ES2913665T3

ES2913665T3 - Método y dispositivo para la purificación de sangre a partir de ADN celular libre en circulación

Info

Publication number: ES2913665T3
Application number: ES18773736T
Authority: ES
Inventors: Kirill Surkov
Original assignee: Santersus AG
Current assignee: Santersus AG
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2018-09-17
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2038-09-17
Also published as: AU2025202467A1; CN111433605B; JP2020534028A; IL273413B1; EP3978923A1; JP7341540B2; AU2018332326B2; AU2018332326A1; PL3685165T3; CA3084620A1; IL273413A; JP2022062112A; US20200261639A1; US11771812B2; IL273413B2; EP3685165A1; JP7019221B2; AU2025202467A9; CN117138146A; JP7341539B2

Abstract

Un dispositivo configurado para realizar la aféresis que comprende una o más matrices de afinidad, en el que dicha una o más matrices de afinidad son capaces de capturar el ADN celular libre (cfDNA) unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido a partir de la sangre o el plasma de un sujeto, en el que al menos una de la una o más matrices de afinidad comprende una histona.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y dispositivo para la purificación de sangre a partir de ADN celular libre en circulación

Campo de la invención

La invención da a conocer dispositivos para aféresis y su uso para la eliminación de prácticamente todos los tipos de ADN celular libre (cfDNA) en la sangre de los pacientes, a saber, cfDNA unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido (incluidos el ADN de doble cadena (dsDNA), el ADN monocatenario (ssDNA) y oligonucleótidos), para limitar los efectos negativos del cfDNA circulante y para tratar diversas enfermedades.

Antecedentes de la invención

El ADN extracelular (eDNA) circulante, también llamado ADN celular libre (cfDNA), está presente en pequeñas cantidades en la sangre de los individuos sanos.

El aumento de la cantidad de cfDNA circulante es ahora un marcador ampliamente aceptado para una serie de enfermedades y afecciones patológicas que incluyen, entre otros, cáncer, cáncer metastásico, insuficiencia orgánica aguda, infarto de órganos (incluidos infarto de miocardio y accidente cerebrovascular isquémico), accidente cerebrovascular hemorrágico, trastornos autoinmunitarios, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), rechazo del injerto, septicemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), lesión traumática, estado proinflamatorio en los ancianos, diabetes, aterosclerosis, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades autoinmunitarias, eclampsia, infecundidad, trastornos de la coagulación, complicaciones asociadas al embarazo e infecciones. Los diferentes subtipos de ADN celular libre en circulación podrían desempeñar una función importante en la progresión de ciertas enfermedades y afecciones patológicas.

Se propuso utilizar la administración sistémica de la enzima desoxirribonucleasa (DNasa), que hidroliza específicamente el cfDNA circulante, para el tratamiento de la infecundidad (patente de los EE.UU. n.° 8916151); trastornos cardiovasculares (patente de los EE.UU. n.° 9.642.822); cáncer; septicemia, enfermedad de injerto contra huésped (GBHD); insuficiencia orgánica; diabetes; aterosclerosis; reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (patentes de los EE.UU. nos.9.248.166; 8.535.663; 7.612.032; 8.388.951; 8.431.123).

Sin embargo, a diferencia de los modelos animales en etapas tempranas, los datos en entornos clínicos reales han demostrado que la aplicación sistémica de la enzima desoxirribonucleasa (DNasa) tiene poco efecto sobre la reducción de la cantidad de cfDNA circulante.

Hazout, A. (documento PCT/IB2013/056321) ha descrito que en 10 mujeres con altos niveles de cfDNA circulante (>80 ng/pl) tratadas con 0,1 mg/kg de DNasa I al día por vía intramuscular dos veces al día durante siete días se observó solo una disminución promedio del 26 % en la cantidad de cfDNA circulante. Sus observaciones coincidieron con las de Davis et al., quienes no lograron demostrar la reducción de la cantidad circulante de anticuerpos contra el dsDNA en los pacientes con nefritis lúpica que recibieron en total una dosis de 25 pg/kg de desoxirribonucleasa recombinante humana en una inyección intravenosa y diez subcutáneas durante un período de 19 días, a pesar de lograr que la concentración plasmática de desoxirribonucleasa catalíticamente efectiva estuviera entre 40-100 ng/ml (Davis J.C. et al., Recombinant human Dnase I (rhDNase) in patients with lupus nephritis. Lupus (1999) Vol 8 (1), págs. 68-76).

El tipo más abundante de cfDNA circulante está representado por el ADN unido a nucleosomas. Un nucleosoma es una subunidad de la cromatina nuclear y consiste en una proteína nuclear central formada por un octámero del corazón de histonas con representación doble y aproximadamente 147 pares de bases de ADN bicatenario (Oudet P, Gross-Bellard M, Chambon P. Electron microscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit. Cell. 1975; 4:281-300). El cfDNA unido a nucleosomas podría circular en la sangre como mononucleosomas o estructuras de orden superior, tales como oligonucleosomas o incluso fragmentos de cromatina que contienen más de 50-100 x 103 pares de bases de ADN. Este tipo en concreto de cfDNA circulante se origina a partir de las células que experimentan necrosis o apoptosis. Otra fuente de cfDNA circulante es la NETosis de neutrófilos. Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son hebras extracelulares de ADN descondensado expulsadas desde los neutrófilos activados, tienen más de 15 x 103 pares de bases de longitud que se organizan en estructuras reticulares 3D de 10-30 nm. El cfDNA que origina la NETosis puede estar libre de partículas o unido a partículas. Las NET también contienen enzimas muy citotóxicas y proteínas citotóxicas que se originan en el espacio interior de los neutrófilos (Scrensen, O.E. y Borregaard, N., Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J. Clin. Invest. 2 de mayo de 2016; 126(5): 1612-20). Se ha demostrado recientemente que no solo los neutrófilos, sino que también los macrófagos pueden producir estructuras similares a las NET (Nat Med., 2018, 24(2):232-238).

Otro tipo importante de cfDNA circulante unido a partículas es el ADN unido a exosomas. Los exosomas son pequeñas vesículas con membrana (30-100 nm) originadas por exocitosis y secretadas por la mayoría de los tipos celulares, que pueden contener ADN monocatenario (ssDNA), mitocondrial (mtDNA) y bicatenario (dsDNA) de 2,5-10 x 103 pares de bases en el espacio interno o externo del exosoma (Thakur, B. K. et al., Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection, Cell Research (2014) 24:766-769).

Una parte significativa del cfDNA circulante libre de partículas está representada por dsDNA y ssDNA lineales y circulares secretados por las células cancerosas, las células inmunitarias activadas y otros tipos de células. Este tipo de cfDNA generalmente tiene una longitud de 250-1000 pares de bases o más y puede estar enriquecido en secuencias genómicas únicas (Kumar, P. et al., Normal and cancerous tissues release extrachromosomal circular DNA (eccDNA) into the circulation, Mol. Cáncer. Res., 20 de junio de 2017 DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-17-0095). Otro componente importante del cfDNA circulante libre de partículas es el ADN mitocondrial (mtDNA) de diferentes longitudes.

Otro tipo recientemente descubierto de cfDNA circulante libre de partículas está representado por los oligonucleótidos de ADN de doble cadena (dsDNA) ultracortos y los oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla (ssDNA) con una longitud subnucleosómica (es decir, por lo general de menos de ~ 147 pares de bases). Se demostró que este cfDNA en concreto está enriquecido con ADN mitocondrial (mtDNA), ADN de origen microbiano y secuencias del genoma humano mutado (Burnham P., Single-stranded DNA library preparation uncovers the origin and diversity of ultrashort cell-free DNA in plasma, Scientific Reports 6, número de artículo: 27859 (2016), doi: 10.1038/srep27859). Es importante destacar que este tipo de cfDNA circulante también contiene fragmentos de ADN de bajo peso molecular que son similares a los que aparecen después de la degradación del ADN unido a partículas por la enzima DNasa I en la sangre de los pacientes.

Se ha intentado varias veces utilizar las tecnologías de eliminación extracorpórea para purificar la sangre de los pacientes por eliminación de ciertos constituyentes del grupo de cfDNA circulantes. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 9.364.601; publicación de solicitud de la patente de los EE.UU. n.° 2007/0092509; Kusaoi et al., Ther. Apher. Dial., 2016, 20:348-353.

La solicitud de patente internacional WO2017/049279 describe celdas de flujo para usar en la aféresis, que incluyen superficies que portan anticuerpos contra las histonas.

Existe la necesidad de nuevos métodos extracorpóreos para tratar las enfermedades asociadas a una concentración elevada en circulación de cfDNA en la sangre y de nuevos dispositivos más eficaces para realizar tales métodos.

Compendio de la invención

Como se especifica en el apartado de Antecedentes, existe la necesidad de nuevos métodos extracorpóreos para tratar las enfermedades asociadas a una concentración elevada de cfDNA circulantes en la sangre y de nuevos dispositivos más eficaces para realizar tales métodos. La presente invención aborda esta y otras necesidades al dar a conocer los dispositivos de aféresis y los procedimientos asociados.

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y los ejemplos que no caen dentro de estas reivindicaciones solo tienen fines ilustrativos.

En un aspecto, la invención da a conocer un dispositivo configurado para realizar la aféresis, que comprende una o más matrices de afinidad, en donde dicha una o más matrices de afinidad son capaces de capturar ADN celular libre (cfDNA) unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido, a partir de la sangre o el plasma de un sujeto, en donde al menos una de la una o más matrices de afinidad comprende una histona.

En algunas realizaciones, el cfDNA no unido comprende dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos.

En algunos ejemplos, el dispositivo de la invención comprende dos o más matrices de afinidad. En algunas realizaciones (i) la primera o más matrices de afinidad son capaces de capturar el ADN celular libre (cfDNA) unido a nucleosomas y/o el cfDNA unido a exosomas, y (ii) la segunda o más matrices de afinidad son capaces de capturar el cfDNA libre no unido, y en donde las matrices de afinidad primera y segunda están dispuestas dentro del dispositivo en cualquier orden. En algunos ejemplos, (i) la primera o más matrices de afinidad comprenden una proteína de unión al ADN (p. ej., una histona [p. ej., una histona H1]), un anticuerpo antihistónico (p. ej., un anticuerpo contra la histona H2A), un anticuerpo antinucleosómico (p. ej., AN-1, AN-44), un agente intercalante del ADN (p. ej., un colorante de tipo Hoechst como, p. ej., Hoechst 33342), un polímero de unión al ADN (p. ej., un polímero catiónico/básico [p. ej., polietilenimina, poli-L-lisina, poli-L-arginina, bromuro de hexadimetrina, dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) terminado en amino (-NH²), dendrímero de polipropilenimina (PPI)], un polímero no iónico/neutro [por ejemplo, polivinilpirrolidona (PVP), polivinilpolipirrolidona (PVPP), poli(N-óxido de 4-vinilpiridina)], un polímero aniónico/ácido; un polímero lineal [p. ej., polietilenimina, poli-L-lisina, poli-L-arginina], un polímero ramificado [p. ej., poli-L-lisina hiperramificada, polietilenimina hiperramificada], un polímero dendrimérico [p. ej., dendrímero de poliamidoamina (PAMAM), dendrímero de polipropilenimina (PPI)]), un anticuerpo anti-ADN (p. ej., anticuerpo monoclonal de ratón de tipo IgM contra ADN mono- y bicatenario ([49/4A1], ab35576, Abcam), una lectina (p. ej., lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), concanavalina A, fitohemalutinina o cianovirina), y cualquier combinación de los mismos, y (ii) la segunda o más matrices de afinidad comprenden una proteína de unión al ADN (p. ej., una histona [p. ej., una histona H1]), un agente intercalante del ADN (p. ej., un colorante de tipo Hoechst como, por ejemplo, Hoechst 33342), un polímero de unión al ADN (por ejemplo, un polímero catiónico/básico [por ejemplo, polietilenimina, poli-L-lisina, poli-L-arginina, bromuro de hexadimetrina, dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) terminado en amino (-NH²), dendrímero de polipropilenimina (PPI)], un polímero no iónico/neutro [p. ej., polivinilpirrolidona (PVP), polivinilpolipirrolidona (PVPP), poli(N-óxido de 4-vinilpiridina)], polímeros aniónicos/ácidos; polímeros lineales [p. ej., polietilenimina, poli-L-lisina, poli-L-arginina], un polímero ramificado [p. ej., poli-L-lisina hiperramificada, polietilenimina hiperramificada], un polímero dendrimérico [p. ej., dendrímero de poliamidoamina (PAMAM), dendrímero de polipropilenimina (PPI)]), un anticuerpo anti-ADN (p. ej., anticuerpo monoclonal de ratón de tipo IgM contra ADN mono- y bicatenario ([49/4A1 ], ab35576, Abcam), y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, dichas dos o más matrices de afinidad están ordenadas secuencialmente como dos o más columnas de afinidad. En algunos ejemplos, la primera matriz de afinidad de la secuencia comprende un polímero de unión al ADN (por ejemplo, dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) terminado en amino (-NH²), dendrímero de polipropilenimina (PPI), poli-L-lisina hiperramificada o polietilenimina hiperramificada) o un agente intercalante del ADN (p. ej., Hoechst 33342). En ciertas realizaciones, la matriz de afinidad no es un dendrímero de poliamidoamina (PAMAM).

Un ejemplo no limitante de una combinación de columnas útil (dispuesta en cualquier orden) es la siguiente: (i) columna de afinidad con anticuerpos contra la histona H2A, (ii) columna de afinidad con lectina y (iii) columna de afinidad con la histona H1.

En algunas realizaciones, el dispositivo de la invención comprende una única matriz de afinidad que comprende una histona (por ejemplo, histona H1 como, por ejemplo, la histona H1.3).

En algunas realizaciones, el dispositivo de la invención captura al menos 30 mg de cfDNA por cada procedimiento de aféresis.

En algunas realizaciones, el dispositivo de la invención reduce la concentración del cfDNA en la sangre en al menos un 25 % por cada procedimiento de aféresis. En algunas realizaciones, el dispositivo de la invención reduce la concentración del cfDNA en la sangre en al menos un 50 % por cada procedimiento de aféresis. En algunas realizaciones, el dispositivo de la invención reduce la concentración del cfDNA en la sangre en al menos un 75 % por cada procedimiento de aféresis.

Se describe además un método para reducir la concentración del ADN celular libre (cfDNA) en la sangre de un sujeto, en donde el método comprende: (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del sujeto a un dispositivo de aféresis de la presente invención para producir sangre o plasma con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma con menos cantidad de cfDNA al sujeto, donde el procedimiento de aféresis reduce la cantidad de cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unido en la sangre del sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad caracterizada por tener una gran cantidad de cfDNA en la sangre. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad neurodegenerativa, un cáncer, una reacción adversa relacionada con la quimioterapia, una reacción adversa inducida por radiación (por ejemplo, síndrome de radiación aguda), una insuficiencia orgánica, una lesión orgánica, un infarto orgánico, isquemia, un acontecimiento vascular agudo, un accidente cerebrovascular, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), rechazo de injerto, septicemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), una lesión traumática, envejecimiento, diabetes, aterosclerosis, un trastorno autoinmunitario, eclampsia, infecundidad, una complicación asociada al embarazo, un trastorno de la coagulación y una infección.

El dispositivo de la invención puede ser útil en un método para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesite, en donde el método comprende: (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del sujeto a un dispositivo de aféresis de la presente invención para producir la sangre o el plasma con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma con menos cantidad de cfDNA al sujeto, en donde el procedimiento de aféresis reduce la cantidad de cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unido en la sangre del sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad caracterizada por una concentración elevada de cfDNA en la sangre. Los ejemplos no limitantes de enfermedades tratables por los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa, un cáncer, una reacción adversa relacionada con la quimioterapia, una reacción adversa inducida por radiación (por ejemplo, síndrome de radiación aguda), una insuficiencia orgánica, una lesión orgánica, un infarto orgánico, isquemia, un acontecimiento vascular agudo, un accidente cerebrovascular, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), rechazo de injerto, septicemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), una lesión traumática, envejecimiento, diabetes, aterosclerosis, un trastorno autoinmunitario, eclampsia, infecundidad, una complicación asociada al embarazo, un trastorno de la coagulación y una infección.

Tal método puede comprender además la vigilancia de la concentración de cfDNA en la sangre del sujeto.

En un aspecto, el método puede comprender además continuar o repetir el procedimiento de aféresis hasta que la concentración de cfDNA se reduzca al menos en un 25 %, al menos en un 50 % o en al menos un 75 %.

En un aspecto, el método puede comprender además continuar o repetir el procedimiento de aféresis hasta que se eliminen al menos 30 mg de cfDNA de la sangre del sujeto.

El procedimiento de aféresis se puede repetir dos o más veces.

En algunos casos, la sangre para el procedimiento de aféresis proviene de la vena porta.

