법은 인간 대상체 및 비-인간 동물 (예컨대 동물 모델)에서 기존 요법 및 새로운 요법의 치료 효과성을 모니터링하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 모니터링 방법은 새로운 약물 물질 및 물질 조합에 대한 스크리닝에 통합될 수 있다.
추가적인 실시양태에서는, 요법이 빠르게 작용하는 것으로 인한 더 빠른 변화의 모니터링이 수시간 또는 수일의 더 짧은 간격으로 수행될 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서는, 질환 상태의 존재를 검출하기 위한 바이오마커를 식별하는 방법이 제공된다. 본원에서 사용될 때의 "식별하는 것"이라는 용어는 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커의 존재를 확인하는 것을 의미한다. 샘플에 존재하는 바이오마커의 양을 정량하는 것에는 샘플에 존재하는 바이오마커의 농도를 측정하는 것이 포함될 수 있다. 식별하는 것 및/또는 정량하는 것은 샘플에서 직접적으로, 또는 그로부터의 추출물 또는 그의 희석물에서 간접적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 대안적인 측면에서는, 바이오마커에 특이적인 결합을 할 수 있으며, 바이오마커에 반응하여 대상체의 신체에 의해 생성되고, 그에 따라 질환 상태에 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플에 존재하는 항체 또는 그의 단편을 검출 및/또는 정량하는 것에 의해, 바이오마커의 존재가 평가된다.
식별하는 것 및/또는 정량하는 것은 대상체로부터의 생물학적 샘플, 생물학적 샘플의 정제물 또는 추출물, 또는 이들의 희석물에서의 특정 단백질의 존재 및/또는 양을 식별하는 데에 적합한 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 정량하는 것은 샘플 또는 샘플들에서의 바이오마커의 농도를 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서 시험될 수 있는 생물학적 샘플에는 전기에서 정의된 바와 같은 것들이 포함된다. 샘플은 예를 들어 적절하게 희석 또는 농축된 후 일상적인 방식으로 저장되는 경우에 제조될 수 있다.
바이오마커의 식별 및/또는 정량은 바이오마커 또는 그의 단편, 예컨대 C-말단 감축 또는 N-말단 감축이 있는 단편의 검출에 의해 수행될 수 있다. 단편은 적합하게는 길이가 4개 아미노산을 초과하는데, 예를 들어 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산이다. 구체적으로, 히스톤 미부의 것과 동일하거나 관련된 서열을 가지는 펩티드는 특히 유용한 히스톤 단백질의 단편인 것으로 알려져 있다.
바이오마커는 예를 들어 SELDI 또는 MALDI-TOF에 의해 직접적으로 검출될 수 있다. 다르게는, 바이오마커는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 바이오마커-결합 단편, 또는 기타 펩티드 또는 리간드, 예컨대 압타머, 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 리간드 또는 리간드들과의 상호작용을 통하여 직간접적으로 검출될 수 있다. 상기 리간드 또는 결합제는 검출가능한 표지, 예컨대 발광, 형광 또는 방사성 표지, 및/또는 친화성 태그를 보유할 수 있다.
예를 들어, 검출하는 것 및/또는 정량하는 것은 하기로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 방법(들)에 의해 수행될 수 있다: SELDI(-TOF), MALDI(-TOF), 1-D 겔-기반 분석, 2-D 겔-기반 분석, 질량 분광법 (MS), 역상 (RP) LC, 크기 투과 (겔 여과), 이온 교환, 친화성, HPLC, UPLC 및 기타 LC 또는 LC MS-기반 기술들. 적절한 LC MS 기술에는 ICAT® (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아 소재), 또는 iTRAQ® (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아 소재)가 포함된다. 액체 크로마토그래피 (예컨대 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 저압 액체 크로마토그래피 (LPLC)), 박층 크로마토그래피, NMR (핵 자기 공명) 분광법 역시 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 진단 또는 모니터링 방법은 SELDI TOF 또는 MALDI TOF에 의해 샘플을 분석함으로써 바이오마커의 존재 또는 농도를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임상적 스크리닝, 예후, 요법 결과의 모니터링, 특정 치료적 치료에 반응할 가능성이 가장 큰 대상체의 식별, 약물 스크리닝 및 개발, 그리고 약물 치료를 위한 새로운 표적의 식별에도 적합하다.
분석물 바이오마커를 식별 및/또는 정량하는 것은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 수반하는 면역학적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 면역학적 방법에는 분석물 바이오마커 상의 상이한 에피토프를 인식하는 2종의 항체를 사용하여 분석물 바이오마커의 검출이 수행되는 샌드위치 면역검정 예컨대 샌드위치 ELISA; 방사성면역검정 (RIA), 직접, 간접 또는 경쟁적 효소 연관 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 형광 면역검정 (FIA), 웨스턴 블롯팅, 면역침전 및 소정의 입자-기반 면역검정 (예컨대 금, 은, 또는 라텍스입자, 자성 입자, 또는 Q-점(dot) 사용)이 포함된다. 면역학적 방법은 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 또는 스트립 포맷으로 수행될 수 있다.
한 실시양태에서는, 1종 이상의 바이오마커가 생물학적 경로 중 바이오마커의 상류 또는 하류에서 발견되는 분자 또는 분자의 측정가능한 단편으로 대체될 수 있다.
