JP2001029077A - 新規ｍｉｔｅ様因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規ＭＩＴＥ様配列の提供。 【解決手段】ニンジンのフェニルアラニンアンモニアリ
アーゼをコードする遺伝子から単離された、植物由来の
２つのＭＩＴＥ様因子、特に新しい挿入重複配列が
（Ａ）ｎＧ（Ａ）ｎ（ｎは１以上の整数）である、新し
いファミリーに属するＭＩＴＥ様配列を有する新規挿入
因子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は植物に由来する新規
な可動性因子（miniature-inverted repeat transposab
le element：ＭＩＴＥ）、より詳細にはニンジン（Dauc
us carota）より単離された新規な可動性因子に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】可動性因子は、原核生物及び真核生物の
別や動物及び植物の別を問わず、ほとんどの生物種のゲ
ノムに見い出されている。これらの可動性因子は、ゲノ
ムを動き回ることによって転移した導入配列前後の遺伝
子を不活性化または活性化することが知られている。さ
らに最近、可動性因子はかかる作用のみならず、多様な
ゲノム再編成（欠失，反転，重複など）を引き起こすこ
とがわかり、これによって生物の進化にとって重要なゲ
ノム可塑性（genome plasticity)が生じること、特に、
可動性因子は、ストレス（genomic stress）に対して対
抗できる環境適応に向けて生物を進化させる重要な役割
を果たしていることが報告されている（McClintock，Sc
ience 26:792-801(1984)；Arber ら，FEMS Microb. Eco
l., 15: 5-14 (1994））。

【０００３】可動性因子は，大きくＤＮＡ型（トランス
ポゾンおよび挿入配列）、ＲＮＡ型（レトロトランスポ
ゾン）（Bergら編集，Mobile DNA (1989))、並びにこれ
らのいずれにも属さない miniature-inverted repeat t
ransposable element (ＭＩＴＥ) (Wesslerら，Curr. O
pin. Genet. Dev. 5 : 914-821 (1995)) の３種類に大
別されている。

【０００４】そのうちＤＮＡ型およびＲＮＡ型の可動性
因子については、それらが実際にゲノム内で転移してい
る実体が検出されているが、ＭＩＴＥについては、ＤＮ
Ａ型に非常によく似ているにもかかわらず、現在までそ
の転移を実証的に観察したという報告はない。

【０００５】ＭＩＴＥは、現在進められているゲノム・
プロジェクトによって解明されつつある各種生物のゲノ
ム遺伝子の塩基配列のデータ・ベースから、コンピュー
タ検索によって見出されたものが殆どであり、１９９２
年に初めてBureauらによってTourist属が見い出されて
以来(Bureau ら，Plant Cell 4: 1283-1294 (1992))、
植物ゲノム並びに昆虫や動物のゲノムからも各種のＭＩ
ＴＥが見い出されている。

【０００６】一般にＭＩＴＥは、(1) その５’末端及び
３’末端の両端に完全もしくは不完全な逆反復配列を有
する（この点でＤＮＡ型可動性因子と類似する。）、
(2) その逆反復配列の両末端側に、ＤＮＡ型可動性因子
がゲノムＤＮＡに挿入される際に生じるのと同様に、２
塩基対以上の同方向反復配列を有する標的重複配列様の
配列が見い出される、及び(3) 大きさが一般的に２ｋｂ
以下である、といった特徴を有するものとして定義され
ている (Wessler ら，Curr. Opin. Genet. Dev.5 : 914
-821 (1995)) 。

【０００７】ところでＭＩＴＥについて、ＤＮＡ型可動
性因子のように、両端の逆反復配列の間にトランスポザ
ーゼをコードするオープンリーディンフレームを有する
ものは、カビや動物から見い出されたIS630-Tc1/Marine
r属のＭＩＴＥだけであり (Kachroo ら, Mol. Gen. Gen
et. 245 : 339-348 (1994)；Smitら，Proc.Natl. Acad.
Sci. USA 93 : 1443-1448 (1996))、植物に由来するＭ
ＩＴＥにはかかるトランスポザーゼをコードするオープ
ンリーディングフレームは発見されていない。

