CN115947808B - 通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用 - Google Patents
通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，公开了通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用，具体为一种在水稻中通过基因编辑膜结合转录因子OsNTL2的编码区序列，产生该基因翻译提前终止并功能获得的不含载体序列的水稻材料，该水稻材料苗期抗高温能力明显增强，生殖期高温胁迫后结实率明显增加、产量明显提高。本发明提供的方法使具有跨膜域的定位于细胞核外的转录因子蛋白转变为没有跨膜域的定位于细胞核中的转录因子蛋白，其突变的基因对应的蛋白在植物抗高温方面具有明显的作用，产生的基因编辑水稻材料具有很高的应用价值，能够明显减少农作物在高温等条件下的产量损失。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用，产生该基因翻译提前终止并功能获得的，在苗期和生殖期高温抗性均增强的，不含载体序列的水稻材料的应用，以及获得的能增强水稻高温抗性的OsNTL2突变形式的基因。
背景技术
植物在生长发育过程中会遭受到来自生存环境的诸多胁迫，例如高温、干旱、冷害、盐害等。严重的环境胁迫成为全球范围内粮食减产、品质降低的关键因素之一。根据数据模型估算，全球平均气温升高1℃，主要粮食作物减产3-8％(Zhao,C.,etal.Temperature increase reduces global yields of major crops in fourindependent estimates.Proc Natl Acad Sci USA,2017,114(35):9326-9331.)。植物在长期的进化过程中形成了应对各种生物胁迫、非生物胁迫的适应机制和调控网络。基因转录调控在整个调控网络中至关重要，而转录因子参与其中发挥着关键作用。当环境条件发生变化时，植物通过一系列的信号感知和加工过程，激活转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合后，启动或抑制下游基因的转录和翻译，最终使植物作出相应的调节应对外界环境变化。据报道，很多转录因子家族成员都参与植物对非生物环境胁迫的响应，其中比较大的基因家族有：bZIP、AP2/ERF、NAC、WRKY、MYB、ZincFinger和bHLH等(Lindemose,S.,etal.Structure,function and networks of transcription factors involved inabiotic stress responses.Int J Mol Sci,2013,14(3):5842-5878.)。大量的研究表明，通过基因工程的手段调控参与植物抗逆相关转录因子的表达可以显著提高植物对高温、干旱、冷害、虫害等非生物胁迫和生物胁迫抗性。由此看来，植物对转录因子的调控过程是其抵御环境胁迫的关键环节。本课题组利用高温处理水稻幼苗进行基因表达(分析，结果发现，基因OsNTL2是响应高温(45℃)诱导表达水平上调的水稻膜结合NAC转录因子(图3)，由此推测它在水稻响应高温环境起着至关重要的作用。
目前，水稻中已经发现了约150个NAC转录因子，作为植物特有的一类转录因子，它们参与了许多胁迫应答途径，表现出了丰富而强大的生物学功能(Fang,Y.J.,etal.Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific orstress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice.Mol GenetGenomics,2008,280(6):547-563.)。OsNAC063参与水稻的高盐胁迫和渗透胁迫应答过程(Puranik,S.,et al.NAC proteins:regulation and role in stress tolerance.TrendsPlant Sci,2012,17(6):369-381.)OsNAC6能够响应许多生物胁迫和非生物胁迫，过表达OsNAC6的水稻材料表现出明显的耐旱、耐盐性状(Nakashima,K.,et al.Functionalanalysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic andbiotic stress-responsive gene expression in rice.Plant J,2007,51(4):617-630.)。有文献分析NAC转录因子蛋白结构特征，结果发现水稻中至少含有5个具有疏水跨膜域的膜结合NAC转录因子。膜结合NAC转录因子被称为NTL(NTM1-Like)。水稻膜结合NAC转录因子大多也可被非生物胁迫诱导，其中OsNTL3参与水稻高温胁迫响应(Liu,et al.Amembrane-associated NAC transcription factor OsNTL3 is involved inthermotolerance in rice.Plant Biotechnol J,18(5):1317-1329.)。因此，膜结合转录因子的调控是基因调节网络的重要组成部分，在植物应对不利环境过程中发挥着重要作用。