En algunas realizaciones, el sujeto es humano.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia en la descripción, las reivindicaciones y los dibujos que vienen a continuación.

Breve descripción de los dibujos

En la figura 1 se muestra un perfil electroforético del cfDNA circulante del plasma de un paciente con cáncer metastásico.

En las figuras 2A y 2B se muestran tumores extirpados de ratones tratados con ADN según el ejemplo 3, en los que la sangre se purificó con una matriz de afinidad con anticuerpos antihistónicos y una matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno). En la figura 2A se muestran tumores extirpados de ratones del grupo de control. En la figura 2B se muestran tumores extirpados de ratones tratados con ADN de un paciente con NSCLC T3N2M+ purificado a partir del cfDNA circulante unido a nucleosomas y a exosomas.

En la figura 3 se muestra un perfil electroforético del cfDNA circulante del plasma de un paciente con cáncer metastásico y de un paciente con accidente cerebrovascular.

En la figura 4 se muestra un perfil electroforético del cfDNA circulante del plasma de un paciente con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y síndrome de disfunción multiorgánica (MODS).

En la figura 5 se muestra un perfil electroforético del cfDNA circulante utilizado en los experimentos de cultivos celulares.

En la figura 6 se muestra un perfil electroforético del cfDNA circulante, transferencia Western de la DNasa I y cuantificación de la actividad DNasa I y el cfDNA circulante.

En la figura 7 se muestra un perfil electroforético del cfDNA circulante del plasma de un paciente con septicemia.

En la figura 8 se muestran los resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 1 % de plasma modelo enriquecido con cfDNA antes y después de la prueba de adsorción de volumen. El carril 1 es el plasma modelo enriquecido con el cfDNA antes de la incubación; el carril 2 es el plasma modelo enriquecido con el cfDNA después de la incubación con el control de Sepharose FF con etanolamina; el carril 3 es el plasma modelo enriquecido con el cfDNA después de la incubación con la PDAM; el carril 4 es el plasma modelo enriquecido con el cfDNA después de la incubación con la PLLAM; el carril 5 es el plasma modelo enriquecido con el cfDNA después de la incubación con la matriz de afinidad con H1.3.

En la figura 9 se muestran los resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 1 % del plasma del paciente diagnosticado con septicemia odontogénica antes y después de la prueba de adsorción de volumen. El carril 1 es el plasma del paciente con la septicemia odontogénica después de la incubación con el control de Sepharose FF con etanolamina; el carril 2 es el del blanco de agua destilada; el carril 3 es el plasma del paciente con la septicemia odontogénica después de la incubación con la matriz de afinidad con H1.3; el carril 4 es el del blanco de agua destilada; el carril 5 es el plasma del paciente con la septicemia odontogénica después de la incubación con la PDAM; el carril 6 es el plasma del paciente con la septicemia odontogénica después de la incubación con la PLLAM.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que suele conocer un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos y/o etapas del tipo descrito en la presente memoria y/o que resultarán evidentes para los expertos en la materia al leer esta descripción.

El término "alrededor de" o "aproximadamente" incluye estar dentro de un margen estadísticamente significativo de un valor. Tal margen puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50%, más preferiblemente dentro del 20%, aún más preferiblemente dentro del 10% e incluso más preferiblemente dentro del 5%, de un valor o margen dado. La variación permisible abarcada por el término "alrededor de" o "aproximadamente" depende del sistema en concreto que se esté estudiando, y puede ser fácilmente apreciada por un experto en la materia.

El término "dispositivo" tal como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier montaje conocido en la técnica que permite la purificación de soluciones líquidas, tales como, entre otros, por ejemplo, cualquier pieza hueca, una columna, una matriz de columna, un filtro, una membrana, un material semipermeable, una perla (por ejemplo, una microperla o una nanoperla) o un tubo. Los términos "columna" y "cartucho" se usan indistintamente en la presente memoria en el contexto de un dispositivo de aféresis.

El término "matriz de afinidad", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a (i) un soporte sólido en el que se inmoviliza un ligando (p. ej., una molécula de unión a cfDNA) o a (ii) un soporte sólido formado por el propio ligando (p. ej., un polímero hidroinsoluble de unión al ADN).

El término "proteína de unión a ADN" se refiere a proteínas que se unen a ADN monocatenario (ssDNA) o ADN bicatenario (dsDNA). Las proteínas de unión al ADN pueden unirse al ADN de manera específica de secuencia (p. ej., factores de transcripción y nucleasas) o sin especificidad de secuencia (p. ej., polimerasas e histonas). Los miembros de la familia de las histonas conectoras H1 son un componente clave de la cromatina y se unen a la partícula central del nucleosoma alrededor de los sitios de entrada y salida del ADN.

Tal como se usa en la presente memoria, los términos "ADN circulante", "ADN celular libre (cfDNA)", "ADN celular libre (cfDNA) en circulación", "ADN extracelular (eDNA)" y "ADN extracelular (eDNA) circulante" se usan indistintamente para referirse al ADN presente en la sangre o el plasma ubicado fuera de las células circulantes de origen hematopoyético y no hematopoyético.

El cfDNA unido a nucleosomas es el ADN que está unido a un nucleosoma. Un nucleosoma es una subunidad de la cromatina nuclear. El cfDNA unido a nucleosomas podría circular en la sangre como mononucleosomas o como estructuras de orden superior, tales como oligonucleosomas, o incluso fragmentos de la cromatina que contienen más de 50-100 x 103 pares de bases de ADN. El cfDNA circulante unido a nucleosomas puede originarse a partir de las células que experimentan necrosis o apoptosis y de NETosis de neutrófilos.

El cfDNA unido a exosomas es cfDNA que está unido a los exosomas o presente en los exosomas. Los exosomas son pequeñas vesículas con membrana (aproximadamente 30-100 nm) originadas por exocitosis, secretadas por la mayoría de los tipos celulares, que pueden contener ADN monocatenario (ssDNA), ADN mitocondrial (mtDNA) y ADN bicatenario (dsDNA) en el espacio interno o externo del exosoma.

Los términos "cfDNA no unido" o "cfDNA sin partículas" o "cfDNA libre de partículas" se refieren al cfDNA que no está unido a exosomas ni a nucleosomas y abarca ADN bicatenario (dsDNA), ADN monocatenario (ssDNA), lineales o circulares, y oligonucleótidos, incluidas las moléculas de ADN ultracortas de tamaño subnucleosómico (normalmente de menos de 147 pares de bases).

Tal como se usan en la presente memoria, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a animales, incluidos los mamíferos tales como humanos, animales veterinarios (por ejemplo, gatos, perros, vacas, caballos, ovejas, cerdos, etc.) y animales modelo para experimentación. En ciertas realizaciones, el sujeto se refiere a un paciente humano, incluidos ambos sexos en poblaciones de adultos y niños.

En el contexto de la presente invención, en la medida en que se relacione con cualquiera de las enfermedades enumeradas en la presente memoria, los términos "tratar", "tratamiento" y similares significan aliviar o mitigar al menos un síntoma asociado a dicha afección, o ralentizar o revertir la progresión de tal afección. Dentro del significado de la presente invención, el término "tratar" también significa detener, retrasar el inicio (es decir, el período anterior a la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar una enfermedad. Los términos "tratar", "tratamiento" y similares con respecto a un estado, trastorno o afección también pueden incluir (1) prevenir o retrasar la aparición de al menos un síntoma clínico o subclínico del estado, trastorno o afección que se desarrolla en un sujeto que puede estar afectado o predispuesto al estado, trastorno o afección, pero que aún no experimenta ni muestra síntomas clínicos ni subclínicos del estado, trastorno o afección; o (2) inhibir el estado, trastorno o afección, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de la misma (en caso de un tratamiento de mantenimiento) o al menos un síntoma clínico o subclínico de la misma; o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado, trastorno o afección o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de análisis estadístico, biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, química de conjugación y bioquímica, que están dentro de la experiencia en la técnica. Dichas herramientas y técnicas se describen en detalle en, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, Nueva Jersey; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, Nueva Jersey; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; y Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ. Hermanson (2013) Bioconjugate Techniques, 3a ed., Academic Press; Niemeyer (2004) Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods, Springer Science & Business Media y Hermanson et al. (1992) Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press. Se explican otras técnicas más, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. n.° 7.912.698 y en las publicaciones de solicitud de patente de los EE.UU. n.os 2011/0202322 y 2011/0307437.

Dispositivos y métodos de la invención

Como se especifica en el apartado de Antecedentes, en la técnica existe una gran necesidad de desarrollar nuevos métodos y dispositivos para reducir el nivel de prácticamente todos los tipos de cfDNA circulantes en la sangre. La presente descripción aborda esta y otras necesidades al dar a conocer métodos y dispositivos de aféresis, en los que el dispositivo de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA, a saber, cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos)).

El uso de tecnologías de extracción extracorpórea puede proporcionar una solución eficaz para eliminar el cfDNA de la circulación y, en consecuencia, disminuir la concentración y los efectos negativos del cfDNA circulante. La aféresis terapéutica es un tratamiento extracorpóreo que extrae los componentes sanguíneos de los pacientes; se utiliza para el tratamiento de afecciones en las que una sustancia patógena o un componente de la sangre provoca el desarrollo de enfermedades: véase, por ejemplo, Ward M.D., Conventional Apheresis Therapies: a Review. Journal of Clinical Apheresis 26: 230-238 (2011).

Sorprendentemente, como se demuestra en la presente memoria, la eliminación extracorpórea de prácticamente todos los tipos de cfDNA circulantes tiene un impacto positivo en el tratamiento de las enfermedades caracterizadas por una concentración elevada de cfDNA circulantes en la sangre.

La presente descripción da a conocer un método para tratar las enfermedades caracterizadas por una concentración elevada de cfDNA circulantes a través de la eliminación de prácticamente todos los tipos de cfDNA, a saber, cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos) de la sangre de un sujeto para reducir los efectos negativos del cfDNA circulante.

Sin desear limitarse a la teoría, en ciertas enfermedades en las que aumenta la concentración de cfDNA circulantes, diferentes tipos de cfDNA circulantes podrían actuar en conjunto para desencadenar diferentes vías moleculares, cada una de las cuales conduce a la progresión de la enfermedad y la mortalidad del paciente; diferentes tipos de cfDNA circulantes que actúan juntos podrían generar una reacción adversa sinérgica, es decir, el efecto tóxico (negativo) de dos o más tipos de cfDNA circulantes es mayor que la suma de los efectos negativos de cada tipo de cfDNA por separado.

Los inventores han descubierto que la eliminación de prácticamente todos los tipos de cfDNA, a saber, cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos el ADN de doble cadena [dsDNA], el ADN de cadena sencilla [ssDNA] y los oligonucleótidos) de la sangre de pacientes en los que aumentó la concentración de cfDNA circulantes puede reducir con eficacia o incluso abolir por completo los efectos patogénicos mediados por dichos cfDNA circulantes. La eliminación de prácticamente todos los tipos de cfDNA, a saber, cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos) resulta fundamental para reducir los efectos patogénicos mediados por el cfDNA.

Los inventores observaron además sorprendentemente que la eliminación de prácticamente todos los tipos de cfDNA circulantes podría conducir a la reactivación de las desoxirribonucleasas endógenas.

Se describe además en la presente memoria que varias matrices de afinidad o combinaciones de las mismas pueden capturar de manera eficaz prácticamente todos los tipos de cfDNA, a saber, cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos) de la sangre de los pacientes que lo necesiten. Los ejemplos de matrices de afinidad útiles en los dispositivos de aféresis de la invención incluyen (i) matrices que comprenden una proteína de unión al ADN (p. ej., una histona [p. ej., una histona H1]), (ii) matrices que comprenden un anticuerpo antihistónico (p. ej., un anticuerpo contra la histona H2A), un anticuerpo antinucleosómico (p. ej., AN-1, AN-44), (iii) matrices que comprenden un agente intercalante del ADN (p. ej., un colorante de tipo Hoechst como, por ejemplo, Hoechst 33342), (iv) matrices que comprenden un polímero de unión al ADN (p. ej., un polímero catiónico/básico [p. ej., polietilenimina, poli-L-lisina, poli-L-arginina, bromuro de hexadimetrina, dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) terminado en amino (-NH²), dendrímero de polipropilenimina (PPI)], un polímero no iónico/neutro [p. ej., polivinilpirrolidona (PVP), polivinilpolipirrolidona (PVPP), poli(N-óxido de 4-vinilpiridina)], un polímero aniónico/ácido; un polímero lineal [p. ej., polietilenimina, poli-L-lisina, poli-L-arginina], un polímero ramificado [p. ej., poli-L-lisina hiperramificada, polietilenimina hiperramificada], un polímero dendrimérico [p. ej., dendrímero de poliamidoamina (PAMAM), dendrímero de polipropilenimina (PPI); véase, por ejemplo, Kaur et al., J Nanopart Res., 2016, 18:146]; véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 7.713.701 y Morozov et al., General Reanimatology, 2016, 12:6 para otros ejemplos), (v) matrices que comprenden un anticuerpo anti-ADN, (vi) matrices que comprenden una lectina (p. ej., lectina de Galanthus nivalis (GNA), lectina de Narcissus pseudonarcissus (NPA), concanavalina A, fitohemalutinina o cianovirina), y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, dos o más matrices de afinidad se disponen secuencialmente como dos o más columnas de afinidad. En algunas realizaciones, la primera matriz de afinidad de la secuencia comprende un polímero de unión al ADN (por ejemplo, dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) terminado en amino (-NH²), dendrímero de polipropilenimina (PPI), poli-L-lisina hiperramificada o polietilenimina hiperramificada) o un agente intercalante de ADN (p. ej., Hoechst 33342).

En la presente memoria se describen matrices de afinidad y dispositivos de aféresis que comprenden tales matrices. Un dispositivo de aféresis de la invención puede configurarse según el conocimiento de un experto en la materia, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente de los EE.UU. n.° 2017/0035955 (Eliaz Issac. publicada el 9 de febrero de 2017). En una posible realización del dispositivo de aféresis, las matrices de afinidad se colocan en varias columnas de afinidad, o cartuchos. El dispositivo de aféresis puede comprender un cartucho de filtración y una o más columnas de afinidad que tienen una entrada y una salida, en las que el dispositivo es capaz de capturar el cfDNA unido a los nucleosomas, el cfDNA unido a los exosomas y el cfDNA no unido (incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos), de la sangre o del plasma de un paciente. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende dos o más columnas de afinidad consecutivas. La entrada y la salida se pueden colocar con respecto a las matrices de afinidad de manera que la sangre que entra por la entrada debe entrar en contacto con las matrices de afinidad antes de salir por la salida. Preferiblemente, la geometría del dispositivo está diseñada para maximizar el contacto de la sangre (o el plasma) con las matrices de afinidad durante su paso por el dispositivo. En la técnica se conocen numerosos diseños de este tipo. Por ejemplo, el dispositivo puede ser un cilindro hueco relleno con un ligando de afinidad inmovilizado en las perlas, que tiene la entrada en un extremo y la salida en el extremo opuesto. También se pueden construir otros dispositivos, tales como las matrices de microtúbulos. Todas estas variaciones de geometría y volumen del recipiente y de las matrices de afinidad contenidas en el mismo pueden diseñarse según los principios conocidos. Al preparar una columna con matriz de afinidad, la matriz de afinidad puede cargarse al menos al 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % del volumen de la columna. Se puede usar un tampón adecuado (p. ej., PBS, en concreto PBS frío) para equilibrar la columna.

En un aspecto, se da a conocer una matriz de afinidad con histonas que comprende perlas de celulosa e histona humana recombinante H1.3, en donde la histona humana recombinante H1.3 está inmovilizada en las perlas de celulosa y en donde el tamaño de las perlas está entre 50 y 350 micrómetros. En algunas realizaciones, el tamaño de las perlas está entre 100 y 250 micrómetros.

En algunas realizaciones, la matriz de afinidad con histonas se prepara mediante un procedimiento que comprende a) oxidar las perlas de celulosa que tienen un tamaño entre 100 y 250 gm para producir perlas de celulosa activada; b) lavar las perlas de celulosa activada;

c) preparar una solución concentrada de histona humana recombinante H1.3;

d) incubar las perlas de celulosa activada con la solución concentrada de histona humana recombinante H1.3; y e) bloquear cualquier grupo CHO libre en las perlas de celulosa activada.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además f) lavar las perlas de celulosa activada con el tampón. En algunas realizaciones, en el paso a) las perlas de celulosa están en suspensión acuosa y oxidadas con NalO. En algunas realizaciones, en el paso b), las perlas de celulosa activada se lavan con bicarbonato de sodio, ácido clorhídrico y agua. En algunas realizaciones, el paso c) comprende dializar una solución de histona humana recombinante H1.3 y concentrar la solución dializada en NaHCO3 a 0,1 M a pH 7-9. En algunas realizaciones, la solución dializada se concentra en NaHCO3 a 0,1 M a pH 8. En algunas realizaciones, en el paso d) la incubación se realiza durante 3-5 horas a 15-30 °C. En algunas realizaciones, en el paso d) la incubación se realiza durante 4 horas a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, en el paso e), el paso de bloqueo comprende agregar etanolamina a 1 M a las perlas de celulosa activada y hacerlas reaccionar durante 30 minutos a 2 horas a 15-30 °C. En algunas realizaciones, en el paso f) las perlas de celulosa activada se lavan con el tampón TBS.