질환에 특이적인 핵심 바이오마커의 식별은 진단 절차 및 치료 요법의 통합에 중요하다. 예보용 바이오마커를 사용하면, 바이오센서와 같은 적절한 진단 도구가 개발될 수 있는데; 이에 따라 본 발명의 방법 및 용도에서, 식별하는 것 및 정량하는 것은 바이오센서, 미세분석 시스템, 미세조작 시스템, 미세분리 시스템, 면역크로마토그래피 시스템 또는 기타 적합한 분석 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 바이오센서는 바이오마커(들)의 검출을 위한 면역학적 방법, 전기, 열, 자성, 광학 (예컨대 홀로그램) 또는 음향 기술들을 통합할 수 있다. 그와 같은 바이오센서를 사용하면, 생물학적 샘플에서 발견되는 예상 농도의 표적 바이오마커(들)를 검출하는 것이 가능하다.
본원에서 사용될 때, "바이오센서"라는 용어는 바이오마커의 존재를 검출할 수 있는 무언가를 의미한다. 바이오센서의 예는 본원에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 바이오센서는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 본원에서 기술되는 바와 같은 리간드 결합제 또는 리간드를 포함할 수 있다. 그와 같은 바이오센서는 본 발명의 바이오마커를 검출 및/또는 정량하는 데에 유용하다.
본 발명의 바이오마커(들)는 "스마트" 홀로그램 또는 고주파 음향 시스템을 기반으로 하는 바이오센서 통합 기술을 사용하여 검출될 수 있는데, 그와 같은 시스템들은 "바 코드" 또는 어레이 배열구조에 특히 적합하다.
스마트 홀로그램 센서 (스마트 홀로그램즈 리미티드(Smart Holograms Ltd), 영국 캠브리지 소재)에서는, 바이오마커와 특이적으로 반응하도록 민감화되어 있는 얇은 중합체 필름에 홀로그래프 영상이 저장된다. 노출시, 바이오마커는 중합체와 반응함으로써 홀로그램에 의해 디스플레이되는 영상의 변경을 초래한다. 시험 결과 판독치는 광학적 밝기, 영상, 색상 및/또는 형상의 위치가 변화될 수 있다. 정성 및 반-정량 적용분야의 경우, 센서 홀로그램은 눈에 의해 판독됨으로써 검출 장비에 대한 필요성이 제거될 수 있다. 단순 색상 센서는 정량 측정치가 요구되는 신호를 판독하는 데에 사용될 수 있다. 샘플의 불투명도 또는 색상이 센서의 작동을 방해하지는 않는다. 센서의 포맷은 수종 물질의 동시 검출을 위한 다중화를 가능케 한다. 상이한 요건들을 충족하도록 가역 센서 및 비가역 센서가 설계될 수 있으며, 특정 대상 바이오마커의 연속 모니터링이 실행가능하다.
적합하게는, 1종 이상의 본 발명 바이오마커의 검출을 위한 바이오센서는 생체분자 인식을 샘플에서의 바이오마커의 존재 검출 또는 정량을 신호로 전환하는 적절한 수단과 조합한다. 바이오센서는 예컨대 병동, 외래대상체 구획, 수술, 가정, 야외 및 작업장에서의 "대체 장소" 진단 시험용으로 변경될 수 있다.
1종 이상의 본 발명 바이오마커를 검출하기 위한 바이오센서에는 음향, 플라스몬 공명, 홀로그래프, 생체-층 간섭법 (BLI) 및 미세조작 센서가 포함된다. 각인 인식 요소(imprinted recognition element), 박막 트랜지스터 기술, 자성 음향 공명기 장치 및 기타 신규 음향-전기 시스템들이 1종 이상의 본 발명 바이오마커의 검출을 위한 바이오센서에 사용될 수 있다.
1종 이상의 본 발명 바이오마커의 검출 및/또는 정량을 포함하는 방법은 벤치-탑(bench-top) 기기에서 수행될 수 있거나 비-실험실 환경, 예컨대 의사의 사무실 또는 대상체의 침상에서 사용될 수 있는 일회용 진단 또는 모니터링 플랫폼 상에 통합될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하는 데에 적합한 바이오센서에는 광학 또는 음향 판독기가 구비된 "크레딧" 카드가 포함된다. 바이오센서는 수집된 데이터가 해석을 위하여 의사에게 전자적으로 전송되는 것을 가능케 하도록 구성될 수 있으며, 그에 따라 e-의료를 위한 기반을 형성할 수 있다.
질환 상태 존재의 진단 및 모니터링을 위한 진단용 키트가 본원에서 기술된다. 한 실시양태에서, 상기 키트는 추가적으로 바이오마커를 식별 및/또는 정량할 수 있는 바이오센서를 포함한다. 적합하게는, 본 발명에 따른 키트는 임의로 본원에서 정의되는 방법들 중 어느 것에 따른 키트의 사용 지침서와 함께, 하기의 군에서 선택되는 1종 이상의 구성요소를 포함할 수 있다: 바이오마커 또는 바이오마커의 구조/형상 모방체에 특이적인 리간드 결합제 또는 리간드, 1종 이상의 대조, 1종 이상의 시약 및 1종 이상의 소모품.