发明内容
本发明提供一种通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用，通过基因组编辑技术获得不含转基因载体的高温抗性提高的水稻材料。
本发明通过基因编辑技术突变膜结合转录因子编码序列，使其编码的蛋白质在跨膜结构域前提前终止，翻译出定位于细胞核的转录因子蛋白，呈现出持续的转录激活活性，显著提高水稻高温抗性。
本发明通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对膜结合转录因子OsNTL2的碱基序列第2252-3889bp区段内替换、缺失或插入碱基，得到水稻高温抗性基因，使OsNTL2编码的蛋白质在跨膜结构域前提前终止。
所述的膜结合转录因子OsNTL2的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
一种水稻高温抗性基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。所述的水稻高温抗性基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
另一种水稻高温抗性基因的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。所述的水稻高温抗性基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明是利用水稻膜结合NAC转录因子OsNTL2影响水稻高温抗性方面的应用。本发明提供的OsNTL2基因是水稻第8号染色体上的一个膜结合NAC转录因子基因，基因编号为Os08g0157900(RAP编号)或LOC_Os08g06140(MSU编号)。
OsNTL2的基因组DNA全长4434bp，共含有7个外显子，序列如SEQ ID NO.1所示，其结构图见图1。OsNTL2基因编码区CDS全长为2190bp，序列如SEQ ID NO.2所示；OsNTL2基因编码729个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.3所示。OsNTL2蛋白含有一个NAC结构域(NACdomain)，一个跨膜结构域(transmembranedomain)，具体见图2所示。
本发明提供一种利用OsNTL2基因改变水稻高温性状方面的应用，具体为：设计针对OsNTL2基因的sgRNA，采用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，在OsNTL2基因组特定位置造成碱基突变、缺失或插入，从而获得基因组改变的水稻植株。
本发明提供设计并合成sgRNA所需的前导序列(GuideSequence)，其序列碱基为：
CC-NTL2-F1 5-GTGTGAGGATAGGAAGTATCCCAA-3 24mer(SEQ ID NO.8)
CC-NTL2-F2 5-GTGTGATCACCCTGTCCTTCCCGG-3 24mer(SEQ ID NO.9)
CC-NTL2-F3 5-GTGTTGAGAACCATGGGGTGATGC-3 24mer(SEQ ID NO.10)
CC-NTL2-F4 5-GTGTGCATTACCTGCATCACCCCA-3 24mer(SEQ ID NO.11)
CC-NTL2-R1 5-AAACTTGGGATACTTCCTATCCTC-3 24mer(SEQ ID NO.12)
CC-NTL2-R2 5-AAACCCGGGAAGGACAGGGTGATC-3 24mer(SEQ ID NO.13)
CC-NTL2-R3 5-AAACGCATCACCCCATGGTTCTCA-3 24mer(SEQ ID NO.14)
CC-NTL2-R4 5-AAACTGGGGTGATGCAGGTAATGC-3 24mer(SEQ ID NO.15)
将CC-NTL2-F1和CC-NTL2-R1、CC-NTL2-F2和CC-NTL2-R2、CC-NTL2-F3和CC-NTL2-R3、CC-NTL2-F4和CC-NTL2-R4等量混合后，合成双链NTL2-F1R1、NTL2-F2R2、NTL2-F3R3和NTL2-F4R4。具体为：在94℃加热5min，在60℃保持30min。将合成的双链NTL2-F1R1、NTL2-F2R2插入到一个CRISPR-Cas9载体中，NTL2-F3R3、NTL2-F4R4插入到另一个CRISPR-Cas9载体中。
