PT2086642E

PT2086642E - Dnase para o tratamento de subfertilidade masculina

Info

Publication number: PT2086642E
Application number: PT78272242T
Authority: PT
Inventors: Benjamin Bartoov; Ronen Yehuda; Melamed Dobroslav
Original assignee: Periness Ltd
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-18
Publication date: 2014-09-30
Also published as: US20130121985A1; EP2416156A1; CA2666794A1; AU2007311444A1; EP2086642B1; DK2086642T3; US20110033438A1; PL2086642T3; EP2086642A2; EP2416155A1; CN101563134A; ES2524458T3; CN105664141A; AU2007311444B2; CA2666794C; JP5323707B2; US9149513B2; AU2007311444A2; EP2416156B1; JP2010506903A

Description

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DESCRIÇÃO

"DNASE PARA O TRATAMENTO DE SUBFERTILIDADE MASCULINA" CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a composições farmacológicas, e mais especificamente àquelas composições farmacológicas para utilização no tratamento da subfertilidade masculina. LISTA DA TÉCNICA ANTERIOR 0 que se segue é uma lista de referências da técnica anterior que é considerada como sendo pertinente para a compreensão da invenção. A indicação destas referências no presente documento será, às vezes, feita por indicação do seu número da lista a seguir em parênteses. 1. Isidori A, Latini M, Romanelli F. (1) Isidori A, Latini M, Romanelli F. Treatment of male infertility. Contraception. Out de 2005;72 (4) : 314-8. 2. Kerin JFP, Peek J, Warms GM, Kirby C, Jeffrey R, Matthews CD, Cox LW (1984) Improved conception rate after intrauterine insemination of washed spermatozoa from men with poor quality semen. Lancet 1:533-534. 3. Ombelet W, Puttemans P, Bosnians E (1995) Intrauterine insemination: a first step procedure in the algorithm of male subfertility treatment. Hum Reprod 10:90-102. 4. Hinting A, Comhaire F, Vermeulen L, Dhont M, Vermeulen A, Vandekerckhove D (1990) Possibilities and limitations of techniques of assisted reproduction for the treatment of male infertility. Hum Reprod 5:544-548 . 5. Comhaire F, Milingos S, Liapi A, Gordts S, Campo R, Depypere H, Dhont M, Schoonjans F (1995) The effective cumulative pregnancy rate of different modes of treatment of male infertility. Andrologia 27:217-221. 2 6. Palermo GD, Cohen J, Alikani M, Adler A, Rozenwaks Z (1995) Intracytoplasmic sperm injection: a novel treatment for all forms of male factor infertility. Fértil Steril 63:1231-1240. 7. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F. Selection of spermatozoa with normal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperm injection. N Engl J Med. 4 de Out de 2001; 345 (14) :1067-8. 8. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosovsky A, Yagoda A, Lederman H, Artzi S, Gross M, Barak Y. Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic morphologically selected sperm injection than with conventional intracytoplasmic injection. Fértil Steril. Dez. de 2003; 80(6): 1413-9. 9. Berkovitz A, Eltes F, Lederman H, Peer S, Ellenbogen A, Feldberg B, Bartoov B. How to improve IVF-ICSI outcome by sperm selection. Reprod Biomed Online. Maio de 2006; 12 (5) :634-8. 10. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm- cervical mucus interaction. Fourth edition 1999. World Health Organization. Cambridge university press. 11. Aitken RJ. Sperm function tests and fertility. Int J Androl. Fev. De 2006; 29(1) :69-75; discussão 105-8 . 12. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosowski A, Menezo Y, Barak Y. Real-time fine morphology of motile human sperm cells is associated with IVF-ICSI outcome. J Androl. Jan.-Fev. de 2002;23 (1) :1-8. 13. Spadafora C. Sperm cells and foreign ADN: a controversial relation. Bioessays. Nov. de 1998; 20 (11) : 955-64. 14. Shak S, Capon DJ, Hellmiss R, Marsters SA, Baker CL. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sei USA 1990; 3 87: 9188-92.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Atualmente, no mundo ocidental, cerca de um casal dentre cinco é subfértil. A subfertilidade é definida como uma falha de conceber após 1 ano de intercurso sexual sem proteção. Em cerca de metade dos casais subférteis, a subfertilidade masculina é observada, e em quase 40% destes casais, a subfertilidade é apenas devido a fatores do sexo masculino. 0 estado de fertilidade masculina é avaliado por uma análise do sêmen. A análise mais comum, conhecida como "análise de rotina do sêmen", proporciona informação sobre o número de espermatozóides presentes no ejaculado, a proporção de células de esperma capazes de mover-se (e/ou capazes progressivamente) e a percentagem de células que são morfologicamente normais. A subfertilidade masculina é geralmente associada a um ou mais dentre produção baixa de esperma (oligozoospermia), motilidade fraca do esperma (astenozoospermia) e morfologia de esperma anormal (teratozoospermia). A combinação de todos os três destes defeitos ("oligoastenoteratozoospermia" OTA) é a causa mais comum de subfertilidade masculina. A probabilidade de conceção aumenta com a concentração aumentada de esperma, motilidade e morfologia normal. A Organização Mundial da Saúde (WHO) propôs diretrizes que especificam os valores de limiar para estes parâmetros para classificar as amostras de sêmen como normais ou anormais (10). A análise de rotina de sêmen, no entanto, tem muitas limitações a que resulta numa proporção significativa de pacientes que demonstram subfertilidade não explicada. Para refinar o diagnóstico, testes adicionais foram desenvolvidos os quais proporcionam mais informação sobre o potencial de fertilização de sêmen humano. Estes testes incluem vários testes funcionais de células de esperma (11) , testes de morfologia funcional como o "exame de 4 morfologia de organelo do esperma capaz de mover-se", (MSOME, 12), e testes que examinam a extensão de dano ao ADN em células de esperma, por exemplo, o ensaio de estrutura de cromatina de esperma (SCSA, 11).

Em alguns casos, a causa de subfertilidade masculina é conhecida. Estas incluem varicocelo, distúrbios hormonais, infeções, infertilidade imunológica, obstrução do trato genital masculino, e criptorquismo. As terapêuticas médicas e cirúrgicas atuais estão disponíveis para estas condições (1) . No entanto, num grande número de casos de subfertilidade masculina, a causa não é conhecida. Nestes casos, vários tratamentos podem ser aplicados ao homem subfértil, com frequência numa base ad hoc. Estes tratamentos incluem antiestrogénios, inibidores de aromatase, androgénios, FSH, pentoxifilina, arginina, camitina, glutationa, vitaminas (A, C e E) e oligominerais (zinco, selênio), (I) .

Quando um tratamento de infertilidade masculina não leva a uma gravidez após um período de tempo razoável ou se as medidas diagnósticas não mostram que uma melhoria no estado de fertilidade é possível, então técnicas de reprodução assistida (ART) podem ser consideradas. Os vários procedimentos de reprodução assistida melhoram o potencial de fertilização do esperma ao se desviar de algumas ou todas as barreiras de migração do trato genital feminino superior e inferior assim como os investimentos no ovo. Os procedimentos ART que são comuns agora incluem inseminação intrauterina (IU 1, 2, 3), fertilização in vitro clássica (IVF, 4, 5) e injeção de esperma intracitoplásmica IVF (IVF-ICSI, 6). Uma melhora em ICSI é uma técnica conhecida como "injeção selecionada morfologicamente intracitoplásmica" (IMSI, 7-9), em que a morfologia fina de espermatozóides capazes de mover-se é examinada por microscopia potente e os espermatozóides demonstram a melhor morfologia dos núcleos são selecionados 5 para ICSI.