【０００８】このため、植物におけるＭＩＴＥに関し
て、それがどのような機構で転移するのか、またその働
きについて、未だ解明されていない部分が多い。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ＭＩＴＥの働きに関し
ては、これまでの研究からＭＩＴＥが様々な遺伝子のプ
ロモーター上流域に多く見い出されていることから(Wes
slerら，Curr. Opin. Genet. Dev. 5 : 914-821 (199
5))、遺伝子プロモーターの活性化に寄与している可能
性も考えられる。また、ＭＩＴＥは matrix attachment
region (MAR)の近傍にも数多く見い出されていること
から(Avramova ら，Nucleic Acids Res. 26: 761-767
(1998))、ゲノムの構造に重要な関わりを持っているこ
とも考えられる。

【００１０】このように、ＭＩＴＥは、未だ研究の進ん
でいないゲノム構造と遺伝子発現の関係を明らかにする
という点において学術上極めて興味ある可動性因子（挿
入因子）であるとともに、ＭＩＴＥがゲノム遺伝子間を
転移し組み込まれることによってゲノム構造を変え、そ
の結果として遺伝子の発現活性をコントロールしている
可能性から、外来遺伝子導入の際の遺伝子発現活性の安
定化、又は不活性化を抑制する因子としての有用性が期
待されている。

【００１１】そこで本発明は、上記のように学術上並び
に産業上有用な、植物に由来する新規なＭＩＴＥ様因子
を提供することを目的とするものである。より詳細に
は、本発明は、ニンジン（Daucus carota）に由来する
新規ＭＩＴＥ様因子を提供することを目的とするもので
ある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ニンジン核
内に存在する複数のフェニルアラニンアンモニアリアー
ゼ（ＰＡＬ：phenylalanine ammonia-lyase）遺伝子プ
ロモーターの全塩基配列を決定していたところ、偶然に
もＭＩＴＥ様の因子の存在を見出し、その単離に成功
し、さらにその構造が従来公知のＭＩＴＥのいずれにも
属さない新規なＭＩＴＥ様因子に属するものであること
を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。

【００１３】すなわち本発明の第一は、下記項１〜５に
掲げる新規ＭＩＴＥ様因子である（以下、かかるＭＩＴ
Ｅ様因子を便宜上「ＩＳ２因子」とも称する。）： 項１．標的配列：（Ａ）ｎＧ（Ａ）ｎ [ｎは１以上の
整数]の重複を引き起こすＭＩＴＥ様因子。 項２．５’末端及び３’末端に末端逆反復配列を有する
項１記載のＭＩＴＥ様因子。 項３．式（１）：ＸｔｔｇｃａａＹ（式中、Ｘはｇ又は
ｔを、Ｙはａ又はｃを示す）、または、式（２）：Ｚａ
ｔｇｃａａ（式中、Ｚはｔ又はａを示す）で示される塩
基配列の少なくとも１つを、複数反復して含有する項１
または２記載のＭＩＴＥ様因子。 項４．末端逆反復配列として、５’末端に配列番号１の
塩基配列、３’末端に配列番号２の塩基配列を有する、
項１乃至３のいずれかに記載のＭＩＴＥ様因子。 項５．配列番号３の塩基配列からなるＭＩＴＥ様因子。

【００１４】さらに本発明の第二は、下記項６及び７に
掲げる新規ＭＩＴＥ様因子である（以下、かかるＭＩＴ
Ｅ様因子を便宜上「ＩＳ１因子」とも称する。）： 項６．末端逆反復配列として、５’末端に配列番号４の
塩基配列、３’末端に配列番号５の塩基配列を有するＭ
ＩＴＥ様因子であって、標的配列ＴＡの重複を引き起こ
すＭＩＴＥ様因子。 項７．配列番号６の塩基配列からなるＭＩＴＥ様因子。