本发明提供含有以上设计的CRISPR-Cas9载体。
本发明提供含有以上CRISPR-Cas9载体的大肠杆菌和农杆菌工程菌。
本发明提供利用农杆菌将设计的CRISPR-Cas9载体转化到水稻品种日本晴中，并筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下：
(1)构建工程菌：将构建的CRISPR-Cas9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-Cas9载体的基因工程菌。
(2)CRISPR-Cas9载体转化水稻愈伤并获得水稻再生苗：用含有CRISPR-Cas9载体的EHA105侵染水稻愈伤组织，并于22℃培养室中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养。经过3-4周培养后，可获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗，种植于水稻田。
(3)鉴定位点突变情况：设计引物将CRISPR-Cas9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为：
OsNTL2-CC-F12 5-GTGCCCGAGATGCTGTTTGG-3 20mer(SEQ ID NO.16)
OsNTL2-CC-R12 5-TGACATACTGATCATGAACTTGC-3 23mer(SEQ ID NO.17)
OsNTL2-CC-F34 5-TGGTTCACAACAGAATATCCAT-3 22mer(SEQ ID NO.18)
OsNTL2-CC-R34 5-GCAAGGATTCAGCACCAGAGT-3 21mer(SEQ ID NO.19)
PCR产物分别为509bp和506bp。将509bp和506bp的PCR产物委托公司测序，确定突变类型；并在后代中筛选突变类型稳定遗传的植株。确定突变类型，其中ntl2-f12-1的突变为在目标区域减少了一个G，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQ ID NO.20所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；ntl2-f12-2的突变为在目标区域插入了T，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQIDNO.22所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.23所示；ntl2-f34-1的突变为在目标区域增加了A，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQIDNO.4所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。ntl2-f34-2的突变为在目标区域增加了G，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
此ntl2-f34-1和ntl2-f34-2水稻材料在苗期的高温抗性方面表现出耐受性状，该位点基因突变能够明显提高水稻对高温胁迫的抗性。此ntl2-f34-2水稻材料在生殖期的高温抗性方面表现出耐受性状，该位点基因突变能够明显提高水稻高温胁迫条件下得结实率和产量。
本发明提供OsNTL2基因改良水稻在高温抗性方面的应用。基因组编辑后的ntl2-f12-1和ntl2-f12-2水稻幼苗材料对高温的抗性比对照日本晴敏感，具体见图4。基因组编辑后的ntl2-f12-1和ntl2-f12-2水稻幼苗材料和对照日本晴高温抗性存活率的统计比较见图5。基因组编辑后的ntl2-f34-1和ntl2-f34-2水稻幼苗材料对高温的抗性比对照日本晴增强，具体见图6。基因组编辑后的ntl2-f34-1和ntl2-f34-2水稻幼苗材料和对照日本晴高温抗性存活率的统计比较见图7。基因组编辑后的ntl2-f34-2水稻材料生殖期对高温的抗性比对照日本晴增强，具体见图8。基因组编辑后的ntl2-f34-2水稻材料和对照日本晴高温胁迫后成熟时株高、穗长、结实率和每穗籽粒重量的统计比较见图9。本发明显示OsNTL2基因在高温抗性方面发挥重要作用，具有很大的应用价值。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明在水稻中利用基因编辑技术编辑突变膜结合NAC转录因子编码基因OsNTL2，探究水稻抵抗高温的性状。本发明通过设计针对OsNTL2基因中编码NAC结构域的核苷酸的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术破坏OsNTL2基因编码区，导致DNA结合域被破坏，此基因编辑水稻材料在苗期的高温抗性方面表现出敏感性状；通过设计针对OsNTL2基因中编码跨膜结构域与编码NAC结构域之间的核苷酸的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术编辑OsNTL2基因编码区，导致编码跨膜域丢失的OsNTL2ΔC，此基因编辑水稻材料在苗期和生殖期的高温抗性方面表现出耐热性状。本发明提供的基因及操作技术在提高水稻高温抗性方面具有明显的作用，可以产生不含转基因载体的水稻材料，具有很高的应用价值，能够明显提高农作物对高温等胁迫的抗性。