También se da a conocer una columna que comprende la matriz de afinidad con histonas de cualquiera de los aspectos y realizaciones anteriores.

Se describe además una matriz de afinidad con lectina preparada según un procedimiento que comprende

a) hacer reaccionar la lectina con las perlas de agarosa activada para producir agarosa acoplada a lectina; y b) lavar la agarosa acoplada a lectina con el tampón.

En algunas realizaciones, la lectina es de Galanthus nivalis (campanilla de invierno). En algunas realizaciones, las perlas de agarosa activada son perlas de agarosa activada con CNBr. En algunas realizaciones, el tampón es PBS, tal como PBS frío y estéril a pH 7,2-7,4.

También se da a conocer una columna que comprende la matriz de afinidad con lectina de cualquiera de los aspectos y realizaciones anteriores.

También se describe una matriz de afinidad con dendrímero de poliamidoamina (PDAM) preparada por un procedimiento que comprende

a) lavar las perlas de celulosa con etanol y agua;

b) incubar las perlas de celulosa lavadas con (±)-epiclorhidrina y NaOH para producir las perlas de celulosa activada; c) hacer reaccionar las perlas de celulosa activada con el dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) para producir las perlas de PDAM y eliminar el dendrímero de PAMAM que no reaccionó con las perlas de celulosa activada; y d) bloquear los grupos epoxi no convertidos en las perlas de PDAM.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además e) lavar las perlas de PDAM con tampón de fosfato a 0,1 M y agua.

En algunas realizaciones, en el paso a) las perlas de celulosa se lavan con etanol al 98% y agua destilada. En algunas realizaciones, en el paso b) las perlas de celulosa lavadas se incuban con una mezcla de (±)-epiclorhidrina y NaOH a 2,5 M. En algunas realizaciones, en el paso c), las perlas de celulosa activada se suspenden con una solución al 20 % del dendrímero de PAMAM con un núcleo de etilendiamina. En algunas realizaciones, en el paso c), la suspensión se realiza a 20-30 °C durante 3-6 horas. En algunas realizaciones, en el paso c) la suspensión se realiza a 24 °C durante 5 horas.

También se describe una columna que comprende una matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) descrita anteriormente. En algunas realizaciones, la columna es una columna de PTFE y la matriz de afinidad con el dendrímero de poliamidoamina está esterilizada.

En otro aspecto se describe una matriz de afinidad con anticuerpos anti-ADN preparada por un procedimiento que comprende

a) preparar las perlas de agarosa activadas por entrecruzamiento de la N-hidroxisuccinimida con las perlas de agarosa;

b) lavar las perlas de agarosa activadas con el tampón de acoplamiento que comprende NaHCO3 y NaCl; c) añadir un anticuerpo contra ADN bicatenario y monocatenario al tampón de acoplamiento;

d) incubar el tampón de acoplamiento que comprende el anticuerpo con las perlas de agarosa activada para producir la matriz de afinidad con el anticuerpo anti-ADN; y

e) lavar la matriz de afinidad con el anticuerpo anti-ADN con el tampón de acoplamiento y el tampón de acetato. En algunas realizaciones, las perlas de agarosa tienen un tamaño medio de 90 micrómetros. En algunas realizaciones, el tampón de acoplamiento comprende NaHCO3 a 0,2 M y NaCl a 0,5 M y está a pH 8,3. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de ratón. En algunas realizaciones, el paso de lavado se realiza al menos tres veces. En algunas realizaciones, el tampón de acetato es un tampón de acetato a 0,1 M y pH 4,0.

También se describe una columna que comprende una matriz de afinidad con anticuerpos anti-ADN descrita anteriormente.

En algunas realizaciones, la columna se prepara incubando la matriz de afinidad con el anticuerpo anti-ADN con el tampón de Tris-HCl estéril. En algunas realizaciones, el tampón de Tris-HCl estéril tiene un pH de 7,4.

En otro aspecto se describe una matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM) preparada mediante un procedimiento que comprende

a) preparar las perlas de agarosa activadas por entrecruzamiento de N-hidroxisuccinimida con las perlas de agarosa;

b) lavar las perlas de agarosa activadas con el tampón de acoplamiento que comprende NaHCO3 y NaCl; c) añadir al tampón de acoplamiento un anticuerpo que se une a los nucleosomas, en el que el anticuerpo se prepara en un ratón MRL/Mp (-)+/+;

d) incubar el tampón de acoplamiento que comprende el anticuerpo con las perlas de agarosa activadas para producir la matriz de afinidad con el anticuerpo antinucleosómico; y

e) lavar la matriz de afinidad con el anticuerpo antinucleosómico con el tampón de acoplamiento y el tampón de acetato.

En algunas realizaciones, la matriz se une al cfDNA circulante unido a nucleosomas, y la matriz no se une al cfDNA no unido que incluye dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos.

También se describe una columna que comprende una matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM) descrita anteriormente.

En otro aspecto más, se da a conocer una matriz de afinidad con el agente intercalante de ADN Hoechst 3342 preparada mediante un procedimiento que comprende

a) oxidar las perlas de celulosa;

b) lavar las perlas de celulosa oxidada;

c) hacer reaccionar las perlas de celulosa oxidada lavadas con una solución que comprende Hoechst 33342 y N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) para producir las perlas de celulosa inmovilizada con Hoechst 33342; y

d) lavar las perlas de celulosa inmovilizada con Hoechst 33342.

En algunas realizaciones, en el paso a) las perlas de celulosa se oxidan con NaIO durante 3-5 horas. En algunas realizaciones, en el paso b) las perlas de celulosa oxidada se lavan con bicarbonato de sodio a 1 M, ácido clorhídrico a 0,1 M y agua. En algunas realizaciones en el paso c), la solución es una solución con el pH tamponado. En algunas realizaciones en el paso d), el lavado se realiza al menos tres veces.

En otro aspecto se describe una matriz de afinidad con poli-L-lisina hiperramificada (PLLAM) preparada mediante un procedimiento que comprende

a) disolver el monoclorhidrato de L-lisina en agua y neutralizarlo con KOH para producir una solución de L-lisina; b) calentar la solución de L-lisina para producir una solución que comprende la poli-L-lisina hiperramificada; c) eliminar la L-lisina y la sal de la solución que comprende la poli-L-lisina hiperramificada;

d) fraccionar la solución que comprende la poli-L-lisina hiperramificada para obtener una fracción que comprende la poli-L-lisina hiperramificada con una masa molecular media de 21.000 a 32.000;

e) dializar y liofilizar la fracción que comprende la poli-L-lisina hiperramificada con una masa molecular media de 21.000 a 32.000 para producir un liofilizado;

f) disolver el liofilizado en agua destilada y dializarlo contra NaHCO³para producir una solución que comprende HBPL; y

g) incubar la solución que comprende la poli-L-lisina hiperramificada con Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno suspendida en NaHCO3 para preparar una matriz de afinidad con la poli-L-lisina hiperramificada. En algunas realizaciones, en el paso b) la solución de L-lisina se calienta a 150 °C durante 48 horas en una corriente de nitrógeno. En algunas realizaciones, en el paso c), la solución que comprende la poli-L-lisina hiperramificada se dializa contra agua. En algunas realizaciones, en el paso d) el fraccionamiento se realiza con una columna de exclusión por tamaños. En algunas realizaciones, en el paso d), el fraccionamiento se realiza con una columna de filtración en gel. También se describe una columna que comprende una matriz de afinidad con poli-L-lisina hiperramificada (PLLAM) descrita anteriormente.

En otro aspecto más, se da a conocer un dispositivo configurado para realizar la aféresis que comprende una o más columnas de afinidad que comprenden una matriz de afinidad y configurado para eliminar sustancialmente todos los tipos de cfDNA de la sangre o el plasma de un paciente. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende dos o más columnas de afinidad consecutivas. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende además un cartucho de filtración. En algunas realizaciones, el cartucho de filtración tiene una entrada y una salida. En algunas realizaciones, una o más de las columnas de afinidad tienen una entrada y una salida.

En algunas realizaciones, el dispositivo comprende dos o más de las siguientes columnas de afinidad dispuestas en cualquier orden, entendiéndose que al menos una de las matrices comprende una histona:

a) una columna que comprende una matriz de afinidad con proteína de unión al ADN (p. ej., histona);

b) una columna que comprende una matriz de afinidad con lectina (por ejemplo, la lectina de Galanthus nivalis (GNA), la lectina de Narcissus Pseudonarcissus (NPA), concanavalina A, fitohemaglutinina o cianovirina); c) una columna que comprende una matriz de afinidad con un polímero de unión al ADN (por ejemplo, un polímero catiónico tal como, por ejemplo, dendrímero de PAMAM terminado en amino (-NH²), poli-L-lisina hiperramificada o polietilenimina hiperramificada);

d) una columna que comprende una matriz de afinidad con anticuerpos anti-ADN;

e) una columna que comprende una matriz de afinidad con agente intercalante del ADN (p. ej., Hoechst 3342); f) una columna que comprende una matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM); y g) una columna que comprende una matriz de afinidad con anticuerpos contra las histonas.

En un ejemplo, el dispositivo comprende la siguiente combinación de columnas dispuestas en cualquier orden: (i) columna de afinidad con anticuerpos contra la histona H2A, (ii) columna de afinidad con lectina, y (iii) columna de afinidad con la histona H1.

En otro aspecto, se da a conocer un dispositivo de aféresis que comprende un cartucho de filtración y una o más columnas de afinidad que tienen una entrada y una salida, en el que el dispositivo es capaz de capturar prácticamente todos los tipos de cfDNA, que incluyen el cfDNA unido a nucleosomas, el cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido (que incluye dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos), de la sangre o del plasma de un paciente.

En algunas realizaciones, el dispositivo comprende dos o más columnas de afinidad consecutivas. En algunas realizaciones, la primera columna de afinidad de la secuencia comprende un polímero de unión a ADN o un agente intercalante del ADN.

En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una columna que comprende una matriz de afinidad con histona delante o antes de una columna que comprende una matriz de afinidad con lectina. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una columna que comprende la matriz de afinidad con histona delante o antes de una columna que comprende una matriz de afinidad con lectina delante o antes de una columna que comprende una matriz de afinidad con PAMAM.

En algunas realizaciones, el dispositivo de aféresis captura al menos 30 mg de cfDNA por cada procedimiento de aféresis. En algunas realizaciones, la columna de afinidad comprende un resto inmovilizado eficaz para capturar uno o más de los cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos, incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el resto inmovilizado es una proteína de unión a ADN, en donde la proteína de unión a ADN es la histona H1 (p. ej., H1.3).

En algunas realizaciones de lo anterior, el dispositivo de aféresis comprende dos columnas de afinidad seguidas, en las que una columna captura el ADN unido a nucleosomas y el ADN unido a exosomas, y otra columna captura el cfDNA no unido, incluidos el dsDNA, el ssDNA y los oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el resto inmovilizado se selecciona del grupo que consiste en una combinación de dos o más de los siguientes restos: anticuerpo de unión a ADN, agente intercalante de ADN, proteína de unión a ADN, polímero de unión a ADN, lectina, anticuerpo antinucleosómico o anticuerpo contra histona.

Se describe además un método para reducir la concentración de cfDNA en la sangre de un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos el cfDNA unido a nucleosomas, el cfDNA unido a exosomas y el cfDNA no unido (incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos).

En algunas realizaciones, el método es eficaz para tratar uno o más de insuficiencia multiorgánica, una enfermedad neurodegenerativa (p. ej., enfermedad de Alzheimer), cáncer, septicemia, lesión renal séptica, reacción adversa inducida por radiación (p. ej., síndrome de radiación aguda) y reacción adversa relacionada con la quimioterapia.

En algunas realizaciones, el paciente tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, cáncer metastásico, insuficiencia orgánica aguda, infarto orgánico, accidente cerebrovascular hemorrágico, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), rechazo de injerto, septicemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome de disfunción multiorgánica (MODS), reacción adversa inducida por la radiación (p. ej., síndrome de radiación aguda), reacción adversa relacionada con la quimioterapia, lesión traumática, estado proinflamatorio en personas de edad avanzada, diabetes, aterosclerosis, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad autoinmunitaria, eclampsia, infecundidad, trastornos de la coagulación e infección.

En algunas realizaciones, el método es eficaz para tratar un trastorno en un paciente, en donde el trastorno se selecciona de cáncer, cáncer metastásico, insuficiencia orgánica aguda, infarto orgánico (incluidos infarto de miocardio y accidente cerebrovascular isquémico), accidente cerebrovascular hemorrágico, trastornos autoinmunitarios, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), rechazo del injerto, septicemia, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS); síndrome de disfunción multiorgánica (MODS); enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), lesión traumática, estado proinflamatorio en personas de edad avanzada, diabetes, aterosclerosis, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad autoinmunitaria, eclampsia, infecundidad, trastorno de la coagulación, complicaciones asociadas al embarazo e infección En algunas realizaciones, el paciente necesita que le traten el trastorno.

En otro aspecto más, se describe un método para tratar el síndrome de disfunción multiorgánica (MODS) en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificados; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados con menos cantidad de cfDNA al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA de la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita un tratamiento de MODS.

En otro aspecto se describe un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa.

En otro aspecto se describe un método para tratar la enfermedad de Alzheimer en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos, dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer.

En otro aspecto se describe un método para tratar el cáncer en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre purificada al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita un tratamiento contra el cáncer.

En otro aspecto se describe un método para tratar la septicemia en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita un tratamiento para la septicemia.

En otro aspecto se describe un método para tratar una lesión renal en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita que le traten la lesión renal.

En otro aspecto se describe un método para tratar la reacción adversa relacionada con la quimioterapia en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos, dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita el tratamiento de reacción adversa relacionada con la quimioterapia.

En otro aspecto se describe un método para tratar la reacción adversa inducida por la radiación (p. ej., síndrome de radiación aguda) en un paciente. El método comprende (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir sangre o plasma purificado con menos cantidad de cfDNA; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados al paciente. El procedimiento de aféresis reduce la concentración de prácticamente todos los tipos de cfDNA en la sangre del paciente, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos, dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos). En algunas realizaciones, el paciente necesita el tratamiento de la reacción adversa inducida por la radiación.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos anteriores, la sangre se desvía desde la vena porta del paciente.

En algunas realizaciones de lo anterior, la sangre purificada tiene menos cantidad de cfDNA en comparación con la concentración de cfDNA en la sangre del paciente antes del procedimiento de aféresis.

En algunas realizaciones, la sangre purificada tiene menos cantidad de todos los cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos, incluidos los dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende además el seguimiento periódico de la concentración de cfDNA circulante en la sangre del paciente y continuar el procedimiento de aféresis para reducir la concentración circulante de cfDNA en al menos un 25 % antes de concluir el procedimiento de aféresis. En algunas realizaciones, el método comprende además el seguimiento periódico de la concentración de cfDNA circulante en la sangre del paciente y continuar el procedimiento de aféresis en el paciente para reducir la concentración circulante de cfDNA en al menos un 50 % antes de concluir el procedimiento de aféresis. En algunas realizaciones, el método comprende además el seguimiento periódico de la concentración de cfDNA circulante en la sangre del paciente y continuar el procedimiento de aféresis en el paciente para reducir la concentración de cfDNA circulante en al menos un 75 % antes de concluir el procedimiento de aféresis.

En algunas realizaciones de cualquiera de lo anterior, se eliminan al menos 30 mg de cfDNA de la sangre del paciente durante uno o varios procedimientos de aféresis consecutivos.

En algunas realizaciones de lo anterior, los pasos del método se repiten o se llevan a cabo según un programa. Los pasos del método pueden realizarse dos veces al día, todos los días, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, cada semana, cada ocho días, cada nueve días, cada 10 días, cada 11 días, cada 12 días, etc. Se pueden tomar muestras de sangre del paciente y analizar la concentración del cfDNA para valorar la frecuencia de realización de los métodos de tratamiento.

La disposición de las columnas de afinidad consecutivas puede permitir capturar prácticamente todos los tipos de cfDNA, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, los cfDNA unidos a exosomas y los cfDNA no unidos (entre ellos, dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos), de la sangre o del plasma de un paciente.