질환 상태에 대한 바이오마커의 식별은 진단 절차와 치료 요법의 통합을 가능케 한다. 본 발명 바이오마커의 검출은 임상 시험에서의 그의 참여 전에 대상체를 스크리닝하는 데에 사용될 수 있다. 상기 바이오마커는 치료 반응, 반응 실패, 바람직하지 않은 부작용 프로파일, 약제 순응도, 및 적정한 혈청 약물 농도의 달성을 표시하기 위한 수단을 제공한다. 바이오마커는 부정적인 약물 반응의 경고를 제공하는 데에도 사용될 수 있다. 바이오마커는 개인화된 요법의 개발에 유용한데, 투약량을 미세조정하고, 처방되는 약제의 수를 최소화하며, 효과적인 요법 달성 지연을 감소시키고, 부정적인 약물 반응을 회피하는 데에 반응의 평가가 사용될 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 바이오마커를 모니터링하는 것에 의해, 대상체의 장애 및 약리유전학 프로파일에 의해 결정되는 요구에 맞도록 대상체 관리가 정밀하게 설계될 수 있으며, 이에 따라 바이오마커는 최적 투여량을 적정하고, 긍정적인 치료 반응을 예상하며, 중증 부작용의 위험성이 높은 대상체를 식별하는 데에 사용될 수 있다.
바이오마커-기반 시험은 '신규' 대상체의 제1선 평가를 제공하며, 현행 수단들을 사용해서는 달성가능하지 않은 정확하고 빠른 진단을 위한 객관적인 수단을 제공한다.
또한, 진단용 바이오마커 시험은 경증 또는 무증상 질환을 가지고 있거나 증상 질환을 발병할 위험성이 높을 수 있는 가족 구성원 또는 대상체를 식별하는 데에 유용하다. 이는 적절한 요법, 또는 예방적 수단, 예컨대 위험 인자 관리의 개시를 가능케 한다. 이러한 접근법은 결과를 개선할 것으로 생각되며, 현성의 장애 발병을 예방할 수 있다.
바이오마커 모니터링 방법, 바이오센서 및 키트 역시 대상체 모니터링 도구로서 의사가 장애의 악화로 인하여 재발이 임박하였는지를 결정하는 것을 가능케 하는 데에 중요하다. 약리학적 치료가 부적당한 것으로 평가되는 경우라면, 요법이 복귀 또는 증가될 수 있으며; 경우에 따라서는 요법의 변화가 제공될 수 있다. 바이오마커는 장애의 상태에 민감하기 때문에, 그것은 약물 요법의 영향에 대한 지표를 제공한다.
지금부터, 하기의 비-제한적인 실시예를 참조하여 본 발명이 예시될 것이다.
실시예 1
5명의 건강한 대상체, 3명의 결장암에 걸린 대상체, 6명의 폐암에 걸린 대상체 및 2명의 췌장암에 걸린 대상체로부터 혈청 샘플을 채취하였다. 헬라 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 생성되었으며 안정성을 위하여 뉴클레오솜 내의 DNA 및 단백질들이 가교-결합된 시중에서 구입가능한 뉴클레오솜 제제를 말 혈청에 연속 희석하였다. 인간 혈액의 뉴클레오솜 제제는 홀덴리에더 (*문헌 [Holdenrieder et al; 2001])의 방법에 따라 제조하였다. 본 발명의 방법에 의해, 이들 샘플 및 제제를 뉴클레오솜-EZH2 부가물에 대하여 2반복으로 검정하였다. 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜 부가물을 함유하지 않는 음성 대조 샘플로서, 조직 배양 용도로 제조된 순수한 시중에서 구입가능한 말 혈청도 검정하였다.
ELISA 방법은 하기와 같이 무손상 뉴클레오솜에 결합하는 고체 상 항-히스톤 포획 항체, 및 비오티닐화된 모노클로날 항-EZH2 검출 항체를 사용하였다: pH7.4의 0.1 M 포스페이트 완충제 중 항-히스톤 항체의 용액을 마이크로타이터 웰 (100 μL/웰)에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여, 포획 항체로 웰을 코팅하였다. 과량의 항-히스톤 항체를 따라내었다. 소 혈청 알부민 (20 g/L)의 용액을 웰에 첨가하고 (200 μL/웰), 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여, 웰 상의 과량의 단백질 결합 부위를 차단하였다. 과량의 소 혈청 알부민 용액을 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰, 1% 트윈 20을 함유하는 pH7.5의 0.05 M 트리스(TRIS)/HCl 완충제)를 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 혈청 샘플 (10 μL/웰) 및 검정 완충제 (50 μL/웰, 0.9% NaCl, 0.05% 나트륨 데옥시콜레이트 및 1% 노니데트(Nonidet) P40 대체물을 함유하는 pH7.5의 0.05 M 트리스/HCl)를 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 혈청 및 검정 완충제 혼합물을 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰)를 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 비오티닐화 항-EZH2 검출 항체의 용액을 첨가하고 (50 μL/웰), 약하게 교반하면서 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 과량의 검출 항체를 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰)를 사용하여 웰을 다시 3회 세척하였다. 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체를 함유하는 용액을 첨가하고 (50 μL/웰), 약하게 교반하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 과량의 접합체를 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰)를 사용하여 웰을 다시 3회 세척하였다. 착색된 기질 용액 (100 μL/웰, 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄염)을 첨가하고, 약하게 교반하면서 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 표준 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm의 파장에서 웰의 광학 밀도 (OD)를 측정하였다. 뉴클레오솜-EZH2 부가물 수준 증가에 따른 색상 증가의 투여량 반응 곡선이 관찰되었는데, 뉴클레오솜 부가물 부재하에서는 (말 혈청) 낮은 바탕 신호가 관찰되었다. (i) 포획 항체는 샘플 중 히스톤에 결합하고, (ii) 검출 항체는 부가물의 EZH2 성분에 결합하므로, 양성 ELISA 신호는 ELISA에 의해 검출된 EZH2가 히스톤 단백질 및 EZH2 모두를 포함하는 뉴클레오솜-EZH2 부가물 내에 통합되어 있다는 것을 나타낸다. 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
실시예 2
5명의 건강한 대상체, 3명의 결장암에 걸린 대상체, 6명의 폐암에 걸린 대상체 및 2명의 췌장암에 걸린 대상체로부터 혈청 샘플을 채취하였다. 헬라 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 생성된 시중에서 구입가능한 뉴클레오솜 제제를 말 혈청에 연속 희석하였다. 인간 혈액의 뉴클레오솜 제제는 홀덴리에더 (*문헌 [Holdenrieder et al; 2001])의 방법에 따라 제조하였다. 본 발명의 방법에 의해, 이들 샘플 및 제제를 뉴클레오솜-HMGB1 부가물에 대하여 2반복으로 검정하였다. 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜 부가물을 함유하지 않는 음성 대조 샘플로서, 순수 말 혈청도 검정하였다.
