JP2001269178A - 遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチド - Google Patents

遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチド

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JP2001269178A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】ＤＮＡに結合し遺伝子の転写を抑制する機能を
有する高等植物由来のペプチド、該ペプチドをコードす
る遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該
組み換えベクターを含む形質転換体を提供する。 【解決手段】（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
からなるペプチド、又は（ｂ）アミノ酸配列（ａ）にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなる遺伝子の転写を抑制する
機能を有するペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の転写を抑
制する機能を有するペプチド、該ペプチドをコードする
遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組
み換えベクターを含む形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物ホルモン、エチレンに応答するシス
制御エレメントに結合するタンパク質因子ＥＲＦ（Ethy
lene Responsive Element binding Factor）は、ＥＲＦ
ドメインと名付けたＤＮＡ結合ドメインを有する植物特
有の転写因子である。最近の研究から、ＥＲＦタンパク
質をコードする遺伝子は、マルチジーンファミリーを構
成していることが明らかになっている。これまでに、タ
バコ、シロイヌナズナ植物からＥＲＦドメインを有する
タンパク質因子をコードするｃＤＮＡが明らかにされて
いるが、本発明者らはさらに、タバコ、イネ、シロイヌ
ナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行い、植物細胞内
でリプレッサーとして機能するドメインを明らかにし、
本発明を完成した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】すなわち、本発明はＤ
ＮＡに結合し遺伝子の転写を抑制する機能を有する高等
植物由来のペプチド、該ペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組み換えベ
クターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、タバコ、
イネ、シロイヌナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行
った結果、ＥＲＦ因子のカルボキシ末端領域のアスパラ
ギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）からなるモ
チーフを有する領域が、遺伝子の転写を抑制する機能を
有することを発見し、本発明を完成した。このようなＤ
ＬＮモチーフを有し遺伝子の転写を抑制する機能を有す
るペプチドとしては、例えばタバコ由来のＥＲＦ３に含
まれるペプチド；シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３、
ＡｔＥＲＦ４（配列番号１）、ＡｔＥＲＦ７及びＡｔＥ
ＲＦ８に含まれるペプチド；イネ由来のｏｓＥＲＦ３に
含まれるペプチドが挙げられる。
【０００５】
【発明の実施の形態】機能解析の方法は、それぞれのＥ
ＲＦ因子をコードしているｃＤＮＡから、タンパク質コ
ード領域を切り出し、これを酵母のＧＡＬ４転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域と結合し、さ
らに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス
３５Ｓプロモーターの下流につないでエフェクタープラ
スミドを構築する。これをＧＡＬ４タンパク質結合部位
をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子