En la presente memoria se describen varias secuencias y se puede usar cualquier secuencia. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una columna que comprende una matriz de afinidad con histonas delante o antes de una columna que comprende una matriz de afinidad con lectina. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una columna que comprende la matriz de afinidad con histonas delante o antes de una columna que comprende una matriz de afinidad con lectina delante o antes de una columna que comprende una matriz de afinidad con dendrímero de poliamidoamina (PDAM).

Como parte de los diversos aspectos descritos a lo largo de la solicitud, (a) se realiza un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificados; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados con menos cantidad de cfDNA al paciente.

El dispositivo de aféresis comprende una matriz de afinidad con histonas. La matriz de afinidad con histonas puede comprender la histona humana recombinante H1.3. La matriz de afinidad con histonas puede ser parte de una columna de afinidad. Las perlas utilizadas como soporte en una columna de matriz de afinidad con histonas pueden ser perlas de celulosa que se oxidan con un oxidante antes de acoplarse con la histona. Las perlas pueden ser perlas de Sepharose, por ejemplo. Como alternativa, se puede usar un soporte de formas además de perlas (fibra hueca, membrana, tubería, etc.). El soporte de la matriz de afinidad se puede hacer a partir de otros compuestos orgánicos e inorgánicos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, polivinilpirrolidona (PVP), polisulfona (PS), polietersulfona (PES), poliariletersulfona (PAES), poliacrilato, poli(metilmetacrilato) (PMMA), poli(metacrilato de glicidilo) (PGMA), poli(hidroximetacrilato), poliestireno (PS), politetrafluoroetileno (PTFE), poliacrilamida, poliacroleína, acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), poliacrilonitrilo (PAN), poliuretano (PU), Eupergit®, polietilenglicol (PEG), hiperfluorocarbono, agarosa (es decir, agarosa reticulada), alginato, carragenina, quitina, almidón, celulosa, nitrocelulosa, Sepharose®, vidrio, sílice, tierra de diatomeas, zirconia, alúmina, óxido de hierro, carbón poroso y mezclas y/o derivados de dichos soportes sólidos; y formas protonadas y desprotonadas de este material de separación.

Las perlas pueden estar recubiertas con proteínas de unión al ADN. Las proteínas de unión al ADN, tales como las histonas, pueden inmovilizarse acoplándolas químicamente a una matriz de soporte sólido e insoluble, tales como las perlas de polisacáridos. Por ejemplo, las perlas de agarosa se activan con bromuro de cianógeno y la proteína de captura del cfDNA se incuba con la agarosa activada para permitir que se produzca el acoplamiento. El material no conjugado se elimina lavando con tampón y la agarosa unida a la proteína se empaqueta en el dispositivo de aféresis/cartucho de afinidad deseado. Existen muchos métodos diferentes para acoplar químicamente una proteína a una variedad de matrices de soporte insoluble. Estos y otros materiales de matriz y métodos de acoplamiento de proteínas conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse en cualquiera de los métodos y dispositivos descritos en la presente memoria.

Por ejemplo, la unión de una molécula de captura del cfDNA a un soporte sólido puede ser a través de una amina, tiol, imida (es decir, carbodiimida hidrosoluble) u otro método de unión química conocido por un experto en la técnica para unir un polipéptido u oligonucleótido a un soporte sólido.

El tamaño de las perlas puede variar de 30 a 200 gm, de 40 a 180 gm, de 45 a 165 gm, de 60 a 150 gm, por ejemplo. Puede usarse cualquier cantidad de oxidantes, tal como el metaperyodato de sodio (NalO). Como alternativa, el grupo hidroxilo primario de la celulosa se puede convertir selectivamente para producir 6-desoxi-6-carboxicelulosa mediante la oxidación mediada por sales de oxoamonio de piperidina (TEMPO) o por oxidación con clorito. Véase, por ejemplo, Eyle, S. y Thielemans, W., Surface modification of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756k) Además, el soporte de celulosa (o agarosa) puede ser oxidado por otros compuestos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, ácido crómico, trióxido de cromopiridina, dimetilsulfóxido (véase, por ejemplo, Peng, L. etal. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J. Biotechnology, 5 (1987) 255-265). A continuación, las perlas oxidadas se incuban con una solución suficientemente purificada y concentrada de la proteína de tipo histona, tal como la histona humana recombinante H1.3. La reacción puede detenerse y luego lavarse con el tampón para eliminar los contaminantes proteicos solubles. Como alternativa, el grupo hidroxilo primario de la celulosa se puede convertir selectivamente para producir 6-desoxi-6-carboxicelulosa mediante la oxidación mediada por sales de oxoamonio de piperidina (TEMPO) o por oxidación con clorito. Véase, por ejemplo, Eyle, S. y Thielemans, W., Surface modification of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756k. Además, el soporte de celulosa (o agarosa) puede oxidarse mediante otros compuestos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, ácido crómico, trióxido de cromo-piridina, dimetilsulfóxido. Véase, por ejemplo, Peng, L. etal. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J. Biotechnology, 5 (1987) 255-265).

El dispositivo de aféresis comprende una matriz de afinidad con histonas. La matriz de afinidad con histonas puede comprender la histona humana recombinante H1.3. La matriz de afinidad con histonas puede ser parte de una columna de afinidad. Las perlas utilizadas en una columna de matriz de afinidad con histonas pueden ser perlas de celulosa que se oxidan con un oxidante. Las perlas pueden ser perlas de Sepharose, por ejemplo. Las perlas pueden estar recubiertas con estreptavidina. El tamaño de las perlas puede variar de 30 a 200 pm, de 40 a 180 pm, de 45 a 165 pm, de 60 a 150 pm, por ejemplo. Puede usarse cualquier cantidad de oxidantes, tal como el metaperyodato de sodio (NalO). Como alternativa, el grupo hidroxilo primario de la celulosa se puede convertir selectivamente para producir 6-desoxi-6-carboxicelulosa mediante la oxidación mediada por sales de oxoamonio de piperidina (TEMPO). Véase, por ejemplo, Eyle, S. y Thielemans, W., Surface modification of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756k). Además, el soporte de celulosa (o agarosa) puede ser oxidado por otros compuestos conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo: ácido crómico, trióxido de cromopiridina, dimetilsulfóxido (véase, por ejemplo, Peng, L. et al. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J. Biotechnology, 1987, 5:255-265). A continuación, las perlas oxidadas se incuban con una solución suficientemente purificada y concentrada de la proteína de tipo histona, tal como la histona humana recombinante H1.3. La reacción puede detenerse y luego lavarse con tampón para eliminar los contaminantes proteicos solubles.

La matriz de afinidad con histonas se prepara mediante un procedimiento que comprende

a) oxidar las perlas de celulosa que tienen un tamaño de entre 100 y 250 pm para producir perlas de celulosa activada;

b) lavar las perlas de celulosa activada;

c) preparar una solución concentrada de histona humana recombinante H1.3;

d) incubar las perlas de celulosa activada con la solución concentrada de histona humana recombinante H1.3; y

e) bloquear cualquier grupo CHO libre en las perlas de celulosa activada.

El procedimiento anterior puede comprender, además: f) lavar las perlas de celulosa activada con el tampón.

Puede usarse cualquier oxidante en el paso a). Un oxidante ejemplar es NalO. Se puede realizar cualquier forma de lavado en el paso b). Por ejemplo, las perlas de celulosa activada se lavan con bicarbonato de sodio, ácido clorhídrico y agua. En el paso c) se pueden usar la diálisis u otros métodos. Por ejemplo, se dializa una solución de histona humana recombinante H1.3 y la solución dializada se concentra en NaHCO³a 0,1 M a pH 7-9, o a pH 8. En el paso d), la incubación se puede realizar durante 3-5 h a 15-30 °C, o durante 4 h a temperatura ambiente. En el paso e), el paso de bloqueo comprende agregar etanolamina a 1 M a las perlas de celulosa activada y hacerlas reaccionar durante 30 min a 2 h a 15-30 °C. En el paso f), las perlas de celulosa activadas pueden lavarse con el tampón TBS.

Las perlas se pueden cargar en una columna, tal como, por ejemplo, una columna de politetrafluoroetileno (PTFE). Otros ejemplos de columnas pueden tener una pared hecha de policarbonato, polietileno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietersulfona, poliéster u otro material polimérico aprobado por la FDA o la EMEA para fabricar dispositivos para el tratamiento extracorpóreo de la sangre o los componentes sanguíneos.

La columna, o el dispositivo de cartucho, también puede estar hecho de un material que no sea tóxico y que proporcione un soporte rígido a la matriz de afinidad que se encuentra dentro. Normalmente, el material será una composición de plástico tal como policarbonato, polietileno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietersulfona, poliéster, poliestireno u otro material similar autorizado por los organismos reguladores tales como la FDA o la EMEA para fabricar dispositivos para el tratamiento extracorpóreo de la sangre o de los componentes sanguíneos. En algunas realizaciones, hay un filtro interno en la parte inferior de la columna (cartucho) para evitar que la matriz de afinidad se salga del dispositivo. En algunas realizaciones, también hay un filtro interno en la parte superior del dispositivo para contener la matriz de afinidad dentro del dispositivo. En algunas realizaciones, estos filtros están compuestos de plástico y/o material celulósico y tienen poros que permitirán que lo atraviesen líquidos tales como el plasma, pero no material en partículas tal como la matriz de afinidad.

Al preparar una columna de matriz de afinidad con histonas, la matriz de afinidad con histonas puede cargarse al menos al 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % del volumen de la columna. Puede usarse PBS, en concreto PBS fría, para equilibrar la columna. También se pueden usar otros tampones adecuados para equilibrar la columna.

El dispositivo de aféresis puede comprender una matriz de afinidad con lectina. Los ejemplos no limitantes de lectinas útiles incluyen, por ejemplo, la lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno) (GNA), la lectina de Narcissus Pseudonarcissus (narciso) (NPA), concanavalina A, fitohemalutinina y cianovirina. En una realización, una lectina se puede acoplar a una matriz de afinidad de agarosa mediante la incubación durante la noche a pH de neutro a ligeramente alcalino. Después de dicha incubación, se puede realizar un lavado extenso con el tampón a un pH de cerca de 7,0 a 7,5 para eliminar la lectina sin fijar.

Se puede preparar una matriz de afinidad con lectina según un procedimiento que comprende

a) hacer reaccionar la lectina con perlas de agarosa activada para producir una agarosa acoplada a la lectina; y

b) lavar la agarosa acoplada a la lectina con el tampón.

El dispositivo de aféresis puede comprender una matriz de afinidad con dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) (PDAM) o una matriz de afinidad con dendrímero de polipropilenimina (PPI). Véase, por ejemplo, Kaur et al., J NanopartRes., 2016, 18:146. Los dendrímeros son polímeros sintéticos únicos de dimensiones nanométricas con una estructura muy ramificada y de forma globular. Entre los dendrímeros, la poliamidoamina (PAMAM) ha recibido la mayor atención como posible agente de transfección para el suministro de genes, porque estas macromoléculas se unen al ADN a pH fisiológico. Los dendrímeros de PAMAM consisten en un núcleo de alquildiamina y ramificaciones de amina terciaria. Están disponibles en diez generaciones (G0-10) con 5 tipos de núcleo diferentes y 10 grupos funcionales de superficie. Los dendrímeros de poliamidamina (PAMAM) y el ADN forman complejos a partir de las interacciones electrostáticas entre los grupos fosfato cargados negativamente del ácido nucleico y los grupos amino protonados (cargados positivamente) de los polímeros. La formación de complejos de alto peso molecular y alta densidad depende principalmente de la concentración de ADN, y se potencia al aumentar la relación de carga entre el dendrímero y el ADN (Shcharbin, D. et al., Practical guide to studying dendrimers. Libro, iSmithers Rapra Publishing: Shawbury, Shrewsbury, Shropshire, Reino Unido, 2010. 120 p. ISBN: 978-1-84735-444-0).

La matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM preparada por un procedimiento que comprende

a) lavar las perlas de celulosa con etanol y agua;

b) incubar las perlas de celulosa lavadas con (±)-epiclorhidrina y NaOH para producir las perlas de celulosa activada;

c) hacer reaccionar las perlas de celulosa activada con el dendrímero de PAMAM para producir las perlas de PAMAM y eliminar el dendrímero de PAMAM que no reaccionó con las perlas de celulosa activada; y

d) bloquear los grupos epoxi no convertidos en las perlas de PAMAM.

Las perlas se pueden cargar en una columna, tal como una columna de politetrafluoroetileno (PTFE). Otros ejemplos de columnas pueden tener una pared hecha de policarbonato, polietileno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietersulfona, poliéster u otro material polimérico aprobado por la FDA o la EMEA para fabricar dispositivos para el tratamiento extracorpóreo de la sangre o los componentes sanguíneos.

Un dispositivo de aféresis que comprende una matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM puede ser más eficaz para eliminar el cfDNA o, como alternativa, puede eliminar el cdDNA de manera más completa o, como alternativa, puede eliminar una cantidad total mayor de cfDNA en una muestra de sangre en concreto, que usar un dispositivo de aféresis que comprende una matriz de afinidad con histona y una matriz de afinidad con lectina.

En ciertas realizaciones, el dispositivo de aféresis puede comprender todo de una matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM, una matriz de afinidad con histona y una matriz de afinidad con lectina.

El dispositivo de aféresis puede comprender una matriz de afinidad con anticuerpos anti-ADN. Los anticuerpos contra el ADN constituyen un subgrupo de anticuerpos contra el núcleo que se unen al ADN monocatenario, al ADN bicatenario o a ambos (anticuerpo anti-ds+ssDNA). Pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de tipo IgM o de cualquiera de las subclases de anticuerpos de IgG. Los anticuerpos que se unen exclusivamente al ADN monocatenario pueden unirse a las bases, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos y esqueleto de ribosas y fosfatos que lo componen, todos los cuales están expuestos en cadenas sencillas de ADN. Los anticuerpos que se unen al ADN de doble cadena pueden unirse al esqueleto de ribosas y fosfatos, pares de bases (desoxiguanosina-desoxicitidina y desoxiadenosinadesoxitimidina) o conformaciones particulares de la doble hélice (Bevra Hannahs Hahn, Antibodies against DNA. N Engl J Med 1998; 338:1359-1368). Los anticuerpos contra el ADN también podrían unirse al ADN que contiene estructuras supramoleculares como los nucleosomas y la cromatina.

La matriz de afinidad con el anticuerpo anti-ADN se puede preparar activando las perlas de agarosa, tal como con N-hidroxisuccinimida (NHS). Luego, las perlas activadas se pueden incubar con un anticuerpo u otro reactivo que tenga afinidad por el ADN. A continuación, el exceso de anticuerpos/reactivos se elimina mediante lavado.

Una matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM) preparada por un procedimiento que comprende

b) lavar las perlas de agarosa activadas con el tampón de acoplamiento que comprende NaHCÜ3 y NaCI;

c) añadir al tampón de acoplamiento un anticuerpo que se une a los nucleosomas, en el que el anticuerpo se prepara en un ratón MRL/Mp (-)+/+;

El dispositivo de aféresis puede comprender una matriz de afinidad con intercalante de ADN. Hay varias formas en que las moléculas pueden interaccionar con el ADN. Los ligandos pueden interaccionar con el ADN mediante unión covalente, unión electrostática o intercalación. La intercalación se produce cuando los ligandos de un tamaño y una naturaleza química apropiados se encajan entre los pares de bases del ADN. Los agentes de unión al ADN tienden a interaccionar de forma no covalente con la molécula de ADN huésped a través de dos modos generales: (i) Intercalación de enhebrado por unión al surco estabilizada por una mezcla de interacciones hidrófobas, electrostáticas y de enlaces de hidrógeno, y (ii) intercalación clásica a través de una asociación intercalante en la que un resto heteroaromático plano se desliza entre los pares de bases de ADN. La asociación intercalante, la más estudiada, es la interacción de apilamiento no covalente resultante de la inserción de un anillo aromático heterocíclico plano entre los pares de bases de la doble hélice del ADN. Véase http://nptel.ac.in/courses/104103018/35. E1Hoechst 33342 es un derivado de bis-bencimida que se une a secuencias ricas en AT en el surco menor del ADN de doble cadena. El resto heterocíclico en este colorante es importante para interaccionar con eficacia con la doble hélice del ADN, lo que hace que el complejo Hoechst-ADN sea más estable.

La matriz de afinidad con intercalante de ADN se puede preparar por oxidación (activación) de las perlas, tales como las perlas de celulosa (soporte) que reaccionan con un compuesto (enlazador), tal como la N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) que une el intercalador de ADN (resto de unión a ADN, es decir, Hoechst 33342) con la superficie de soporte. Luego se lavan las perlas.

Una matriz de afinidad con Hoechst 3342 preparada por un procedimiento que comprende

a) oxidar las perlas de celulosa;

b) lavar las perlas de celulosa oxidada;

c) hacer reaccionar las perlas de celulosa oxidada lavadas con una solución que comprende e1Hoechst 33342 y la N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) para producir las perlas de celulosa inmovilizada con Hoechst 33342; y

d) lavar las perlas de celulosa inmovilizada con Hoechst 33342.