ELISA 방법은 하기와 같이 무손상 뉴클레오솜에 결합하는 고체 상 항-히스톤 포획 항체, 및 비오티닐화된 모노클로날 항-HMGB1 검출 항체를 사용하였다: pH7.4의 0.1 M 포스페이트 완충제 중 항-히스톤 항체의 용액을 마이크로타이터 웰 (100 μL/웰)에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여, 포획 항체로 웰을 코팅하였다. 과량의 항-히스톤 항체를 따라내었다. 소 혈청 알부민 (20 g/L)의 용액을 웰에 첨가하고 (200 μL/웰), 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여, 웰 상의 과량의 단백질 결합 부위를 차단하였다. 과량의 소 혈청 알부민 용액을 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰, 1% 트윈 20을 함유하는 pH7.5의 0.05 M 트리스/HCl 완충제)를 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 혈청 샘플 (10 μL/웰) 및 검정 완충제 (50 μL/웰, 0.9% NaCl, 0.05% 나트륨 데옥시콜레이트 및 1% 노니데트 P40 대체물을 함유하는 pH7.5의 0.05 M 트리스/HCl)를 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 혈청 및 검정 완충제 혼합물을 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰)를 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 비오티닐화 항-HMGB1 검출 항체의 용액을 첨가하고 (50 μL/웰), 약하게 교반하면서 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 과량의 검출 항체를 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰)를 사용하여 웰을 다시 3회 세척하였다. 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합체를 함유하는 용액을 첨가하고 (50 μL/웰), 약하게 교반하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 과량의 접합체를 따라내고, 세척 완충제 (200 μL/웰)를 사용하여 웰을 다시 3회 세척하였다. 착색된 기질 용액 (100 μL/웰, 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄염)을 첨가하고, 약하게 교반하면서 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 표준 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm의 파장에서 웰의 광학 밀도 (OD)를 측정하였다. 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 수준 증가에 따른 색상 증가의 투여량 반응 곡선이 관찰되었는데, 뉴클레오솜 부가물 부재하에서는 (말 혈청) 낮은 바탕 신호가 관찰되었다. (i) 포획 항체는 샘플 중 히스톤에 결합하고, (ii) 검출 항체는 부가물의 HMGB1 성분에 결합하므로, 양성 ELISA 신호는 ELISA에 의해 검출된 HMGB1이 히스톤 단백질 및 HMGB1 모두를 포함하는 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 내에 통합되어 있다는 것을 나타낸다. 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
더 대형 실험으로써, 25명의 결장암에 걸린 환자, 25명의 유방암에 걸린 환자 및 24명의 폐암에 걸린 환자는 물론, 31명의 건강한 대상체로부터 혈청 샘플을 채취하였다. 상기 샘플들을 뉴클레오솜-HMGB1 농도에 대하여 시험하고, 건강 평균 결과 더하기 평균의 표준 편차 2를 컷-오프로 사용하여, 결장암, 유방암 및 폐암에 대하여 하기의 결과들을 수득하였는데:
* 결장암: 76%의 암이 검출되었으며 (25명의 환자 중 19명), 특이성 90% (31명의 건강 샘플 중 3명의 가양성);
* 유방암: 96%의 암이 검출되었으며 (25명의 환자 중 24명), 특이성 90% (31명의 건강 샘플 중 3명의 가양성); 및
* 폐암: 100%의 암이 검출되었으며 (24명의 환자 중 24명), 특이성 86% (28명의 건강 샘플 중 4명의 가양성);
여기서 컷-오프 수준을 초과하는 측정 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 수준은 양성 결과로 간주되며, 더 낮은 농도는 음성 결과로 간주된다. 결과를 도 5에 나타내었다.
항-HMGB1 항체가 포획 항체로서 웰에 코팅되고 항-뉴클레오솜 항체가 비오티닐화되어 검출 항체로 사용된 역 포맷으로도 뉴클레오솜-HMGB1 부가물 수준에 대한 검정을 수행하였다. 이와 같은 검정 포맷 역시 사용된 양성 대조에서는 뉴클레오솜-HMGB1 부가물을 성공적으로 검출하였으나 (OD405nm = 1.15), 말 혈청 또는 완충제에서는 그렇지 않았다 (모두 OD406nm = 0.13).