附图说明
图1为OsNTL2基因组结构图，其中，外显子用黑框表示，内含子用粗线条表示；
图2为OsNTL2蛋白结构图，其中，NAC domain为DNA结合域，TM为跨膜域，其中箭头所示为突变体中蛋白翻译提前终止位置；
图3为定量PCR实验验证OsNTL2能够响应高温胁迫；
图4为对照日本晴和突变体ntl2-f12-1、ntl2-f12-2的幼苗期高温表型；
图5为对照日本晴和突变体ntl2-f12-1、ntl2-f12-2的存活率比较；
图6为对照日本晴和突变体ntl2-f34-1、ntl2-f34-2的幼苗期高温表型；
图7为对照日本晴和突变体ntl2-f34-1、ntl2-f34-2的存活率比较；
图8为对照日本晴和突变体ntl2-f34-2的生殖期高温表型；
图9为对照日本晴和突变体ntl2-f34-2的产量相关农艺性状的比较；
图10为高温处理前后OsNTL2亚细胞器间转移实验；
图11为高温处理前后OsNTL2蛋白大小变化；
图12为OsNTL2ΔC亚细胞定位实验；
图13为酵母自激活验证OsNTL2Δ1和OsNTL2ΔC具有转录激活活性；
图14为转录组测序实验分析野生型(日本晴)和OsNTL2功能缺失突变体(ntl2-f12-1)中高温响应下游基因的表达差异；
图15为转录组测序实验分析野生型(日本晴)和OsNTL2功能获得突变体(ntl2-f34-2)中高温调控的下游基因的表达差异；
图16为OsNTL2Δ1直接结合的靶基因；
图17为OsNTL2Δ1在高温下直接结合的靶基因。
具体实施方式
以下实施案例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施案例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂均为市售商品。
实施例1：用CRISPR-Cas9编辑OsNTL2基因探究其在高温抗性方面的应用
以下实施案例采用水稻粳稻品种日本晴(Oryza sativaL.japonica.cv.Nipponbare)为例。利用农杆菌将设计的CRISPR-Cas9载体转化到日本晴基因组中，并筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下：
(1)CRISPR-Cas9载体构建
设计并合成sgRNA所需的前导序列(GuideSequence)，其序列碱基为：
CC-NTL2-F1 5-GTGTGAGGATAGGAAGTATCCCAA-3 24mer(SEQ ID NO.8)
CC-NTL2-F2 5-GTGTGATCACCCTGTCCTTCCCGG-3 24mer(SEQ ID NO.9)
CC-NTL2-F3 5-GTGTTGAGAACCATGGGGTGATGC-3 24mer(SEQ ID NO.10)
CC-NTL2-F4 5-GTGTGCATTACCTGCATCACCCCA-3 24mer(SEQ ID NO.11)
CC-NTL2-R1 5-AAACTTGGGATACTTCCTATCCTC-3 24mer(SEQ ID NO.12)
CC-NTL2-R2 5-AAACCCGGGAAGGACAGGGTGATC-3 24mer(SEQ ID NO.13)
CC-NTL2-R3 5-AAACGCATCACCCCATGGTTCTCA-3 24mer(SEQ ID NO.14)
CC-NTL2-R4 5-AAACTGGGGTGATGCAGGTAATGC-3 24mer(SEQ ID NO.15)
将CC-NTL2-F1和CC-NTL2-R1、CC-NTL2-F2和CC-NTL2-R2、CC-NTL2-F3和CC-NTL2-R3、CC-NTL2-F4和CC-NTL2-R4等量混合后，合成双链NTL2-F1R1、NTL2-F2R2、NTL2-F3R3和NTL2-F4R4。具体为：在94℃加热5min，在60℃保持30min。将合成的双链NTL2-F1R1、NTL2-F2R2插入到CRISPR-Cas9中间载体中，NTL2-F3R3、NTL2-F4R4插入到另一个CRISPR-Cas9中间载体中(Zhang,F.,et al.Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cassystem.Cell Res,2013,23(10):1229-32.)，然后分别通过酶切连接到pCAMBIA1300双元载体上。