からなるリポーター遺伝子と同時に、タバコ培養細胞あ
るいはシロイヌナズナ葉にエレクトロポーション法によ
り導入し、リポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝
子の活性を測定することによって調べた。
【０００６】つぎに、リプレッサー因子に存在するリプ
レッサー機能を有する領域であるリプレッサードメイン
を同定するために、各遺伝子のコード領域を削除する方
法であるディリーション解析法を用いて、ＥＲＦ因子の
どの領域にリプレッサードメインが存在するのかを調べ
た。
【０００７】
【実施例】アラビドプシス（和名シロイヌナズナ）AtER
F4遺伝子の単離 （プローブの作成）すでに塩基配列が決定されているタ
バコのERF3遺伝子のcDNAをクローニングしたプラスミド
pERF3を制限酵素EcoRIとNotIで消化し、アガロースゲル
電気泳動でERF3のcDNAを含む950bpのDNA断片を単離し
た。このDNA断片約50ngを100℃で１０分変性した後、DN
Aラベリングキット（アマシャムファルマシア社製Ready
-To-GoDNA Labelling Beads)と5uLのアルファ３２P-dCT
P（アマシャムファルマシア社AA0005）をもちいて標識
し、プローブを作成した。
【０００８】（cDNAの作成とスクリーニング）アラビド
プシス植物体から葉を採取し、液体窒素中でミキサーを
用いて粉状に粉砕する。この粉砕した葉粉末１0gに対し
２０ｍＬのRNA抽出バッファー（８Ｍ塩酸グアニジン、
２０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDT
A)、２０ｍＭ ２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸
(MES)、５０ｍＭ メルカプトエタノール）と８ｍＬのTE
溶液（10mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA)で飽和したフェ
ノールと２ｍＬのクロロホルムを加えよく攪拌し、遠心
（10000g）して上精を回収する。上精に対して0.2倍容
量の１Ｍ酢酸と0.7倍容量のエタノールを加え-20℃で静
置した後、遠心（10000g）する。沈殿を２mLのTE溶液に
溶解し、500mLの１０Ｍ塩化リチウム溶液を加え、０℃
で２時間静置し、遠心する。沈殿を７０％のアルコール
で洗浄した後、風乾し、全RNA標品を得た。この全RANを
プロメガ社製Poly A Tract System 1000 を用いて全RNA
からmRNAのみを精製した。このmRNAを鋳型としてファル
マシア社製cDNAダイレクションクローニングキットを用
いて二本鎖cDNAを合成。これらをファルマシア社のプロ
トコールに従ってラムダgt11発現ベクターのEcoRI-NotI
制限酵素サイトに組み込んだのち、ラムダパッケージン
グキット（ファルマシア社）を用いてライブラリーを完
成させた。
【０００９】作成したアラビドプシスcDNAライブラリー
を組み込んだラムダファージがプレート（10cm x 14c
m）一枚につき約４万個のプラークが得られる容量を、
予め0.5ccmLの10mMの硫酸マグネシウム溶液で縣濁して
おいた大腸菌1090株に縣濁して感染させ、選択するため
の薬剤である50mg/Lのアンピシリン酸ナトリウムLB寒天
培地（1Lに対して10gトリプトン、10g塩化ナトリウム、
5gイーストイクストラクト、15g寒天）に展開し、37℃
で培養する。プラークが約２ｍｍになった時点でニトロ
セルロース膜（S&S社製）に写し取り、変性液（0.2M Na
OH, 1.5M NaCl)に浸した濾紙（ワットマン3MM)上に５
分、中和液（0.4M Tris-HCl, pH7.5, 2xSSC)に浸した濾
紙上で５分間静置した後、2xSSC溶液に５分間浸し、濾
紙上で２０分間風乾する。80℃で１２０分乾燥させ、プ
ラークDNAをニトロセルロース膜に固定する。
【００１０】ニトロセルロース膜（10cm x 14cm）１枚
につき２ｍＬのハイブリダイゼーションバッファー（6x
SSC, 0.05% skim milk)に浸し６０℃で２時間保温した
後、１００℃１０分間加温し、急冷によって変性させた
ERF3のプローブを含む新しいバッファーと交換し、６０
℃で12時間保温した。その後、フィルター１枚につき５
ｍＬの0.1%のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む2xS
SC溶液で１５分、0.1%のSDSを含む0.5xSSCで１５分、0.