실시예 3
사용된 비오티닐화 항체가 프로게스테론 수용체 (PR)에 결합하도록 유도되었다는 것 이외에는 상기 실시예 1의 방법을 사용하여, 뉴클레오솜-PR ELISA 검정을 수행하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 4
사용된 비오티닐화 항체가 안드로겐 수용체 (AR)에 결합하도록 유도되었다는 것 이외에는 상기 실시예 1의 방법을 사용하여 수행된 뉴클레오솜-AR 부가물 ELISA 검정을 사용하여, 2명의 전립선암 환자로부터 채취된 혈청 샘플은 물론, 양성 및 음성 대조를 검정하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
실시예 5
사용된 비오티닐화 항체가 에스트로겐 수용체의 알파 형태 (ERα)에 결합하도록 유도되었다는 것 이외에는 상기 실시예 1의 방법에 의해, *문헌 [Holdenrieder et al; 2001]의 방법에 의해 제조된 뉴클레오솜 샘플을 사용하여, 뉴클레오솜-ERα 부가물 ELISA 검정을 수행하였다. 결과를 도 8에 나타내었다.
실시예 6
MCF7 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 뉴클레오솜 샘플을 제조하고, ELISA에 의해 뉴클레오솜-ERβ 부가물에 대하여 검정하였다. 검정이 다른 항-뉴클레오솜 항체, 및 에스트로겐 수용체의 베타 형태 (ERβ)에 결합하도록 유도된 항체를 사용하여 수행되었다는 것 이외에는 상기 실시예 1의 것과 유사한 방법에 의해 검정을 수행하였다. 검정은 2종의 상이한 포맷으로 수행되었다. 첫 번째 포맷에서는, 항-뉴클레오솜 항체를 웰 상에 코팅하고, 항-ERβ 항체를 비오티닐화하였다. 두 번째 포맷에서는, 항-ERβ 항체를 웰 상에 코팅하고, 항-뉴클레오솜 항체를 비오티닐화하였다. 모든 포맷에서 검정은 성공적이었다. 흥미롭게도, ChIP 방법에서 종종 그러하듯이 MCF7 염색질을 가교-결합시키는 경우, 검정이 덜 우수하게 수행되는 것으로 보였다. 결과를 도 9에 나타내었다.
실시예 7
H2AZ를 함유하는 뉴클레오솜-ERβ 부가물의 하위세트만이 검출되도록, 사용된 비오티닐화 항체가 히스톤 변이체 H2AZ에 결합하도록 유도되었다는 것 이외에는 항-ERβ 항체가 웰 상에 코팅되었던 상기 실시예 6의 방법에 의해, 그리고 *문헌 [Holdenrieder et al; 2001]의 방법에 의해 제조된 뉴클레오솜 샘플을 사용하여, 뉴클레오솜 H2AZ-ERβ 부가물 ELISA 검정을 수행하였다. 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜 성분 결합제가 특정 후성적 신호 구조에 결합하도록 유도되는 이와 같은 방법을 사용하면, 그 후성적 신호만을 함유하는 특정 뉴클레오솜 부가물 하위세트를 검출하는 것이 가능하다. 결과를 도 10에 나타내었다.
실시예 8
12명의 건강한 대상체, 3명의 결장암에 걸린 대상체, 6명의 유방암에 걸린 대상체, 3명의 폐암에 걸린 대상체 및 4명의 췌장암에 걸린 대상체로부터 혈청 샘플을 채취하였다. 홀덴리에더 (*문헌 [Holdenrieder et al; 2001])의 방법에 따라 인간 혈액의 뉴클레오솜 제제를 제조하고, 말 혈청에 연속 희석하였다. 본 발명의 방법에 의해, 이들 샘플 및 제제를 뉴클레오솜-ERβ 부가물에 대하여 2반복으로 검정하였다. 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜 부가물을 함유하지 않는 음성 대조 샘플로서, 조직 배양 용도로 제조된 순수한 시중에서 구입가능한 말 혈청도 검정하였다. 검정은 사용된 검출 항체가 에스트로겐 수용체 (ERβ)에 대하여 유도되었다는 것 이외에는 상기 실시예 1의 방법을 사용하여 수행하였다. 건강 평균 결과 더하기 평균의 표준 편차 2로 계산된 컷-오프를 사용하였을 때; 3명의 결장암 샘플 중 2명, 6명의 유방암 샘플 중 3명, 3명의 폐암 샘플 중 2명 및 4명의 췌장암 샘플 중 4명이 뉴클레오솜-ERβ 부가물에 대하여 양성인 것으로 밝혀졌다. 결과를 도 11에 나타내었다.
실시예 9
사용된 검출 항체가 스테로이드 에스트로겐에 대하여 유도되었다는 것 이외에는 상기 실시예 6의 방법을 사용하여, 뉴클레오솜-에스트로겐 수용체-스테로이드 에스트로겐 ELISA 검정을 수행하였다. 따라서, 이와 같은 검정은 스테로이드 호르몬을 추가적으로 함유하는 뉴클레오솜-에스트로겐 수용체 부가물만을 검출하였다.
실시예 10
유기 용매에 대하여 내성인 마이크로타이터 플레이트 또는 튜브에서 검정이 수행되고, 웰 표면 상에서의 뉴클레오솜-에스트로겐 수용체 부가물의 항-뉴클레오솜 항체 포획 후, 웰의 액체 내용물을 따라내고, 포획된 부가물에 존재하는 소정의 스테로이드를 용해시키기 위하여 디에틸에테르를 첨가한다는 것 이외에는 상기 실시예의 것과 유사한 방법을 사용하여, 뉴클레오솜-에스트로겐 수용체-에스트로겐 부가물 ELISA 검정을 수행한다. 상기 에테르를 또 다른 웰 또는 튜브로 옮긴 후 건조시킨다. 건조된 추출물을 검정 완충제에 재용해시키고, 에스트로겐 분석을 위하여 고전적인 경쟁적 면역검정 방법을 사용하여 에스트로겐 농도를 측정한다. 따라서, 이와 같은 검정은 에스트로겐을 추가적으로 함유하는 뉴클레오솜-에스트로겐 수용체 부가물만을 검출한다.