(2)CRISPR-Cas9载体转化农杆菌
将构建的CRISPR-Cas9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，在LB平板上通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-Cas9载体的基因工程菌。
(3)水稻转基因
A：培养基配方：
N6D固体培养基：N6基本培养基+0.1g/L肌醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel+2mg/L2,4-D，pH5.8
N6I固体培养基：N6基本培养基+0.1g/L肌醇+2g/L水解酪蛋白+40g/L蔗糖+10g/L葡萄糖+3g/LPhytagel+2mg/L2,4-D，pH5.2
N6CH固体培养基：N6基本培养基+0.1g/L肌醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel+2mg/L2,4-D+50mg/L潮霉素B+300mg/L头孢霉素，pH5.8
N6R固体培养基：N6基本培养基+0.1g/L肌醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+50mg/L潮霉素B+300mg/L头孢霉素，pH5.8
B：水稻愈伤组织诱导：
去壳的水稻成熟种子先用体积百分数70％乙醇浸泡1-2min，然后用15％NaClO(v/v)浸泡并摇晃30min，进行表面灭菌(可在摇床上进行)，然后在超净工作台上用无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基N6D上，28℃暗培养。约10-15天后，可见到从胚的位置生长出愈伤组织。
C：水稻愈伤组织的继代培养
剥下从成熟胚上长出的愈伤组织，转入同样的N6D固体培养基上，在28℃下继代培养。以后每两周继代培养一次。
D：农杆菌介导的水稻转基因方法
农杆菌的培养：在转化前一天将含有目的载体的农杆菌加入到50mLLB+50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平的液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养12-16h至OD600＝0.4-0.6。
水稻愈伤的收集：将培养的水稻愈伤组织在超净工作台上收集到一个灭过菌的容器中待用。
侵染菌液的准备：将新鲜培养的农杆菌加入到50mL离心管中，5000rpm，10min收集农杆菌。用10mMMgSO4洗一次。沉淀悬浮于N6I液体培养基(成分同N6I固体培养基，但不加Phytagel)中，调整菌体浓度至OD600为0.5，加入AS(乙酰丁香酮)，使AS终浓度为100mΜ。
侵染和共培养：在收集的水稻愈伤组织中加入适量体积的农杆菌悬浮液，使菌液没过水稻愈伤组织，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基，固体培养基为加入100mMAS的N6I固体培养基，24℃黑暗培养2-3天。
除菌：将共培养后的愈伤转移至50mL的灭菌离心管，用无菌水清洗3次以上，直至洗脱液体比较清亮。倒出洗脱液后，用加入300mg/L头孢霉素的N6D液体培养基再洗一次，倒去洗脱液后，将洗净后的水稻愈伤组织倒在一张无菌滤纸上，吸干多余的水分。
筛选：将洗过的水稻愈伤转移至N6CH固体培养基上，在28℃暗室中培养。每2周继代一次。约4周后，可看到新鲜长出来的抗性愈伤，将这些抗性愈伤转移到新鲜的N6CH培养基上继代。
分化：将抗性愈伤转移至N6R固体培养基上，在光照培养室16h光/8h暗培养。一般经过7-10天左右有绿点出现。30-40天后绿点进一步分化出小苗。将小苗种植于水稻田。
(4)鉴定目的位置突变情况
设计引物将CRISPR-Cas9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为：
OsNTL2-CC-F12 5-GTGCCCGAGATGCTGTTTGG-3 20mer(SEQ ID NO.16)
OsNTL2-CC-R12 5-TGACATACTGATCATGAACTTGC-3 23mer(SEQ ID NO.17)
OsNTL2-CC-F34 5-TGGTTCACAACAGAATATCCAT-3 22mer(SEQ ID NO.18)
OsNTL2-CC-R34 5-GCAAGGATTCAGCACCAGAGT-3 21mer(SEQ ID NO.19)