【００１５】公知のＭＩＴＥとしては、前述するように
今までTourist、Stowawayの他、Castaway、Crackle、Em
igrant、Explorer、Ditto、Gaijin、Krispie、Pop、Sna
p、Wanderer、Wujin、Wukong、Wuneng、Xbr が見い出さ
れている。これらＭＩＴＥ因子の構造的特徴はすべて末
端に完全もしくは不完全な逆反復配列を有している点で
あるが、各々のＭＩＴＥ因子においてその逆反復配列の
塩基配列および長さは全く異なっている。さらに、これ
らのＭＩＴＥ因子の挿入重複配列は TouristがＴＡＡ、
StowawayがＴＡ、CastawayがＴＡＡ、Crackle がＧＴＴ
ＧＡＴＡＴ、Ditto がＴＴＡ、EmigrantがＴＡ、Gaijin
がＡＴＴもしくはＴＡＧもしくはＴＧＡもしくはＧＧＴ
もしくはＧＴＴもしくはＧＡＡ、Krispie がＴＴＧＡＡ
Ｃ、PopがＡＡＡＡＣＡＡＡもしくはＡＡＡＡＡＡＡ
Ａ、SnapがＴＴＴＴＴＴＴ、WandererがＴＴＡもしくは
ＴＡＡ、Wujin がＴＡもしくはＣＡＴＡ、WukongがＴＡ
ＴＡもしくはＴＡＣＡ、WunengがＴＴＡＡもしくはＴＴ
ＡＴ、Xbr がＴＴＡＡである（なお Explorer には明確
な挿入重複配列は見い出されていない）（Bureauら、Pr
oc. Matl. Acad. Sci. USA, 93: 8524-8529 (1996)、Ca
sacuberta ら、PlantJ., 16 : 79-85 (1998)、Songら、
Mol. Gen. Genet., 258 : 449-456 (1998)、Tu、Proc.
Matl. Acad. Sci. USA, 94 :7475-7480 (1997)、Unsal
と Morgan、J.Mol. Biol., 248 : 812-823 (1995) ）。

【００１６】一方、上記本発明のＩＳ２因子は、挿入重
複配列として、上記従来のＭＩＴＥ（挿入因子）ではみ
られない（Ａ）ｎＧ（Ａ）ｎ[ｎは１以上の整数]を有す
るものであり、その点で従来公知のファミリーのいずれ
にも属さない新規なファミリーに属する挿入因子である
といえる。

【００１７】また、本発明のＩＳ１因子は挿入重複配列
としてＴＡを有しており、これから従来公知のファミリ
ーStowaway属 (Bureau and Wessler (1994))に属する、
新規なＭＩＴＥ様因子であるといえる。

【００１８】

【発明の実施の形態】（１）ＩＳ２因子 本発明の第一のＭＩＴＥ様因子（ＩＳ２因子）は、ゲノ
ム遺伝子の挿入部位に（Ａ）ｎＧ（Ａ）ｎの重複をもた
らすことを特徴とするものである。ここでｎは１以上の
整数であればよく、特に制限されないが、具体的には２
〜６、好ましくは３〜５、より好ましくは４を挙げるこ
とができる。

【００１９】本発明のＭＩＴＥ様因子は、より具体的に
は、大きさが２ｋｂ程度以下、好ましくは０．２〜２ｋ
ｂ程度のＤＮＡであり、その５’末端及び３’末端に互
いに逆向きの反復配列（末端逆反復配列）を有するもの
である。

【００２０】かかる点から、本発明のＩＳ２因子は前述
する(1)〜(3)の要件、すなわち(1)５’末端及び３’末
端の両端に完全若しくは不完全な逆反復配列を有するこ
と、(2) 遺伝子挿入部分の逆反復配列の両側に重複配列
として２塩基対以上の同方向反復配列が見出されるこ
と、(3) 大きさが２ｋｂ以下であることといった、３つ
の要件を満たすことから、ＭＩＴＥ様配列を有する可動
性因子（挿入因子、ＭＩＴＥ様因子）であると規定する
ことができる。

【００２１】本発明のＩＳ２因子は、他の構造的な特徴
として、その塩基配列中に式（１）：ＸｔｔｇｃａａＹ
（式中、Ｘはｇ又はｔを、Ｙはａ又はｃを示す）（配列
番号７〜10）、または式（２）：Ｚａｔｇｃａａ（式
中、Ｚはｔ又はａを示す）（配列番号11〜12）で示され
る塩基配列の少なくとも１つを、連続又は非連続に反復
して含有するものである。

【００２２】かかる反復配列の位置及びその数は特に制
限はなく、ＩＳ２因子の両末端域に位置する末端逆反復
配列中、または該末端逆反復配列間に挟まれた中間領域
中に含まれていても良い。

【００２３】本発明のＩＳ２因子として具体的には、図
１に示すように、上記式（１）及び式（２）で示される
反復配列を複数、末端逆反復配列間の中央領域中に含
み、また式（１）で示される反復配列を複数、末端逆反
復配列中に含む構造を有するものを挙げることができ
る。