As células de esperma de várias espécies são conhecidas in vitro para ligar-se a e absorver ADN exógeno (13) . A ligação ao ADN é mediada pelo menos em parte por CD4 e moléculas MHCII presentes sobre a superfície das células de esperma e é antagonizada pela glicoproteína IF-1, presente no fluido seminal. A interação do esperma com ADN acelular extracelular ativa as nucleases intracelulares como DNase que clivam o ADN genómico do esperma, o que leva eventualmente a um processo de morte celular que se parece com a apoptose. A DNase I bovina tem sido usada clinicamente desde 1965. Foi usada antes nos países da antiga União Soviética para tratar infeções causadas pelos vírus de ADN como Herpes e adenovírus. Acredita-se que DNase degrada o ADN virai em mono- e oligonucleótidos. Esta medicação é geralmente usada para tratar infeção por Herpes simples tipo 2 (herpes genital), infeções herpéticas o olho causadas por Herpes simples, infeções por Herpes zoster, inflamação do trato respiratório como bronquite e pneumonia e tuberculose. Para estas aplicações, é administrada ou por injeções intramusculares, inalação ou colírio. A DNase humana recombinante I é outra DNase I clinicamente usada. É uma medicina aprovada pelo FDA administrada por inalação para tratar pacientes com fibrose cística (CF) . Nestes pacientes, a retenção de secreções purulentas viscosas nas vias aéreas contribui tanto a função pulmonar reduzida como exacerbação de infeções. As secreções pulmonares purulentas contêm concentrações muito altas de ADN extracelular libertado por degeneração de leucócitos que se acumulam em resposta à infeção. A DNase I hidrolisa o ADN no esputo de pacientes com CF e reduz a viscoelasticidade do esputo (14) .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se numa nova e inesperada 6 descoberta de que níveis elevados de desoxioligonucleótido acelular presente na circulação do sangue do homem são associados com subfertilidade e que a administração de ADN acelular exógeno reduz a qualidade do esperma e causa a subfertilidade. Os inventores assim descobriram que proporcionar pessoas do sexo masculino subférteis com uma DNase pode melhorar a qualidade de sêmen e o potencial de fertilidade.

De acordo com a invenção, proporciona-se uma composição farmacêutica para tratar a subfertilidade masculina. A composição farmacêutica da invenção compreende ou um agente que bloqueia o efeito das moléculas de ácido desoxirribonucleico acelular sobre as células de esperma. 0 agente é uma enzima que afeta o nível de moléculas acelulares de ácido desoxiribonucleico em fluidos corporais. A enzima é preferentemente uma desoxirribonuclease (DNase). DNase pode ser uma endodesoxirribonuclease ou exodesoxirribonuclease (endodesoxirribonuclease cliva dentro das moléculas enquanto a exodesoxirribonuclease cliva de uma extremidade das moléculas, 3' ou 5').

Uma ampla variedade de DNases é conhecida, a qual difere em suas especificidades de substrato, mecanismos químicos, e funções biológicas. As DNases não limitativas que são aplicáveis de acordo com a invenção são DNase I, DNase II, DNase gama, DNase ativada por caspase (CAD), L-DNase II, DHPII. De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, a DNase é DNase I. A DNase pode ser de origem animal, vegetal, bacteriana, virai, de levedura ou de protozoários ou pode ser DNase recombinante, preferentemente DNase recombinante, preferentemente DNase recombinante humana. A composição pode incluir, em combinação com o agente, veículos farmaceuticamente aceitáveis. Pelo termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa-se que qualquer um 7 dentre os excipientes inertes, não tóxicos, que essencialmente não reagem com o agente que interfere com o ADN que tem um efeito sobre as células de esperma e é adicionado às mesmas a fim de dar forma ou consistência à composição e para prover proteção contra degradação do agente e aumentar sua sobrevivência fora e dentro do corpo e para obter penetração dentro do corpo e distribuição nos fluidos do corpo e para facilitar a distribuição do agente no corpo do indivíduo e a distribuição ao local alvo (ao ADN acelular).

De acordo com uma forma de realização, a composição está numa forma apropriada para administração oral. De acordo com outra forma de realização, a composição está numa forma apropriada, para injeção, preferentemente injeções intramuscular (IM), subcutânea, ou intravenosa (i.v.). De acordo com ainda outra forma de realização, a composição está na forma apropriada para inalação. Apesar de outras formas de administração serem também aplicáveis, nota-se que a administração oral é uma via preferida de acordo com a invenção devido a uma melhor aderência ao tratamento.

As amostras de sêmen obtidas de homens tratados pelo método da invenção podem ser usadas em técnica de reprodução assistida convencional (ART). Uma lista não limitativa de técnicas de reprodução assistida inclui inseminação intrauterina (IUI), fertilização in vitro (IVF clássica); injeção de esperma intracitoplásmática (ICSI) e injeção selecionada morfologicamente intracitoplasmática (IMSI), assim como outras técnicas bem conhecidas na especialidade de fertilidade. 0 agente usado na invenção é administrado e dosado de acordo com a boa prática médica, levando em conta a condição clínica do indivíduo do sexo masculino, o local e método de administração, esquema de administração, idade do indivíduo, peso corporal e outros fatores bem conhecidos dos médicos. As doses podem ser únicas ou doses múltiplas num dia único ou num período de vários dias/semanas/meses (etc). 0 tratamento geralmente tem uma extensão proporcional à severidade da condição de subfertilidade, eficácia do agente e o indivíduo do sexo masculino a ser tratado. A dosagem pode ser prontamente determinada por administração a uma pluralidade de indivíduos testados (indivíduos que demonstram subfertilidade) com várias quantidades de agente testado e então traçando em gráfico a mudança na qualidade do sêmen como uma função da dosagem. Alternativamente, a dosagem pode ser determinada através de experiências realizadas em modelos de animais apropriados, e então extrapolando para seres humanos usando um dentre uma pluralidade de métodos de conversão. Como conhecido, a quantidade que é considerada como eficaz num indivíduo pode depender de vários fatores, como o modo de administração (por exemplo administração oral pode requerer uma dose maior para obter um dado nível no plasma do agente do que uma administração intravenosa); a idade, peso, área de superfície do corpo, condição de saúde, e fatores genéticos do indivíduo, assim como os fármacos a serem simultaneamente administrados ao indivíduo. A duração do tratamento será determinada de acordo com a quantidade e qualidade do sêmen. A espermatogénese ocorre nos testículos e dura aproximadamente 64 dias em humanos. Ela é seguida por 8-10 dias de transporte epididimal (EPT). O efeito deletério de ADN acelular é observado em seções diferentes do trato genital do indivíduo do sexo masculino: os túbulos seminíferos dos testículos e a cauda epidídimos. Assim, ADN acelular pode afetar diferentes estágios de espermatogénese, produzindo dano às células de esperma manifestadas em diferentes níveis de severidade. O dano aos testículos é tanto quantitativos como qualitativo enquanto o dano epididimal é principalmente qualitativo. Assim, a 9 duração do tratamento pode variar e deve ser determinada de acordo com a quantidade e qualidade do sêmen. A duração do tratamento é preferentemente selecionada dentro os seguintes regimes:

Tratamento agudo A. 10 dias. Este curso visa reduzir o efeito de ADN acelular em células de esperma durante transporte epididimal.