1%のSDSを含む0.2xSSCで１５分洗浄し、X線フィルムに
感光させた。ERF3のプローブが結合したプラークを寒天
プレートから単離し、1mLのファージバッファー（10mM
Tris-HCl pH7.5, 10mM MgSO4）に縣濁し、ファージを回
収した後、上記のスクリーニングを３回繰り返し、単一
プラークを得た。このプラークを再び大腸菌に感染させ
増幅して、ファージよりDNAを抽出し、cDNA領域を制限
酵素EcoRIとNotIを用いて切り出した。このDNA断片をプ
ラスミドpT7D3（ファルマシア社）の制限酵素EcoRI-Not
I部位に組み込み、プラスミド塩基配列の解析をおこな
なった。配列番号１に示すAtERF4のcDNAの全長配列を持
つプラスミドをpAtERF4と名付けた。
【００１１】AtERF4リプレッションドメインの同定 エフェクタープラスミドの構築 （AtERF4全長を含むエフェクタープラスミドpGAL4DB-At
ERF4の構築：図１）クローンテック社製(Clontech社, U
SA)のプラスミドpBI221を制限酵素XhoIとSstIで切断
し、T4ポリメラーゼで平滑末端処理した後、アガロース
ゲル電気泳動でGUS遺伝子を除き、カリフラワーモザイ
クウイルス35Sプロモーター（以下CaMV35S）とノパリン
合成酵素遺伝子の転写終止領域（Nosターミネーター、
以下Nos-ter)を含む35S-Nosプラスミド断片DNAを得た。
クローンテック社製のpAS2-1ベクターを制限酵素HindII
Iで消化し、酵母 GAL4タンパク質のDNA 結合領域 ( 1-1
47 アミノ酸残基) をコードする 748 bp の DNA 断片
（以下GAL4DBD)をアガロースゲル電気泳動によって単離
した後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理をした。
このGAL4DBDを含むDNA断片を、先ほどの35S-NosのDNAの
35SプロモーターとNosターミネータ間の平滑末端にした
部位に挿入し、35Sプロモーターに対して酵母 GAL4 タ
ンパク質のDNA 結合領域の ORF が順方向に並んでいる
ものを選抜してp35S-GAL4DBD ベクターを構築した。
【００１２】AtERF4のcDNAプラスミドpAtERF4とGAL4DBD
と読み枠（フレーム）が一致するように設計した５末ア
ッパープライマーprimer1（配列番号３：AtERF4塩基配
列1-20に結合）GATGGCCAAGATGGGCTTGAAと制限酵素SalI
部位を持つ３末ローワープライマーprimer2（配列番号
４：AtERF4塩基配列649-669に結合）GTCGACTCAGGCCTGTT
CCGATGGAGGを用いてAtERF4全タンパク質コード領域（配
列番号１：AtERF4塩基配列1-669; アミノ酸配列1-222）
をPCR法によって増幅し、DNA断片を得た。PCR反応の条
件は、変性反応94℃１分、アニール反応℃47℃２分、伸
長反応74℃１分を１サイクルとしてで25サイクルおこな
った。以下全てのPCR反応は同じ条件でおこなった。得
たDNA断片を制限酵素SalIで消化した後、アガロース電
気泳動によって目的とするDNA断片を単離した。このAtE
RF4をコードするDNA断片を、制限酵素SmaIとSalIで予め
消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エ
フェクタープラスミドpGAL-AtERF4を構築した。このエ
フェクタープラスミドpGAL-AtERF4を構築する手順を図
１に示した。
【００１３】（AtERF4アミノ酸183/222を含むエフェク
タープラスミドpGAL-166/225AtERF4の構築）pAtERF4プ
ラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと読み枠が一
致するように設計した５末アッパープライマーprimer3
（配列番号５：結合部位AtERF4塩基配列549-559）GGCTT
GTGGTGCCCAAAGCGACTCと制限酵素SalI部位を持つ３末ロ
ーワープライマーprimer2（配列番号４：結合部位AtERF
4塩基配列591-678）GTCGACTCAGGCCTGTTCCGATGGAGGを用
いてAtERF4のアミノ酸配列183/222コード領域に該当す
る塩基配列549-678の領域を含むDNA断片をPCR法によっ
て得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化し、アガロ
ース電気泳動によって目的とするDNA断片を単離した。
このAtERF4のアミノ酸配列183/222にをコードするDNA断
片(DNA領域549-678)を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化
しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エフェ
クタープラスミドpGAL-183/222AtERF4を構築した。
【００１４】（レポーター遺伝子の構築：図２及び図
３）プラスミドpUC18 を制限酵素EcoRIとSstI で消化す
る。 pBI221 （クローンテック社）を 制限酵素EcoRIと
SstIで消化し、Nos-ter (nopaline synthase terminat
or) を領域含む270bpのDNA断片を挿入するアガロースゲ
ル電気泳動によって単離する。得られた断片を制限酵素