【００２４】本発明のＩＳ２因子が有する末端逆反復配
列は、両者が互いに厳格に相補的な配列である必要はな
く、５’末端領域と３’末端領域とがストリンジェント
な条件で互いにハイブリダイズし、その結果、ＩＳ２因
子が図１に示すようにステム構造となるものであれば足
りる。この意味で本発明のＩＳ２因子は、末端逆反復配
列として完全のみならず不完全な逆反復配列を有するも
のを包含するものである。

【００２５】本発明の具体的なＩＳ２因子としては、末
端逆反復配列として、５’末端領域に配列番号１の塩基
配列を有し、また３’末端領域に配列番号２の塩基配列
を有するものを例示することができる。ＩＳ２因子とし
てより具体的には、配列番号３の塩基配列を有するもの
を挙げることができる。なお、ＩＳ２因子は、それ自身
の機能または活性を実質的に有する機能的同等物である
かぎり、末端逆反復配列もしくはこれらの反復配列に挟
まれた中央領域に位置する配列において、１つまたは複
数のヌクレオチドが置換、付加または欠失していてもよ
く、本発明のＭＩＴＥ様因子はかかる機能的同等物を包
含するものである。

【００２６】好ましい機能的同等物としては、配列番号
３の塩基配列を有するＩＳ２因子の機能または活性を実
質的に有し、挿入部位において（Ａ）ｎＧ（Ａ）ｎ [ｎ
は１以上の整数]の重複を引き起こし、かつ上記ＩＳ２
因子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするも
のを挙げることができる。尚、ストリンジェントな条件
としては、１×ＳＳＣ、０．１％w/w ＳＤＳ中、５０℃
以上で１時間の条件を挙げることができる。より具体的
には、機能的同等物として、上記機能を有するととも
に、配列番号３で示されるＩＳ２因子と比べた場合に、
塩基配列において７０％以上、好ましくは８５％以上、
より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上
のホモロジーを有するものを挙げることができる。 （２）ＩＳ１因子 本発明のＭＩＴＥ様因子（ＩＳ１因子）は、ゲノム遺伝
子の挿入部位にＴＡの重複をもたらすものであり、末端
逆反復配列として５’末端領域に配列番号４の塩基配列
を、また３’末端領域に配列番号５の塩基配列を有する
ことを特徴とする。また本発明のＩＳ１因子は、具体的
には大きさが１ｋｂ程度以下、好ましくは１００ｂｐ〜
５００ｂｐ程度のＤＮＡを挙げることができる。このよ
うな点から、本発明のＩＳ１因子も、上記ＩＳ２因子と
同様に、ＭＩＴＥ様の因子であると規定することができ
る。

【００２７】本発明のＩＳ１因子として具体的には、図
２に示す構造を有するものを例示することができる。よ
り具体的には配列番号６の塩基配列を有するものを例示
することができる。なお、かかる塩基配列を有するＭＩ
ＴＥ様因子は、それ自身の機能または活性を実質的に有
する機能的同等物であるかぎり、末端逆反復配列もしく
はこれらの反復配列に挟まれた中央領域に位置する配列
において、１つまたは複数のヌクレオチドが置換、付加
または欠失していてもよく、本発明のＭＩＴＥ様因子は
かかる機能的同等物を包含するものである。

【００２８】好ましい機能的同等物としては、配列番号
６の塩基配列を有するＭＩＴＥ様因子（ＩＳ１因子）の
機能または活性を実質的に有し、かつ該ＩＳ１因子と比
べた場合に、それぞれ塩基配列において８５％以上、好
ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のホモ
ロジーを有するものを挙げることができる。

【００２９】以上で説明する本発明のＭＩＴＥ様因子
（ＩＳ２因子、ＩＳ１因子）は、いずれも後述するよう
にニンジンのゲノム、具体的にはニンジンのフェニルア
ラニンアンモニアリアーゼ遺伝子から見出されたもので
あり、本明細書の記載に従って、これらのものから単離
・取得することができる。しかしながら、本発明のＭＩ
ＴＥ様因子は、前述する構造ならびに特性を有するもの
であるかぎり、その由来を何ら制限するものではない。

【００３０】

【発明の効果】可動性因子は植物ゲノム自身の自己改変
のセルフメカニズムとして生物の進化や環境適応に大き
く関与している可能性が指摘されている。

【００３１】本発明のＭＩＴＥ様因子に関して、それが
植物ゲノムの自己改変のセルフメカニズムに対してどう
いったメカニズムによって機能するかについては不明で
あるが、レトロトランスポゾンの場合（McDonald，BioS
cience 40 : 183-191(1990))のように、内部にエンハン
サー・エレメントを有していて、その因子が転移するこ
とによってそのエンハンサー・エレメントが挿入された
遺伝子プロモーターの活性化を示すということは見られ
ない。