B. 16 dias. Este curso visa reduzir o efeito de ADN acelular em células de esperma durante a fase de amadurecimento da espermiogénese e durante o transporte epididimal.

Tratamentos semi-crónicos C.

_26 dias. Este curso visa reduzir o efeito de ADN acelular em células de esperma durante o ciclo espermatogénico e durante o transporte epididimal. D. 32 dias. Este curso visa reduzir o efeito de ADN acelular em células de esperma durante a espermiogénese completa e durante o transporte epididimal.

Tratamentos crónicos E.

74 dias. Este curso visa reduzir o efeito de ADN acelular em células de esperma durante a espermatogénese completa e durante o transporte epididimal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A fim de compreender a invenção e verificar como pode ser realizada na prática, uma forma de realização preferida será agora descrita, por meio de exemplos não limitativos apenas, com referência aos desenhos anexos, em que: A Figura 1 é um histograma que mostra a concentração de ADN em homens férteis e subférteis; A Figura 2 mostra um histograma do efeito de injeções de ADN sobre o potencial de fertilidade de ratinhos machos; ratinhos A Figura 3 é um histograma que mostra o efeito de injeção de ADN acelular em ratinhos sobre a 10 estabilidade de cromatina em células de esperma; A Figura 4 é um histograma que mostra o efeito de injeção de ADN acelular em ratinhos sobre a percentagem de células de esperma que expressam recetor Fas; A Figura 5 é um histograma que mostra o efeito de injeção de ADN acelular em ratinhos sobre a atividade de caspas 3 em suas células de esperma; A Figura 6 é um histograma que mostra o efeito de injeção de ADN acelular em ratinhos sobre a atividade de DNase endógeno em suas células de esperma; A Figura 7 mostra dano morfológico causado em tecido de testículo por injeção de ADN; A Figura 8 mostra dano apoptótico causado em tecido de testículo por injeções de ADN (coloração TUNEL); A Figura 9 mostra a quantificação do dano apoptótico causado em tecido de testículo por injeções de ADN; A Figura 10 mostra dano morfológico e apoptótico causado em tecido de testículo por injeções de ADN (coloração TUNEL); A Figura 11 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a densidade do esperma em sêmen de homens subférteis; A Figura 12 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a motilidade de esperma em sêmen de homens subférteis; A Figura 13 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a motilidade progressiva no sêmen de homens subférteis; A Figura 14 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a percentagem de células de esperma normais no sêmen de homens subférteis como realizado de acordo com WHO usando microscopia de luz; A Figura 15 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a percentagem 11 de células de esperma com defeitos de cabeça diferentes no sêmen de homens subférteis como realizado de acordo com o WHO usando microscopia de luz; A Figura 16 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a percentagem de células de esperma com cabeças amorfas no sêmen de homens subférteis como realizado de acordo com o WHO usando microscopia de luz; A Figura 17 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a percentagem de células de esperma com defeitos de peças intermediárias no sêmen de homens subférteis como realizado de acordo com o WHO usando microscopia de luz; A Figura 18 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre estabilidade de cromatina em células de esperma no sêmen de homens subférteis; A Figura 19 é um histograma que mostra o efeito de injeções de DNase intramusculares sobre a percentagem de células de esperma que expressam o recetor Fas no sêmen de homens subférteis; A Figura 20 é um histograma que mostra o efeito da administração oral de DNase sobre a densidade do esperma; A Figura 21 é um gráfico que mostra o efeito da administração oral de DNase sobre o volume de sêmen; A Figura 22 é um histograma que mostra o efeito da administração oral de DNase sobre a concentração de células de esperma; A Figura 23 é um gráfico que mostra o efeito da administração oral de DNase sobre a percentagem de células de esperma com morfologia de núcleo normal realizada por MSOME; A Figura 24 é um gráfico que mostra o efeito da 12 administração oral de DNase sobre o número de células de esperma com morfologia de núcleo normal realizada por MSOME; A Figura 25 é um histograma que mostra o efeito da administração oral de DNase sobre a percentagem de células de esperma com morfologia de cabeça estreita como realizado por MSOME; A Figura 26 é um histograma que tem o efeito da administração oral de DNase sobre a estabilidade de cromatina em células de esperma; A Figura 27 é um gráfico que mostra o efeito da administração oral de DNase sobre a percentagem de células de esperma que expressam o recetor Fas; A Figura 28 é um gráfico que mostra o efeito da inalação de DNase sobre a percentagem de células de esperma com morfologia de núcleo normal realizada por MSOME; A Figura 29 é um histograma que mostra a inibição da atividade de DNase de células de esperma internas pelo inibidor de DNase citrato; A Figura 30 é um histograma que mostra a expressão do recetor Fas sobre a superfície de células de esperma de homens férteis e subférteis; A Figura 31 é um histograma que mostra a atividade de caspas 3 tanto em células de esperma que expressam o recetor Fas como células de esperma que expressam o recetor não Fas de homens subférteis; A Figura 32 é um histograma que mostra o número de proles obtidas em inseminação artificial de ratinhos usando tanto células de esperma que expressam o recetor Fas como células de esperma que expressam o recetor não

Fas; A Figura 33 é um histograma que mostra o número de zigotos 2PN obtidos em inseminação de ratinho usando tanto células de esperma que expressam o recetor Fas 13 como células de esperma que expressam o recetor não

Fas; A Figura 34 mostra um desenvolvimento embrionário em ratinhos após fertilização natural ou após inseminação artificial usando tanto células de esperma que expressam o recetor Fas como células de esperma que expressam o recetor não Fas; A Figura 35 é um histograma que mostra a percentagem de células de esperma que expressam recetor Fas no sêmen de homens subférteis que tanto foram bem-sucedidos como falharam num tratamento com IUI; e A Figura 36 é um histograma que mostra a atividade de DNase em plasma sanguíneo de ratinho após administração de DNase.

EXEMPLOS

Materiais

Solução de ADN padrão; 100 mM de ADN de timo de bezerro foram dissolvidos em água destilada em dobro (DDW).

Solução de DPA: 1,5 g de difenilamina foram dissolvidos em 100 ml de ácido acético glacial e 1,5 ml de ácido sulfúrico foram adicionados. No dia da utilização, 0,5 ml de acetaldeído foi adicionado.

Solução de polivinil pirrolidona (PVP):

Meio PVP 1089000 obtido de Medi-Cult.

Tampão de reação de atividade de DNase de Kunitz:

MgS04 5 mM x 7H20, Acetato de Na 0,1 M pH 5, 4 mg% de ADN de timo de bezerro. Níveis de ADN e de desoxioligonucleótido (método de Burton):

Solução de ADN padrão foi diluída em 5, 10, 20 e 50 pg/ml em 166 μΐ. Para cada 166 μΐ de amostras de plasma ou amostra de ADN padrão, 166 μΐ de HC104 IN e 664 μΐ de solução de DPA foram adicionados. As amostras foram 14 incubadas a 37 °C durante 20 h, e então centrifugadas durante 10 min (15.000 g, 37 °C), 300 μΐ do sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 poços e medidos num espectrofotómetro a 600 nm.