EcoRIとSstI で消化しておいたプラスミドpUC18 のEcoR
I-SstI部位に挿入する。カリフラワーモザイクウイルス
35SプロモーターTATAボックスを含む相補鎖のDNA １
（配列番号６）AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGA
AGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTG及びDNA ２（配列番号
７）GATCCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAG
GAAGGGTCTTGCAGATCTAを合成する。合成したDNAを90℃２
分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２
５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成
させる。Nos-terを持つpUC18プラスミドを制限酵素 Hin
dIIIと BamHI で消化する。合成した２本鎖DNAをpUC1８
のHindIII-BamHI部位に挿入し、TATA-boxとNos-terを含
むプラスミドを構築する。上記の手順は、図２に示し
た。
【００１５】このプラスミドを制限酵素SstIで消化し、
T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理をおこなう。ホ
タル・ルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をもつプラスミドベ
クター PGV-CS2 (東洋インキ社製）を 制限酵素XbaI と
NcoIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理
をおこなった後、アガロースゲル電気泳動によって、ル
シフェラーゼ遺伝子を含む 1.65 kb の DNA 断片を単離
精製した。このDNA断片を上記のTATAボックスとNosター
ミネーターを含むプラスミドに挿入しTATA-LUC リポー
ター遺伝子を構築した。酵母の GAL4 タンパク質のＤＮ
Ａ結合配列を５コピー持つプラスミド pG5CAT(Clontech
社製) を 制限酵素SmaIと XbaIで消化し、T4 DNA ポリ
メラーゼで平滑末端化処理をおこなった後、５コピーの
GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含むDNA 断片をアガ
ロースゲル電気泳動で精製した。TATA-LUC ベクターを
制限酵素BglIIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末
端化処理をおこう。この部位に平滑末端化した５コピー
の GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含む DNA 断片を
挿入し、得られたプラスミドのうち GAL4 タンパク質の
ＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リ
ポーター遺伝子GAL4-LUC を構築した。（図３参照）
【００１６】（レファレンス遺伝子の構築）ウミシイタ
ケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセ
ットベクター pRL-null を制限酵素NheIと XbaI 制限酵
素で切断し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を
行った後、アガロースゲル電気泳動で ウミシイタケ・
ルシフェラーゼ遺伝子を含む 948 bp の DNA 断片を精
製する。この DNA 断片をエフェクタープラスミドの構
築の際に用いたGUS遺伝子を除いたpBI221ベクターのGUS
遺伝子があった領域にに挿入する。得られたプラスミド
のうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子がが順方
向に向いているものを選抜する（pPTRL の構築）。
【００１７】（レポーター遺伝子の活性測定法）タバコ
培養細胞プロトプラストにリポーター遺伝子とエフェク
タープラスミドをエレクトロポレーション法を用いて導
入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を
測定することによって調べた。 （プロトプラストの調製法）100 mL の MS 培地 (ムラ
シゲ・スクーグ培地用混合塩類、日本製薬社製 、3%シ
ョ糖、0.2 g/L KH2PO4, 0.2 g/L m-inositol, 2 mg/L g
lycine, 1 mg/L 塩酸チアミン、0.2 mg/L 2, 4-D, pH
を 5.8 に調節する) に７日間培養した タバコ培養細胞
BY-2 の前培養液３ｍｌを加えて 26℃で３日間暗所で
培養した細胞を金属製のメッシュ（目の開きが 125 mm,
東京スクリーン社製）濾過回収し、0.4M マニトールを
含む MS 培地 で細胞を洗浄する。 洗浄した細胞を 25
mL の 0.4 M マニトールを含む MS 培地 に懸濁して１
０分間室温で放置3,000 rpm で１分間遠心して細胞を回
収する。この細胞を 20 mL の１％セルラーゼ（オノヅ
カRS, ）と 0.1％ペクトリアーゼ Y-23（セイシン社
製）を含む MS 培地に細胞を再懸濁して、26℃で 90 分
間暗所で 60 rpm で回転振とうしながら細胞壁を消化す