【００３２】従って、本発明のＭＩＴＥ様因子は、植物
ゲノム中に挿入されることによって、ゲノム構造の変化
を引き起こし、それがもとで従来のエンハンサー・エレ
メントとは全く異なったメカニズムによって、ゲノムＤ
ＮＡの巻き戻しのしやすさ、ヌクレオソーム構造の変化
といったゲノム構造のダイナミクスの変化に寄与してい
る可能性が高いものと考えられる。

【００３３】本発明のＭＩＴＥ様因子によれば、この性
質を利用して、これまでとは異なった手法によって、そ
の近傍に存在する遺伝子の発現を制御することが可能と
なる。一般に、外来遺伝子が、ゲノムＤＮＡのcryptic
siteに挿入されると、その発現が抑制ないしは不活性化
することが指摘されている。ゆえに本発明のＭＩＴＥ様
因子によれば、上記性質に基づいて、遺伝子組み換えに
よって導入された外来遺伝子の低下した発現能を賦活化
ないしは活性化することが可能と考えられる。このこと
から、本発明のＭＩＴＥ様因子は遺伝子組み換え生物の
作出において、導入遺伝子発現用カセット及び該カセッ
トを含むプラスミドの構築に有用であり、更にこれらを
用いることによって、導入遺伝子を発現する遺伝子組み
換え生物の安定した作出に有用である。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。ただし、本発明はかかる実施例によって何ら限定さ
れるものではない。なお、本発明で用いられる遺伝子工
学的技術並びに分子生物学的実験操作（制限酵素処理条
件，ライゲーション反応条件，大腸菌へのトランスフォ
ーメーション方法等）は、一般に広く用いられている方
法、例えばJ.,Sambrook, E., F., Frisch,T.,Maniatis
著、モレキュラークローニング第２版（Molecular Clon
ing 2nd edition）、コールド・スプリング・ハーバー
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory pres
s）発行、1989年及びD.,M.,Glover著、ＤＮＡクローニ
ング、IRL発行、1985年などに記載されている方法に従
って行うことができる。実施例１ １）標的植物、標的遺伝子 ＭＩＴＥ様因子の探索にあたり、標的植物としてニンジ
ンを用いた。具体的には、ニンジン（Daucus carota L.
cv.Kurodagosun）のフェニルアラニンアンモニアリアー
ゼ（ＰＡＬ）遺伝子を用いた。 ２）ニンジンＰＡＬ遺伝子 gDCPAL3および gDCPAL4のク
ローニング ニンジン核ＤＮＡライブラリーから、ニンジン核遺伝子
をクローニングした。なお、ニンジン核ＤＮＡライブラ
リーは、本発明者の先行文献（Ozeki et al. (1993))の
記載に従って、ニンジン培養細胞 (Ozeki and Komamine
(1981)）からλEMBL3 ベクターを用いて作成した。

【００３５】具体的には、ニンジンの核ＤＮＡを、Murr
ay and Thompson(1980)の方法に従って、臭化セチルト
リメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液を用いて凍結乾
燥したニンジンから調製した。得られた核ＤＮＡを Sau
3AＩで部分消化し、ショ糖濃度勾配法によってサイズ分
画した。15〜20kbpの範囲にあるＤＮＡ画分を集めて、B
amHI消化したλEMBL3にライゲーションして、ファージ
粒子内にパッケージングすることによってニンジン核ラ
イブラリーを構築した。

【００３６】次いで、ニンジンＰＡＬ（フェニルアラニ
ンアンモニアリアーゼ）ゲノムクローンを、Ozeki et a
l. (1990) においてクローニングされた PAL cDNA (ANT
-PALcDNA)をプローブとして用いてスクリーニングした
（Sambrook et al. 1989）。なお、ニンジン核ライブラ
リーのスクリーニングのハイブリダイゼーションは、6
×SSC，60mMリン酸ナトリウム（pH6.8），10mM EDTA，
１％SDS，0.02% ポリビニルピロリドン，0.02% Ficoll
400,及び100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液で６
８℃で終夜処理することにより行った。また、メンブラ
ンの洗浄は、2×SSC，0.5% SDSの溶液中で室温１５分で
２回、0.1×SSC，0.1% SDSの溶液中で室温１０分で２
回、最後に0.1×SSC溶液中６８℃で３０分を２回行うこ
とによって実施した。