El dispositivo de aféresis puede comprender una matriz de afinidad con poli-L-lisina hiperramificada. Se puede preparar una matriz de afinidad con poli-L-lisina hiperramificada mediante un procedimiento que comprende

a) disolver el monoclorhidrato de L-lisina en agua y neutralizarla con KOH para producir una solución de L-lisina;

b) calentar la solución de L-lisina para producir una solución que comprende la poli-L-lisina;

c) eliminar la L-lisina y la sal de la solución que comprende la poli-L-lisina;

d) fraccionar la solución que comprende la poli-L-lisina para obtener una fracción que comprende la poli-L-lisina con un peso molecular medio de 21.000 a 32.000;

e) dializar y liofilizar la fracción que comprende la poli-L-lisina con un peso molecular medio de 21.000 a 32.000 para producir un liofilizado;

f) disolver el liofilizado en agua destilada y dializar contra NaHCO3 para producir una solución que comprende la HBPL; y

g) incubar la solución que comprende la HBPL con Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno suspendida en NaHCO3.

En ciertas realizaciones, el dispositivo de aféresis puede comprender todos o cualquier número de los siguientes: una matriz de afinidad con intercalante de ADN, una matriz de afinidad con Hoechst 33342, una matriz de afinidad con anti-ADN, una matriz de afinidad con PAMAM, una matriz de afinidad con histonas, una matriz de afinidad con lectina y una matriz de afinidad con poli-L-lisina.

A lo largo de la solicitud se describen varios procedimientos de aféresis y métodos de tratamiento. Los diversos métodos y procedimientos comprenden (a) realizar un procedimiento de aféresis que comprende desviar la sangre o el plasma del paciente a un dispositivo de aféresis para producir la sangre o el plasma purificados; y (b) devolver la sangre o el plasma purificados con menos cantidad de cfDNA al paciente. Puede seleccionarse cualquier vena para una desviación óptima de la sangre. Por ejemplo, la sangre puede desviarse desde la vena porta del paciente. Como alternativa, la sangre puede desviarse de la vena femoral o la vena yugular del paciente.

En varias realizaciones del tratamiento, un procedimiento de aféresis se puede realizar más de una vez, o incluso dos veces, por ejemplo, el día 1 y el día 3. Si se está tratando una lesión renal, el nivel de lesión renal se puede valorar midiendo la concentración de la creatinina sérica y la concentración del nitrógeno ureico en la sangre (BUN) con Roche Reflotron Plus (Roche Diagnostics) antes de cada procedimiento de aféresis.

El cfDNA circulante se puede extraer de las muestras de plasma con el método convencional de THP (Triton, calor y fenol) (Breitbach et al., PLoS ONE, 2014, 9(3):e87838). El cfDNA extraído se puede cuantificar con varios ensayos, tales como, por ejemplo, el ensayo PicoGreen (Molecular Probes, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para visualizar el cfDNA en gel de agarosa tal como se describe en los ejemplos, a continuación, se pueden usar colorantes de ADN bien conocidos, que incluyen, por ejemplo, bromuro de etidio (Sigma-Aldrich), colorante de ácido nucleico Diamond™ (Promega), tinción de gel de ácido nucleico SYBR® Gold (Molecular Probes). Los colorantes se pueden usar como tinción de gel, como agente de prefabricación o se pueden precargar directamente en el tampón de carga de muestras.

En diversas realizaciones, llevar a cabo un procedimiento de aféresis comprende además separar la sangre en el plasma. A continuación, la porción de plasma se puede desviar a una o más matrices de afinidad para eliminar el cfDNA.

Ejemplos

La presente invención también se describe y se demuestra por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el uso de estos y otros ejemplos en cualquier parte de la especificación es solo ilustrativo y de ninguna manera limita el alcance ni el significado de la invención ni de cualquier término ejemplificado.

Ejemplo 1: Preparación de la columna de afinidad y la matriz de afinidad con la histona H1

La matriz de afinidad con la histona H1 y la columna de afinidad se prepararon como sigue: se oxidaron las perlas de celulosa (tamaño de las perlas de 100-250 pm, Sigma-Aldrich) con metaperyodato de sodio. Para lograr esto, se agitó a temperatura ambiente durante 4 h una suspensión acuosa de las perlas (3 g, 5 ml) y NalO (0,1 g, 0,5 mmol) en 10 ml de agua. Se recogieron las perlas activadas y se lavaron con bicarbonato de sodio a 1 M, ácido clorhídrico a 0,1 M y 200 ml de agua. Se dializó una solución de la histona H1.3 humana recombinante (>98 % de pureza, Instituto de Química Bioorgánica, Moscú) y se concentró (10 ml; 5 mg/ml) en NaHCO3 a 0,1 M (pH 8). Luego, la solución se incubó con las perlas oxidadas (5 ml) a temperatura ambiente durante 4 h con agitación. Después de la incubación, se añadió etanolamina a 1 M (1,5 ml) a la suspensión de perlas activadas (15 ml) para bloquear los grupos CHO libres; la reacción continuó durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas de celulosa resultantes con la histona H1 inmovilizada se lavaron tres veces con el tampón TBS para eliminar los contaminantes proteicos solubles y proporcionar la matriz de afinidad con la histona H1. Se cargaron las columnas de policarbonato de 4 ml - 30 ml de volumen (al 70-90% del volumen) con la matriz de celulosa con la histona H1 inmovilizada.

Ejemplo 2: Purificación de la sangre de un paciente con cáncer mediante la retirada de diferentes tipos de cfDNA circulantes

La separación del tipo de cfDNA unido a partículas (es decir, cfDNA unidos a nucleosomas y cfDNA unidos a exosomas) del cfDNA circulante no unido se realizó de la siguiente manera: se preparó el plasma de un paciente con cáncer con adenocarcinoma gástrico avanzado y con numerosas metástasis en los pulmones y el hígado (T4N2M1) recogiendo la sangre en tubos tratados con citrato y la centrifugación durante 10 min a 2.000 g en una centrífuga refrigerada, y se recogió el sobrenadante.

El cfDNA unido a nucleosomas y el cfDNA unido a exosomas se eliminaron con dos columnas de afinidad seguidas que contenían una matriz de afinidad con anticuerpos antihistónicos y una matriz de afinidad con lectina, tal como se describe, respectivamente, en la solicitud de patente internacional WO2007/049286A1 y en la patente de los EE. UU. n.29364601.

Brevemente, se prepararon una matriz de afinidad con anticuerpos antihistónicos y una columna de la siguiente manera: 0,5 ml (1 volumen) de perlas de Sepharose recubiertas con estreptavidina (tamaño promedio de las perlas: 45 a 165 pm, Pierce Biotechnology, EE. UU.) se empaquetaron en una columna de poliestireno con un volumen de 1,3 (1,3 ml) sobre lana de vidrio. La columna se equilibró con 2 ml (4 volúmenes) de PBS. Se añadió a la columna 1 ml (volumen) de una solución de 100 pg/ml de anticuerpos antihistónicos biotinilados (H2A.X; Santa Cruz Biotechnologies) y se dejó entrar en el lecho de gel. Las tapas inferior y superior se volvieron a colocar secuencialmente y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, la columna se lavó con 2 ml (4 volúmenes) de solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría.

La matriz de afinidad con lectina se preparó de la siguiente manera: 2 ml (1 volumen) de lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno), es decir, una solución de GNA (Sigma-Aldrich) a una concentración de 10 mg/ml en NaHCO3 a 0,1 M y pH 9,5, se añadió a 2 ml (1 volumen) de perlas de agarosa activadas con CNBr (Sepharose 6MB activada con bromuro de cianógeno, agarosa al 6 %, macroperlas de 200-300 gm de diámetro, Sigma-Aldrich) y se dejó reaccionar durante una noche en frío a pH de 7,4 - 8,0. Cuando se completó la reacción, la agarosa acoplada con la lectina se lavó extensamente con la solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría estéril a de pH 7,2 - 7,4. La matriz de afinidad con lectina que se ha preparado se transfirió a una columna de poliestireno de 0,6 x 6 cm.

Para la retirada del cfDNA unido a nucleosomas, se aplicó 1,0 ml de plasma a la primera columna de afinidad (que comprende la matriz de afinidad con el anticuerpo contra la histona H2A) y se dejó fluir. Luego, el plasma se aplicó a la segunda columna de afinidad (unión de exosomas) (que comprende la matriz de afinidad con lectina [GNA]) y se dejó fluir.

Como alternativa, se dejó fluir la misma cantidad de plasma del paciente a través de una sola columna de afinidad con la histona H1 preparada tal como se describe en el ejemplo 1 (perlas de celulosa acopladas con la histona H1.3 inmovilizada).

Todas las muestras de plasma se analizaron mediante electroforesis en gel con colorante de ADN fluorescente antes de la aféresis y después de completar la aféresis.

El perfil electroforético del cfDNA circulante del plasma del paciente con cáncer antes de la eliminación del ADN unido a nucleosomas y exosomas (carril A), después de la purificación por afinidad secuencial con las columnas de afinidad con el anticuerpo contra la histona H2A y con lectina (carril B) y después de la purificación por afinidad con la columna de afinidad con la histona H1.3 (carril C) se presenta en la figura 1.

A pesar de que el cfDNA circulante unido a nucleosomas y exosomas se eliminaron del plasma, la muestra que se ve en el carril central todavía contenía cantidades significativas de cfDNA circulante visualizado dentro de un rango molecular de 100-1000 pares de bases. Tal y como se muestra en el carril de la derecha, no se visualizó ADN en la muestra después del paso por la columna de afinidad con la histona H1.3. Por lo tanto, la aféresis/purificación del plasma del paciente mediante una matriz de afinidad que contiene la proteína de unión al ADN (histona H1.3) puede eliminar una gran proporción, casi la totalidad o la totalidad, del cfDNA unido a nucleosomas, del cfDNA unido a exosomas y del cfDNA no unido, entre ellos el dsDNA, el ssDNA y los oligonucleótidos de la sangre del paciente.

Ejemplo 3: El cfDNA circulante purificado a partir del ADN unido a nucleosomas y exosomas promueve el crecimiento tumoral

Se recogieron 60 ml de plasma de un paciente con un carcinoma de pulmón no microcítico metastásico (NSCLC T3N2M+) durante unos pocos días consecutivos y se retiraron el cfDNA circulante unido a nucleosomas y a exosomas utilizando las columnas de afinidad con lectina y con el anticuerpo contra la histona H2.A, en consecuencia, tal como se describe en el ejemplo 2 (matriz de afinidad con anticuerpos contra la histona y matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno)). Para preparar la columna de afinidad, se utilizaron columnas de policarbonato de 2,0 x 7,0 cm. Cada una se cargó al 70-80 % del volumen de la columna con la matriz correspondiente. El cfDNA circulante restante se extrajo del plasma purificado con la extracción clásica con fenol-cloroformo y precipitación con etanol (Stirling, D. et al., DNA extraction from plasma and serum, en: Methods in MolecularBiology, vol. 226: PCR Protocols, segunda edición, ed. por J.M.C. Bartlett y D. Stirling, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003, 556 páginas). El cfDNA extraído en seco se almacenó a -70 °C. La cantidad total de ADN residual recuperado del plasma del paciente después de la purificación del cfDNA circulante unido a nucleosomas y exosomas fue de 9,7 gg. El cfDNA se volvió a disolver en PBS y se usó para los experimentos con animales tal como se describe a continuación.

El efecto sobre el crecimiento tumoral que tenía el cfDNA que no estaba unido a nucleosomas ni a exosomas se probó usando el modelo ortotópico Panc02 /C57/BL6 (Jiang Y-J, Lee C-L, Wang Q, et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model. World Journal of Gastroenteerology: WJG. 2014; 20(28):9476-9485). Se inyectaron 1 x 106 células Panc02 suspendidas en Martigel helado en la cola del páncreas de cada animal (día 0). Se dividieron 24 ratones portadores de tumores en 3 grupos de 8 ratones cada uno. A los ratones del grupo de control se les administraron inyecciones diarias únicas de PBS (100 gl; seno venoso retroorbital) durante 10 días: desde el día 10 hasta el día 20. A los ratones del grupo 1 se les administraron inyecciones diarias de 100 ng de cfDNA de pacientes con cáncer purificado tal como se describe más arriba y los ratones del grupo 2 recibieron 100 ng de ADN de esperma de salmón UltraPure™ (Life Technologies) con un tamaño medio de <2.000 pares de bases (como control inespecífico) con la misma pauta y técnica.

En la tabla 1 que viene a continuación se resumen los efectos de las inyecciones de ADN sobre el peso de los tumores en los animales tratados frente al grupo de control. El peso de los tumores se midió al finalizar el estudio el día 23.

Tabla 1:

En la figura 2A se muestran los tumores extirpados de los ratones del grupo de control. En la figura 2B se muestran los tumores extirpados de ratones tratados con cfDNA de un paciente con NSCLC T3N2M+ purificado a partir del cfDNA circulante unido a nucleosomas y exosomas. Los tumores del grupo de control eran mucho más pequeños, densos, bien separados de los órganos adyacentes, y no presentaban necrosis ni hemorragias.

El cfDNA circulante del plasma de los pacientes con cáncer purificado a partir de nucleosomas y exosomas unidos al cfDNA circulante retuvo propiedades oncogénicas significativas. Por lo tanto, puede ser beneficioso reducir las cantidad de cfDNA unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido, entre ellos, dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos.

Ejemplo 4: Preparación de la matriz de afinidad con el dendrímero de poliamidoamina y de la columna de afinidad

La matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) y las columnas que contienen la PDAM se prepararon según Wang (Wang, Y., et al., New method for the preparation of adsorbent with high adsorption capacity, Chínese Science Bulletín 2005, vol. 50, núm. 21, págs. 2432-2435) como sigue. Las perlas de celulosa (Macroporous Bead Cellulose MT 500, tamaño de partícula de 100-250 pm, lontosorb, República Checa) se lavaron dos veces con etanol al 98 % y agua destilada. Se incubó 1 g de perlas con una mezcla de 1,0 ml de (±)-epiclorhidrina (Sigma-Aldrich) y 3,0 ml de NaOH a 2,5 M. La reacción de activación se realizó a 40 °C durante 2,5 h en un agitador. Las perlas activadas se lavaron minuciosamente con agua destilada. El contenido de epoxi de las resinas se determinó que era aproximadamente de 0,31 mmol/g de perlas secas mediante la valoración de tiosulfato de sodio con cloruro de hidrógeno. Se suspendieron 4,0 ml de perlas de celulosa activada preparadas en húmedo con 9,0 ml de una solución al 20 % del dendrímero de PAMAM terminado en amino (-NH²) (núcleo de etilendiamina, generación 3.0, Sigma-Aldrich) y se agitó a 24 °C durante 5 h. Después de la modificación, el PAMAM sin reaccionar se eliminó lavando con agua destilada y los grupos epoxi restantes sin convertir en las perlas se bloquearon haciéndolos reaccionar con etilamina. A continuación, la matriz de afinidad funcionalizada se lavó con tampón de fosfato a 0,1 M y agua MilliQ. Se colocaron de 2,0 - 20,0 ml de matriz de afinidad preparada en la columna de politetrafluoroetileno (PTFE) libre de pirógenos (0,5 - 3,0) cm x (1,0 - 10,0) cm (hasta una carga del 70-90 % del volumen de la columna). La columna de afinidad preparada se esterilizó en el autoclave a 121 °C durante 30 min.

Ejemplo 5: Purificación del plasma sanguíneo de pacientes con cáncer y de pacientes con accidente cerebrovascular por la retirada de diferentes tipos de cfDNA circulantes

Las alícuotas de 1.0 ml de muestras de plasma de un paciente con accidente cerebrovascular isquémico (24 h desde el inicio del accidente cerebrovascular) y de un paciente con cáncer con adenocarcinoma gástrico avanzado con múltiples metástasis en los pulmones y en el hígado (T4N2M1) se purificaron posteriormente a través de columnas de afinidad con lectina y con anticuerpos contra la histona H2A, como se describe en el ejemplo 2 (matriz de afinidad con anticuerpos contra la histona H2A y matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno)), o a través de una columna de 0,6 x 10,0 cm de afinidad con dendrímero de poliamidoamina sola preparada como se describe en el ejemplo 4 (matriz de afinidad de perlas de celulosa conjugada al dendrímero de PAMAM).

Todas las muestras de plasma se analizaron mediante electroforesis en gel con tinción fluorescente del ADN antes de la purificación y después de finalizar la purificación.

En la figura 3 se presenta el perfil electroforético del cfDNA circulante del plasma de estos pacientes antes de retirar el cfDNA unido a nucleosomas y a los exosomas, después de la aféresis por afinidad con columnas de afinidad con lectina y con anticuerpo antihistónico, y después de la purificación por afinidad con una columna de afinidad con dendrímero de poliamidoamina.