Volume de sêmen, densidade de esperma e concentração de esperma: O volume de cada ejaculado de sêmen foi medido usando uma pipeta. A concentração de esperma foi determinada contando as células usando tanto hemocitómetro de Helber como hemocitómetro de Neubauer (Helber é usado quando a concentração de esperma é alta e Neubauer quando é baixa). A densidade de esperma (= número de células no ejaculado total) foi calculada multiplicando-se o volume de ejaculado pela concentração de esperma.

Motilidade de esperma e motilidade progressiva: Células de esperma capazes ou não de mover-se foram contadas usando tanto hemocitómetro de Helber como hemocitómetro de Neubauer e a percentagem de células de esperma capazes de mover-se consequentemente foi calculada. Uma amostra de 20 células de esperma móveis aleatórias foi examinada para motilidade progressiva examinando sua capacidade de progredir numa linha reta até 200 μπι e a percentagem de célula de esperma capaz de mover-se progressivamente foi consequentemente calculada.

Morfologia do esperma usando a técnica de coloração com eosina - nigrosina: Células de esperma foram coloridas usando 2% de eosina, uma coloração nuclear e 10% de nigrosina para o fundo. 50 células de esperma foram avaliadas usando microscopia de luz numa amplitude de lOOOx sob óleo de imersão. A análise da morfologia do esperma foi medida de acordo com as guias WHO (10).

Exame da morfologia de organelos de esperma capazes de moverem-se em seco e húmido (regular) (MSOME): 15

Preparação de esperma para observação morfológica em MSOME húmido (regular):

Uma alíquota de 1-2 μΐ da suspensão de esperma contendo alguns milhares de espermatozóides foi transferida para uma microgoticula de meio de esperma contendo solução de polivinil pirrolidona (PVP) a 0% - 8% e colocada num prato de fundo de vidro sob óleo de parafina. A avaliação morfológica de células de esperma em movimento tomou-se possível pela criação de pequenas baias estendendo-se do aro das goticulas, que capturaram as cabeças dos espermatozóides capazes de se mover.

Preparação de esperma para observação morfológica em MSOME seco:

Ejaculado novo pós-liquefação foi transferido para tubos de fundo redondo em temperatura ambiente (22-25 °C) . O grânulo mole de células de esperma ejaculado foi obtido por centrifugação em recipientes com balanço em 1500 RPM durante 15 minutos, em temperatura ambiente. O sobrenadante do plasma seminal foi removido. O grânulo de esperma foi colocado em suspensão em 1 ml de meio IFV Ferticult (FertiPro N.V. Beemem, Bélgica) e então re-centrifugado em 1500 RPM durante 15 minutos, em temperatura ambiente. Os tubos foram então transferidos para um incubador a C02 a 5%, a 37 °C durante uma incubação oscilante, inclinados a 45°. O sobrenadante foi então cuidadosamente removido até a interfase do grânulo de esperma. O sobrenadante oscilante foi centrifugado a 1500 RPM durante 5 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado. 0 grânulo foi esfregado em lâminas de vidro de microscópio e seco ao ar.

Observação de MSQME de esperma: Células de esperma foram examinadas a 21 °C por um microscópio invertido (Olympus IX 70), equipado com Ótica Nomarski, uma lente Uplan Apo X 100/1,35 objetiva, e uma lente de condensador 0,55 NA. As imagens foram capturadas 16 por uma câmara de vídeo colorida DXC- 950P (Sony), que tem uma potência HAD CCD de 3 chips, de 1,27 cm contendo por volta de 380.000 elementos efetivos (pixéis) para produção de imagem de alta qualidade, e um monitor de vídeo colorido (Sony PVM-14M4E, HR-Trinitron). A avaliação morfológica foi conduzida sobre a tela do monitor que, sob a configuração acima, alcançou uma amplitude real de 6300. Cem espermatozóides móveis de cada amostra de esperma foram examinados para o estado morfológico de 6 organelos subcelulares, lâmina pós-acrossomal, pescoço, mitocôndria, cauda e núcleo. Os 5 primeiros destes organelos subcelulares foram considerados morfologicamente normais ou anormais na base da presença de malformações específicas, que foram definidas como descrito em Bartoov et al., 1981;

Glezerman e Bartoov, 1993. Para o núcleo, o estado morfológico foi definido por tanto a forma como teor de cromatina. Os critérios para o núcleo normalmente conformado por MSOME são configurações lisas, simétricas e ovais. O intervalo normal de comprimento e largura do núcleo do esperma foi tomado como 4,75 ± 0,28 pm e 3,28 ± 0,20 pm, respetivamente (desvio padrão ± médio) enquanto células de esperma fora deste intervalo foram consideradas anormais. A massa de cromatina no nuclear é homogénea, com nenhum distúrbio nuclear regional e contendo não mais do que um veículo com diâmetros de limítrofes de 0,78+0,18 pm a partir da visão frontal. Para ser considerado morfologicamente normal, um núcleo de esperma deve ter tanto forma normal como teor de cromatina normal. Uma célula de esperma demonstrando um núcleo normal bem como um acrossoma normal, lâmina pós-acrossomal, pescoço, cauda, mitocôndria e nenhuma goticula de citoplasma ou citoplasma em tomo da cabeça foi classificada como morfologicamente normal.

Teste da estrutura de cromatina no esperma (SCSA): O SCSA determina a percentagem de espermatozóides com 17

estrutura de cromatina anormal. Estrutura de cromatina anormal foi definida como suscetibilidade aumentada de ADN de esperma a desnaturação induzida por ácido in situ. As quantidades de desnaturação de ADN por célula foram determinadas por citometria de fluxo que mediu o deslocamento de fluorescência verde (ADN nativo) para vermelho (ADN desnaturado, monocatenário) em núcleos coloridos com acridina laranja. Este deslocamento é expresso como o DFI (índice de Fraqmentação de ADN), que está no intervalo de vermelho para intensidade de fluorescência total (vermelho + verde), representando a quantidade de ADN de filamento único desnaturado sobre o ADN celular total. No SCSA, DFI foi calculado para cada espermatozóide numa amostra, e os resultados foram expressos como a média de 5000 células de esperma. Alíquotas de 100 μΐ de suspensão de células de esperma foram misturadas com 2 ml de solução de tampão TNE (Tris 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 0,001 M, pH 7,4) e centrifugadas a 400 x gmax durante 15 minutos a 25 °C. O grânulo final foi recolocado em suspensão em 2 ml de tampão TNE. A suspensão foi centrifugada a 3000 x gmax durante 15 minutos a 4 °C. O grânulo de núcleos obtidos foi fixado por pipetagem vigorosa numa solução de fixação de 500 μΐ (acetona: 70% de etanol, 1:1 v/v) . Todas as etapas do procedimento acima foram realizadas a 4 °C. A amostra foi centrifugada a 3000 x gmax durante 15 minutos em temperatura ambiente e o grânulo foi misturado com 100 μΐ de solução de ácido-detergente (HC1 0,08 M, NaCl 0,15 M, 0,01% de Triton X-100, pH 1,2), durante 30 s a 4 °C. Então, a amostra foi colorida adicionando 5 μΐ de solução de coloração acridina laranja (AO) contendo 6 mg/ml de AO. A amostra foi diluída com 500 μΐ de tampão cítrico (ácido cítrico, 0,037 M, Na2HP04 0,126 M, EDTA 0,001 M, NaCl 0,15 M, pH 6,0) . Posteriormente, a amostra foi submetida a citometria de fluxo num citómetro de fluxo Becton-Dickenson FACSort, San Francisco, CA, USA 18 equipado com um laser ultrasense um laser de ião árgon de 15 mW com um comprimento de onda de excitação de 488 nm. A relação de DFI foi calculada como um pacote de software de 1.1 relação-tempo escrita por Jan van der Aa (Becton Dickenson, Erembodegem, Bélgica) e com software WinMDI 2.8. 0 índice de Fragmentação de ADN (DFI) é a fluorescência média de células de esperma com fragmentação de ADN nuclear. A% de índice de Fragmentação de ADN (% DFI) é a percentagem de células de esperma com fragmentação de ADN nuclear. Este parâmetro foi computado com base na distribuição de DFI.