【００３７】その結果、８個のポジティブ・クローンが
得られた。かかるクローンについて制限酵素マップを作
成したところ，それらは２種類に分類され，それらをお
のおの gDCPAL3および gDCPAL4と命名した。

【００３８】gDCPAL3 について，Sambrook et al. (198
9)に記載された方法でポジティブ・クローンのλファー
ジを培養し，λＤＮＡを抽出して Bam HI で切断し，ナ
イロン膜にサザン・トランスファーを行った。これをプ
ローブとしてANT-PAL cDNAをEcoRIで切断した時に得ら
れるＤＮＡ断片（984 bp）の 5' 端を [³²Ｐ] で標識し
たものを用いてサザン解析を行い、プローブがハイブリ
ダイズする 2.77 kbpのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ
断片を、Bam HIで切断し calf intestine alakaline ph
osphatase (CIP) 処理した pBluescript SK プラスミド
にサブ・クローニングしてgDCPAL3-pro/SKを得た（図３
参照）。次いで得られたプラスミドgDCPAL3-pro/SKを、
制限酵素Sal I と Apa Iで切断し，Sambrook et al. (1
989)に記載された方法で Exonuclease IIIおよび Mungb
ean nucleaseを用いて、一連の欠失 DNA断片群を作成
し、これらを用いて DNAの塩基配列を決定した。Ozeki
andTakeda (1994) に示したニンジンから抽出した mRNA
を用いたプライマー・エクステンション法によって見
い出されたバンドの位置から転写開始点 (+1) を決定し
た。

【００３９】gDCPAL4 についても同様にして、上記に対
応するプラスミドgDCPAL4-pro/SKを作成して、転写開始
点を決定した。具体的には、ポジティブ・クローンgDCP
AL4のλファージから得たλ DNAを Hind III と Bam HI
で切断し、同上のプローブを用いてサザン解析を行
い、プローブがハイブリダイズする 1.63 kbp の DNA断
片を Hind III とBam HIで切断し CIP処理した pBluesc
ript SK プラスミドにサブ・クローニングしてgDCPAL4-
pro/SKを得た。次いで得られたプラスミドgDCPAL4-pro/
SKを、制限酵素Xba I と BstX Iで切断し，Sambrook et
al. (1989)に記載された方法で Exonuclease IIIおよ
び Mungbean nucleaseを用いて、一連の欠失 DNA断片群
を作成し、これらを用いて DNAの塩基配列を決定した。 ３）結果 決定した gDCPAL3および gDCPAL4の塩基配列を比較した
ところ，gDCPAL3 プロモーター領域には gDCPAL4には見
られない不完全な逆向き繰り返し配列を持ったminuture
inverted-repeat transposable element (ＭＩＴＥ）
が、-1897 〜 -1599 (長さ 299 bp)および -1157〜 -38
9 (長さ 769 bp)の２箇所に存在することがわかった
（図４）。これらの配列をそれぞれＩＳ１およびＩＳ２
と命名した。

【００４０】これらの配列並びに挿入部位周辺の塩基配
列について、それぞれオートシークエンサー（ABI社
製）でシークエンスを行った。ＩＳ１の塩基配列を配列
番号６に、IS2の塩基配列を配列番号３にそれぞれ示
す。

【００４１】これらのＩＳ１及びＩＳ２の性状は下記の
通りであった。 ＩＳ１ 配列番号６に示す塩基配列（全長２９９bp）からなり、
５’末端及び３’末端にはそれぞれ互いに不完全な逆反
復配列（３２bp）を有し、また標的遺伝子であるゲノム
への挿入部位にはＴＡの標的重複配列が見られた。この
ことからすでに報告されている Stowaway 属 (Bureau a
nd Wessler (1994))に属する新規なＭＩＴＥ因子の遺伝
子配列であることが推定された。ＩＳ１因子のステム構
造、並びに末端逆反復配列領域及び挿入部位領域の構造
を図２に示す。