La consiguiente purificación del plasma del paciente con cáncer mediante columnas de afinidad con lectina y con anticuerpos antihistónicos eliminó la mayoría del cfDNA circulante unido a partículas; sin embargo, permaneció en el plasma una cantidad visible de cfDNA circulante unido a nucleosomas y de cfDNA circulante de tamaño mononucleosómico y de tamaño subnucleosómico (aproximadamente por debajo de 147 pares de bases de longitud). La purificación del plasma con una columna de afinidad con dendrímero de poliamidoamina (PAMAM) condujo a la eliminación total del cfDNA circulante del plasma del paciente con cáncer. En un paciente con accidente cerebrovascular, la purificación por afinidad con la columna de afinidad con dendrímero de poliamidoamina (utilizada como un solo paso) condujo a una eliminación suficiente de prácticamente todos los tipos de cfDNA circulantes del plasma, de modo que eran indetectables.

Por lo tanto, al plasma sanguíneo del paciente se le pueden retirar prácticamente todos los tipos de cfDNA, incluidos cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos los dsDNA, los ssDNA y los oligonucleótidos) con una matriz de afinidad que contiene un polímero de unión al ADN.

Ejemplo 6: El cfDNA del plasma sanguíneo purificado a partir del ADN unido a nucleosomas y exosomas tiene actividad procoagulante

En la patente de los EE. UU. N.°. 9.642.822 se describe que el cfDNA circulante unido a nucleosomas de alto peso molecular en forma de NET de neutrófilos tiene actividad procoagulante en los pacientes con cáncer avanzado y con problemas vasculares agudos. Se tomaron muestras del plasma sanguíneo del paciente con accidente cerebrovascular (24 h desde el inicio) y del paciente con cáncer con un adenocarcinoma gástrico avanzado con metástasis múltiples en los pulmones y en el hígado (T4N2M1), y se purificaron en consecuencia a través de una columna de afinidad con anticuerpos contra la histona y una columna de afinidad con lectina (preparadas como se describe en el ejemplo 2 (matriz de afinidad con anticuerpos contra la histona H2A y matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis [campanilla de invierno]) o a través de una columna de afinidad de 1,0 x 5,0 cm con dendrímero de poliamidoamina (preparada como se describe en el ejemplo 4). Las muestras del plasma purificado y sin tratar se desfibrinaron más centrifugándolas a 3.000 g durante 20 min y filtrando a través de un filtro de 0,22 gm. Las muestras se dividieron en alícuotas en tubos de plástico de 1,0 ml, se agitaron en un baño María a 50 °C durante 25 min y se centrifugaron a 10.000 g (10 min). Los sobrenadantes se almacenaron a -80 °C y luego se analizaron en un ensayo de generación de trombina de la siguiente manera: una mezcla de 25 gl de tromboplastina (Sigma) diluida (1:9), 25 gl de NaCl al 0,9 % y 50 gl de una dilución 1:1 de plasma desfibrinado (todos los reactivos se diluyeron en NaCl al 0,9 %).

Todos los reactivos del ensayo de generación de trombina se diluyeron en NaCl al 0,9 %. Se añadió una mezcla de 25 gl de tromboplastina, 25 gl de NaCl al 0,9 % y 50 gl de una dilución 1:1 de plasma desfibrinado a los pocillos de una placa de microtitulación y se precalentó a 37 °C durante 10 min. A continuación, se le añadieron secuencialmente 50 gl de espectrozima a 1 mM, un sustrato cromógeno para la trombina, y 50 gl de cloruro de calcio a 30 mM. Las placas se leyeron en un lector automatizado de placas de inmunoensayo (Victor, Perkin Elmer) a 1000 s y 405 nm a temperatura ambiente. Todas las mediciones se realizaron por triplicado. En esta prueba, el valor de la DO es proporcional a la actividad procoagulante del plasma (generación de trombina).

Tabla 2:

Los resultados se muestran en la tabla 2. Por lo tanto, no solo el cfDNA circulante unido a nucleosomas y exosomas, sino también el cfDNA no unido tienen actividad procoagulante en el cáncer y en los problemas vasculares agudos. Por lo tanto, es beneficioso reducir la concentración de todos los tipos de cfDNA, incluidos cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos los dsDNA, los ssDNA y los oligonucleótidos).

Ejemplo 7: Preparación de la columna y de la matriz de afinidad con anticuerpos anti-ADN

La matriz de afinidad con el anticuerpo anti-ADN y la columna de afinidad se prepararon de la siguiente manera: 5 ml de perlas esféricas de agarosa al 4 % activada con N-hidroxisuccinimida (NHS) altamente reticulada, tamaño medio de las perlas de 90 gm (Sepharose 4 Fast Flow activada con NHS, GE Healthcare Life Sciences). La matriz activada se lavó dos veces con el tampón de acoplamiento frío (de 2 - 4 °C) (NaHCO3 a 0,2 M, NaCl a 0,5 M, pH 8,3). Se dializaron 1000 gg del anticuerpo monoclonal de ratón de tipo IgM de alta afinidad contra ADN mono- y bicatenario ([49/4A1], ab35576, Abcam) frente al tampón de acoplamiento y luego se acoplaron según el procedimiento del fabricante a Sepharose activada por NHS. Se utilizaron tres ciclos de lavado con tampón de acoplamiento seguido de tampón de acetato a 0,1 M (pH 4,0) para eliminar el exceso de anticuerpos anti-ADN no unidos. Se vertieron 4 ml de la matriz de afinidad lavada en una columna de 5 ml y la columna de afinidad se equilibró en el tampón de Tris-HCl estéril (pH 7,4).

Ejemplo 8: Preparación de la columna y la matriz de afinidad con intercalante de ADN

La matriz de afinidad con Hoechst 33342 y la columna de afinidad se prepararon como sigue: se oxidaron perlas de celulosa (tamaño de las perlas de 100-250 pm, Sigma-Aldrich) con metaperyodato de sodio. Esta suspensión acuosa de las perlas (3 g, 5 ml) y NalO (0,1 g, 0,5 mmol) en 10 ml de agua se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Se recogieron las perlas activadas y se lavaron con bicarbonato de sodio a 1 M, ácido clorhídrico a 0,1 M y 200 ml de agua. Se mezclaron 450 mg de perlas de celulosa activada con 1000 ml de la solución con el pH tamponado que contenía 0,047 mg/ml de Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) y 0,4 mg/ml de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC), y se hizo reaccionar a una velocidad constante de agitación vorticial durante 1 h a 32 °C. Las perlas con Hoechst 33342 inmovilizado se lavaron tres veces con agua desionizada para eliminar el colorante que no había reaccionado. La matriz de afinidad preparada con el intercalante de ADN se colocó en una columna de plástico (policarbonato) de 4 ml de volumen. La columna se almacenó a 4 °C.

Ejemplo 9: Separación de los diferentes tipos de cfDNA circulante de la sangre de un paciente con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y síndrome de disfunción multiorgánica (MODS).

Se tomaron muestras de plasma del paciente ingresado en la unidad de cuidados intensivos (UCI) con un diagnóstico de síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) con insuficiencia multiorgánica (síndrome de disfunción multiorgánica, MODS) secundaria a una pancreatitis aguda. Se realizó el recambio plasmático terapéutico como tratamiento de rescate. Se purificaron las alícuotas de 1 ml de plasma del paciente dado de alta a través de las columnas de afinidad con lectina y con el anticuerpo antihistónico como se describe en el ejemplo 2 (matriz de afinidad con anticuerpos antihistónicos y matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno)) o a través de una columna de afinidad con el intercalante de ADN como se describe en el ejemplo 8 (perlas de celulosa acopladas con Hoechst 33342, una matriz de afinidad con intercalante de ADN). Todas las muestras de plasma se analizaron mediante la electroforesis en gel con colorante fluorescente para ADN antes de la purificación y después de la purificación.

Como se muestra en la figura 4, el plasma del paciente con SIRS contenía una cantidad significativa de cfDNA circulantes, lo que dio una fuerte señal fluorescente después de la tinción con el colorante fluorescente para el ADN. La purificación por afinidad con los anticuerpos antihistónicos y las columnas de afinidad con lectina eliminó el cfDNA circulante unido a nucleosomas; sin embargo, una cierta cantidad de cfDNA circulante unido a nucleosomas y de cfDNA circulante subnucleosómico (aproximadamente por debajo de 147 pares de bases de longitud) permaneció en el plasma. La purificación por afinidad con la columna de afinidad con Hoechst 33342 condujo a la eliminación del cfDNA circulante subnucleosómico, pero todavía estaba presente una cierta cantidad de cfDNA circulante unido a nucleosomas. Por lo tanto, los inventores probaron la purificación consecutiva con diferentes columnas: una alícuota de 1 ml del plasma del paciente se purificó secuencialmente a través de una columna de afinidad con Hoechst 33342 seguida de una columna de afinidad con el anticuerpo anti-dsDNA de la manera descrita en el ejemplo 2 para el uso secuencial de columnas de afinidad con anticuerpo contra la histona y de columnas de afinidad con lectina. El plasma se verificó adicionalmente mediante la electroforesis en gel con tinción con el colorante fluorescente para ADN y no se detectó cfDNA circulante.

Por lo tanto, la purificación mediante matriz de afinidad que contiene dos matrices de afinidad de la presente invención puede eliminar prácticamente todos los tipos de cfDNA de la sangre del paciente, incluidos cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos los dsDNA, los ssDNA y los oligonucleótidos), de la sangre o el plasma del cuerpo del paciente.

Ejemplo 10: El cfDNA circulante del plasma purificado a partir de los exosomas y del ADN unido a los nucleosomas tiene actividad proinflamatoria y contribuye a la disfunción orgánica en la septicemia.

Se tomaron muestras de plasma del paciente ingresado en la unidad de cuidados intensivos (UCI) con diagnóstico de síndrome de respuesta inflamatoria sistémica con síndrome de disfunción multiorgánica (MODS) secundario a una pancreatitis aguda. Se realizó un reemplazo terapéutico de plasma como tratamiento de rescate. Se purificaron 100 ml del plasma extraído del paciente a través de las columnas de afinidad con lectina y con los anticuerpos antihistónicos (como se describe en el ejemplo 2, es decir, la matriz de afinidad con anticuerpos antihistónicos y la matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis [campanilla de invierno]) dos veces para conseguir la retirada completa del cfDNA circulante unido a nucleosomas y a exosomas. El cfDNA circulante restante se extrajo del plasma purificado a partir de nucleosomas y exosomas como se describe en el ejemplo 3. La cantidad total de ADN residual (recuperado del plasma del paciente el que había retirado antes el cfDNA circulante unido a nucleosomas y a exosomas) fue de aproximadamente 50 pg. A continuación, se resuspendió el ADN en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,2 y se usó para un experimento con animales tal como se describe a continuación.

A ocho ratones macho C57/BL6 de 10 semanas de edad se les inyectó por vía intravenosa 1 pg de cfDNA extraído tres veces con un intervalo de 1 h. Los animales se sacrificaron 4 h después de la última inyección de ADN para recoger la sangre.

La concentración de la creatinina en el plasma se midió mediante un ensayo enzimático. Se usó el inmunoensayo con perlas magnéticas fluorescentes para la concentración plasmática de TNF-a, IFN-g e IL-12 (Bio-Rad Laboratories, EE. UU.). Los resultados se resumen en la tabla 3 que viene a continuación.

Tabla 3:

Por lo tanto, el cfDNA del plasma purificado sin exosomas ni ADN unido a nucleosomas tiene una fuerte actividad proinflamatoria y compromete el funcionamiento de los órganos.

Ejemplo 11: El cfDNA circulante del plasma de un paciente sin el ADN unido a los nucleosomas y a los exosomas, pero no desprovisto de ADN libre de partículas, es responsable de la activación de TLR9.

La activación de los receptores TLR9 se ha reconocido recientemente que es un componente importante en el desarrollo de la respuesta inflamatoria sistémica del huésped, insuficiencia orgánica, invasión y metástasis del cáncer, lesión neuronal en el accidente cerebrovascular, autoinmunidad, eclampsia y desregulación senil de la inmunidad que conduce a un estado proinflamatorio senil.

El paciente era un hombre de 33 años con leucemia mieloide aguda y un trasplante de médula ósea (TMO) compatible con HLA, seguido de la inmunosupresión estándar y la profilaxis antibiótica. Aproximadamente 1 mes después del TMO, el paciente desarrolló una erupción eritematosa compatible con GVHD de grado III y diarrea intensa. Se tomaron muestras de plasma al ingreso del paciente y se purificaron posteriormente con la columna de afinidad con anticuerpos contra la histona H2A y la columna de afinidad con lectina como se describe en el ejemplo 2 (matriz de afinidad con anticuerpos antihistónicos y matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis (campanilla de invierno)) o se purificaron con una columna de afinidad con la histona H1.3 preparada como se describe en el ejemplo 1 (matriz de afinidad de perlas de celulosa acoplada con la histona H1.3).

Las células indicadoras HEK-Blue™ hTLR9 (Invivogen) se enjuagaron con medio para separarlas del frasco de cultivo y las células se resuspendieron a la densidad celular especificada por el protocolo del fabricante. Se estimularon 180 pl de suspensión celular por pocillo durante 24 h (37 °C, 5 % de CO) con 60 pl del plasma del paciente no tratado. El plasma del paciente se purificó a través de las columnas de afinidad con lectina y con el anticuerpo antihistónico, o se purificó a través de una columna de afinidad con H1.3 (en un solo paso). Después de la incubación, se realizó el análisis de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) usando el medio de detección Quanti-Blue como se describe en las instrucciones del fabricante. La detección de la absorbancia a 650 nm se midió utilizando un lector de microplacas.

Tabla 4:

La cuantificación de la activación del TLR9 se realizó leyendo la densidad óptica (DO) a 620 nm (N=3). Los resultados se muestran en la tabla 4. Sorprendentemente, la eliminación del cfDNA circulante unido a exosomas y a nucleosomas impidió la activación del TLR9 por el plasma del paciente en un grado bastante limitado, mientras que la eliminación de prácticamente todos los tipos de cfDNA unido a partículas y no unido, incluidos el dsDNA, el ssDNA y los oligonucleótidos, impidió casi por completo la activación del TLR9 por el plasma del paciente.

Ejemplo 12: Preparación de la matriz de afinidad con poli-L-lisina hiperramificada (PLLAM) y la columna de afinidad

Se sabe que los poliaminoácidos catiónicos como la poli-L-lisina (PLL) son eficaces para condensar el ADN plasmídico en nanoestructuras compactas y se han utilizado para la unión de ADN in vitro e in vivo.

Se preparó un polímero catiónico de unión a ADN, a saber, poli-L-lisina hiperramificada (HBPL) como se describe en Kadlecova, Z. et al, A comparative study on the in vitro cytotoxicity of linear, dendritic and hyperbranched polylysine analogs, Biomacromolecules, v. 13 (2012) págs. 3127-3137): 27,45 g de monoclorhidrato de L-lisina (calidad de reactivo, >98 %, Sigma-Aldrich, EE. UU.) se disolvieron en 55 ml de agua Milli-Q y se neutralizaron con 8,4 g de KOH. Luego, la solución se calentó a 150 °C durante 48 h en una corriente de nitrógeno. A continuación, para eliminar el exceso de sal y la L-lisina restante, el producto de polimerización se dializó con un tubo de membrana de diálisis contra agua Milli-Q (tubo de diálisis de piel de serpiente, Thermo Fisher Scientific, Suiza, umbral de peso molecular: 3000 g/mol).El producto de diálisis se liofilizó y luego se fraccionó en una columna de filtración en gel Sephadex G75 (GE Healthcare Life Science, Suiza): la columna se cargó con 50 ml de una solución de 2 mg/ml de HBPL en HCl a 0,01 M y posteriormente se eluyó con HCl a 0,01 M. Se recogieron fracciones de 20 ml y se liofilizaron. Se recogió la fracción con un peso molecular medio ponderado de 21.000-32.000 (determinado por cromatografía de exclusión por tamaños) y se liofilizó. La fracción liofilizada se disolvió en agua bidestilada, se dializó frente a NaHCO3 a 0,1 M y se utilizó para preparar luego la matriz de afinidad. Se preparó la matriz de agarosa que comprende HBPL inmovilizado mediante un método convencional de la siguiente manera: se suspendió Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno (peso húmedo 10 g, Sigma) en 10 ml de NaHCO3 a 0,1 M, se mezcló con 10 ml de la fracción de HBPL de 21.000-32.000 (5 mg/ml en NaHCO3 a 0,1 M), y se agitó durante 24 h a 4 °C. La Sepharose con HBPL preparada (4 mg de HBPL por ml de suspensión de perlas) se vertió luego en una columna de policarbonato (1,0 x 12 cm) y se lavó con 750 ml de NaHCO3 a 0,1 M, 750 ml de NaCl a 0,5 M y se ajustó a pH 9,2. La columna se equilibró con tampón de Tris-HCl a 0,05 M, pH 7,5. La columna de afinidad preparada con la matriz de afinidad con poli-L-lisina hiperramificada (PLLAM) se almacenó a 4 °C.