실시예 11
사용된 스테로이드 경쟁적 면역검정이 레티노산에 대하여 유도되었다는 것 이외에는 상기 실시예 10의 방법을 사용하여, 뉴클레오솜-레티노산 수용체-레티노산 ELISA 검정을 수행하였다. 따라서, 이와 같은 검정은 스테로이드 레티노산을 추가적으로 함유하는 뉴클레오솜-레티노산 수용체 부가물만을 검출한다.
실시예 12
사용된 고체 상 코팅 항체가 5-메틸시티딘에 대하여 유도되었다는 것 이외에는 실시예 1-10에서 기술된 것과 유사한 뉴클레오솜 부가물 검정을 수행하였다. 따라서, 이러한 검정은 메틸화된 DNA와 추가적으로 결합된 뉴클레오솜-호르몬 수용체 부가물 및 뉴클레오솜-호르몬 수용체-호르몬 복합체 부가물만을 검출한다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002

Claims (31)

  1. 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 진단을 위한 혈중 바이오마커로서의 뉴클레오솜-단백질 부가물의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 바이오마커가 암의 진단에 사용되는 것인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레오솜-단백질 부가물이 염색질 변형 효소, 핵 수용체 또는 호르몬을 포함하는 것인 용도.
  4. 제2항에 있어서, 뉴클레오솜-단백질 부가물이 고도 운동성 군 단백질을 포함하는 것인 용도.
  5. 제3항에 있어서, 염색질 변형 효소가 히스톤 아세틸화, 탈아세틸화, 메틸화, 탈메틸화, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화, 탈유비퀴틴화, 수모일화, 탈수모일화 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제 효소인 용도.
  6. 제3항에 있어서, 핵 수용체가 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 글루코코르티코이드 수용체 또는 레티노산 수용체인 용도.
  7. 제3항에 있어서, 호르몬이 갑상선 호르몬, 글루코코르티코이드 호르몬, 또는 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스토겐, 코르티코스테로이드 또는 레티노산을 포함한 스테로이드 호르몬인 용도.
  8. (i) 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
    (ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
    (iii) 샘플 중 부가 단백질에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량하는 단계; 및
    (iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계
    를 포함하는, 샘플 중 뉴클레오솜-단백질 부가물의 존재를 검출하는 방법.
  9. (i) 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 단백질에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
    (ii) 상기 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
    (iii) 샘플 중 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량하는 단계; 및
    (iv) 그와 같은 결합의 존재 또는 정도를 샘플 중 뉴클레오솜 부가물 존재의 척도로서 사용하는 단계
    를 포함하는, 샘플 중 뉴클레오솜 부가물의 존재를 검출하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 뉴클레오솜 부가물이 전염증성 단백질, 고도 운동성 군 단백질, 폴리콤 단백질, 염색질 변형 효소, 핵 수용체 또는 호르몬을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 고도 운동성 군 단백질이 HMGB1인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 염색질 변형 효소가 EZH2인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 호르몬 수용체가 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 갑상선 호르몬 수용체 또는 레티노산 수용체인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 호르몬이 갑상선 호르몬, 글루코코르티코이드 호르몬, 또는 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스토겐 또는 레티노산을 포함한 스테로이드 호르몬인 방법.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜 성분 결합제가 특정 후성적 신호 구조에 결합하도록 유도됨으로써, 상기 후성적 신호 구조를 함유하는 특정 뉴클레오솜 부가물 하위세트만이 검출되는 것인 방법.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 항체, 항체 단편 또는 압타머인 방법.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 생물학적 유체인 방법.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액 또는 혈청 또는 혈장인 방법.
  19. (i) 세포로부터 염색질을 단리하는 단계;
    (ii) 염색질을 소화시키거나, 초음파처리하거나, 또는 다르게 분해하여, 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 형성시키는 단계; 및
    (iii) 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 정의되어 있는 바와 같이 뉴클레오솜 부가물의 존재를 검출 또는 측정하는 단계
    를 포함하는, 세포에서 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의되어 있는 바와 같이 뉴클레오솜-단백질 부가물의 존재를 검출하는 방법.
  20. (i) 제8항 또는 제9항의 방법 중 어느 하나에 정의되어 있는 바와 같이 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
    (ii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준을 대상체의 질환 상태를 식별하는 데에 사용하는 단계
    를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출 또는 진단하는 방법.
  21. (i) 제8항 또는 제9항의 방법 중 어느 하나에 정의되어 있는 바와 같이 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
    (ii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준을 대상체에 적합한 치료의 선택을 위한 파라미터로서 사용하는 단계
    를 포함하는, 의학적 치료에 대한 적합성에 대하여 동물 또는 인간 대상체를 평가하는 방법.
  22. (i) 제8항 또는 제9항의 방법 중 어느 하나에 정의되어 있는 바와 같이 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계;
    (ii) 1회 이상의 횟수로 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물의 검출 또는 측정을 반복하는 단계; 및
    (iii) 검출된 뉴클레오솜 부가물 수준의 임의의 변화를 대상체 상태의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계
    를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오솜 부가물이 측정 패널들 중 하나로서 검출 또는 측정되는 것인 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 암, 양성 종양, 염증성 질환, 자가면역 질환, 자궁내막증, 감염성 질환, 패혈증, 졸중 또는 심근 경색에 실제로 걸려 있거나 그것이 의심되는 대상체에서 사용하기 위한 방법.