【００４２】また得られた塩基配列の情報をもとに、市
販のデータベース（例えばGENE TYX-MAC/CD1995）を用
いて塩基配列のホモロジー解析を行ったところ、すでに
報告されている Stowaway 属 (Bureau and Wessler (19
94))に属するMITE様因子の遺伝子配列と末端逆反復配列
において７０〜９０％の割合でホモロジーがあり、この
ことから当該因子がStowaway属に属する挿入因子である
ことが確認された（図５）。 ＩＳ２ 配列番号３の塩基配列（全長７６９bp）からなり、５’
末端及び３’末端に不完全な逆反復配列（１５８bp）を
有し、また標的遺伝子であるゲノムへの挿入部位にＡＡ
ＡＡＧＡＡＡＡの標的重複配列が見られた。塩基配列の
ホモロジー比較を行ったが、既知挿入因子との相同性が
見られず、このことから従来の挿入因子ファミリーに属
さない新規なファミリーを構成する挿入因子、特にＭＩ
ＴＥ様因子であることが判明した。このステム構造、並
びに末端逆反復配列領域及び挿入部位領域の構造を図１
及び図６に示す。

【００４３】なお、本発明で引用する文献は下記の通り
である。 １．Bureau, T. E. and Wessler, S. R. Stowaway :
a new family of inverted repeat elements associate
d with the genes of both monocotyledonous and dico
tyledonous plants. Plant Cell, 6 : 907-16 (1994) ２．Mita, S., Suzuki-Fujii, K. and Nakamura, K. S
ugar-inducible expression of a gene for β-amylase
in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 107 : 8
95-904 (1995). ３．Ozeki, Y., Matsui, K., Sakuta, M., Matsuoka,
M., Ohashi, Y., Kano-Murakami, Y., Yamamoto, N. an
d Tanaka, Y. Differential regulation of phenylala
nine ammonia-lyase genes during anthocyanin synthe
sis and by transfer effect in carrot cell suspensi
on cultures. Physiol. Plantarum, 80 :379-387 (199
0). ４．Ozeki, Y., Davies, E. and Takeda, J. Structur
e and expression of chalcone synthase gene in carr
ot suspension cultured cells regulated by 2,4-D.
Plant Cell Physiol., 34 : 1029-1037 (1993). ５．Ozeki, Y. and Komamine, A. Induction of antho
cyanin synthesis in relation to embryogenesis in
a carrot suspension culture ; Correlation of met
abolic differentiation with morphological differ
entiation. Physiol. Plantarum, 53 : 570-577 (19
81). ６．Ozeki, Y. and Takeda, J. Regulation of phenyl
alanine ammonia-lyasegenes in carrot suspension cu
ltured cells. Plant Cell, Tissue and Organ Cultu
re, 38 : 221-225 (1994). ７．Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T.
Molecular Cloning, aLaboratory Manual, Second Edi
tion. Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yor
k (1989). ８．Murray,M.G. and Thompson,W.F. (1980) Rapid iso
lation of high molecular weight plant DNA. Nucl.
Acids Res. 8: 4321-4325.