Ejemplo 13: Separación de los diferentes subtipos de cfDNA circulante de la sangre de un paciente con enfermedad neurodegenerativa.

El cfDNA circulante de los pacientes con trastornos neurodegenerativos puede atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) e inducir la muerte de las células neuronales. El uso de la enzima desoxirribonucleasa podría suprimir este efecto. Véase la publicación de solicitud de la patente internacional WO2016190780. Para investigar el efecto de los diferentes subtipos del cfDNA circulante en la muerte de las células neuronales y para ver si la retirada de la sangre de todo el cfDNA unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido, entre ellos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos, podría impedir la muerte de las células neuronales, se realizaron los siguientes experimentos.

Para los cultivos neuronales, se retiró la corteza cerebral de los embriones de rata Sprague Dawley el día embrionario (E) 15-17. Los explantes corticales se diseccionaron en trozos de aproximadamente 200-400 gm2 con agujas finas y se disoció con el sistema de disociación con papaína (Worthington Biochemicals) según las instrucciones del fabricante, y luego se mantuvo en medio mínimo esencial (Gibco) enfriado con hielo. Las neuronas se colocaron en placas sobre cubreobjetos de vidrio de 13 mm de diámetro recubiertos primero con poli-D-lisina (10 gg/ml en PBS) seguido de laminina (10 gg/ml en PBS) (Gibco) y se cultivaron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera de CO²humidificada al 8 % (v/v) durante 24-48 h en medio neurobasal con Antibiótico-Antimicótico (Gibco) al 1 % (v/v).

Después de un período inicial de cultivo, el medio de cultivo celular se diluyó dos veces (v/v) con una de las siguientes muestras de plasma con cultivo adicional durante otras 24 h: (a) plasma de un donante sano de 20 años, (b) plasma del paciente con la enfermedad de Alzheimer (EA) en rápida progresión, (c) plasma del mismo paciente con la EA tratado durante 6 h con 5 gg/ml de DNasa I (Pulmozyme, Genentech), (d) plasma del mismo paciente con la EA después del paso por las columnas de afinidad con lectina y con anticuerpo contra la histona H2A (preparadas como se describe en el ejemplo 2, es decir, la matriz de afinidad con los anticuerpos contra la histona H2A y la matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis [campanilla de invierno]), y (e) plasma del mismo paciente con la EA después del paso a través de la columna de afinidad con la histona H1.3 (la matriz se preparó como se describe en el ejemplo 1, es decir, la matriz de afinidad de perlas de celulosa acoplada con la histona H1.3) y se colocó en una columna de policarbonato de 0,8 x 9 cm (hasta el 80 % del volumen de la columna), en donde el volumen de las muestras de plasma pasado a través de las columnas correspondientes es de aproximadamente 2,0 ml.

El perfil electroforético del cfDNA circulante de las muestras de plasma utilizadas en los experimentos de cultivo celular se presenta en la figura 5.

Solo se detectó una cantidad limitada del cfDNA circulante unido a nucleosomas en forma de mononucleosomas en el plasma de un donante sano. Se detectó una gran cantidad de cfDNA circulante unido a nucleosomas en forma de mono- y oligonucleosomas en el plasma de un paciente con la EA. El tratamiento del plasma de los pacientes con la EA con la enzima DNasa I dio como resultado una disminución del contenido de ADN en las fracciones oligonucleosómicas y mononucleosómicas, pero dio un aumento significativo de ADN en la fracción subnucleosómica (por debajo de unas 147 pares de bases de longitud). El plasma de un paciente con la EA purificado con las columnas de afinidad con lectina y con anticuerpos contra la histona H2A no contenía cfDNA circulante unido a nucleosomas, sino solo el cfDNA subnucleosómico (es decir, no unido). El plasma de un paciente con la EA tratado con una columna de afinidad con la histona H1.3 (como un solo paso) no contenía ningún cfDNA circulante.

La inducción del marcador de muerte celular apoptósica caspasa 3 se determinó en las neuronas corticales disociadas cultivadas después de 24 h de exposición a muestras de plasma. Las células se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % (p/v) y se incubaron durante 1 h con el anticuerpo escindido contra la caspasa 3 (Abcam) diluido 1:500 en PBS. Las células se lavaron y se incubaron durante 1 h con los anticuerpos policlonales de cabra conjugados a Alexa Fluor 488 anti-conejo (Invitrogen) en PBS antes del lavado y el recuento.

Tabla 5:

Los resultados se muestran en la tabla 5. Por lo tanto, retirar de la sangre prácticamente todos los tipos de cfDNA, incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (entre ellos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos) impide la muerte de las células neuronales en un grado sustancialmente mayor que una simple retirada de cfDNA unidos a nucleosomas y exosomas e incluso mejor que la escisión del cfDNA circulante en el plasma con la enzima DNasa I, probablemente debido a la liberación de subproductos de la degradación enzimática del ADN o a la baja sensibilidad del cfDNA circulante a la DNasa I.

Ejemplo 14: Reactivación de la desoxirribonucleasa endógena

La enzima desoxirribonucleasa (DNasa) es la principal enzima responsable de la degradación del ADN de alto peso molecular en circulación. Numerosos estudios muestran que la actividad desoxirribonucleasa se suprime en ciertas condiciones que involucran un aumento del cfDNA circulante en la sangre, tal como cáncer, cáncer metastásico, enfermedad autoinmunitaria, septicemia, infecundidad (Tamkovich SN, Circulating DNA and DNase activity in human blood. Ann N Y Acad Sci. 2006 septiembre; 1075:191-6; Martinez-Valle, DNase 1 activity in patients with systemic lupus erythematosus: relationship with epidemiological, clinical, immunological and therapeutical features. Lupus. 2009 abril; 18(5): 418-23; patente europea EP20070827224; Travis J Gould, Cellular and Biochemical Properties of cell-free DNA: a prognostic marker in severe sepsis patients. Blood 2011,118:2169)

Para valorar cómo la reducción del cfDNA unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido, incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos, afecta a la actividad DNasa I en el plasma, se realizó el siguiente experimento. El cfDNA se midió en el plasma con el método descrito por Goldstein (Goldshtein, H. et al., A rapid direct fluorescent assay for cell-free DNA quantification in biological fluids, Annals of Clinical Biochemistry, Vol 46, Número 6, págs. 488 494). El colorante para gel de ácidos nucleicos SYBR® Gold (Invitrogen) se diluyó primero a 1:1000 en dimetilsulfóxido y luego a 1:8 en solución salina tamponada con fosfato. Se aplicaron 10 gl de muestras de plasma en las placas de 96 pocillos. Se le añadieron 40 gl de SYBR Gold diluido a cada pocillo (dilución final 1:10.000) y se midió la fluorescencia con un fluorímetro de 96 pocillos a una longitud de onda de emisión de 535 nm y una longitud de onda de excitación de 485 nm.

Se realizó la inmunotransferencia Western de la DNasa I en las muestras de plasma independientes usando geles de SDS-PAGE al 10 %, transferidos a membranas de transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF) e incubadas con anticuerpos de cabra anti-DNasa I humana (Santa Cruz Biotechnology). La unión se visualizó con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal (Pierce) después de la incubación con el IgG anti-cabra conjugado con HRP.

La actividad desoxirribonucleasa sérica se midió con ORG590 (Orgentec) según el protocolo del fabricante. La detección se realizó en un fotómetro de microplacas (Multiscan FC) a 450 nm con una longitud de onda de corrección de 620 nm.

Se tomó una muestra de sangre de una paciente de 56 años con cáncer de mama, metástasis múltiples en los pulmones, hígado y mediastino (T4N3M1). Una alícuota de plasma de 5 ml se sometió a varios ciclos por una columna de policarbonato de 1 ml (0,5 x 5 cm) que contenía 0,5 ml de la matriz de afinidad con la histona H1.3: la valoración del perfil electroforético de cfDNA circulantes, la transferencia Western de la DNAsa y cuantificación de la actividad desoxirribonucleasa, y el contenido extracelular circulante, se midieron después de cada ciclo de columna. Los resultados se resumen en la figura 6.

La valoración electroforética del perfil de cfDNA circulantes mostró una disminución continua del contenido de todas las fracciones junto con un número creciente de ciclos de la columna. Esa observación se confirmó por la cuantificación directa del cfDNA circulante en el plasma. Inicialmente, en el plasma del paciente estaba presente una cantidad comparable de la enzima DNasa I detectada por inmunotransferencia Western. Sin embargo, la actividad enzimática de la DNasa I, que estaba fuertemente suprimida, se volvió significativa solo después de 4 ciclos de columna cuando la cantidad de cfDNA circulante se redujo aproximadamente a la mitad.

Por lo tanto, la aféresis según la presente invención en la que la concentración global circulante de cfDNA en dicho mamífero se reduce en al menos un 50% podría reactivar la actividad de la enzima DNasa I endógena, lo que es beneficioso para los pacientes que requieren una reducción de la concentración de cfDNA circulantes.

Según la gran cantidad de cfDNA circulantes descrita de aproximadamente 5000 ng/ml (que se describen para algunos pacientes con cáncer avanzado, pacientes septicémicos y pacientes con un traumatismo), la columna de afinidad o la combinación de columnas de afinidad con capacidad de unión de 30 mg podría proporcionar una retirada casi completa del plasma del paciente de todo el cfDNA unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido, incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos.

Ejemplo 15: Preparación de una columna de afinidad que contiene la matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM)

Se preparó un anticuerpo monoclonal de ratón específico de nucleosomas utilizando ratones MRL/Mp (-) /+ según el método descrito en M. J. Losman, Monoclonal antibodies to subnucleosomas from a MRL/Mp (-)+/+ mouse. Oligoclonality of the antibody response and recognition of a determinant composed of histones H2A, H2B, and DNA. J Immunol 1 de marzo de 1992, 148 (5) 1561-1569). Los anticuerpos (IgG) monoclonales (mAb) preparados, denominados aquí AN-1 y AN-44, correspondientemente, se seleccionaron en función de su capacidad para unirse selectivamente a los nucleosomas, pero no a los componentes de los nucleosomas como las histonas centrales o el ADN. (Kees Kramers, Specificity of monoclonal anti-nucleosome auto-antibodies derived from lupus mice, Journal of Autoimmunity, V. 9, Número 6, 1996, págs 723-729). La afinidad relativa de AN-1 y AN-44 por los nucleosomas y los componentes del nucleosoma de tipo histona y que no son histonas se resumen en la tabla 6 que viene a continuación.

Tabla 6:

Se usó 1 ml de la columna HP HiTrap activada con NHS preempaquetada con Sepharose High Performance activada con NHS (GE Healthcare) para la preparación de matriz/cartucho de afinidad. Se acoplaron 200 gg de AN-1 según el procedimiento del fabricante a Sepharose activada con NHS.

En función de los datos de afinidad presentados en la tabla anterior, es obvio que la ANAM se une solo al cfDNA circulante unido a nucleosomas, pero no al cfDNA no unido, incluidos los dsDNA, los ssDNA y los oligonucleótidos.

Por lo tanto, para asegurar la unión del cfDNA no unido, incluidos los dsDNA, los ssDNA y los oligonucleótidos, en los experimentos con animales se usaron dos columnas consecutivas. Se preparó una columna con matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM) como se describe anteriormente en este ejemplo. Se preparó una segunda columna con la matriz de afinidad con el dendrímero de poliamidoamina como se describe en el ejemplo 4.

Ejemplo 16: Procedimiento de aféresis

Se insertaron catéteres venosos crónicos en la vena femoral y en la vena yugular de ratas experimentales con anestesia general (inyección i.p. de 0,8 mg de xilazina y 4 mg de ketamina). Los catéteres se enjuagaron tres veces por semana con solución salina heparinizada durante el estudio. Antes de cada procedimiento de aféresis, se administró un bolo de heparina (90 UI/100 g de peso corporal (p.c.)). El sistema extracorpóreo se llenó completamente con la solución salina heparinizada y, posteriormente, los extremos del catéter se conectaron con el sistema extracorpóreo.

Para los experimentos de aféresis en los animales, las columnas de afinidad descritas en esta especificación se equiparon con entradas y salidas para incorporar más estas columnas de afinidad preparadas al segundo circuito (plasma) del sistema extracorpóreo/aféresis.

En el primer circuito del sistema, se bombeaba sangre (minibomba peristáltica rotativa, Fisher Scientific) desde el animal (vena femoral) a través de un separador de plasma (Saxonia Medical, Radeberg, Alemania) y se devolvía al animal mediante un catéter venoso. El plasma separado se hacía entrar en el segundo circuito (a través de una segunda minibomba peristáltica rotativa) y se hacía pasar a través de uno o más cartuchos de afinidad según los ejemplos específicos de los procedimientos de aféresis descritos en esta especificación.

En el primer circuito del sistema, se bombeaba la sangre (minibomba peristáltica rotativa, Fisher Scientific) desde el animal (vena femoral) a través de un separador de plasma (Saxonia Medical, Radeberg, Alemania) y se devolvía al animal mediante un catéter venoso insertado a la vena yugular. El plasma separado se hacía entrar en el segundo circuito (apoyado por una segunda minibomba peristáltica rotativa) y se hacía pasar a través de cartuchos de afinidad (según los ejemplos específicos de los procedimientos de aféresis descritos en esta especificación), y regresaba al cuerpo del animal a través de una línea de polímero también conectada al catéter insertado en la vena yugular.

Ejemplo 17: Tratamiento con aféresis de la septicemia y de la lesión renal septicémica

Se establecieron modelos clásicos de septicemia inducida por el método de ligadura del ciego y punción (CLP). Se utilizaron ratas hembra Sprague-Dawley (SD) de 350-400 g de peso corporal. Los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico (50 mg/kg por vía intraperitoneal).

Se realizó una incisión abdominal en la línea media de aproximadamente 1,5 cm. Se diseccionó el mesenterio ciego para exponer el ciego. Luego, se ligó el ciego entre la válvula terminal y la ileocecal para mantener la continuidad intestinal. A continuación, se perforó el ciego mediante una única punción completa con una aguja del calibre 21 en el segmento central de la ligadura. El segmento atado se presionó suavemente para asegurar que una pequeña cantidad de heces saliera a la superficie del intestino. El ciego se devolvió a la cavidad abdominal. La herida quirúrgica se suturó capa a capa con una sutura reabsorbible para la capa muscular y con grapas quirúrgicas para la piel. Después de la operación, se inyectó a las ratas 10 ml/kg de cloruro sódico tibio al 0,9% para la inyección y, después de la recuperación, los animales se dividieron al azar en cuatro grupos (grupos 1 -3; 6 animales en cada grupo) según el tratamiento.

El tratamiento con aféresis se realizó como se describe en el ejemplo 16. El procedimiento de aféresis se llevó a cabo dos veces: el día 1 (24 h después de la CLP) y el día 3 (72 h después de la CLP). A 6 ratas se les realiza el procedimiento de aféresis con la columna/cartucho con una matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM) preparada como se especifica en el ejemplo 15, y a 6 ratas se les realiza un procedimiento de aféresis con la columna/cartucho que contiene una matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) preparada como se especifica en el ejemplo 4. Seis ratas (grupo de control negativo) reciben el procedimiento de aféresis con un cartucho que se cargó con el volumen correspondiente del cartucho de soporte no modificado. El nivel de lesión renal aguda (función renal) se evaluó midiendo la concentración de creatinina sérica y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) con Roche Reflotron Plus (Roche Diagnostics) antes de cada procedimiento de aféresis. El cfDNA circulante se extrajo de 100 pl de las muestras de plasma con el método de THP convencional (Triton-calor-fenol) (Breitbach et al., PLoS ONE, 2014, 9(3):e87838). El ADN se cuantificó con el ensayo PicoGreen (Molecular Probes, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante y los cambios de cfDNA se expresaron como porcentaje de la concentración del ADN inicial, es decir, a la concentración antes del primer procedimiento de aféresis. Para el grupo de control negativo, se prepararon columnas/cartuchos que contenían la cantidad correspondiente de soporte no modificado (Macroporous Bead Cellulose MT 500, tamaño de las partículas de 100-250 pm, lontosorb, República Checa, lavado dos veces con etanol al 98 % y agua bidestilada). La tasa de supervivencia (120 h después de la CLP) se supuso que sería el parámetro principal de la eficacia del tratamiento de la septicemia. La asignación de los animales y los resultados se muestran en la tabla 7 que viene a continuación.