  25. 제8항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물을 검출하는 데에 사용하기 위한 방법.
  26. 제25항에 있어서, 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물이 티록신-갑상선 호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물, 트리아이오도티로닌-갑상선 호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물, 레티노산-레티노산 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물, 안드로겐-안드로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물 또는 에스트로겐-에스트로겐 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물을 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 호르몬에 결합하도록 유도된 항체 또는 다른 결합제를 포함하는 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 항체 포획된 호르몬-호르몬 수용체-뉴클레오솜 복합체 부가물로부터 호르몬을 추출하는 단계 및 이후 정량화 단계를 포함하는 방법.
  29. (i) 제8항 또는 제9항의 방법 중 어느 하나에 정의되어 있는 바와 같이 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계;
    (ii) 건강한 대상체 또는 대조 대상체의 체액에서 뉴클레오솜 부가물을 검출 또는 측정하는 단계; 및
    (iii) 질환에 걸린 대상체와 대조 대상체에서 검출된 수준 사이의 차이를 사용하여, 뉴클레오솜 부가물이 질환 상태에 대한 바이오마커로서 유용한지 여부를 식별하는 단계
    를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출 또는 진단하기 위한 뉴클레오솜 부가물 바이오마커를 식별하는 방법.
  30. 제29항에 정의된 방법에 의해 식별되는 바이오마커.
  31. 뉴클레오솜 부가물 검출용 키트로서, 부가물 중 단백질 또는 그의 성분 부분에 특이적인 리간드 또는 결합제, 또는 부가물 중 단백질 또는 그의 성분 부분의 구조/형상 모방체, 및 이와 함께 제3항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 따른 키트의 사용 지침서를 포함하는 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190013707A (ko) * 2016-03-22 2019-02-11 벨지언 볼리션 에스피알엘 암 검출을 위한 뉴클레오솜-전사 인자 복합체의 용도

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201115095D0 (en) * 2011-09-01 2011-10-19 Singapore Volition Pte Ltd Method for detecting nucleosomes containing nucleotides
PL2788767T3 (pl) 2011-12-07 2018-03-30 Belgian Volition Sprl Sposób wykrywania adduktów nukleosomowych
EP4155401A1 (en) 2012-03-02 2023-03-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
GB201303576D0 (en) * 2013-02-28 2013-04-10 Singapore Volition Pte Ltd Method for predicting therapy efficacy using nucleosome structure biomarkers
EP2971100A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
US11365447B2 (en) 2014-03-13 2022-06-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2015168483A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Expression Pathology, Inc. Srm/mrm assay for the androgen receptor (ar) protein
AU2015340378B2 (en) 2014-10-29 2021-08-12 Belgian Volition Sprl Method for the enrichment of circulating tumor DNA
GB201421933D0 (en) * 2014-12-10 2015-01-21 Singapore Volition Pte Ltd Method for a detection of hormone sensitive diease progression
GB201511512D0 (en) * 2015-07-01 2015-08-12 Singapore Volition Pte Ltd Use of cell-free nucleosomes as biomarkers
GB201511542D0 (en) * 2015-07-01 2015-08-12 Singapore Volition Pte Ltd Use of cell free nucleosomes as biomarkers
GB201518674D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Singapore Volition Pte Ltd Method for detecting nuleosomes containing histone modifications and variants
GB201518665D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Singapore Volition Pte Ltd Method for enrichment of cell free nucleosomes
GB201612815D0 (en) * 2016-07-25 2016-09-07 Belgian Volition Sa Novel combination test
CA3084620C (en) 2017-09-18 2024-06-18 Santersus Sa Method and device for purification of blood from circulating cell free dna
GB201721569D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Belgian Volition Sprl Method for the detection and treatment of colorectal adenomas
EP3765638A2 (en) * 2018-03-13 2021-01-20 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Diagnostic use of cell free dna chromatin immunoprecipitation
GB201818965D0 (en) 2018-11-21 2019-01-09 Belgian Volition Sprl Method for the detection of colorectal cancer
GB201818963D0 (en) 2018-11-21 2019-01-09 Belgian Volition Sprl Methof for the detection of prostate cancer
GB201906201D0 (en) 2019-05-02 2019-06-19 Belgian Voltion Sprl Method for the detection of protate cancer
GB201906199D0 (en) 2019-05-02 2019-06-19 Belgian Volition Sprl Method for the detection of cancer
KR20220111246A (ko) 2019-08-27 2022-08-09 벨지언 볼리션 에스알엘 순환 뉴클레오솜을 단리하는 방법
GB201912251D0 (en) 2019-08-27 2019-10-09 Belgian Volition Sprl Method of isolating circulating nucleosomes
KR20220110794A (ko) 2019-12-02 2022-08-09 벨지언 볼리션 에스알엘 바이오마커로서의 무세포 뉴클레오솜의 사용
JP2023520168A (ja) 2020-03-20 2023-05-16 ベルジアン ボリション エスアールエル 無細胞ヌクレオソームレベルを用いるトリアージ方法
CN111413497A (zh) * 2020-04-15 2020-07-14 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 组蛋白甲基转移酶ezh2在制备用于诊断脓毒症的生物标记物中的用途
US20230355851A1 (en) 2020-09-21 2023-11-09 Belgian Volition SRL (BE/BE) Device for inline monitoring of free nucleosomes in blood
TW202238131A (zh) 2020-11-25 2022-10-01 比利時商比利時意志有限公司 測量無細胞核蛋白染色質片段之方法
TW202238132A (zh) 2020-12-08 2022-10-01 比利時商比利時意志有限公司 多發性硬化症之診斷方法