る。その後、1,000 rpm で５分間遠心してプロトプラス
トを回収する。
【００１８】（エレクトロポレーションによる遺伝子導
入）上記で得たプロトプラストを濃度が 2.5 X 106 細
胞/ mL になるように エレクトロポレーション緩衝液
（5 mM MES pH5.8, 70 mM KCl, 0.3 M マニトール）に
再懸濁する。 エレクトロポレーション用キュベット
（ジーンパルサーキュベット 0.4 cm elecrode, バイオ
ラッド社製）に構築したpGAL4-LUCレポーター遺伝子と
エフェクタープラスミド としてpGALDB-AtERF4あるいは
そのデレーションシリーズ（pGALDB-1/25AtERF4~pGALDB
-204-225AtERF4）のDNAを 各10ugと リファレンス遺伝
子プラスミド1ugを 100 uL の 2X エレクトロポレーシ
ョン緩衝液（10 mM MES pH5.8, 140 mM KCl, 0.6 M マ
ニトール）を加えて、滅菌水で全量を 200 uL にする。
キュベットに 600uL のプロトプラスト懸濁液を入れ
て、エレクトロポレーター（Genepulser II Electropor
ation Systemバイオラッド社製）を用いて 600 V, 25 m
F の条件で DNA を導入する。導入後、キュベットから
プロトプラストを1,000 rpm で５分間遠心して回収し、
5 mL の 0.4 M マニトールを含む MS 培地 にプロトプ
ラストを再懸濁して、 26℃で６時間暗所で静置した
後、レポーター遺伝子の活性を測定した。
【００１９】（ルシフェラーゼ活性測定）６時間静置し
たプロトプラスト懸濁液を 1 mL 採取して、2,000 rpm
で3 分間遠心してプロトプラストを回収した後、 Dual-
LuciferaseTMReporter Assay System (Promega 社製)
に添付されている Passive Lysis Buffer 50 uL に懸
濁する。プロトプラストを破砕した後、遠心して上清を
回収する。この細胞抽出液を5 uL 用いて Dual-Lucifer
aseTMReporter Assay System (Promega 社製)とルミネ
ッセンスリーダー（BLR-201, アロカ社製）を用いてル
シフェラーゼ活性測定を行なった。ホタル・ルシフェラ
ーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を
測定キットの説明書に従って 10 秒間の発光を積分モー
ドでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値ををリ
ポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRela
tive luchifarase activityを測定値として求めた。エ
フェクターを入れない場合の相対値を100として、エフ
ェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにリポ
ーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効
果を調査した。すなわち、pGAL4-LUCレポーター遺伝子
とpGALDB-AtERF4エフェクタープラスミドを導入したと
きのリポーターの活性値がとな減少することから、pGAL
DB-AtERF4は、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果
（リプレッサー機能）があることを示している。以下、
リポーターの活性値を測定して、リポーターの相対活性
値が１００以下になる場合に、導入したエフェクターに
はリプレッサー機能が存在するので、どのエフェクター
がリプレッサーとして機能するのかをレポーターの活性
を測定することによって調べた。
【００２０】（リプレッサードメインの同定）アラビド
プシスAtERF4の遺伝子の転写制御に関わる機能を解析す
るため、リポーター遺伝子pGAL4-LUCとpGALDB-AtERF4を
タバコ培養細胞より調整したプロトプラストにエレクト
ロポレーション法によって導入し、リポーター遺伝子の
活性を調べた。その結果、pGAL-AtERF4エフェクター
は、リポーター遺伝子の活性をエフェクターを導入しな
いリポーター遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ
７５％に減少させた。対照実験としておこなったAtERF4
のコード領域を含まないp35S-GALDBDは、リポーター遺
伝子の活性に影響を及ぼさなかった。このことは、AtER
F4が転写を抑制するリプレッサーとして機能しているこ
とを示している。
【００２１】次に、AtERF4遺伝子のタンパク質コード領
域をディリーションしたDAN断片もつエフェクタープラ
スミド、pGAL-183/222AtERF4が、リポーター遺伝子の活
性を抑制する機能をもつかを調べた。pGAL-183/222AtER
F4エフェクタープラスミドをリポーター遺伝子と共にタ
バコ培養細胞に導入し、リポーター遺伝子の活性を測定
した結果、pGAL-183/222AtERF4エフェクターは、pGALDB
-AtERF4を導入した場合と同様に、レポーター遺伝子の
活性をコントロールに比べ、約50％に抑えるリプレッサ
ー機能があることが示された。（図４B）。この結果か
ら、AtERF4のリプレッサー機能を持つ領域（リプレッシ