Atividade de DNase no plasma intracelular e sanguíneo: Células de esperma foram submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento e foram então centrifugadas durante 10 min (27.000 g, 4 °C) . O plasma foi separado do sangue por centrifugação em tubos de EDTA, 0,3ml de sobrenadante foi adicionado a 0,6 ml de tampão de atividade de DNase e a mistura foi medida num espectrofotómetro a 260 nm contra uma referência que continha somente tampão e meio. Curvas de calibração foram feitas usando uma DNase I bovino comercial. A DNase interno de células de esperma foi medido em unidades Kunitz. Uma vez que a unidade Kunitz é definida como a quantidade de DNase que produz um aumento de 1 O.D. por minuto a 260 nm numa extensão de trajeto de 1 cm em pH 5 a 25 °C, num tampão de reação que contém MgS04 5 mM x 7H20, acetato de Na 0,1 Mm pH 5 e 4 mg/% de ADN de timo de bezerro. A DNase do plasma foi medida em unidades Bartoov. Uma unidade Bartoov (BU) é definida como a quantidade de enzima que produz um ΔΑ26ο de 0,001 por minuto em extensão de trajeto de 1 cm em 0H 7,5 a 25 °C, num tampão de reação que consiste de Tris 0,1 M, CaCl2 10 mM,

MnCl2 10 mM e 0,05 mg/ml de ADN de timo de bezerro. Expressão do recetor Fas em células de esperma:

Células de esperma foram lavadas com PBS e incubadas em 4% de paraformaldeído (PFA) durante 30 min a 25 °C. AS 19 células foram então incubadas durante 15 min em solução de bloqueio (1% de BSA em PBS) e então incubadas durante 40 min com anticorpos de recetor Fas anti-cabra. Anticorpo de recetor Fas anti-humano foi marcado com FITC e nenhum segundo anticorpo foi necessário. Quando células de esperma de ratinho foram usadas, as células foram lavadas com PBS e incubadas durante 30 min com um segundo anticorpo anti-cabra marcado com FITC. As células foram lavadas e a fluorescência foi medida num citómetro de fluxo Becton-Dickensen FASCSort.

Atividade de caspase-3 em células de esperma: A atividade de caspase-3 foi medida usando um kit calorimétrico obtido de R&D Company. As células de esperma foram lavadas com PBS, incubadas em tampão de lise durante 10 min a 4 °C e centrifugadas durante 1 min a 10.000 g. 50 μΐ de tampão de reação e 5 μΐ de substrato colorimétrico de caspase 3 foram adicionados a cada 50 μΐ de sobrenadante e incubados durante 2 h a 37 °C. A atividade foi medida num espectrofotómetro a 405 nm.

Separação de células de esperma que expressam recetor Fas de células de esperma que expressam recetor não Fas: Células de esperma foram lavadas com PBS e incubadas durante 30 min com anticorpos de recetor Fas anti-cabra. O anticorpo de recetor Fas anti-humano foi marcado com biotina e nenhum segundo anticorpo foi necessário. Quando se usou células de esperma de ratinho, as células foram lavadas com PBS e incubadas durante mais 30 min com um segundo anticorpo anti-cabra marcado com FITC. As células então foram lavadas com PBS e incubadas durante 20 min tanto com anticorpo anti-biotina conjugado a microesferas contendo iões ferro (de Myltenyi biotech Company) para determinação da atividade caspas, ou anticorpo anti-FITC conjugado a estas microesferas para inseminação em ratinho. A separação de células de esperma positivas e negativas do recetor Fas foi realizada como a seguir. As células foram 20 lavadas com PBS e transferidas através de uma coluna de separação de MACS imuno-magnética de Myltenyi biotech Company. Células de esperma não marcadas que não expressaram o recetor Fas fluíram através da coluna sem ligação. As células de esperma que expressaram o recetor Fas foram ligadas à coluna e eluíram depois usando pressão de êmbolos.

Exame de DNase no plasma em ratinhos após administração oral ou por injeção

Ratinhos pretos C57 foram deixados em jejum durante 12 horas e então receberam tanto administração oral de PBS (placebo, n=10) como administração oral de 9 mg de DNase I em 200 μΐ de PBS (n=14) , ou injeção intraperitoneal de 3 mg de DNase I em 200 μΐ de PBS (n=6). Ratinhos de controlo não foram tratados de todo (n=10) . O sangue foi coletado do coração do ratinho 40 min após injeção ou 1 h após administração oral. O plasma foi separado do sangue por centrifugação em tubos de EDTA e armazenado a —20 °C. A atividade de DNase no plasma foi determinada em unidades Bartoov.

Resultados

Efeitos in vivo de ADN acelular

Como observado na Fig. 1, os níveis de ADN acelular endógena são elevados no sangue de homens subférteis comparados a homens férteis, indicando uma correlação entre nível de ADN alto no sangue e subfertilidade. Naturalmente, injeções intravenosas de ADN acelular em ratinho macho prejudicaram seu potencial de fertilidade. Dois grupos de 10 ratinhos machos receberam injeções intravenosas tanto de 200 pg de ADN acelular como PBS durante 15 dias. Os ratinhos foram então acasalados com ratinhas e o número da prole foi contado em ambos os grupos. A Fig. 2 mostra que i acasalamento com os ratinhos de controlo deu proles de 6,9 ± 1,7 fêmea enquanto acasalamento com ratinhos injetados com ADN deu proles de 0,7 ± 2,2 por fêmea. Além disso, 21 injeção intravenosa de ADN acelular em ratinhos prejudicou sua qualidade nuclear de células de esperma, como observado por uma redução na estabilidade de cromatina em células de esperma como expresso num aumento no DFI (Fig. 3) . Além disso, injeção intravenosa de ADN acelular em ratinhos induziu ativação de marcadores apoptóticos no recetor Fas, caspas 3 e DNase dentro de suas células de esperma (Figs. 4-6) .