TW202242130A (zh) 2020-12-29 2022-11-01 比利時商比利時意志有限公司 循環轉錄因子分析
TW202242145A (zh) 2020-12-29 2022-11-01 比利時商比利時意志有限公司 核小體耗盡循環無細胞染色質片段之轉錄因子結合位點分析
TW202242146A (zh) 2021-01-13 2022-11-01 比利時商比利時意志有限公司 肺癌的檢測方法
GB202108185D0 (en) 2021-06-08 2021-07-21 Belgian Volition Sprl Standardisation of nucleosome assays using biologically derived calibrants
GB202108452D0 (en) 2021-06-14 2021-07-28 Belgian Volition Sprl Triaging method using cell free nucleosome levels
WO2023073179A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Belgian Volition Srl Homogeneous immunoassay method
GB202117799D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Belgian Volition Srl Method for the detection of blood cancer
WO2023170298A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Belgian Volition Srl Differential diagnosis method
GB202205212D0 (en) 2022-04-08 2022-05-25 Belgian Volition Sprl Method for transplant organ health assessment
WO2024042208A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Belgian Volition Srl Method for the detection of dementia
WO2024042210A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Belgian Volition Srl Method for measuring cell free chromatin

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005019826A1 (en) * 2003-08-18 2005-03-03 Chroma Therapeutics Limited Detection of histone modification in cell-free nucleosomes
WO2005040814A1 (en) * 2003-10-14 2005-05-06 Cancer Research Technology Limited Methods and means of cancer detection by histone modification

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2652901A1 (fr) 1989-10-11 1991-04-12 Pasteur Institut Complexes biologiques a base de nucleosomes, et leurs applications, notamment dans le domaine du diagnostic in vitro du lupus erythemateux dissemine (led).
JP3517642B2 (ja) * 1998-03-18 2004-04-12 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー アポトーシス産物の検出
JP2001029077A (ja) * 1999-07-21 2001-02-06 Yoshihiro Koseki 新規ｍｉｔｅ様因子
NL1014106C2 (nl) 2000-01-18 2001-07-20 Univ Amsterdam Werkwijze voor het detecteren van een pathologische afwijking bij een cel, een antistof en een assay kit.
WO2007084253A2 (en) 2005-11-28 2007-07-26 Medimmune, Inc. High affinity antibodies against hmgb1 and methods of use thereof
RU2322264C1 (ru) * 2006-07-27 2008-04-20 Михаил Аркадьевич Шурдов Способ лечения заболеваний
WO2008122434A1 (en) * 2007-04-05 2008-10-16 Symbiotec Gesellschaft Zur Forschung Und Entwicklung Auf Dem Gebiet Der Biotechnologie Mbh Bis-met histones
CN104404068A (zh) 2008-11-21 2015-03-11 哥本哈根大学 免疫应答的引发
JP2012524278A (ja) * 2009-04-14 2012-10-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア がんの臨床診断および予後診断のためのヒストン修飾パターン
US20130183662A1 (en) 2010-04-22 2013-07-18 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Means and methods for identifying an increased risk of systemic lupus erythematosus (sle) patients for developing renal manifestations
FI20105715A0 (fi) 2010-06-18 2010-06-18 Helsingin Yliopisto Asetyloituun HMGB1:een sitoutuva polyklonaalinen vasta-aine
CN102147409B (zh) * 2010-12-31 2016-06-22 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 一种测定抗核小体抗体IgG的方法及试剂装置
EP2684604A4 (en) 2011-03-08 2014-12-31 Mitsubishi Plastics Inc CATALYST, ELEMENT FOR REMOVING STAIN OXIDE AND SYSTEM FOR REMOVING STAIN OXIDE
PL2788767T3 (pl) 2011-12-07 2018-03-30 Belgian Volition Sprl Sposób wykrywania adduktów nukleosomowych

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005019826A1 (en) * 2003-08-18 2005-03-03 Chroma Therapeutics Limited Detection of histone modification in cell-free nucleosomes
WO2005040814A1 (en) * 2003-10-14 2005-05-06 Cancer Research Technology Limited Methods and means of cancer detection by histone modification

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Daolin Tang et al, Biochim Biophys Acta (2010), 1799(1-2): 131, pp 1-22. *
Robert et al, Trends in Cell Biology (2006), vol 17, no 2, pp 72-79. *
V Urbonaviciute et al, Journal of Experimantal Medicine (2008), vol 205, no 13, pp 3007-3018. *
V Urbonaviciute et al, Journal of Internal Medicine (2011), vol 270, no 4, pp 309-318. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190013707A (ko) * 2016-03-22 2019-02-11 벨지언 볼리션 에스피알엘 암 검출을 위한 뉴클레오솜-전사 인자 복합체의 용도
KR20210049954A (ko) * 2016-03-22 2021-05-06 벨지언 볼리션 에스피알엘 암 검출을 위한 뉴클레오솜-전사 인자 복합체의 용도

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US20170276684A1 (en) 2017-09-28
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SG10201604081YA (en) 2016-07-28
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US20160097772A1 (en) 2016-04-07
BR112014013082B1 (pt) 2021-02-02
EP2788767B1 (en) 2017-09-06
HUE035855T2 (en) 2018-05-28

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