PCR产物分别为509bp和506bp。将509bp和506bp的PCR产物委托公司测序，确定突变类型；并在后代中筛选突变类型稳定遗传的植株。确定突变类型，其中ntl2-f12-1的突变为在目标区域减少了一个G，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQ ID NO.20所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；ntl2-f12-2的突变为在目标区域减少了T，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQIDNO.22所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.23所示；ntl2-f34-1的突变为在目标区域增加了A，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQIDNO.4所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。ntl2-f34-2的突变为在目标区域增加了G，引起移码突变，突变后的碱基序列如SEQIDNO.6所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。
(5)基因突变水稻在高温抗性方面的考察
本发明提供的OsNTL2基因在改良水稻高温抗性方面具有很高的应用价值。基因编辑突变体水稻ntl2-f12-1和ntl2-f12-2有苗期的高温抗性比对照敏感；基因编辑突变体水稻ntl2-f34-1和ntl2-f34-2在幼苗期的高温抗性方面显著强于日本晴；基因编辑突变体水稻ntl2-f34-2在生殖期的高温抗性方面显著强于日本晴。具体见图4、图5、图6、图7、图8、图9所示。
图4为野生型日本晴对照(NIP)和OsNTL2突变体ntl2-f12-1、ntl2-f12-2的幼苗期高温表型。图例：29℃培养箱正常生长8天左右的水稻野生型(WT)和NTL2的基因编辑水稻突变体材料(ntl2-f12-1、ntl2-f12-2)转移到45℃培养箱培养2天，然后转回29℃培养箱10天恢复生长后观察表型照相。
图5为野生型日本晴对照(NIP)和OsNTL2突变体ntl2-f12-1、ntl2-f12-2的存活率比较。图例：29℃培养箱正常生长8天左右的水稻野生型(WT)和NTL2的基因编辑水稻突变体材料(ntl2-f12-1、ntl2-f12-2)转移到45℃培养箱培养2天，然后转回29℃培养箱10天恢复生长后统计存活率。绿色新叶出现计为存活苗，未出现绿色新叶计为死亡苗。
图6为野生型日本晴对照(NIP)和OsNTL2突变体ntl2-f34-1、ntl2-f34-2材料的幼苗期高温表型。图例：29℃培养箱正常生长8天左右的水稻野生型(WT)和基因编辑突变体材料(ntl2-f34-1、ntl2-f34-2)转移到45℃培养箱培养3天，然后转回29℃培养箱19天恢复生长后观察表型照相。
图7为野生型日本晴对照(NIP)和OsNTL2突变体ntl2-f34-1、ntl2-f34-2存活率比较。图例：29℃培养箱正常生长8天左右的水稻野生型(WT)和ntl2-f34-1、ntl2-f34-2基因编辑突变体材料转移到45℃培养箱培养3天，然后转回29℃培养箱19天恢复生长后统计存活率。绿色新叶出现计为存活苗，未出现绿色新叶计为死亡苗。
图8为野生型日本晴对照(NIP)和OsNTL2突变体ntl2-f34-2材料的生殖期高温表型。图例：29℃温室正常生长到抽穗(挑选抽穗时间一致的分蘖并标记好)的水稻野生型(WT)和ntl2-f34-2基因编辑突变体材料转移到培养箱(白天38℃条件12小时，晚上29℃条件12小时)培养3天，然后转回29℃温室恢复生长至成熟后取标记的穗子观察表型照相，并每个材料收集12个穗子中结实的种子拍照。
图9为野生型日本晴对照(NIP)和OsNTL2突变体ntl2-f34-2产量相关农艺性状比较。图例：29℃温室正常生长到抽穗(挑选抽穗时间一致的分蘖并标记好)的水稻野生型(WT)和ntl2-f34-2基因编辑突变体材料转移到培养箱(白天38℃条件12小时，晚上29℃条件12小时)培养3天，然后转回29℃温室恢复生长至成熟后取标记的穗子，统计穗长、结实率、每穗结实粒数和千籽重。
(5)OsNTL2调控水稻耐高温的分子机理探究
本发明探究了OsNTL2调控高温抗性的分子机理，发现OsNTL2高温下从细胞膜转移到细胞核中，并且其分子量发生了明显改变(图10-11)。苗期和生殖期高温抗性都增强的f34-2突变体中的截短形式的OsNTL2ΔC蛋白也定位在细胞核中(图12)。去除跨膜域的OsNTL2具有转录激活活性，并且氨基酸151-325区间具有转录激活活性；此外，OsNTL2ΔC蛋白也具有转录激活活性(图13)。通过比较野生型水稻日本晴对照(NIP)和OsNTL2基因功能缺失突变体材料(ntl2-f12-1)常温和高温下得基因表达，找到了一批依赖于OsNTL2的高温响应下游基因。具体结果如下：
图10为为高温处理前后OsNTL2亚细胞器间转移实验。图例：将GFP标签融合OsNTL2创制GFP-NTL2稳定表达的水稻转基因材料，将3天大小转基因水稻幼苗进行45℃高温处理，对照为29℃处理，取根在激光共聚焦显微镜下观察，发现对照温度下GFP荧光主要在细胞膜上，高温处理下GFP荧光主要在细胞核中。