ョンドメイン）は、AtERF4のアミノ酸配列、183/222に
存在することを明らかにした（図４B）。このアミノ酸
配列を配列番号２に示した。
【００２２】本発明の遺伝子の転写を抑制する機能を有
するペプチドは、例えばガン遺伝子の転写調節領域に特
異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質と融合させて、細
胞内で発現させることにより、ガン遺伝子の発現を効率
的に抑制することが可能となる。また、リプレッサー機
能は調べたところ遺伝子に非特異的であるが、ＤＮＡと
の結合が必要であることから、特定のＤＮＡに結合する
ＤＮＡ結合ドメインと融合することにより、遺伝子特異
的あるいは非特異的に転写を抑制することが可能とな
る。このことによって、例えば色素代謝系の酵素をコー
ドする遺伝子の発現を制御することが可能となり、これ
までには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作
することができる。また、アレルゲンとなるタンパク質
の発現を抑制することによって、アレルゲンの少ない食
物の生産も可能となる。
【００２３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Secretary of Agency of Industrial Science and Technology <120>Novel repression domain of plant specific transcription factor <130> <160> 7 <210> 1 <211> 795 <212> DNA <213>Arabidopsis thaliana <400>1 atg gcc aag atg ggc ttg aaa ccc gac ccg gct act act aac cag acc 48 Met Ala Lys Met Gly Leu Lys Pro Asp Pro Ala Thr Thr Asn Gln Thr 5 10 15 cac aat aat gcc aag gag att cgt tac aga ggc gtt agg aag cgt cct 96 His Asn Asn Ala Lys Glu Ile Arg Tyr Ser Gly Val Ser Lys Arg Pro 20 25 30 tgg ggc cgt tat gcc gcc gag atc cga gat ccg ggc aag aaa acc cgc 144 Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Gly Lys Lys Thr Arg 35 40 45 gtc tgg ctt ggc act ttc gat acg gct gaa gag gcg gcg cgt gct tac 192 Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr 50 55 60 gat acg gcg gcg cgt gat ttt cgt ggt gct aag gct aag acc aat ttc 240 Asp Thr Ala Ala Arg Asp Phe Arg Gly Ala Lys Ala Lys Thr Asn Phe 65 70 75 80 cca act ttt ctc gag ctg agt gac cag aag gtc cct acc ggt ttc gcg 288 Pro Thr Phe Leu Glu Leu Ser Asp Gln Lys Val Pro Thr Gly Phe Ala 85 90 95 cgt agc cct agc cag agc agc acg ctc gac tgt gct tct cct ccg acg 336 Arg Ser Pro Ser Gln Ser Ser Thr Leu Asp Cys Ala Ser Pro Pro Thr 100 105 110 tta gtt gtg cct tca gcg acg gct ggg aat gtt ccc ccg cag ctc gag 384 Leu Val Val Pro Ser Ala Thr Ala Gly Asn Val Pro Pro Gln Leu Glu 115 120 125 ctt agt ctc ggc gga gga ggc ggc ggc tcg tgt tat cag atc ccg atg 432 Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Ile Pro Met 130 135 140 tcg cgt cct gtc tac ttt ttg gac ctg atg ggg atc ggt aac gta ggt 480 Ser Arg Pro Val Tyr Phe Leu Asp Leu Met Gly Ile Gly Asn Val Gly 145 150 155 160 cgt ggt cag cct cct cct gtg aca tcg gcg ttt aga tcg ccg gtg gtg 528 Arg Gly Gln Pro Pro Pro Val Thr Ser Ala Phe Ser Ser Pro Val Val 165 170 175 cat gtt gcg acg aag atg gct tgt ggt gcc caa agc gac tct gat tcg 576 His Val Ala Thr Lys Met Ala Cys Gly Ala Gln Ser Asp Ser Asp