Injeção de ADN acelular afeta não somente as células de esperma mas também o tecido do testículo. Como observado nas Figs. 7 e 10, ADN acelular causou o aparecimento de células gigantes e depleção do epitélio do túbulo por mudança do envoltório de células germinais maduras e não maduras testiculares no lúmen do túbulo. Injeção de ADN acelular também causou o aparecimento de grandes áreas apoptóticas (Figs. 8-10). Espermatogénese nos testículos leva aproximadamente 64 dias em humanos. Assim, espera-se que o dano aos testículos causado por ADN tenha um impacto sobre o desenvolvimento de células de esperma durante um longo periodo de tempo e o reparo deste dado pode requerer tratamento prolongado.

Administração intramuscular de DNase I A fim de examinar se DNase I pode melhorar a qualidade do sémen e o potencial de fertilidade, ele foi administrado em homens subférteis. Num grupo de 11 casais em que o homem foi previamente identificado como sendo subfértil e que falhou na conceção num tratamento com IVF- ICSI, os homens receberam quatro vezes ao dia 25 mg de DNase I bovino por injeção intramuscular (IM) durante um período de 7-10 dias. 7-11 dias após a primeira injeção, os casais receberam um segundo tratamento com ICSI. Amostras de sémen e sangue foram tomadas dos indivíduos duas vezes antes de começar o tratamento e 4-7 e 8-15 dias após a primeira injeção e analisadas. Como mostrado na Fig. 11, a análise do sémen revelou que a densidade do esperma aumentou em 70% após 8- 22 15 dias de tratamento comparado às células (24,28 ± 14,73 x 106 /ejaculado de pré-tratamento versus células 14,31 ± 10,15 x 106 /conjugado, respetivamente, P <0,08). Além disso, um aumento de 60% na motilidade de esperma foi observado após 4-7 dias de tratamento em comparação com pré-tratamento (30,6 + 12,6% versus 19+11,3%, respetivamente, P<0, 033, Fig. 12) e um aumento de 76% foi observado na motilidade progressiva de esperma após 8-15 dias de tratamento em comparação com pré-tratamento (47 ± 33,1% versus 26,7 ± 23,4%, respetivamente, P <0,010, Fig. 13) . A morfologia das células de esperma foi analisada de acordo com as guias de WHO (10). Após 8-15 dias de tratamento com DNase, a percentagem de células de esperma morfologicamente conformadas no sêmen dos indivíduos foi elevada em 129% em comparação com pré-tratamento (19,9 ± 12,1% versus 8,7 ± 15,6%, respetivamente, P <0,098, Fig. 14) . Além disso, foi mostrado que tratamento com DNase causou uma redução de 24% na percentagem de defeitos de cabeça total após 8-15 dias de tratamento em comparação com pré-tratamento (57,3 ± 17,6% versus 77,3+ 13,4%, respetivamente, P <0,015, fig. 15) . Em particular, uma redução de 73% foi observada na percentagem de cabeças amorfas após 8-15 dias de tratamento em comparação com pré-tratamento (9,4+ 7,3% versus 34,5+ 29,3% respetivamente, P <0,043, fig. 16). Além disso, uma redução de 60% foi observada na percentagem de defeitos de peças intermediárias após 8-15 dias de tratamento em comparação com pré-tratamento (5,4+ 5,1% versus 13,5+ 8,6%, respetivamente, P <0,040, fig. 17). A morfologia das células de esperma foi analisada também por MSOME em 3 indivíduos. Uma melhora numa variedade de parâmetros de MSOME foi observada para estes indivíduos após o tratamento com DNase (Quadro 1) . Em particular, há uma melhora na percentagem de células de esperma com núcleo normal. ο -P 0 0) Ό Β α 0 < ^ rd Μ -μ * ιΗ LT) ω ο Τ3 0 0 μ> μ <

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Dano de ADN em células de esperma está correlacionado com taxas de conceção prejudicadas bem como com a saúde da prole. Um dos métodos mais empregados para avaliar este dado é o "teste de estrutura de cromatina no esperma" (SCSA), que mede a estabilidade de cromatina no esperma em células expostas a meios ácidos. A fig. 18 mostra que o tratamento com DNase causou uma elevação na estabilidade de cromatina em células de esperma (valores%DFI menores) após 4-7 dias de tratamento em comparação com pré-tratamento (15,1 ± 12,4% versus 25 ± 19,6%, respetivamente, P <0,033). Além disso, tratamento com DNase causou uma redução na expressão do recetor Fas do marcador apoptótico em célula de esperma, tanto após 4-7 como 8-15 dias de tratamento, em comparação com pré- tratamento (26,5 ± 12,5% e 29,2 ± 17,4% versus 39,7 ± 23%, respetivamente, P <0,009 durante 4-7 dias e P <0,023 durante 8-15 dias, fig. 19).

Quatro mulheres de 11 casais (36%) tomaram-se grávidas após o segundo tratamento com ICSI que seguiu o tratamento com DNase. A taxa de gravidez média de um primeiro ciclo de ICSI no centro de IVF em que esta tentativa foi conduzida é de 25% [faixa de 18% a 32%] . A taxa de gravidez de um segundo ciclo de ICSI de pacientes não tratados neste centro de IVF é desconhecida uma vez que após um ICSI não bem-sucedido, eles não realizaram um segundo ICSI mas ao contrário foram aconselhados sobre as falhas de ICSI de modo a usar inseminação de doador. Em qualquer caso, a taxa de sucesso de 36% do segundo tratamento com ICSI está acima de 25% do centro de IVF, assim está claro que tratamento com DNase melhorou as chances de gravidez de tratamentos com ICSI.

Os resultados nas Figs. 11 a 19 e Quadro 1 mostram que a administração intramuscular de DNase I melhorou o sêmen na maioria dos parâmetros de qualidade de sêmen. A densidade do esperma foi melhorada em 70% ao término da experiência. A motilidade do esperma melhorou em 60% já 25 após 4-7 dias de tratamento, mas uma redução na motilidade ocorreu mais tarde, possivelmente devido a uma resposta imune que se realiza em torno de dezassete dias e foi observada após uma febre de 24 h. A motilidade progressiva de esperma melhorou em 76% ao término da experiência. A elevação na motilidade do esperma e densidade do esperma melhorou o potencial de fertilidade dos indivíduos e permitiu aos que não puderam ser bem-sucedidos no primeiro tratamento com ICSI conceber num segundo tratamento com ISCI e possivelmente também em outros tratamentos com ART como IVF clássico ou mesmo um tratamento com IUI.

Administração de DNase intramuscular também melhorou a morfologia do esperma como analisado de acordo com as guias de WHO (10) . A percentagem de células de esperma normais foi elevada em 129%. A percentagem de células de esperma com defeitos na cabeça foi reduzida em 24% e levou a valor normal (< 65) . A percentagem de células de esperma com cabeças amorfas foi reduzida em 73% e a percentagem de células de esperma com defeitos nas peças intermediárias foi reduzida em 60%. Uma melhora na morfologia do esperma foi observada também usando MSOME. O número de células de esperma considerado para análise de MSOME e o número de células de esperma com núcleo normal aumentou após tratamento. O número de células de esperma com vacúolos nucleares, o número de células de esperma de forma estreita e o número de células de esperma com distúrbio regional foi reduzido.

Além disso, o tratamento com DNase reduziu dano em células de esperma. O dano de cromatina em células de esperma (como avaliado por SCSA) foi reduzido em 40% já após 4-7 dias de tratamento e a expressão do recetor Fas do marcador apoptótico foi reduzida em 26% após 4-7 dias e em 33% após 8-15 dias. Espera-se que a melhora na qualidade de sêmen observada após tratamento com DNase melhore o potencial de fertilidade e naturalmente um aumento na taxa 26 de sucesso de tratamento com ICSI foi observado após tratamento.