【００４４】

【配列表】 <110> Ozeki, Yshihiro; Saneigen ffi Inc. <120> Novel MITE-like element <130> 469JP <160> 12 <210> 1 <211> 158 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 1 gggatctttt taaaaatacc catctgtaaa attatttttt taaaaatact accatctttt 60 tcattgtttt taaaaatacc ttttcataaa tttttttttt caaaaatacg atttgcaact 120 tttgcaacct catttgcaac cttgggcggc gcagccgt 158 <210> 2 <211> 158 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 2 acggctggcg ccgcctgtag ttgcaaatga ggttgcaaaa gttgcaaaca gtatttttga 60 aaaaaagatt ttatgaaaag gtatttttaa aaataattct ggaaggtagt atttttgaaa 120 acaataaaag aaaaggtagg tagttttgta gatttccc 158 <210> 3 <211> 769 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 3 gggatctttt taaaaatacc catctgtaaa attatttttt taaaaatact accatctttt 60 tcattgtttt taaaaatacc ttttcataaa tttttttttt caaaaatacg atttgcaact 120 tttgcaacct catttgcaac cttgggcggc gcagccgtaa aagttgccag tgaggttgca 180 aaagttgcaa atgagtttgt aaaagttgca aatgaggttg caaaagttgc aaataaaaat 240 ggaaagttgc aacagttgca actgcaattg caactagttc aactgaaaac tgtaagttgc 300 aaaagttgca aatgaggttg caactaaatg caactgaaaa ctgtaagtaa caacagatgt 360 atggtgtgcc cctggcgggg ccgttagatt acaatagaat caactgaatg caatcatatg 420 caactgaata caactatatg caatcatata tgcaattaca aatcctgatt tcaagttcca 480 gttttcgaat gtcattttcg aaatcgatat atatatatat atatatatat cgatttcgaa 540 aatgacattc gaaaactgga acttgaaatc aggaattcag ctgcatatga agttgcaaaa 600 gaggttgcaa cacggctggc gccgcctgta gttgcaaatg aggttgcaaa agttgcaaac 660 agtatttttg aaaaaaagat tttatgaaaa ggtattttta aaaataattc tggaaggtag 720 tatttttgaa aacaataaaa gaaaaggtag gtagttttgt agatttccc 769 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 4 ctccctacgt cccattttat gtgacctcat tt 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 5 aaactcattc acataaaatg ggacagaggg ag 32 <210> 6 <211> 299 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 6 ctccctacgt cccattttat gtgacctcat tttctttttg ggacgtctca aaaaaaataa 60 cctagaatac ttactatttt ttaacactat ttttcactat tacacccacc aactctatat 120 tttatactat tttattatta aataaacact attacaccca ctacttttct ccactatctc 180 aaatctatta ttaaatattg ataggtccac cactttaccc acttttcaac tacatttact 240 acatttttct taatctccgt gaaagtcaaa ctcattcaca taaaatggga cagagggag 299 <210> 7 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 7 gttgcaaa 8 <210> 8 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 8 gttgcaac 8 <210> 9 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 9 tttgcaaa 8 <210> 10 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 10 tttgcaac 8 <210> 11 <211> 7 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 11 tatgcaa 7 <210> 12 <211> 7 <212> DNA <213> Carrot(Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 12 aatgcaa 7

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＭＩＴＥ様因子、ＩＳ２因子の構造を
示す。

【図２】本発明のＭＩＴＥ様因子、ＩＳ１因子の構造、
及びその末端逆反復配列、挿入重複配列（下線部分のＴ
Ａ）を示す。

【図３】gDCPAL3-pro/SKの構築方法を示す概略図であ
る。

【図４】ニンジン PAL遺伝子 gDCPAL3および gDCPAL4と
の構造を比較した図である。

【図５】本発明のＭＩＴＥ様因子（ＩＳ１因子）の塩基
配列を、従来公知のStowaway属の塩基配列 (Bureauおよ
び Wessler、Plant Cell, 6 : 907-917(1994)) と比較
した結果を示す図である。黒字に白抜きの配列が相同性
の見られる末端逆反復配列である。

【図６】本発明のＭＩＴＥ様因子、ＩＳ２因子の末端に
見られる不完全逆反復配列、挿入重複配列（下線矢印部
分のＡＡＡＡＧＡＡＡＡ）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 香田 隆俊 大阪府豊中市三和町１丁目１番11号 三栄 源エフ・エフ・アイ株式会社内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 4B024 AA20 BA80 CA04 CA09 DA20 EA03 GA11 HA14 4B065 AA88Y AA98X AB01 BA02 CA23 CA60

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】標的配列：（Ａ）ｎＧ（Ａ）ｎ [ｎは１
   以上の整数]の重複を引き起こすＭＩＴＥ様因子。
2. 【請求項２】５’末端及び３’末端に末端逆反復配列を
   有する請求項１記載のＭＩＴＥ様因子。
3. 【請求項３】式： ＸｔｔｇｃａａＹ （１） （式中、Ｘはｇ又はｔを、Ｙはａ又はｃを示す）、また
   は式： Ｚａｔｇｃａａ （２） （式中、Ｚはｔ又はａを示す）で示される塩基配列の少
   なくとも１つを、複数反復して含有する請求項１または
   ２記載のＭＩＴＥ様因子。
4. 【請求項４】末端逆反復配列として、５’末端に配列番
   号１の塩基配列、３’末端に配列番号２の塩基配列を有
   する、請求項１乃至３のいずれかに記載のＭＩＴＥ様因
   子。
5. 【請求項５】配列番号３の塩基配列からなるＭＩＴＥ様
   因子。
6. 【請求項６】末端逆反復配列として、５’末端に配列番
   号４の塩基配列、３’末端に配列番号５の塩基配列を有
   するＭＩＴＥ様因子であって、標的配列ＴＡの重複を引
   き起こすＭＩＴＥ様因子。
7. 【請求項７】配列番号６の塩基配列からなるＭＩＴＥ様
   因子。