Ser 180 185 190 tca tcg gtc gtt gat ttc gaa ggt ggg atg gag aag aga tct cag ctg 624 Ser Ser Val Val Asp Phe Glu Gly Gly Met Glu Lys Ser Ser Gln Leu 195 200 205 tta gat cta gat ctt aat ttg cct cct cca tcg gaa cag gcc tga gct 672 Leu Asp Leu Asp Leu Asn Leu Pro Pro Pro Ser Glu Gln Ala Trp Ala 210 215 220 ttt aac ggt gtc gtt tca att cga agc gca tgc gtt tct tct tct ttt 720 Phe Asn Gly Val Val Ser Ile Arg Ser Ala Cys Val Ser Ser Ser Phe 225 230 235 240 tga gct gtg aaa att cgt ttt ctc ata gtt ttt cct ctc tct ctc tct 768 Trp Ala Val Lys Ile Arg Phe Leu Met Val Phe Pro Leu Ser Leu Ser 245 250 255 cag tct aaa ttt att acc agt ttt tag 795 Gln Ser Lys Phe Ile Thr Ser Phe 260 <210> 2 <211> 40 <212> RPT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Ala Cys Gly Ala Gln Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Val Val Asp Phe 5 10 15 Glu Gly Gly Met Glu Lys Ser Ser Gln Leu Leu Asp Leu Asp Leu Asn 20 25 30 Leu Pro Pro Pro Ser Glu Gln Ala 35 40 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA <400> 3 gatggccaag atgggcttga a <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA <400> 4 gtcgactcag gcctgttccg atggagg <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA <400> 5 ggcttgtggt gcccaaagcg actc <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA <400> 6 agcttagatc tgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggaca 10 20 30 40 50 60 cgctg 65 <210> 7 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA <400> 7 gatccagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat atagaggaag ggtcttgcag 10 20 30 40 50 60 atcta 65
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpBI221からpGAL4DB-AtERF4を構築す
る手順を示す図である。
【図２】レポーター遺伝子GAL4-LUC を構築する手順の
前半部を示す図である。
【図３】図２に引き続きレポーター遺伝子GAL4-LUC を
構築する手順の後半部を示す図である。
【図４】Aはリポーター遺伝子とエフェクタープラスミ
ドを示す図である。図において、5XGAL4: GAL4転写因子
DNA結合配列、TATA: CaMV35SプロモーターTATAボックス
を含む領域、LUC: ルシフェラーゼ遺伝子、CaMV 35S:
カリフラワーモザイクウイルス35Sタンパク質遺伝子プ
ロモーター、GAL4 DB:酵母GAL4転写因子DAN結合ドメイ
ンコード領域、Nos:ノパリン合成酵素遺伝子転写終止領
域を表す。ＢはAtERF4およびAtERF4のディリーションが
リポーター遺伝子の活性(Relative Activity)に及ぼす
影響 を示す図である。図において、左の数字（183/22
2）は、AtERF4のアミノ酸領域を示す。真ん中のボック
スは左の数字に該当するアミノ酸配列領域を示す。右の
グラフは、左の領域をもつエフェクタープラスミドを導
入したときのリポーター遺伝子の活性を示す。エフェク
ターを入れないときのリポーター遺伝子の活性を100と
した。AtERF4およびAtERF4ディリーションのエフェクタ
ーでアミノ酸配列183/222を持つエフェクターがリポー
ター遺伝子の活性を５０％に減少させ、転写を抑制する
効果を持つことが示されている。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年４月１１日（２０００．４．１
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】（レポーター遺伝子の構築：図２及び図