Administração oral de DNase I A fim de examinar se a administração oral de DNase I pode melhorar a qualidade do sêmen como observado com administração intramuscular, um grupo de 9 homens recebeu oralmente, quatro vezes ao dia, 50 mg de DNase I durante um período de 16 dias. Amostras de sêmen foram tomadas e analisadas dos indivíduos 5 dias após o inicio do tratamento, no dia do início do tratamento, e nos dias 5, 10 e 17 de tratamento. Como pode ser visto no Quadro 2, a análise do sêmen revelou que a densidade do esperma (espermatozóides/ejaculado total) aumentou significativamente pós- tratamento em comparação como pré-tratamento (103 ± 50xl06 células/ejaculado versus 42 ± 38xl06 células/ejaculado, respetivamente, P <0,05). Quando os resultados foram expressos como% de controlo, um aumento na densidade do esperma foi observado já 5 dias de tratamento e mais dramaticamente após 10 e 17 dias de tratamento (235 ± 95%, 160 ± 72% e 284 ± 138% versus 100% em controlo, respetivamente, P <0,05, fig. 20).

Quadro 2

Parâmetros de rotina -5 0 5 10 17 Volume (ml) 1,2 ± 0,5 1,4 ± 0,6 1,8 ± 0,7 1,7 ± 0,8 2,3 ± 0,6** Concentração (xlO6 células/ml) 31 ± 13 30 ± 12 42 ± 15 37 ± 12 45 ± 16* Espermatozóides totais (xlO6 células/ej) 37 ± 30 42 ± 38 75 ± 46 63 ± 52 103 ± 50* % de Motilidade do esperma 85 ± 22 52 ± 5 61 ± 21 72 ± 12 86 ± 33 % de viabilidade do esperma 76 ± 13 72 ± 11 71+ 12 71 ± 12 11 ± 10 27

Parâmetros de rotina -5 0 5 10 17 % de formas normais 15 ± 8 11 + 5 17 ± 16 18 ± 10 15 ± 9 % de defeitos de cabeça 67 ± 10 70 ± 7 70 ± 16 12+ 15 67 ± 9 % de defeitos de peça intermediária 6 ± 3 8 ± 4 6 ± 4 7 ± 2 6 ± 3 % de defeitos na cauda 15 ± 10 12 ± 12 8 + 6 12 + 8 12 + 6 *p <0,05, n=9 **p <0,001, n=9

Além disso, um aumento no volume de sêmen foi observado após 17 dias de tratamento (1,3 ± 0,5 ml pré-tratamento versus 2,3 ± 0,6 ml após 17 dias de tratamento, P <0,001, Quadro 2 e Fig. 21) . Este aumento indica uma função aumentada das glândulas acessórias. Como mostrado no Quadro 2 e na Fig.. 22, a concentração de esperma também aumentou durante o tratamento. A análise de MSOME mostrou que a percentagem de células de esperma que tem um núcleo normal aumentou 2 vezes já após 5 e 10 dias de tratamento em comparação com níveis de pré-tratamento, como mostrado no Quadro 3 e Fig. 23. Também houve um aumento no número de células de esperma com núcleo normal após 10 e 17 dias de tratamento em comparação com pré- tratamento (5,0 ± 3,4xl06 células e 5,7 ± 5,lxl06 células versus 1,6+ 2,lxl06 células, respetivamente, P <0,05, Quadro 3 e Fig. 24) . Além disso, um decréscimo nas células de esperma com cabeças estreitas foi observado após 5, 10 e 17 dias de tratamento em comparação como controlo (84 ± 15%, 85 ± 15% e 83 ± 21% versus 100% no controlo, respetivamente, P <0,05, Fig. 25).

Quadro 3 28

Parâmetros de MSOME -5 0 5 10 17 % de núcleo normal 5,2 + 2, 7 4,7 ± 2, 6 9,0 ± 4, 3* 10,' ± 6,1* 12, 3 ± 6 , 3** Núcleo normal (xlO6 células) 2,0 + 2, 7 1,2 ± 0, 9 3,0 ± 2, 4 5, 0 ± 3,4* 5,7 ± 5, 1* Formas anormais totais 159 + 31 154 ± 30 154 ± 30 150 ± 28 151 ± 30 % de Vacúolos nucleares 80 ± 13 79 ± 14 79 ± 12 73 t 13 11 ± 10 % de formas pequenas 0,1 ± 0, 3 0,5 ± 0, 8 0,4 ± 1, 2 0,1 ± 0,3 0,4 ± 0, 6 % de formas grandes 3,3 ± 2, 3 4,4 ± 2, 3 3, 9 ± 2, 1 2,2 ±1,4 2,5 ± 2, 3 % de formas estreitas 40 ± 10 41 ± 14 33 ± 10 35 t 9 34 ± 9 % de formas amplas 4,2 ± 3, 0 3,2 ± 2, 4 3,5 ± 2, 0 5,2 ± 4,0 2,9 ± 2, 0 % de distúrbios regionais 31 ± 7 25 ± 11 34 ± 8 34 t 9 34 ± 8 índice de vacúolos 1,8 ± 0, 3 1,8 ± 0, 3 1,7 ± 0, 2 1,6 ± 0,3 1,7 ± 0, 3 * p <0, 05, n = 9 ** P<0,001, n = 9

Um aumento na estabilidade de cromatina nas células de esperma (valores DFI menores) foi observado já após 5 dias de tratamento em comparação como controlo (75 ± 36% versus 100%, respetivamente, P < 0,05, Fig. 26). Este aumento foi mais pronunciado após 10 e 17 dias (65 ± 31% e 62 ± 33% versus 100%, respetivamente, P <0,005, Fig. 26). Além disso, a percentagem de células de esperma gue expressam o recetor Fas do marcador apoptótico diminuiu após 10 dias de tratamento em comparação com pré-tratamento (10,6 ± 7,5% versus 35,4 ± 26,4%, respetivamente, P <0,05, Fig. 27). Um outro aumento foi observado após 17 dias de tratamento em comparação com pré- tratamento (6,4 ± 5,2% versus 35,4 ± 26,4%, respetivamente, P <0,005, Fig. 27).

Dentre os indivíduos que participaram da experiência com DNase administrada oralmente, somente um indivíduo tentou com sua parceira do sexo feminino completar com êxito a gravidez. Este casal tinha falhado anteriormente em quatro procedimentos com IUI. Após o tratamento com DNase, o casal alcançou com sucesso gravidez espontânea. 29

Os resultados nas Figs. 20 a 27 e Quadros 2 e 3 mostram que a administração oral de DNase I tem os seguintes efeitos: 1. Aumentar o volume de sêmen. 2. Aumentar a densidade e concentração de células de esperma. 3. Melhorar a qualidade de espermatozóides aumentando a fração de células de esperma que tem um núcleo normal, aumentando a estabilidade de cromatina e diminuindo a proporção de células expressando o recetor Fas. A fim de examinar se a administração de DNase por inalação leva a efeitos similares na qualidade do sêmen, ela foi examinada para um caso. No procedimento de inalação, o indivíduo inalou três vezes ao dia 8 mg da enzima, tomados em intervalos de 4 horas. A inalação da enzima leva à elevação na percentagem de núcleos anormais que foi mais profunda após 9 e 17 dias de inalação (Fig. 28) .