Tabla 7:

Los resultados demuestran que el dispositivo de aféresis con PDAM podía capturar prácticamente todos los tipos de cfDNA, entre ellos cfDNA unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido (incluidos los dsDNA, los ssDNA y los oligonucleótidos) y proporcionó una mejor eficacia terapéutica y redujo de manera más eficiente la concentración del cfDNA circulante en la septicemia y la lesión renal septicémica.

Ejemplo 18: Tratamiento con aféresis de los signos de reacción adversa relacionados con la quimioterapia

Se prepararon 18 ratas hembra Sprague-Dawley (SD) de 300-350 g de peso corporal para el procedimiento de aféresis como el que se describe en el ejemplo 16 y recibieron una única inyección intravenosa en bolo de paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb S.r.L.) a una dosis de 10 mg/kg. El procedimiento de aféresis se inició 4 h después de la inyección de paclitaxel y continuó durante 12 h; 6 ratas se sometieron a un procedimiento de aféresis con una columna/cartucho con matriz de afinidad con anticuerpos antinucleosómicos (ANAM), y 6 ratas se sometieron a un procedimiento de aféresis con una columna/cartucho que contenía una matriz de afinidad con poli-L-lisina hiperramificada (PLLAM). Seis ratas (control negativo) se sometieron al procedimiento de aféresis con un cartucho que se cargó con el volumen correspondiente de soporte no modificado (Sepharose 4B).

Se cuantificó la concentración de cfDNA circulantes y se presentó como se describe en el ejemplo 17 (donde el cfDNA se expresó como porcentaje de la concentración de ADN con respecto al valor inicial). La tasa de supervivencia (24 h después del bolo) se supuso que sería el parámetro principal de la eficacia del tratamiento. La asignación de los animales y los resultados se muestran en la tabla 8 que viene a continuación.

Tabla 8:

Los resultados demuestran que el dispositivo de aféresis con PLLAM podía capturar prácticamente todos los tipos de cfDNA, entre ellos cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos (incluidos los dsDNA, los ssDNA y los oligonucleótidos), brinda una mejor protección/eficacia terapéutica y reduce de manera más eficiente la concentración del cfDNA circulante en los animales envenenados por un fármaco quimioterápico.

Ejemplo 19. Purificación/aféresis del cfDNA en el plasma con un cartucho que captura el ADN unido a nucleosomas y exosomas y otro cartucho que captura el cfDNA no unido, incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos.

Para la medición de la concentración de cfDNA en el plasma, se extrajo el cfDNA de muestras de plasma de 500 gl con el método de HTP modificado (Xue, X., etal. Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum, Clínica Chimica Acta, V.404 (2009), págs 100-104) y se cuantificó utilizando el ensayo PicoGreen (Molecular Probes, Países Bajos) según las instrucciones del fabricante.

Cuando el cfDNA era indetectable en una muestra mediante el ensayo PicoGreen, la ausencia de cfDNA en las muestras se confirmaba mediante la electroforesis de ADN en gel de agarosa de la manera descrita en la especificación anterior.

Para los procedimientos de aféresis/purificación, las muestras de plasma se aplicaron gradualmente a las columnas de afinidad correspondientes y se dejaron fluir.

Una muestra de plasma de 2,0 ml obtenida de un paciente con choque septicémico de 67 años se purificó en consecuencia a través de una columna de afinidad de ANAM. La columna de afinidad de ANAM (que captura el cfDNA unido a nucleosomas) se preparó sobre la base de 1 ml de columna HP activada con NHS HiTrap (como se describe en el ejemplo 15) y la columna de afinidad con lectina (que captura el cfDNA unido a exosomas) se preparó como se describe en el ejemplo 2 (matriz de afinidad con la lectina de Galanthus nivalis [campanilla de invierno]).

La concentración inicial de cfDNA en el plasma del paciente fue de 1150 ng/ml con una presencia significativa de prácticamente todos los tipos de cfDNA visualizados mediante la electroforesis de ADN en gel de agarosa (véase la figura 7, carril A). La concentración de cfDNA en el plasma después del primer análisis mediante la combinación de columnas de afinidad con lectina y con ANAM ha disminuido a 350 ng/ml. El plasma del paciente parcialmente purificado se sometió además a una segunda ronda a través de la misma combinación de columnas de afinidad con lectina y con ANAM nuevas. La concentración de cfDNA en el plasma después de la segunda ronda permaneció sin cambios con cantidades visibles de cfDNA de origen no nucleosómico con un peso molecular de hasta 750 kDa visualizado por electroforesis de ADN en gel de agarosa con tinción fluorescente del ADN (véase la fig. 7, carril C).

El experimento dejó en claro que la incapacidad de las columnas de afinidad con lectina y con ANAM para retirar completamente el cfDNA del plasma del paciente no se relacionó con la capacidad de unión general de la combinación de columnas de afinidad con lectina y con AMAM, sino más bien con su incapacidad para capturar el cfDNA de origen no nucleosómico o no exosómico del plasma del paciente. Para confirmar esto, purificamos más la muestra a través de una columna de afinidad con anticuerpos anti-DNA preparada como se describe en el ejemplo 7 (matriz de agarosa acoplada con IgM monoclonal de ratón de alta afinidad por el ADN mono- y bicatenario). Después de una operación de purificación, la concentración de cfDNA en el plasma del paciente se volvió indetectable según lo medido por el ensayo PicoGreen. Esta observación se confirmó además por la ausencia de material de ADN visible después de la electroforesis del ADN en el gel de agarosa.

Por lo tanto, el uso de dos columnas/cartuchos de afinidad consecutivas, en los que una columna/cartucho captura el ADN unido a nucleosomas y el ADN unido a exosomas y la otra columna/cartucho captura el cfDNA no unido, incluidos el dsDNA, el ssDNA y los oligonucleótidos, es muy eficaz para la purificación/aféresis de la sangre del paciente de todo tipo de cfDNA circulante.

En consecuencia, se purificaron otros 2 ml de muestra de plasma del mismo paciente a través de una columna de afinidad con intercalante de ADN (preparada como se describe en el ejemplo 8, es decir, perlas de celulosa acopladas con el Hoechst 33342) y una columna de afinidad con anticuerpos anti-ADN (preparada como se describe en el ejemplo 7, es decir, matriz de agarosa acoplada con IgM monoclonal de ratón de alta afinidad por el ADN). La concentración de cfDNA en el plasma después del primer ciclo a través de la combinación de columnas de afinidad con intercalante de ADN y con anticuerpos anti-DNA ha disminuido a 475 ng/ml, en donde los cfDNA de diferente origen se visualizan por electroforesis de ADN en gel de agarosa (figura 7, carril B). Este plasma de paciente parcialmente purificado se sometió además a un segundo ciclo a través de la misma combinación de columnas de afinidad nuevas con anticuerpo anti-ADN y con intercalante de ADN. La concentración de cfDNA en el plasma después del segundo ciclo se volvió indetectable en el plasma del paciente según lo medido por el ensayo PicoGreen. Esta observación se confirmó además por la ausencia de material de ADN visible después de la electroforesis del ADN en gel de agarosa con tinción fluorescente del ADN.

Por lo tanto, el uso de una combinación de columnas/cartuchos que contienen matrices que se unen prácticamente a todos los tipos de cfDNA (incluidos los cfDNA unidos a nucleosomas, cfDNA unidos a exosomas y cfDNA no unidos [incluidos dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos]) según la invención permite la captura de una cantidad inusualmente alta de cfDNA.

Ejemplo 20. Purificación/aféresis del plasma de la vena porta para retirar el cfDNA de la sangre de ratas con una pancreatitis aguda

En el experimento se usaron seis ratas macho Sprague-Dawley, de 250-350 g. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en una mesa de operaciones calentada con anestesia general con inyección i.p. de 0,8 mg de xilazina y 4 mg de ketamina.

La pancreatitis aguda se indujo como sigue. Durante la laparotomía se canuló transduodenalmente la papila de Vater con una cánula de infusión i.v. de 24G de Abbocath®-T. Antes de la infusión controlada por presión de 0,5 ml de ácido glicodesoxicólico esterilizado en una solución tamponada de glicilglicina-NaOH (10 mmol/l, pH 8,0, 37 °C), se pinzó el colédoco y se permitió que la bilis y el líquido pancreático se drenaran por la cánula. Inmediatamente después de la infusión, se restableció el flujo hepatoduodenal de la bilis al retirar la pinza. El orificio de la punción en el duodeno se cerró cuidadosamente con una sutura serosa de polipropileno 8.0.

Después del cierre del abdomen en las ratas 1,2 y 3, se les insertaron catéteres venosos crónicos en la vena femoral y en la vena yugular como se describe en el ejemplo 16.

A las ratas 4, 5 y 6 se les implantó un catéter de vena porta en la vena porta hepática a 8 mm caudal del hígado como lo describe Strubbe (Strubbe J. H. et al, Hepatic-portal and cardiac infusion of CCK-8 and glucagon induce different effects on feeding. Physiol Behav 46: 643-646, 1989).

El tratamiento con aféresis se realizó como se describe en el ejemplo 16 usando un cartucho de afinidad con PDAM, preparado como se describe en el ejemplo 4 y provisto de entrada y salida de polipropileno. El procedimiento de la aféresis se llevó a cabo diariamente durante los días 1-3 y cada procedimiento de la aféresis duró 12 h.

La tasa de supervivencia (96 h después de la inducción de la pancreatitis) se supuso que sería un parámetro principal de la eficacia del tratamiento. Para cuantificar el cfDNA de rata y el cfDNA de origen bacteriano (es decir, la carga bacteriana), se aisló el cfDNA total de muestras de plasma de rata de 200 gl utilizando un kit QlAamp DNA Mini según las instrucciones del fabricante. La tasa de supervivencia (96 h después de la inducción de la pancreatitis) se supuso que sería un parámetro principal de la eficacia del tratamiento. Para cuantificar el cfDNA de rata y el cfDNA de origen bacteriano (es decir, la carga bacteriana), se aisló el cfDNA total de muestras de plasma de rata de 200 gl utilizando un kit QlAamp DNA Mini según las instrucciones del fabricante. La concentración del cfDNA en las muestras de plasma se midió mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa utilizando el detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) y TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) según el protocolo del fabricante. Para cuantificar el cfDNA de origen bacteriano, se diseñaron cebadores específicos y una sonda para las regiones conservadas del rDNA 16S bacteriano: el cebador directo, 5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3', el cebador inverso 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3' y la sonda (6-FAM)-5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'-(TAMRA) (véase: Mangala, A.; Nadkarni, A. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology, 2002, vol. 148, págs. 257-266). El ensayo de expresión génica con TaqMan de la actina p de rata Rn00667869_m1 (Applied Biosystems) se utilizó para amplificar el cfDNA genómico de rata.

La supervivencia/desenlace y los resultados de cada PCR (Ct, es decir, el valor del ciclo umbral) para el gen de la actina p de rata y el ADNr bacteriano 16S en el plasma sanguíneo extraído de la vena yugular se presentan en la tabla 9.

Tabla 9:

•Media ± DE de tres ciclos independientes. Los valores de Ct son logaritmos naturales e inversos a la cantidad de ácido nucleico o gen de interés en la muestra. El Ct es el número de ciclo en el que la fluorescencia generada en una reacción se cruza con la línea del umbral.

Los resultados demuestran que desviar/retirar la sangre para la aféresis hacia un dispositivo de aféresis según la invención desde la vena porta daba como resultado una mejor supervivencia (en comparación con el desvío de la sangre desde la vena femoral, es decir, no regional) y una retirada más eficaz del cfDNA de la sangre (incluido el cfDNA de origen bacteriano) en las ratas con pancreatitis aguda.

Por lo tanto, en las circunstancias clínicas en donde el proceso patológico responsable de la liberación del cfDNA (crecimiento tumoral, inflamación septicémica o aséptica, liberación de ADN bacteriano) se origina en las áreas/regiones drenadas principalmente por la vena porta (esofágica, gástrica, intestinal, esplénica, pancreática, de vesícula biliar, de cavidad peritoneal) podría ser beneficioso desviar la sangre para el procedimiento de aféresis desde la vena porta.

Ejemplo 21. Comparación de la eliminación del cfDNA del plasma del paciente mediante la matriz de afinidad con la histona H1, la matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM y la matriz de afinidad con poli-L-lisina (PLLAM)

La matriz de afinidad con poli-L-lisina (PLLAM) se produjo como se especifica en el ejemplo 12. La matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) se produjo como se especifica en el ejemplo 4. La matriz de afinidad con la histona H1 se produjo como se especifica en el ejemplo 1.

El plasma modelo enriquecido con cfDNA se produjo mezclando el plasma de voluntarios sanos con el ADN marcador (escalera de ADN de 1 kbp Plus, Invitrogen) hasta la concentración final de cfDNA de 10 gg/ml. La capacidad de adsorción de la matriz de afinidad con poli-L-lisina (PLLAM), la matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) y la matriz de afinidad con la histona H1 con respecto al plasma modelo enriquecido con la escalera de ADN artificial de 1 kbp Plus se comprobó mediante el método de adsorción de volumen con relación de matriz de afinidad:plasma de 1:5 (100 gl de matriz de afinidad se mezclaron con 500 gl de plasma de modelo) durante 1 h a 37 °C con rotación lenta. Se usó Sepharose FF con etanolamina como control. Las muestras de plasma se analizaron mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1 % utilizando el sistema E-Gel de Invitrogen antes de la incubación y tras la sedimentación de la matriz de afinidad. El cfDNA se extrajo del plasma del paciente con el kit QIAamp DNA Blood Mini, Qiagen, y se cuantificó con el fluorímetro Qubit 3.0. Las mismas matrices de afinidad se incubaron con el plasma del paciente diagnosticado con septicemia relacionada con odontogénesis en una relación matriz de afinidad:plasma de 1:10 (100 gl de matriz de afinidad se mezclaron con 1 ml del plasma del paciente) usando las mismas condiciones de incubación. Al cabo de 1 h, la matriz de afinidad se retiró por centrifugación. Las muestras de plasma se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % utilizando el sistema E-Gel de Invitrogen antes de la incubación y tras la sedimentación de la matriz de afinidad. Se usó Sepharose FF con etanolamina como control. El cfDNA se extrajo del plasma del paciente con el kit QIAamp DNA Blood Mini, Qiagen, y se cuantificó con el fluorímetro Qubit 3.0. Los datos de cuantificación del cfDNA se presentan en la tabla 10 que viene a continuación.

Tabla 10

Parece que la matriz de afinidad con poli-L-lisina (PLLAM), la matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) y la matriz de afinidad con la histona H1 tienen la misma capacidad para eliminar el cfDNA del modelo del plasma del modelo enriquecido con cfDNA, pero la matriz de afinidad con histona H1 es significativamente mejor para la eliminación del cfDNA del plasma del paciente. El hallazgo se confirmó mediante el análisis electroforético de las muestras (véanse las figuras 8 y 9).

La prueba de adsorción de volumen con la matriz de afinidad con poli-L-lisina (PLLAM), la matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) y la matriz de afinidad con la histona H1 produjo casi la misma imagen electroforética con un contenido marginal de cfDNA.

La prueba de adsorción de volumen con la matriz de afinidad con poli-L-lisina (PLLAM), la matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM (PDAM) y la matriz de afinidad con la histona H1 arrojó una imagen electroforética diferente con un contenido de cfDNA marginal después de la incubación con la matriz de afinidad con la histona H1, pero un contenido de cfDNA significativo después de la incubación con la matriz de afinidad con poli-L-lisina y la matriz de afinidad con el dendrímero de PAMAM.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo configurado para realizar la aféresis que comprende una o más matrices de afinidad, en el que dicha una o más matrices de afinidad son capaces de capturar el ADN celular libre (cfDNA) unido a nucleosomas, cfDNA unido a exosomas y cfDNA no unido a partir de la sangre o el plasma de un sujeto, en el que al menos una de la una o más matrices de afinidad comprende una histona.

2. El dispositivo según la reivindicación 1, en el que el cfDNA no unido comprende dsDNA, ssDNA y oligonucleótidos.

3. El dispositivo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dispositivo comprende dos o más matrices de afinidad.

4. El dispositivo según la reivindicación 3, en el que (i) la primera o más matrices de afinidad son capaces de capturar el ADN celular libre (cfDNA) unido a nucleosomas y/o cfDNA unido a exosomas, y (ii) la segunda o más matrices de afinidad son capaces de capturar el cfDNA no unido, y en el que las matrices de afinidad primera y segunda están dispuestas dentro del dispositivo en cualquier orden.

5. El dispositivo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dispositivo comprende una única matriz de afinidad.

6. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la histona es la histona H1.

7. El dispositivo según la reivindicación 6, en el que la histona es la histona H1.3.

8. Un sistema para el tratamiento extracorpóreo de la sangre por reducción de la concentración del cfDNA circulante, sistema que comprende un circuito extracorpóreo, que comprende el dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.