图11为OsNTL2在高温处理下会产生一条较小的蛋白形式。图例：采用贝塔雌激素诱导型启动子，将MYC标签融合OsNTL2创制MYC-NTL2稳定表达的水稻转基因材料，将8天大小转基因水稻幼苗先用5μM贝塔雌激素诱导24hr后，再进行45℃高温处理2hr，对照为29℃处理2hr，提取总蛋白进行Western blotting实验，anti-MYC抗体检测融合蛋白，anti-H3抗体检测组蛋白亚基内参，发现相比对照，高温条件下分子量小的条带明显增加。野生型日本晴对照(NIP)中没有MYC信号。
图12为OsNTL2ΔC亚细胞定位实验。图例：将从OsNTL2突变体f34-2中扩增截短形式的OsNTL2ΔC融合到YFP标签(F34G-YFP)，在烟草叶片中瞬时表达，空载体YFP做对照，激光共聚焦显微镜下观察，发现相比空载体YFP的细胞质和细胞核定位情况，OsNTL2ΔC主要定位于细胞核，与细胞核marker(NLS-mCherry)共定位。
图13为酵母自激活验证OsNTL2Δ1和OsNTL2ΔC具有转录激活活性。图例：将不同长度片段的OsNTL2(NTL2Δ1-NTL2Δ4)以及从OsNTL2突变体f34-2中截短形式的OsNTL2ΔC融合到GAL4的DNA结合结构域(BD)并转化酵母细胞，在营养缺陷型(-TRP)培养基中筛选得到酵母菌株，并在两种营养缺乏(-TRP-HIS)培养基中验证它们是否可以激活下游报告基因(HIS)的表达。
图14为转录组测序实验分析野生型(日本晴)和OsNTL2功能缺失突变体(ntl2-f12-1)中高温响应下游基因的表达差异。图例：29℃培养箱正常生长8天左右的野生型水稻日本晴对照(NIP，WT)和OsNTL2的基因编辑突变体材料(ntl2-f12-1，f12)转移到45℃培养箱培养3小时后取样进行RNA-Seq分析。维恩图显示的是各材料中高温处理上调(Up-regulated)的基因数目。差异表达的标准为上调时Fold Change≥2，P≤0.05。该分析得到受高温处理上调、依赖于OsNTL2的838个基因。
图15为转录组测序实验分析野生型(日本晴)和OsNTL2功能获得突变体(ntl2-f34-2)中高温调控的下游基因的表达差异。图例：29℃培养箱正常生长8天左右的野生型水稻日本晴对照(NIP,WT)和OsNTL2的基因编辑突变体材料(ntl2-f34-2，f34)转移到45℃培养箱培养3小时后取样进行RNA-Seq分析。维恩图显示的是野生型中高温处理上调(Up-regulated)以及不同温度条件下突变体相对野生型上调的基因数目。差异表达的标准为上调时Fold Change≥2，P≤0.05。该分析得到OsNTL2功能获得突变体(ntl2-f34-2)中766个上调的基因，其中114个基因在野生型中受高温处理上调。
图16为OsNTL2Δ1直接结合的靶基因。图例：把截短形式的OsNTL2、(NTL2Δ1)融合到9XMYC标签(N-端融合)，采用组成型启动子UBIQUITIN在水稻中稳定表达。29℃培养箱正常生长2周左右的以上水稻转移到45℃培养箱培养3小时后取样进行ChIP-Seq分析。维恩图显示的是三个重复中OsNTL2Δ1直接结合的靶基因，其中6169个基因的启动子(UP2K)区域在三个的重复样品中都有显著富集(q<0.001)。
图17为OsNTL2Δ1在高温下直接结合的靶基因。图例：把截短形式的OsNTL2、(NTL2Δ1)融合到9XMYC标签(N-端融合)，采用组成型启动子UBIQUITIN在水稻中稳定表达。将OsNTL2功能获得突变体(ntl2-f34-2)中766个特异上调的基因与OsNTL2Δ1直接结合的6169个靶基因进行比较分析，维恩图显示共有258个重叠的基因，这些基因可能是幼苗期OsNTL2功能获得突变体(ntl2-f34-2)中OsNTL2直接调控的下游基因。
Claims (1)
1.通过基因编辑突变膜结合转录因子制备高温抗性增强的水稻材料的应用，其特征在于，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对膜结合转录因子OsNTL2的碱基序列第2252-3889 bp区段内替换、缺失或插入碱基，得到水稻高温抗性基因，制备高温抗性增强的水稻材料，使OsNTL2编码的蛋白质在跨膜结构域前提前终止，翻译出定位于细胞核的转录因子蛋白，呈现出持续的转录激活活性，显著提高水稻高温抗性；
所述的膜结合转录因子OsNTL2的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的水稻高温抗性基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID NO.6所示。
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