Inibição de DNase em células de esperma endógenas A fim de examinar se o citrato inibidor de DNase pode inibir a DNase em células de esperma intracelulares, as células de esperma foram incubadas com ou sem citrato 10 mM durante até 8 horas. A atividade de DNase intracelular foi medida de hora em hora e a soma da atividade de DNase foi calculada. A soma da atividade de DNase nas células de esperma tratadas com citrato foi 43% das células de esperma de controlo (Fig. 29), indicando inibição de atividade de DNase intracelular por citrato. A relação entre expressão do recetor Fas e atividade de caspas 3 em células de esperma e fertilidade

Um dos marcadores de apoptose conhecidos é a expressão do recetor Fas. Como observado na Fig. 4, injeção de ADN acelular em ratinho leva a uma elevação estatisticamente significativa na expressão do recetor Fas sobre a membrana 30 de suas células de esperma. A incubação in vitro de células de esperma com ADN acelular leva também à elevação significativa na expressão do recetor Fas sobre a membrana das células de esperma (não mostrado) . A fim de determinar se há uma correlação entre a expressão do recetor Fas e fertilidade masculina, a expressão do recetor Fas sobre a superfície de células de esperma foi determinada em homens férteis e subférteis. A percentagem de células de esperma expressão o recetor Fas foi quatro vezes maior em subférteis do que em férteis (78,8 ± 27,4 versus 12,7 ± 6,4, P <0,001, Fig. 30) . A seguir, a fim de examinar se existe uma correlação entre a expressão do recetor Fas em células de esperma de homens subférteis e a atividade de caspase-3 no marcador apoptótico, as células de esperma de homens subférteis foram separadas de acordo com sua expressão do recetor Fas. A atividade de caspase-3 foi determinada em cada população de células de esperma. A percentagem da atividade de caspase-3 nas células de esperma positivas para recetor Fas foi 4 vezes maior do que a atividade de caspase-3 na subpopulação negativa para recetor Fas (207,2 ± 39,6 versus 47,2 ± 10,5, P <0,001,

Fig. 31). A fim de determinar se a expressão do recetor Fas está correlacionada com o potencial de fertilidade, a seguinte experiência foi conduzida: células de esperma de ratinho foram incubadas com ADN acelular (que se descobriu que estimulam a expressão do recetor Fas) e então células de esperma que expressam o recetor Fas foram separadas de células que não expressam o recetor Fas. Quatro grupos de 10 ratinhas foram inseminados tanto com células de esperma que expressam recetor Fas (Fas+), células de esperma que não expressam recetor Fas (Fas-), células de esperma que foram incubadas com ADN acelular, mas não classificadas de acordo com a expressão do recetor Fas, e células de controlo que não foram expostas a ADN. Todas as 31 inseminações foram realizadas com o mesmo número de células de esperma. Como pode ser visto na Fig. 32, nenhum feto foi obtido da inseminação com células de esperma (Fas-) em contraste com células de esperma (Fas+) ou células de esperma de controlo que produziram 3 ± 1,4 e 2,7 ± 1,1 fetos médios por ratinha, respetivamente. A inseminação com células que foram incubadas com ADN acelular mas não classificadas deram origem a somente 0,3 ± 0,4 fetos médios por fêmea. A fim de determinar o estágio em que as células de esperma que expressam recetor Fas falharam em produzir prole, quatro grupos de ratinhas foram inseminados com células de esperma como descrito acima. 16-20 horas após a inseminação, as fêmeas foram sacrificadas, oócitos foram tomados do oviduto e o número de 2 zigotos pronúcleo (2PN) foi contado. Como mostrado na Fig. 33, as células de esperma Fas ( + ) e as Fas (-) deram origem a um número similar de zigotos 2PN e nenhuma diferença significativa foi observada entre células de esperma de controlo e células de esperma que foram incubadas com ADN acelular. Então, um inseminação similar foi realizada usando células de esperma Fas ( + ) e Fas(-) e as ratinhas foram sacrificadas em diferentes estágios da gravidez. O desenvolvimento embrionário foi examinado em ambos os tratamentos e em comparação como desenvolvimento embrionário em fertilização natural. Nenhum desenvolvimento embrionário além do estágio de 2PN foi observado em fêmeas inseminadas com células de esperma Fas ( + ) enquanto fêmeas inseminadas com células de esperma Fas (-) demonstraram desenvolvimento embrionário normal como em fertilização natural (Fig. 34).

Além disso, a correlação entre a expressão do recetor Fas em células de esperma e o resultado de tratamento com IUI foi examinada em humanos. Amostras de sémen de 72 casais subférteis que passaram por tratamento com IUI foram examinadas para expressão de Fas por coloração com 32 imunofluorescência com recetor Fas anti-humano e análise FACS. 18 casos resultaram em gravidez enquanto os 54 casos restantes não resultaram em gravidez. Como mostrado na Fig. 35, a frequência de células de esperma Fas(+) no grupo que obteve gravidez (22,4 ± 18,2 versus 33,1% ± 16,6, respetivamente, P <0,027.

Atividade de DNase no plasma sanguíneo de ratinho A fim de examinar a capacidade de DNase alcançar a corrente sanguínea quando de administração oral, os ratinhos foram tratados com DNase tanto por injeção intraperitoneal como administração oral e a atividade de DNase foi examinada após 1 hora. Como mostrado na Fig. 36, um aumento significativo na atividade de DNase no plasma sanguíneo foi observada tanto nos grupos injetados peritonealmente como administrados oralmente em comparação com o grupo de controlo negativo (14399 ± 4000 e 10853 ± 2150, respetivamente, versus 1345 + 580, p<0,001). Uma pequena elevação na atividade de DNase também foi observada no grupo que recebeu placebo (4055 ± 3500).

Estudo em animal examinando a segurança e eficácia de DNase

Um estudo em animais examinando a segurança e eficácia de DNase em roedores e cães foi realizado no Federal Institute of Toxicology in Rússia. O estudo mostrou que a administração aguda e prolongada de DNase não tem um efeito tóxico sobre os animais de laboratório de sangue quente estudados. A administração de DNase diariamente, prolongada (30 dias), nos animais experimentais em doses que foram acima de 100 vezes maiores do que a dose recomendada para humanos não produziu efeitos prejudiciais detetáveis sobre os principais sistemas do corpo (nervoso, cardiovascular, hematopoiético, secretor, respiratório), metabolismo, condição de saúde geral, desenvolvimento e parâmetros homeostáticos básicos do organismo. A ausência de efeitos irritantes no sistema digestivo quando da administração de DNase também foi observada. 33

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de subfertilidade masculina que compreende uma desoxiribonuclease (DNase) e um veiculo fisiologicamente aceitável.

2. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima é de origem animal, vegetal, bacteriana, virai, de leveduras, ou de protozoários ou é uma enzima recombinante ou uma enzima recombinante humana.

3. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, numa forma adequada para administração oral.

4. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, numa forma farmacêutica adequada para administração por inalação.

5. A composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, numa forma farmacêutica adequada para administração por injeção.