３）プラスミドpUC18 を制限酵素EcoRIとSstI で消化す
る。 pBI221 （クローンテック社）を 制限酵素EcoRIと
SstIで消化し、Nos-ter (nopaline synthase terminat
or) を領域含む270bpのDNA断片を挿入するアガロースゲ
ル電気泳動によって単離する。得られた断片を制限酵素
EcoRIとSstI で消化しておいたプラスミドpUC18 のEcoR
I-SstI部位に挿入する。カリフラワーモザイクウイルス
35SプロモーターTATAボックスを含む相補鎖のDNA １
（配列番号６）AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGA
AGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTG及びDNA ２（配列番号
７）GATCCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAG
GAAGGGTCTTGCAGATCTAを合成する。合成したDNAを90℃２
分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２
５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成
させる。Nos-terを持つpUC18プラスミドを制限酵素 Hin
dIIIと BamHI で消化する。合成した２本鎖DNAをpUC18
のHindIII-BamHI部位に挿入し、TATA-boxとNos-terを含
むプラスミドを構築する。上記の手順は、図２に示し
た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】（エレクトロポレーションによる遺伝子導
入）上記で得たプロトプラストを濃度が 2.5 X 10６ 細
胞/ mL になるように エレクトロポレーション緩衝液
（5 mM MES pH5.8, 70 mM KCl, 0.3 M マニトール）に
再懸濁する。 エレクトロポレーション用キュベット
（ジーンパルサーキュベット 0.4 cm elecrode, バイオ
ラッド社製）に構築したpGAL4-LUCレポーター遺伝子と
エフェクタープラスミド としてpGALDB-AtERF4あるいは
そのデレーションシリーズ（pGALDB-1/25AtERF4~pGALDB
-204-225AtERF4）のDNAを 各10ugと リファレンス遺伝
子プラスミド1ugを 100 uL の 2X エレクトロポレーシ
ョン緩衝液（10 mM MES pH5.8, 140 mM KCl, 0.6 M マ
ニトール）を加えて、滅菌水で全量を 200 uL にする。
キュベットに 600uL のプロトプラスト懸濁液を入れ
て、エレクトロポレーター（Genepulser II Electropor
ation Systemバイオラッド社製）を用いて 600 V, 25 m
F の条件で DNA を導入する。導入後、キュベットから
プロトプラストを1,000 rpm で５分間遠心して回収し、
5 mL の 0.4 M マニトールを含む MS 培地 にプロトプ
ラストを再懸濁して、 26℃で６時間暗所で静置した
後、レポーター遺伝子の活性を測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｃ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA08 AA20 BA80 CA04 DA01 EA04 FA02 GA14 GA17 GA21 HA01 HA17 4B064 AG01 BA12 BA14 CA11 CA19 CC24 DA01 DA10 DA11 4B065 AA88X AA88Y AA89X AB01 AC14 BA03 BA10 CA24 CA41 CA44 CA53 4H045 AA10 BA10 BA20 CA30 EA01 EA05 EA28 FA72 FA74 HA04 HA05

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配
    列からなるペプチド、又は（ｂ）アミノ酸配列（ａ）に
    おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
    付加されたアミノ酸配列からなる遺伝子の転写を抑制す
    る機能を有するペプチド。
  2. 【請求項２】 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配
    列からなるペプチド、又は（ｂ）アミノ酸配列（ａ）に
    おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
    付加されたアミノ酸配列からなる遺伝子の転写を抑制す
    る機能を有するペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のペプチドをコー
    ドする遺伝子。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の遺伝子を含有する組み
    換えベクター。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載の組み換えベクターを含
    む形質転換体。
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